Verteilung radioaktiv markierter freier und konjugierter Gibberelline in abgeschnittenen Gerstenblättern

Biochem. Physiol. Pflanzen 175, 148 -153 (1980)

Verteilung radioaktiv markierter freier und konjugierter Gibberelline in abgeschnittenen Gerstenblättern H. W. LIEBISCH, E. SCHMIDT und H. R. SCHÜTTE Institut für Bioehernie der Pflanzen, Halle (Saale), Forschungszentrum für Molekularbiologie und Medizin der Akademie der Wissenschaften der DDR

Distrihution of Radioactively LabelIed Free and Conjugated GibbereJIins in Detached Barley Leaves Key Term Index: phytohormones, gibberellins, gibberellin conjngates, transport; Hordeurn distichon.

Summary Significant differences in the translocation behaviour of free and eonjugated gibberellins have been observed in detached barley leaves. Following uptake through the cut area labelIed GA3-glucosyl ester, GA 3-O(3)-glueoside, and GAa-oyl-glyein to a high degree accumulated in the upper part of the leaves. On the contrary, free gibberellins like GA1 , GA a, GA 4 , and GA 3-7-aldehyde as weH as indoleacetic acid, O(3)-methyl-D-glucose, and iX-aminoisobutyric acid remained in the basal part of the leaves. Both types of compounds were nearly equally distributed along the leafaxis when taken up through the roots of intact barley seedlings.

Einleitung

In der Phytohormonklasse der Gibberelline hat man bisher 56 natürliche Vertreter (GA l bis GA 56) und zusätzlich mehr als 10 Gibberellinkonjugate isolieren und strukturell aufklären können (HEDDEN et al. 1978). Gibberellinkonjugate sind kovalent an niedermolekulare Verbindungen gebundene Gibberelline, die in der Natur hauptsächlich als Gibberellin-O-glucoside und Gibberellin-glucosylester vorkommen (SEJlIBDNER 1974). Solche Phytohormonkonjugate könnten bevorzugte Formen für den Langstreckentransport darstellen (SEMBDNER et al. 1968). Untersuchungen über den Transport wurden aber fast ausschließlich mit den freien Gibberellinen durchgeführt (z. B. MCCOJIfB 1964; MUSGRAVE et al. 1969; JACOB et al. 1973; JACOBS und PRUETT 1973; HARTU~G und PHILLIPS 1974; WILKINS und NAsH 1974; BARENDSE und DE KLERK 1975; NASH und CROZIER 1975; RumcH et al. 1976; COUILLEROT und BONNFMAIN 1978). Nachdem die Darstellung3iniger konjugierter Gibberelline in markierter Form gelungen war, sollte das Transportverhalten dieser Verbindungen verfclgt und mit dem freier Gibberelline und anderer Phytoeffektoren verglichen werden. Als Objekte wurden Gerstenpflanzen verwendet. Material und Methoden Pflanzenmaterial und Aufarbeitung Die Blätter von 50 bis 100 fünf Tage alten Gerstenpflanzen (Hordeu111 distichon L., Sorte "Certina") wurden an der Basis abgeschnitten und für eine Stunde in die Lösung der lmtrkierten Substanzen

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gestellt. Danach wurden die Pflanzen für die Dauer des Versuches (24 bis 72 h) in Wasser umgesetzt. Während der gesamten Zeit befanden sich die Pflanzen unter einer Glasglocke. Nach 24 bzw. 72 h wurden die Pflanzen geerntet und quer zur Achse in 10 je 1 em lange Segmente zerschnitten; die einander entsprechenden Segmente von 3 bis 5 Pflanzen wurden in lVleßküvetten gebracht, mit 3 ml Methanol versetzt und zur Zerstörung des Chlorophylls mit UV-Licht behandelt. Die Extraktion des Pflanzen materials erfolgte mit Methanol und die Dünnschichtchromatographie an Kieselgel G (0,3 mm, MERCK, Darmstadt) in den Laufmitteln Chloroform: Ethylacetat: Eisessig = 10: 50: 1 (freie Gibberelline) bzw. Chloroform: Methanol: Eisessig: Wasser = 80: 20: 4: 2 (konjugierte Gibberelline). Die Säulenchromatographie an DEAE-Sephadex A 25 (0,9 x 25 cm) wurde diskontinuierlich nach GRAEBNEIl et al. (1976) bzw. mit kontinuierlichem Gradienten nach LIEBISCH (1980) durchgeführt.

