Gibberelline in sprossen von Busch- und stangenbohnen

Institut fur Botanik, Technische Hochschule, Darmstadt, Bundesrepublik Deutschland

Gibberelline in Sprossen von Busch- und Stangenbohnen Gibberellin-like Substances in Dwarf and Tall Bean Shoots EUGEN FISCHER und DIETHARD KOHLER Mit 6 Abbildungen Eingegangen am 20. Marz 1978 . Angenommen am 20. April 1978

Summary The free acid gibberellins in extracts from young second internodes of dwarf and tall Phaseolus vulgaris seedlings were bioassayed with the tall pea assay. Tall plants contain more gibberellin-like substances than dwarf ones; amounts found correspond with freshweights of extracted internodes. Since dwarfs grow like tails after application of a bean gibberellin, it is concluded, that the low gibberellin-content of dwarf shoots is the cause and not the consequence of dwarfism in beans. The gibberellin deficit of the dwarf shoot seems to be the consequence of the low gibberellin content in cotyledons of dwarfs, which was found by GOTO and ESASHI. Key words: Phaseolus vulgaris, dwarfism, growth, gibberellins.

Einleitung

Wenn langsam wachsende "Zwerg"-formen von Pflanzen durch eine Gibberellinbehandlung zu normalem Wachstum angeregt werden konnen, wie z. B. Erbsen (BRIAN und HEMMING, 1955), Mais (PHINNEY, 1961) oder Reis (SUGE und MURAKAMI, 1968), dann liegt die Vermutung nahe, dag bei diesen Formen ein Mangel an Gibberellin fur das verlangsamte Wachstum verantwortlich ist. Der Mangel kann in einem Defizit an Gibberellin bestehen, ebensogut kann sich aber auch eine herabgesetzte Reaktionsfahigkeit auf das eigene, in normaler Menge vorhandene Gibberellin (KENDE und LANG, 1964; KOHLER, 1969/77) als Mangel augern. Unseres Wissens liegt noch keine experimentell begrundete Vorstellung vor, welcher Art der Gibberellinmangel der Buschbohnen ist, obwohl Versuche von GOTO und ESASHI (1973/75) ein Gibberellindefizit wahrscheinlich machen. Diese Autoren fanden namlich, dag die Kotyledonen und Embryoachsen von Stangenbohnen wahrend der Keimung mehr Gibberellin enthalten als die der Buschbohnen. Wir haben daher die Mengen an freien sauren Gibberellinen in jungen, bereits unterschiedlich wachsenden Sprossen beider Varietaten bestimmt. Z. Pflanzenphysiol. Bd. 89. S. 273-279. 1978.

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EUGEN FISCHER und DIETHARD KOHLER

