Hitzelabilität der ribosomalen RNA aus Anacystis nidulans

Biochem. Physiol. Pflanzen (BPP), Bd.165, S. 407-418 (1974)

Institut fiir Biochemie der Pflanzen Halle (Saale) des Forschungszentrums fiir Molekularbiologie und Medizin der Akademie der Wissenschaften der DDR

Hitzelabilitat der ribosomalen RNA aus Anacystis nidulans Thermolability of the Ribosomal RNA from Anacystis nidulans

Von R.

WOLLGIEHN

und D.

MUNSCHE

Mit 6 Abbildungen (Eingegangen am 29. November 1973)

Summary 1. The ribosomal RNAs of Anacystis nidulans extracted with Mg++ containing buffer at low temperature and separated by polyacrylamide gel electrophoresis show intactness of both 1.1 x 106 and 0.56 x 106 molecules. After heating the rRNA fraction for 1 min at 60°C, the 1.1 x 106 rRNA splits into fragments of 0.9 and 0.2 x 106 daltons mol. wt. 2. The lability of the rRNA depends on the age of the ribosomes in the cell and on the physiological state, i.e., there is a correlation to the intensity of growth of the cell culture. Pulse-labelled ribosomal precursor RNA (p 23 and p 16) and newly synthesized mature 1.1 and 0.56 x 106 rRNAs are thermostable. The appearence of the lability of the radioactive 1.1 x 106 rRNA can be studied after pulse-labelling during a chase period. The amount of the cleaved molecules depends on the intensity of growth of the culture. Pulse-labelled 1.1 x 106 rRNA is stable more than 18 hours in logarithmically grown cultures during the first chase period. However, in cells beyond the log phase . of the culture 50 per cent of this RNA is heat-degraded already after 10 hours chase. During a long chase period (length of the experiment 82 h) an equilibrium is reached between labile (about 75 %) and stable (25 %) 1.1 x 106 rRNA, independent from the intensity of growth in the early chase period. 3. The level of labelled rRNA (after 32P·pulse) of the culture is nearly constant in a 82 h chase penod. Therefore, no direct relation has been found between thermolability of the 1.1 x 106 rRNA and degradation of the ribosomes in the cell. 4. The breaks in the RNA are not produced during heating by nucleases which resisted phenol extraction. It is suggested that in the course of aging of the ribosomes one phospho diester bound per 1.1 x 106 rRNA molecule is hydrolysed by a specific nuclease action within the ribosomes producing two fragments. Their dissociation is prevented by non-covalent interactions in the secondary structure of the molecules at low temperature and in the presence of Mg++. 5. In contrast to Anacystis nidulans rRNA the ribosomal RNAs of Escherichia coli are thermostable. Abkiirzungen: p 23 und p 16, Precursoren der ribosomalen RNA der Mol.-Gew. 1,1 und 0,56 x 106 (23 S bzw. 16 S); MAK-Saule, Methylalbumin-Kieselgur-Saule; P AA-Gel-Elektrophorese, Polyacrylamidgel-Elektrophorese; EDT A, Athylendiamintetraessigsaure; SDS, N atriumdodecylsulfat