Markierte Verbindungen und Radioaktiritiitsmessung [17-l 4 C]-G Aa (1,6 mCi/mMol), [2-14 C]-lndolylessigsäure (14,2 mCi/ nülol), [14C]-0(3)-Methyl- Dglucose und [l- H C]-x-Aminoisobuttersäure (5B,8 mCi/mlVlol) wurden vom Radiochemieal Center Amersham bezogen. [1,2- 3 H]-GA1 (540 mCi/mlVfol) und [1,2- 3 H]-GA4 (81 mCi/mJlol) wurden uns durch katalytische Hydrierung von GA 3 und GA 7 mit Tritiumgas bzw. [U-3H]-GA 3 (49 mCi/mMol), [U-3H]-GAa-0(3)-glucosid (9,4 mCijm:Mol, SCHNEIDER 1978) und [U-3H]-p-Chlorphenoxydimethylessigsäure (48 mCi/mMol) durch Wilzbach-Tritierung in Zentralinstitutfür Kernforschung der AdW der DDR in Rossendorf markiert. Die Darstellung von [G-3H]-GA 3-7-aldehyd (105 mCijmMol, LISCHEWSKI et al. 1980), [U-3H]-GA 3-glueosylester (21,9 mCijmMol, MIERSCII und LIERISCH 1974), [2-14 C]-GA 3-oyl-glycin (5,4 mCi/mMol, LISCHEWSKI und ADAM 1976) und [2- H C]-p-Chlorphenyldimethylessigsäure (2,8 mCijmNlol, lVTrERSCH 1980) erfolgte auf synthetischem Wege. Zur Radioaktivitätsmessung der l3lattsegmente und Extrakte wurde ein Flüssigkeitsszintillationsspektrometer Tricarb Modell 3380 (Packard Instrument Co., Downers Grove, m., USA) verwendet. Neben der Direktmessung wurden die lllattsegmente auch durch In-vial- Verbrennung mit dem Mikromat BF 5010 (Berthold, Wildbad, BRD) für die Radioaktivitätsmessung vorbereitet.

Ergebnisse Aufnahme und Verteilung der markierten Substanzen Als Voraussetzung für vergleichende Untersnchungen über die Verteilung freier und konjugierter Gibberelline in Gerstenblättern war die Abhängigkeit der Aufnahme von der Konzentration der angebotenen markierten Substanzen zu bestimmen. Dazu wurden je 20 abgeschnittene Gerstenblätter in GAa-Lösungen gleicher Gesamtradioaktivität, aber unterschiedlieher I\onzentmtion (10-5 bis

Anteil derGesamtradioaKtivität[%]

Abb. 1. Verteilung der Gesamtradioaktivität in abglschnittenen Gerstenblättern. GAa-[17-1 4 C] (R ~.c H, >< - - - x) bzw. GA 3 -O(ß)-glueosid-[U- 3 H] R = ß-D-Glucosyl, (0 - - 0). In intakten Gerstenkeimlingen ist die Wurzel frei von Radioaktivität, und im lllatt sind beide Substanzen nahezu gleichverteilt (0 ....... 0).

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10- 1 M) eingestellt. Naeh 24 h kamen gleiche Teile jeder Variante zur Radioaktivitätsmessung. Im Bereich von 10-5 M bis [). 10- 3 M enthielten die Gerstenblätter die gleiche Radioaktivitätskonzentration, das bedeutet, daß die Aufnahme der angebotenen GAs-Menge proportional war. Für den Vergleich verschiedener Gibberelline wurden Konzentrationen von 10- s Mangewendet und nach 24 bzw. 72 h der Anteil der Gesamtradioaktivität in 1 cm langen Blattabschnitten (s. Abb. 1) bestimmt. Die ermittelten Radioaktivitätsanteile sind in der Tabelle 1 wiedergegeben und für 2 typische Vertreter (GAs und GAs-0(3)-glucosid) in der Abbildung graphisch dargestellt. Die Unterschiede in der Verteilung von freiem GA 3 und seinem O-GIucosid sind gravierend. Nach Aufnahme, von freiem GAs über die Schnittfläche verbleiben etwa 80 % der Gesamtradioaktivität im basalen. Abschnitt. Demgegenüber zeigt das GIucosid die Tendenz, sich in der Blattspitze anzureichern. Wie das GAs-O(3)-glucosid verhalten sich auch GA3-glucosylester und GAs-oyl-glycin als weitere Vertreter von Gibberellinkonjugaten und wandern in die Spitze des Blattes. Die 3 verwendeten konj ugierten Gibberelline waren unters chiedlich markiert: GAa-glu cosylester im Aglucon, GAs-oylTabelle 1. Verteilung der Radioaktivität längs der Achse von Gerstenblälternin aktivität (Versuchsdauer 24 h) markierte Verbindung

GA 1-[1,2-aR ] GAa-[17 _14C] GA 4-[1,2- 3 R] G Aa-7 -aldehyd[6- aR] GAa-[u-aR]methylester GAa-[U-3R ]-glucosylester GAa-[u-aR]-tetraacetylglucosylester GA a-0(3)-glucosid-[U- 3 H] GAa-oyl-glycin[2-14 C] 0(3)-}\[ethyl-[!4C]D-glucose a -Aminoisobuttersäure-[l-HC] Indolylessigsäure-[2-I4 C] p-Chlorphenyldimethyless igsäure-[2-I4 C] p-Chlorphenoxydimethylessigsäure-[ u-aR]