Material und Methoden Versuchspflanzen waren Bohnen der Art Phaseolus vulgaris, und zwar Buschbohnen (var. nanus, Sorte Pergousa, Fa. Sperli) und Stangenbohnen (var. vulgaris, Sorte Neckarkonigin, Fa. Hild). Die Pflanzen wurden unter Langtagsbedingungen im Gewachshaus oder im Freien angezogen. Die Extraktion des Materials, seine Reinigung und der Gibberellintest erfolgten im wesentlichen, wie bei KOHLER 1970 angegeben: Das Pflanzenmaterial wurde zweimal mit Methanol extrahiert. Bei der 1. Extraktion betrug das Verhaltnis MethanollFrischgewicht mindestens 3 : 1. Die vereinigten Extrakte wurden bei reduziertem Druck und 30 DC vollstandig eingetrocknet. Der Riickstand wurde nacheinander in Petroleumbenzin und 10 0/0 waBriger KCI-Losung aufgenommen, der Vorgang wurde wiederholt, bis der gesamte Riickstand gelost war. Das Petroleumbenzin wurde nach der Trennung verworfen, die Wasserphase auf pH 8 gebracht, zweimal mit Essigsaureathylester (EA) ausgeschiittelt, auf pH 3 gebracht und wiederum zweimal mit EA geschiittelt. Die saure EA-phase wurde mit 1 0/0 waBriger Losung von NaHC0 3 geschiittelt, die Bicarbonatlosung auf pH 3 gebracht und wiederum mit EA ausgeschiittelt. Die letzte EA-phase enthalt die sauren Gibberelline. Das EA wurde abgedampft, der Riickstand mit insgesamt 4 ml konzentriertem Puffer von pH 8 aufgenommen und auf eine Saule gegeben. Die Saule enthielt 6 g Sephadex G 50 fine, das iiber Nacht in milS Phosphatpuffer pH 6,5 gequollen worden war. Die Saulen hatten Durchmesser von 1 cm. Nach Beladung der Saule wurde mit puffergesattigtem EA zur Trennung durchgespiilt. Aufgefangen wurden 60 Fraktionen zu 25 ml. Die Trennwirkung der Saule ist vorwiegend ein verteilungschromatographischer Effekt. Sephadex in der stationaren Phase wurde gewahlt, weil es alles Gibberellin wieder freigibt. Die Fraktionen wurden - unterschiedlich zusammengefaBt - eingetrocknet, der Riickstand in 0,1 oder 0,2 ml 0,05 010 Losung von tween 20 aufgenommen. Davon wurden 5 III pro Testpflanze appliziert. Testpflanzen waren normalwiichsige Erbsen (Sorte groEhiilsige Schnabel, Fa. Meisert), die zur Verzwergung auf eine 0,5 010 Losung des Halmverkiirzungsmittels Cycocel = CCC (wirksamer Bestandteil Chlorcholinchlorid) umgesetzt waren, eine Lange von ca. 25 mm besaBen und im Rotlicht wuchsen. (Normalerbsen reagieren empfindlicher gegen die Gibberelline der Bohne als Zwergerbsen.) Kontrollen wurden mit abgestuften Mengen Erbsengibberellin behandelt, das mit einem der Hauptgibberelline der Bohne - und zwar mit dem zuerst aus der Saule austretenden - identisch zu sein scheint. Behandelt wurden pro Probe (Kontrollen und Testpflanzen) je 8 Pflanzen. Die Langen der Testpflanzen wurden drei Tage nach Behandlung gemessen. Aus den Langen der Kontrollen wurde die ideale Eichkurve erstellt (KOHLER, 1977), aufgrund derer die in den Fraktionen vorliegenden Gibberellinmengen als relative (Erbsen-) Gibberellinaquivalente berechnet wurden. Die meisten Tests wurden wiederholt.

Ergebnisse Ein deutlicher Wachstumsunterschied zwischen Stangen- und Buschbohnen zeigte sich erst tiber den Primarbhittern (Abb. 1), d. h. bei den zweiten Internodien. Daher wurden nur zweite Internodien extrahiert und getestet. Insgesamt wurden vier Vergleiche zwischen im Gewachshaus angezogenen Buschund 5tangenbohnen und drei mit Freilandmaterial angestellt. Die Ergebnisse aller 7 Vergleiche sind in Tabelle 1 zusammengefafk Die Tabelle enthalt aile notwendigen Angaben, wie Alter der Pflanzen bei der Ernte, Langen der extrahierten 2. Imernodien und gefundene Gibberellinaktivitaten absolut und bezogen auf das Frischgewicht.

z.

Pflanzenphysiol. Ed. 89. S. 273-279. 1978.

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Abb. 2 zeigt das Ergebnis von vier einzelnen Testen. Die Abb. so11 einen Eindruck vom Zustandekommen der Daten in Tab. 1 vermitteln. In Abb. 3 sind die Gibbere11inmengen, die in den Versuchen mit Gewachshausmaterial gefunden wurSTANGENB.

20 em

BUSCHBOHNEN

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20~/ ~reiland =:~~::-_-:: ,:;:::::::._-

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~-!.' -------------

13

16

19

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22 13

16

19

22

Fig. 1: Growth of tall (left) and dwarf (right) varieties of beans in the greenhouse (upper part) and in the garden. Significant differences are manifest only above the primary leaves. 50

STANGENBOH NEN

BUSCHBOHNEN

Gewaehshaus

o loJ!!!!!!