408

R. WOLLGIEHN und D. MUNSCHE

Einleitung

Die ribosomale RNA der Blaualgen (Mol. Gew. 1,1 und 0,56 x 1()6) geht ebenso wie die rRNA anderer prokaryontischer Systeme (Bakterien 1, 5, 12, 33, 34; Chloroplasten 11, 24) aus Vorstufen (p 23 und p 16) hervor, die nur wenig gro13er sind als die reifen rRNA-Molekiile (7, 10, 31, 37). Extrahiert man die Nucleinsauren aus Anacystis nidulans und einigen anderen Blau algen in einem Mg++-freien Puffer, dann zerfiUlt die altere akkumulierte 1,1 x 106 r RNA in spezifische Fragmente, wahrend aUe ribosomale Vorstufen-RNA und die neusynthetisierte 1,1 x 106 RNA ebenso wie die gesamte 0,56 x 106 r RNA stabil sind (10, 27, 31, 36, 37). Ahnlich labil in Mg++-freiem Puffer ist auch die 1,1 x 106 r RNA aus Chloroplasten-Ribosomen, die je nach Pflanze in mehrere unterschiedliche Bruchstticke zerfliUt (15, 22, 25). In ahnlicher Weise wird die schwere ribosomale RNA aus verschiedenen Organism en auch bei kurzzeitigem Erhitzen in genau definierte Bruch.;tticke gespalten, also unter Bedingungen, bei denen nur Wasserstoffbindungen, nicht aber cova.lente Bindungen gelOst werden. Neben der 25-28 S RNA aus einigen Eukaryonten (2-4, 9, 13, 16-20, 26,32) und Prokaryonten(13 a, 27,30,36) ist die altere akkumulierte 23 S RNAaus Chloroplasten-Ribosomen besonders hitzelabil (25). Wiederholt sind Beziehungen zwischen Alter der ribosomalen RNA und ihrer Stabilitat beobachtet worden (14,15,17,19,23, 25, 26, 36, 37). Wie wir in einer vorangegangenen Arbeit bereits kurz berichtet haben (36), wird auch die 1,1 x 106 rRNA aus Anacystis nidulans beim Erhitzen in der gleichen Weise wie bei Mg++-Entzug in 2 Fragmente der Mol. Gew. 0,9 und 0,2 x 106 gespalten. In der vorliegenden Arbeit solI tiber die Abhangigkeit der Hitzelabilitat vom Alter der RNA und dem physiologischen Zustand der Zellen berichtet werden. Material und Methoden Anzucht der Zellen und VersuchsdurchIiihrung Anacystis niaulans (Stamm Gottingen) wurde in der bereits an anderer Stelle beschriebenen Weise bei 40 °0 kultiviert und nach 72 Stunden geerntet (36,37). Escherichia coli K 12 wurde iiber Nacht bei 35 °0 in 8,5 g Difco Nutrient Broth plus 5 g Glukose pro Liter angezogen. Vor der Inkubation mit 32p wurde Anacystis durch 5 Stun den Wachstum in einem normalen, aber phosphatfreien Niihrmedium naeh KRATZ und MYERS (21) und E. coli durch 2 Stunden Wachstum in einem PhosphatMangelmedium nach GAREN und LEVINTHAL (8) an Phosphat verarmt. Die Zellen wurden einmal mit dem jeweiligen P-Mangelmedium gewaschen, erneut im gleichen Medium suspendiert und mit 5 /tOp2Pfml inkubiert (Na2H32P04 yom Zentralinstitut fiir Kernforschung Rossendorf). Nach der bei den einzelnen Versuchen angegebenen Inkubationszeit wurden die Zellen nach schnellem Abkiihlen in Eis abzentrifugiert und aufgearbeitet, oder sie wurden abzentrifugiert, gewaschen und in einem normalen, 31P-haltigen Nahrmedium unter den jeweils angegebenen Bedingungen we iterkultiviert (pulse-ehase-Versuch). Extraktion der Nucleinsauren Zur Extraktion der Nucleinsauren (36,37) wurden die Zellen bei + 2 °0 mit Alcoa A-305 zerrieben. Die Paste wurde mit 0,05 M Tris-HOI, pH 7,8; 0,1 M NaCl; 0,01 M MgOI 2 aufgenommen und

Hitzelabilitat der ribosomalen RNA aus Anacystis nidulans

409

nach Abzentrifugieren des Alcoa wurde durch mehrfaches Ausschiitteln mit wassergesattigtem Phenol deproteinisiert. Die N ucleinsauren wurden in der Kalte mit 2,5 Vol. Alkohol gefallt und einmal umgefaUt.