% der

Gesamtradio-

9

10 (Spitze)

Dlattsegmente 1 (Basalsegment)

2

3

4

5

6

49 81 43 50

12 14

4 2 4 9

2 2

0 0

4

1 6

4

2 0 2 3

2

7

4

4

6

4

7

18

8

4

2

0

35

19

5

2

1

1

2

4

9

22

9

6

4

1

0

0

3

7

12

58

18

8

2

2

0

1

2

4

17

,t6

61

19

8

3

i}

"

2

1

1

0

2

68

16

6

2

1

0

1

:2

2

:2

63

14

8

6

3

2

1

1

1

1

58

21

8

3

1

2

1

1

0

5

71

10

3

2

2

1

1

2

2

6

6 20

2

8

7

2

7

2

4 0 7 3

0 9 3

18 2 12 4

11

20

28

9

1

3

4

12 48

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glycin im Aminosäureteil bzw. GA 3-O(3)-glucosid in Aglucon und Zucker. An Dünnschichtchromatogrammen von Extrakten der Blattspitzen zeigte sich, da,ß die Radioa,ktivität fast ausschließlich den Konjugaten wkam, was gegen eine Spaltung im Zuge des Transportes spricht. Eine Akkumulation der Radioaktivität im Basalsegment zeigen neben dem GA3 mit GA g-7aldehyd, GAl und GA4 weitere freie Gibberelline. O(3)-Methyl-D-glu cose, cx-Aminoisobuttersäure, das Auxin Indolylessigsäure sowie synthetische Phytoeffektoren vom Dimethylessigsäure-Typ zeigen die gleiche Radioaktivitätsverteilung längs der Blattachse. Damit ergeben sich prinzipiell nur 2 Verteilungsmuster für die untersuehten Verbindungen: Akkumulation im Basalteil bei freien Gibberellinen und anderen Effektoren bzw. Transport in die Spitze bei Konj ugaten. Nach 72 h war die in der Tabelle 1 für 24 b gezeigte Radioaktivitätsverteilung nahezu unverändert. Der Transport der Konjugate erfolgt sebr rascb. Bereits nach 1 h war der Hauptteil der Radioaktivität von markiertem GA 3-glucosylester vom Basa.Jteil abgewandert, und na ch 2 hzeichnete sich die bevorzugte Akkumuhttion in der Spitze ab (42 % der Gesamtradioaktivität). Vergleichsweise durchgeführte Untersuchungen über die Translokation von HC-markiertem GAg und tritiertem GAg-glucosylester in intakten Gerstenpflanzen gleichen Alters ergaben ein völlig anderes Bild(s. Abb. 1). Die durch die Wurzel aufgenommenen Verbindungen wurden annähernd gleichmäßig längs des Blattes v~rteilt, und die Wurzeln waren frei von Radioaktivität.

Extmktion und Chromatographie des Pflanzen materials Die von dem Verteilungssehema (s. Abh. 1) abweichende partielle Anreicherung von Radioaktivität in der Spitze beim GA c und GA 4- Versuch war überras chend und mußte näher untersucht werden. Radiodünnschichtchromatogramme von Extrakten der Segmente 8- 10 wiesen auf polare ~fetabolitehin. Der GA4-Metabolit (12 %der Gesamtradioaktivität) erwies sich nach DEAE-Chromatographie als Neutralsubstanz, die sich durch Cellulase (MÜLLER et al. 1978) partiell zu GA, spalten ließ. Nach diesen Eigenschaften und dem dünnschichtchromatographischen Verhalten kann dieser Metabolit als G A4-glucosylester angesehen werden. Nach den chromatographischen Eigenschaften ist auch der GAl-Metabolit (8 % der Gesamtradioaktivität) ein Zuckerkonjngat. Weitere Konjugate {5 % der Gesamtradioaktivität) wurden in den Extrakten der beiden Dimethylessigsäureabkömmlinge chromatographisch nachgewiesen. Für eine Strukturaufklärung waren die Substanzmengen nicht ausreichend. In den Versuchen mit GA 3 , GA3 -methylester, GA 3 -7-aldehyd. GA 3 -O(3)-glucosid. GA 3 -oyl-glycin.
Diskussion

Durch Entfernen des Wurzelsystems der Gerstenpflanze wird die Barriere für xylemmobile Substanzen beseitigt, aber nur die konjugierten Gibberelline akkumulieren rasch in den apikalen Teilen der Blätter. Um experimentelle Fehler ausschließen zu können, waren [17- 14 C]-GA3 und [U-3H]-GA3-glucosylester bzw. [U-3H]-GA3 und GA3-oyl-[2-14 C]-glycin gemeins~m angeboten und die 3H: 14C-Anteile in den Segmenten