I I J I ! I ! 'I

I

I

I

[L--

liJJIIO~u=r=

....,...n b....,

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.a .Q

i5

Freiland

LO

o 10

20

30

LO 10 Fraktions·Nr.

2a

30

La

50

Fig. 2: Gibberellin-activities in chromatographic fractions obtained from extracts of second internodes of tall and dwarf beans. Experiments 6T, 4D, 2T, 3D. STANGEN BOHNEN

BUSCHBOHNEN

" 100 ':;
<

.a .Q

i3

Fraktions -Nr.

Fig. 3: Sum of gibberellin activities found in the experiments with plant material grown in the greenhouse. Talis (left) and dwarfs (right).

Z. Pflanzenphysiol. Bd. 89. S. 273-279. 1978.

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Table 1: Gibberellin-equivalents in 2. internodes of beans T = tall, D = dwarf beans. gibb.-eq.ll000 pI. assay 1 2

gibb.-eq.l g fresh weight 1 2

plants grown in the open air 23 IT 10 1.5 23 ID 21 2T 2.5 24 2D 1.5 15 5 3T 15 0.5 3D

870 57.7 2073 47.5 860 195

2.43 0.84 22.6 1.06 11.9 16.1

plants grown in the greenhouse 13 10 2 10 10 7.2 1.9 10 10 7 1.5 10 4 9 1 9

551 81.2 570 316 1713 624 410 374

Expt.

2. intnd. length em

age of plants days

-

4T 4D 5T 5D 6T 6D 7T 7D

2099 382 763 320 648 160 889 72.7 1896 206 868

3.97 3.3 7.9 18.9 17.8 46 0.9 17.3

22.9 8.5 10.6 26.4 4.67 6.5 12.3 4.35 19.7 15.2 60.3

40

10

20 30 40 Fraktions-Nr.

50

Fig. 4: Amounts of gibberellin found in parts of second internodes of tall beans. The internodes were divided into 3 almost equal parts (5 1: Upper part with the bud, 5 3: Part above the primary leaf).

den, getrennt nach Stangen- und Buschbohnen aufsummiert. Die Abb. zeigt deutlicher als Tabelle 1, daB die 2. Internodien der Stangenbohnen viel mehr Gibberellin enthielten als die der Buschbohnen, und zwar in allen Aktivitatsbereichen. Bezieht man die gefundenen Gibberellinmengen auf die Frischgewichte, die bei den Stangenbohnen erheblich h6her lagen, als bei den Buschbohnen, dann ergeben sich etwa gleiche Gibberellingehalte bei beiden Varietaten (Tab. 1), jedenfalls laBt sich aus den von Versuch zu Versuch stark streuenden Werten kein gerichteter Trend fur eine Ungleichheit erkennen. Die Gibberellinmengen entsprechen also den Frischgewichten der zweiten Internodien in beiden Varietaten. Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 89. S. 273-279. 1978.

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25

ai'

I

b

~M

20 OIII!II~I'

50

mm

Ol=r'

rill!!!!!

I

50

06

dill!!!!!

10

oL =-= 16

d11t-----J1.....3'2

4'8

dillCl

16

60

32

48

60

Fraktions-Nr.

Fig. 5: Gibberellins in immature seeds of beans; fractions 1-10, 11-20, 21-30 ... were rechromatographed and the fractions bioassayed. Ordinate: length of plants as compared to controls. 1. (left) and 2. assay (right).

50

STANGENB. - eee

01

.. / _..... ,"

pO

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,

//,'~GA3

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BuseHBOHNEN -eee

/
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10

=== + o --_·=~~~---:--T-------:==~ 5 Tage

L.

.eee ..

••

"'Z:I"'"

======

5

Fig. 6: Effect of gibberellic acid GA 3 (l,ug/plant) and chlorocholinchloride growth of second and higher internodes of beans.