Hitzebehandlung der RNA Die Nucleinsauren wurden in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,8); 0,05 M KCl; 0,005 M MgCl 2 geliist, 1 min im Wasserbad auf 60 DC erhitzt, sofort in Eis abgekiihlt und auf die PAA-Gele zur Elektrophorese aufgetragen. Pol y a cry la midgel- Ele ktrop hores e Die PAA-Gel-Elelektrophorese und die Auswertung der Gele erfolgte wie friiher beschrieben (24, 41).sAls Elektrophorese-Puffer verwendeten wir den E-Puffer nach LOENING (30 mM NaH2 P0 4 ; 1 mM EDTA, Dinatriumsalz; 0,2% SDS; 36 mM Tris; pH 7,7). Nach der Registrierung der UVAbsorption bei 265 nm wurden die Gele zur Bestimmung der Radioaktivitat den Rohren entnommen und auf Filterpapier getrocknet. Sie wurden dann auf Rontgenfilm aufgelegt und je nach Radioaktivitat unterschiedlich lange exponiert. Die Schwarzung des Films wurde, wie friiher beschrieben, bei 600 nm gemessen und aufgezeichnet (41). In den Abbildungen ist nur die relative Radioaktivitat, d. h. die Schwarzung der Autoradiogramme (Aooo nm) angegeben. Zur quantitativen Bestimmung des Zerfalls der neusynthetisierten 1,1 x 106 rRNA wurden die einzelnen RNA-Fraktionen aus den Gelen ausgeschnitten und auf Filterpapierscheiben getrocknet. Die Bestimmung der Radioaktivitat der RNA erfolgte im Tricarb-Scintillations-Spektrometer. MAK-Saulenanalyse Zur Bestimmung der spezifischen Radioaktivitat der Gesamt-rRNA wurden die Nucleinsauren auf der Methylalbumin-Kieselgur-Saule fraktioniert (40).

Ergebnisse

Werden die Nucleinsauren in einem Mg++-haltigen Puffer bei niedriger Temperatur (+ 2°C) aus Anacystis nidulans extrahiert und anschlie.6end durch PAA-GelElektrophorese (bei 15-18 °C) fraktioniert, dann bleibt die gesamte ribosomale RNA stabil (Abb. la, lc). Erhitzt man die Nucleinsauren vor der Elektrophorese jedoch 1 min lang auf 45-50 °C, dann setzt ein Zerfall der 1,1 X 106 RNA ein. Beim Erhitzen auf 60°C wird der gro.6ere Teil dieser RNA in 2 Fragmente der Mol. Gew. 0,9 und 0,2 X 106 gespalten (Abb. lb, ld, O.D.-Kurve), also in der gleichen Weise wie beim Entzug von Mg++ (31,36,37). Die 0,56 X 106 RNA bleibt dagegen beim Erhitzen ebenso wie bei Mg++-Entzug unverandert. Die ThermolabiIitat der 1,1 X 106 r RNA ist sehr stark yom physiologischen Zustand der Zellen und besonders yom Alter der Molektile selbst abhangig. Nach pulse-Markierung der Zellen bleibt sowohl die radioaktive ribosomale Vorstufen-RNA (p 23 und p 16) als auch der gro.6te Teil der neusynthetisierten 32P-markierten 1,1 X 106 und die gesamte 0,56 X 106 RNA beim Erhitzen auf 60°C stabiI (Abb. 1 b, Radioaktivitatsprofil). Dementsprechend sind die 0,9 und 0,2 X 106 Fragmente kaum markiert. Bei dies em Versuch ist jedoch zu berticksichtigen, da.6 nach 5 min Inkubation mit 32p nur p 16 in gro.6erer Menge vorhanden ist, wahrend p 23 wesentlich schneller in die reife 1,1 x 106 rRNA umgewandelt wird. Inkubiert man die Zellen 1 Std. mit 32p (Abb. lc, ld), dann sind die Vorstufen der rRNA im RadioaktivitatsprofiI nicht mehr erkennbar. Aber nahezu die gesamte 28 Biochem. Physiol. Pflanzen, Bd. 165

410

R. WOLLGIEHN und D. MUNSCHE ~O

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Abb.1. Hitzelab ilitiit der ribosomalen RNA ails Anacystis nidulans.' PAA-Gel-Elektrophorese der Nucleinsauren nach 1 min Erhitzen allf 60 °0 (bzw. + 2 °0 = KontroBe). ( a, b): ails ZeBen nach 5 min pu!se-Markierung, (c, d): aus Zellen nach 60 min Inkubati on mit 32P.