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bestimmt worden. Die freien Gibberelline erreichen offenbar nicht die Xylem zellen und verbleiben im Basalteil, ebenso Indolylessigsäure und andere Säuren (s. Tabelle 1). Eine freie Carboxylgruppe ist aber in diesem System nicht für die geringe Mobilität verantwortlich zu machen, da GA3-7-aldehyd gleichfalls im Basalteil akkumuliert. Unterschiede in der Verteilung von GAs und seinem Methylester in Erbsensprossen (MuSGRAVE et al. 1969) und von GA3 und seinem Glucosid im Hypocotyl von Pharbitis nil (BARENDsE und DE KLERK 1975) sind bereits beobachtet worden. Im Pharbitis-System reicherte sich das Glucosid hauptsächlich in den Cotyledonen an und erst wenn diese entfernt wurden, im apikalen Bereich des Hypocotyls. Offenbar sind aber monocotyle Pflanzen ein ge€igneteres Objekt, um Unterschiede in der Mobilität von freien und konjugierten Phytoeffektoren darzustellen, da wir die in Tabelle 1 und Abb. 1 gezeigte Radioakcivitätwertcilung auch mit abgeschnittenen Weizen-, Mais- und Reisblättern erhielten. Bei letzterem ist jedoch vielfach eine Hydrolyse von Zuckerkonjugaten durch Glucosidasen mikrobieller Herkunft zu beobachten (LIEBISCH 1974). Für die Bestimmung von Mobilitätskoeffizienten (JACOB et al. 1973) scheillt das benutzte System weniger geeignet zu sein. Literatur BARENDSE, G. W. M., and DE KLERK, G. J. M.: The metabolism of applied gibberellic acid in Pharbilis nil Choisy: Tentative identification of its sole metabolite as gibberellic acid glucoside and some of its properties. Planta 126, 26-35 (1975). COUILLEROT, J. P., and J30NNEMAIN, J. L.: Transport and fate of gibberellins in Lyeopersieon eseulentum MILL.: The role of leaves. Compt. rend. 286, 269-271 (1978). GRÄBNER, R., SCHNEIDER, G., und SEMBDNEH, G.: Fraktionierung von Gibberellinen, GibberelIinkonjugaten und anderen Phytohormonen durch DEAE-Sephadex-Chromatographie. J. Chromatogr. 121, 110-115 (1976). HARTl'NG, W., and PTIILLlrS, 1. D. J.: Basipetally transport of 3H-gibberellin Al and 14C-gibberellin Aa, and aeropetal polarity of l40-indole-3-acetic acid transport in stelar tissnes of Phasealus coccineus roots. Planta 118,311-322 (1974). HEDDEN, B., MACMILLAN, J., and PHINNEY, B. 0.: The metabolism of the gibberellins. Annu. Rev. Plant Physiol. 29, 149-192 (1978). JACOB, 1"., NnmANN, S., and STHOBEL, U.: Studies on mobility of exogen applied substances in plants. In: Transactions of the 3rd Symposium on Accumulation and Translocatiou of Nutrients and Regulators in Plant Organisms, 315-330, Warschau 1973. JACOBS, W. P., and PRUETT, P . .1\1.: The time-course of polar movement of gibberellin through pea roots. Amer. J. Bot. 60, 868-900 (1973). LIEßISCIJ, H. W.: Uptake, translocation and metabolism of GA a glucosyl ester. In: SCHREIBElt, K, H. R. SCHÜTTE and G. SEMBDNER, Biochemistry and Chemistry of Plant Growth Regulators, 109 -113, Halle (Saale) 1974. Uptake and metabolism of labelled gibberellins in cell suspension cultures of Lyeopersieon eseL!lentum. (In Vorbereitung.) LISCHEWSKI, M., und ADAM, G.: Darstellung von Gibberellin-A a-oyl-glycin-[2-l4 0]. Z. Ohem. 16, 357 (1976). - PLEISS, H., LIEBISCH, H. W., und ADAM, G.: Synthese von 6- 3 H-markiertem GA 3 , GA a-7-aldehyd und GA a-7-alkohol. In Vorbereitung. Mc:OOMB, A. J.: The stability and movement of gibberellic acid in pea seedlings. Ann. Botany (London) 28, 669 -686 (1964).

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Eingegangen am 28. September 1979. Anschrift der Verfasser: Dr. HANS- WERNER LIEBISCH, Dipl.-Biol. ELISABETH SCHl'iIIDT und Prof. Dr. HORST-ROBERT SCHÜTTE, Institut für Bioehemie der Pfla,nzen, 402 - Ihlle (Sa,ale), Weinber~ 3.