(Ccq

on

Diese Feststellung gilt auch ftir die Teile des zweiten Internodiums: Langere zweite Internodien von 5tangenbohnen wurden in drei etwa gleich schwere Teile geteilt (51 = 5pitzen mit Knospen, 49 g; 52 = Mitte!stticke, 39 g; 53 = Portionen direkt tiber den Primarblattern, 56 g), getrennt extrahiert und getestet. Das Ergebnis ist in Abb. 4 wiedergegeben. Die drei Teile enthie!ten etwa gleich vie! Gibbere1Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 89. S. 273-279. 1978.

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EUGEN FISCHER

und

DIETHARD KOHLER

lin. Ob der etwas hohere Anteil der basalen Portion S 3 an Gibberellin des zweiten Aktivitatsbereiches (Fraktionen tiber 13) real ist, ist nicht zu entscheiden. Die Gibberelline in den Internodien unterscheiden sich von den Gibberellinen, die man aus unreifen Samen extrahieren kann, nicht oder wenig: Ein Samenextrakt wurde chromatographiert, die Fraktionen 2-10, 11-20, 21-30 usw. zusammengefaBt und wieder chromatographiert. Die Gibberellinaktivitaten verteilten sich nach der zweiten Trennung wie Abb. 5 zeigt. Ein Hauptgibberellin liegt bei Fraktion 10, auBerdem lassen sich zwei weitere peaks im 40er Bereich trennen. Die Zusammenfassung der Gibberellinaktivitaten aus Stangenbohneninternodien (Abb. 3) ergab ein ganz ahnliches Bild, wenn dort auch die spateren peaks nicht so deutlich getrennt erschienen und in frtiheren Fraktionen lagen, was aber wahrscheinlich eine Folge der hoheren Belastung der Saulen im Falle der Sprosse war (weil Bohnensamen mehr Gibberellin enthalten als Sprosse, wurde bei ihnen weniger Material extrahiert; die zweite Chromatographie verringerte die Belastung der Saulen noch weiter). Einige Versuche tiber die Wirkung von Gibberellin auf das Wachstum der Bohnen sollen kurz beschrieben werden. Die Gibberellinbehandlung erfolgte auf die noch nicht gestreckte Knospe zwischen den Primarblattern. Gibberellinsaure GA 3 wirhe nur sehr schwach auf Buschbohnen, abs-::>lut zwar etwas starker auf Stangenbohnen, relativ jedoch ahnlich (Abb. 6). Chlorcholinchlorid hemmte das Wachstum stark, seine Wirkung konnte durch GA 3 hochstens andeutungsweise aufgehoben werden. Dagegen wirhe Gibberellin aus jungen Erbsensamen - das mit dem Bohnengibberellin identisch zu sein scheint, das zuerst aus der Saule ausgewaschen wird auf Buschbohnen sehr stark, es glich ihren Wuchs praktisch dem Wuchs der Stangenbohnen an. In einem Versuch hatten die Sprosse tiber den Kotyledonen 7 Tage nach der Behandlung folgende Langen (in mm: x-a-relative Lange): Buschbohnen ohne Gibb: 170--46-1 mit Gibb: 502-101-2,95 Stangenbohnen ohne Gibb: 545-56-3,2 mit Gibb: 598-124-3,5 Mit Bohnengibberellin aus hoheren Fraktionen gelang die Angleichung nicht ohne daB dies bedeutet, daB eine Angleichung mit diesen Gibberellinen nicht moglich ist; bei der starksten applizierten Konzentration war die Wirkung geringer als bei niedrigerer Konzentration, was darauf hindeutet, daB mit der Konzentrierung der Gibberelline eine Konzentrierung von hemmenden Begleitsubstanzen einhergegangen war.

Diskussion Die jungen Sprosse der Stangenbohnen enthielten wesentlich mehr Gibberellin als die der Buschbohnen. Die Gibberellingehalte beider entsprachen ungefahr ihren Frischgewichten, also dem wahrend des Wachstums produzierten Volumen, das bei den Stangenbohnen groBer war.

z.