Hitzelabilitat der ribosomalen RNA aus Auacystis nidulans

411

neu synthetisierte 1,1 x 106 r RNA (Radioaktivitatsprofil) bleibt beim Erhitzen intakt im Gegensatz zum gro13eren Teil der alteren akkumulierten RNA (O.D.-Lillie). Urn den Zeitpunkt des Auftretens von Briichen in den rRNA-Molekiilen von Anacystis genauer erfassen zu konnen, haben wir die Zellen in einem weiteren Versuch 60 min mit 32p markiert, gewaschen und nach Verdiinnung in einer normalcn, nicht radioaktiven NahrlOsung wachsen lassen (chase-Bedingungen). Wie die Trockengewichtszunahme (Abb. 3) zeigt, war die Verdiinnung so gewahlt, daB das Wachstum nur langsam erfolgte, also nicht mit einer erneuten logarithmischen Wachstumsphase begann. Die Zunahme des Chlorophyll- und RNA-Gehaltes der Kultur h'1tte einen ahnlichen Verlauf wie die Trockengewichtszunahme. Nach 10, 15, 20, 36, 60 und 82 Std. wurde jeweils ein Teil der Kultur geerntet, um die Thermolabilitat der isolierten radioaktiv markierten RNA zu priifen. Nach einer 9stiindigen chase-Periode im AnschluB an eine einstiindige Inkorporation von 32p sind noch 50 % der radioaktiven 1,1 X 106 RNA stabil, der Rest zerfallt beim Erhitzen in Fragmente der Mol. Gew. 0,9 und 0,2 X 106 (Abb. 2a, b). Nach 81 Std. chase (Abb. 2c, d) sind bereits 75 % der radioaktiven 1,1 X 106 RNA labil und zerfallen bcim Erhitzen wie die iibrige 1,1 X 106 RNA (O.D.-Linie). Abb. 4 zeigt zusammenfa3send die El1twicklung der Hitzelabilitat pulsc-markiercnder radioaktiver 1,1 X 106 r RNA im VerI auf des Wachstums einer Anacystis- Kultur (pulse-chase-Versuch). Bereits nach 36 Std. hat sich ein Gleichgcwicht zwischen labiler (75 %) und stabiler (25 %) RNA eingestellt, das iiber eine lange Zeit des stationaren Wachstums erhalten bleibt. Diese Abhangigkeit der Labilitat yom Alter der RibGsomen ist in begrellztem Umfang auch aus der O.D.-Kurve der Elektrophoreseprofile ersichtlich, allerdings wegen der standigen Neusynthese nichtmarkierter ribosomaler RNA nicht so deuLlich wie beim Studium des "Alterns" pulse-markierter RNA. Trotzdem ist erkennbar, daB die 1,1 RNA aus intensiv wachsenden Zellen mit starker RNA-Synthese stabiler ist (z. B. Abb. 2b) als RNA aus Zellen einer stationaren Phase (z. B. 2d). Eine genaue Bestimmung des Zeitpunktes, d. h. des Alters der Ribosomen, an dem die Labilitat der RNA-Molekiile von Anacysti,~ einsetzt, ist jedoch nur schwer moglich. Wie wir bereits in einer vorangegangenen Arbeit mitgeteilt haben (36), bereitf'n chaseVersuche mit Anacystis - zumindest in der ersten chase-Phase - Schwierigkeiten. Damit die Zellen geniigend 32p aufnehmen, miissen sie vor Versuchsbeginn an Phosphat verarmt werden. Sic speichern jedoch dann wahrend des 32P-pulse sehr viel radioaktives Phosphat, das sie noch mehrere Stunden, selbst in einem Nahrmedium hoher 31p_ Konzentrationen, zur RNA-Synthese verwenden. Deshalb ist in der ersten chase-Phase VOll etwa 10 Stun den nicht ohne weiteres zu entscheiden (Abb. 2b, Abb. 4), inwieweit die hitzestabile RNA tatsachlich "alte", also bereits wahrend der pulse-Phase synthetisierte RNA ist, oder aber ob sic erst wahrend der chase-Phase gebildet worden ist. Wie Abb. 3 zeigt, nimmt die Menge an radioaktiv markierter rRNA in der Kultur ebenso wie die spezifische Aktivitat der r RNA in den ersten Stunden unter chaseBedingungen noch sehr stark zu, weil tatsachlich wahrend der chase-Phase zunachst noch radioaktive RNA gebildet wird. In der weiteren chase-Phase nimmt dann jedoch die spezifische Aktivilat der rRNA ab, und zwar sinkt die spezifische Aktivitat der 28*

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413

Hitzelabilitiit der ribosomalen RNA aus Anacystis nidulans

r RNA entsprechend der Zellteilungsrate, wenn man als MaE fUr die Zellteilung die Trockengewichtszunahme (aber auch die Chlorophyll- und RNA-Zunahme) der Kultur zugrunde lfgt. Die Abnahme der spezifischen Aktivitat ist im wesentlichen nur auf eine Vrrdtinnung der radioaktiven rRNA durch neusynthetisierte rRNA zurtickzufUhren, denn die wahrend der ersten Stundcn gebildete radioaktive rRNA-Menge bleibt tiber die ganze Versuchsdauer von 82 Std. nahezu erhalten (Abb. 3). Wahrend dieses Zeitmums findet somit kaum ein Abbau an radioaktiver RNA statt. ~ 18

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Abb. 3. Charakterisierung des Wachstums und des RNA-Stoffwechsels von Anacystis nidulans in einem pulse-chase-Versuch. Die Zellen wurden 60 min mit 32p inkubiert, gewaschen und nach Verdiinnung der Kultur 81 Stun den in einem normalen 31P-haltigen Nahrmedium weiterkultiviert (chase) bei nicht logarithmischem Wachstum. Nach den angegebenen Zeiten wurde das Trockengewicht und die Menge an radioaktiver ribosomaler RNA (d. h. Imp/min in der gesamten rRNA) pro 150 ml Zellsuspension sowie die spezifische Aktivitat der rRNA bestimmt. Die rRNA- Werte wurden durch ~AK-Saulenanalyse der Nucleinsauren gewonnen. 100~--------------------------------~

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Abb. 4. Zunahme der Hitzelabilitat der pulse-markierten 1,1 x 106 r RN A von Anacystis nidulans in einem pulse-chase-Versuch. Versuchsdurchfiihrung wie in Abb. 3. N ach den angegebenen Zeiten wurde der Prozentsatz der bei 60°C zerfallenden radioaktiven 1,1 x 106 rRN A ermittelt. Diese Werte wurden aus den PAA-Gel-Elektrophoresen der erhitzten RNA bestimmt. Die Radioaktivitat in den Zonen 1,1 + 0,9 + 0,2 X 106 ist als 100 % festgelegt. 29

Biochem. Physiol. Pflanzen, Bd. 165

414

R. WOLLGIEHN und D. MUNSCHE

Auch in Bakterien ist eine ahnlich lange Lebensdauer der Ribosomen tiber mehrere Zellgenerationen nachgewiesen worden (6). Diese Versuche zeigen, daB die Hitzelabilitat der 1,1 X 106 RNA zwar vom Alter der RNA-MolekUle abhangt, daB aber andererseits keine direkten Beziehungen zwischen dem Auftreten der BrUche in der Polynucleotidkette und dem Abbau der rRNA in der Zelle bestehen. Der Zeitpunkt des Auftretens von BrUchen in der RNA nach ihrer Synthese hangt auch vom physiologischen Zustand der Kultur, d. h. von der Intensitat des Wachstums und der Teilungsgeschwindigkeit der Zellen abo Die bisher beschriebenen Versuche hatten wir ausschlieBlich mit langsam wachsenden Kulturen durchgeftihrt weil in solchen Zellen der Anteil an hitzelabiler RNA immer relativ hoch ist, d. h. nach 10 Stunden chase zerfallen bereits 50 % der 1,1 x 106 RNA beim Erhitzen (Abb. 2b, Abb. 4). Das Einsetzen der HitzelabiJitat ist jedoch wesentlich verzogert, wenn man die pulse-markierten Zellen wahrend der chase-Phase zu einem intensiven Wachstum mit einer annahernd logarithmischen Wachstumsphase bringt (durch starke VerdUnnung der Suspension), wobei die Generationszeit 4-5 Stunden betragt.