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Dieser Befund allein Higt keine eindeutige Aussage tiber die Wirkungsbeziehungen zwischen Gibberellin und Wachstum zu. Einerseits konnte mehr vorhandenes Gibberellin die Ursache des versdrkten Wachsturns sein, andererseits konnte aber auch die starkere Volumenzunahme die Ursache ftir eine erhohte Gibberellinzufuhr sein. Ftir die erste Alternative mug man sich entscheiden, wenn man berticksichtigt, dag beide Varietaten nach Applikation ausreichender Mengen eines Bohnengibberellins (oder an seiner Stelle von damit wahrscheinlich identischem Erbsengibberellin) gleichstark - und zum Teil schneller als die unbehandelten Stangenbohnen wachsen. Die Buschbohnen vertreten also den Typ des Gibberellinmangels, bei dem es sich urn ein echtes Gibberellindefizit handelt. Dieses Defizit ist nicht Folge einer beeintrachtigten Gibberellinsynthese, sonst hatten die Versuche mit Cycocelbehandlung anders ausfallen mtissen, d. h. die Wirkung des Cycocels, das die Gibberellinsynthese bei vielen Pflanzen unterbindet (z. B. N INNEMANN et al., 1964; KOHLER, 1966; ANDERSON und MOORE, 1967; JONES und PHILIPPS, 1967) hatte zum grogen Teil durch Gibberellinapplikation aufgehoben werden mtissen. Bei den Buschbohnen kann der Gibberellinmangel also nur in einer verringerten Zufuhr von Gibberellin zu den wachsenden Organen bestehen. Da die Kotyledonen von Buschbohnen nach GOTO und ESASHI, 1973 und 1975, wahrend der Keimung weniger Gibberellin enthalten als die von Stangenbohnen, wird auch die Versorgung des wachsenden Sprosses mit Gibberellin bei den Buschbohnen nicht so reichlich sein konnen wie bei den Stangenbohnen. Der Unterschied zwischen jungen Stangen- und Buschbohnen beruht also darauf, dag in den Kotyledonen der letzteren weniger Gibberellin vorhanden und entsprechend weniger in den wachsenden Sprog transportiert wird. Diese Erklarung kann nattirlich nicht ftir die gesamte Entwicklung gelten, weil irgendwann auch die Stangenbohnen aus den Kotyledonen kein Gibberellin mehr erhalten. Die Wachstumsunterschiede zwischen alteren Stangen- und Buschbohnen konnen nur noch durch eine unterschiedliche Gibberellinsynthese bedingt sein. Diese Differenz in der Gibberellinsynthese ware dann auch ftir die unterschiedliche Belieferung der Samen verantwortlich, deren unterschiedlicher Gibberellingehalt wiederum das unterschiedliche Wachstum der J ungpflanzen bedingt. Literatur ANDERSON, J. D. and T. C. MOORE: Plant Physiol. 42, 1527-1534 (1967). BRIAN, P. W. and H. G. HEMMING: Physiol. Plantarum 8, 669-681 (1955). GOTO, N. and Y. ESASHI: Physiol. Plantarum 28, 480-489 (1973). - Plant Cell Physiol. 16, 759-766 (1975). JONES, R. L. and 1. D. J. PHILIPPS: Planta (Berlin) 72,53-59 (1967). KENDE, H. and A. LANG: Plant Physiol. 39, 435-440 (1964). KOHLER, D.: Planta (Berlin) 67, 44-54 (1965). KOHLER, D.: Z. Pflanzenphysiol. 62, 426-435 (1970). - Z. Pflanzenphysiol. 82, 137-143 (1977).

Z. Pflanzenphysiol. Bd. 89. S. 273-279. 1978.

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NINNEMANN, H., J. A. D. ZEEVART, H. KENDE, and A. LANG: Planta (Berlin) 61, 229-235 (1964). PHINNEY, B. 0.: In: H. KLEIN (ed.) Plant Growth Regulation, IOWA State College press, AMES, IOWA, 489-501 (1961). SUGE, H. and Y. MURAKAMI, Plant Cell Physiol. 9, 411-414 (1968).

Professor Dr. D. KOHLER, Institut fUr Botanik, stadt.

Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 89. S. 273-279. 1978.

TH, Schnittspahnstr. 3-5, D-6100 Darm-