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Abb.5. Hitzelabilitat der ribosomalen RNA von Anacystis nidulans in einem pulse-chase-Versuch bei logarithmischem Wachstum der Kultur. Versuchsdurchfiihrung wie in Abb. 2. Die Zellen wurden aber nach60 min Inkubation mit 32p gewaschen und so stark mit 31P-Nahrlosung verdiinnt, daB die chase-Phase mit einem intensiven logarithmischen Wachstum der Kultur begann. Nach 18 Std. chase wurde die Hitzelabilitat der r RNA (60 °0) durch P AA-Gel-Elektrophorese untersucht.

Hitzelabilitiit der ribosomalen RNA aus Anacystis nidulans

415

Untersucht man die Hitzelabilitat dieser RNA einer 18 Stunden chase-Phase, wobei sich die Zellen etwa 4mal geteilt haben (36), dann erweist sich die radioaktive, wahrend der pulse-Phase synthetisierte RNA als nahezu vollig hitzestabil (Abb. 5). Wahrend der folgenden stationaren Phase stellt sich dann jedoch das normale Gleichgewicht zwischen stabiler und labiler 1,1 x 106 rRNA ein. Das Auftreten von Brlichen in der 1,1 x 106 RNA hat also keine feststehende zeitliche Beziehung zum "Alter" der Ribosomen, sondern es wird auch yom physiologischen Zustand der Zellen bestimmt. Je intensiver die Zellen wachsen, desto langsamer treten die Veranderungen in der Struktur der ribosomalen RNA auf. Als Vergleich zu der Blaualge Anacystis nidulans haben wir die Thermolabilitat der ribosomalen RNA eines anderen Prokaryonten, von Escherichia coli, geprlift, weil die rRNA von E. coli als sehr stabil beschrieben worden ist (5, 29, 30, 32, 35). Diese Befunde konnten mit unseren Methoden bestatigt werden. 1m Gegensatz zur 1,1 x 106 RNA aus Anacystis ist die gesamte ribosomale RNA (Vorstufen-RNA, neusynthetisierte reife rRNA, alte akkumulierte rRNA) beim Erhitzen auf 80°C vollig stabil (Abb. 6). 1,O~--------------~--------------~1,O

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MUNSCHE

Diskussion

Die Befunde an Anacystis nidulans ermoglichen folgende Aussagen: 1. Die Hitzelabilitat der RNA, d. h. das Auftreten eines Bruches in der Polynucleotidkette der 1,lxl06 rRNA, hangt zwar vom Alter der RNA-Molekiile selbst und vom physiologischen Zustand (Wachstumsintensitat) der Zellen ab, sie steht jedoch nicht in unmittelbarer Beziehung zum Abbau der rRNA und der Ribosomen in der Zelle.

2. Es stellt sich ein Gleichgewicht zwischen hitzestabiler und hitzelabiler RNA ein, wobei eine langere Kulturdauer (stationare Phase) etwa 25 % der 1,1 X 106 RNA hitzestabil bleiben. 3. Es bleibt zunachst offen, ob es sich bei der labilen und der stabilen RNA urn unterschiedliche RNA-Typen handelt. Es ist unwahrscheinlich, daB die 1,1xl06 rRNA bei P AA-Gel-Elektrophorese durch einen anderen, nicht ribosomalen und deshalb hitzestabilen RNA-Typ iiberlagert wird. Eine RNA vom Messenger-Typ scheidet aus, sie miiBte in der langen ehase-Periode abgebaut worden sein. Es kann jedoch nieht ausgesehlossen werden, daB in Anacystis untersehiedliehe 70 S-Ribosomen mit untersehiedlieher 1,1 X 106 RNA vorkommen (freie und membrangebundene?), die sieh dureh untersehiedliehe Hitzelabilitat auszeichnen. 4. Uber die Ursaehen der Thermolabilitat der 1,1 X 106 rRNA kann noch keine klare Aussage gemaeht werden. Ribosomale Vorstufen-RNA und neusynthetisierte RNA von Anacystis aber aueh aus anderen Organism en (2, 4, 9, 13-17, 19, 23, 26, 38) sind hitzestabil. Das bedeutet, daB diese RNA aus linear en Ketten von Nueleotiden in eovalenter Bindung und nieht aus Untereinheiten oder Fragmenten (entspreehend den 0,9 und 0,2 X 106 Bruehstiieken) besteht. Bereits diese Tatsache sprieht dagegen, daB die Spaltung der alteren 1,1 x 106 RNA erst wahrend des Erhitzens durch eine exogene Ribonuclease erfolgt. Es ist auBerst unwahrscheinlich, daB innerhalb der gleichen RNA-Praparation selektiv nur die "alte" RNA von der RNase angegriffen wird. Aber auch die Kinetik der Hitzespaltung mit einer kritischen Temperatur von 45-50 °C spricht gegfn einen fllzymatischen ProzeB. Eine Behandlung der RNA-Praparate mit ProteinaseK zum Zerstoren der RNase (39) hat ebenfalls keinen EinfluB auf die Hitzespaltung. Deshalb kann angenommen werden, daB die Briiche ("hidden breaks") in der 1,1 X 106 RNA bereits innerhalb der 50 S-Untereinheit der alteren Ribosomen entstehen, vermutlich durch eine endogene Ribonuclease, die jeweils nur eine einzige Phosphodiesterbindung an einer prii.formierten Position hydrolysiert. Die beiden Fragmente der Mol. Gew. 0,9 und 0,2xl06 werden jedoch durch Wasserstoffbindungen in der Sekundar-Struktur der Molekiile zusammengehalten. Stabilisiert wird der Zusammenhalt durch Mg++, denn bereits bei Mg++-Entzug werden die Fragmente voneinander gelOst. Urn somehr werden sie beim Erhitzen der RNA-aueh in Gegenwart von Mg++- voneinander getrennt, d. h. wenn die gesamte Sekundar- und Tertiarstruktur der Molekiile zerstort wird. Diese Deutung stimmt mit Befullden an schwerer ribosomaler RNA aus

Hitzelabilitat der ribosomalen RNA aus Anacystis nidulans

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mmgen anderen Organismen einschliel3lich einiger Blaualgen tiberein, die ebenfalls beim Erhitzen, bei Behandlung mit Harnstoff oder Dimethylsulfoxyd oder bereits bei Mg++-Entzug zerfallen. Das Zerfallsmuster (Anzahl der Brtiche und Gro13e der Fragmente weist jedoch eine gro13e Vielfalt auf (2, 3, 9, 10, 13, 13a, 16-20, 22, 25, 27, 28, 32). 5. Ob dem Auftreten von "hidden breaks" in der 1,1 x 106 RNA in Abhangigkeit vom Alter der Ribosomen eine regulatorische Bedeutung zukommt, d. h. ob die Brtiche physiologische Konsequenzen fUr die Funktion der Ribosomen haben, bleibt offen, zumal nicht in allen Organismen die schwere rRNA durch das Auftreten von Brtichen und damit durch eine besondere Hitzelabilitat charakterisiert ist. Wir danken Frau SIGRID SCHWARZ fiir die zuverlassige Mitarbeit bei der Durchfiihrung der Versuche.

Anmerkung bei der Korrektur: Die Ergebnisse einer neuen Arbeit von F. W. DOOLITTLE, J. Bacteriol. 113. 1256 (1974), fiihrten im wesentlichen zu den gleichen SchluBfolgerungen iiber die Altersabhangigkeit der Labilitat der 1,1 x 106 r RNA von Anacystis nidulans. Die Arbeit zeigt dariiber hinans, daB das Auftretrn von Briichen in der rRNA in pluse-chase-Versuchen bei Belichtung der Zellen schneller erfolgt als im Dunkeln (siehe auch Literatur 37).

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Anschrift der Verfasser: Dr. habil. R. WOLLGIEHN und Dr. D. MUNSCHE, Institut fiir Biochemie der Pflanzen der Akademie der Wissenschaften der DDR, 401 Halle/Saale, Weinberg.