Hybridation et introgression entre « bonnes espèces ». Le cas de Parnassius apollo et P. phoebus

C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences 323 (2000) 327–337 © 2000 Académie des sciences/Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés S0764446900001293/FLA

Évolution / Evolution

Hybridation et introgression entre « bonnes espèces ». Le cas de Parnassius apollo et P. phoebus Magali Deschamps-Cottina*, Josiane Auberta, Bernard Barascuda, Henri Descimona a

Laboratoire de systématique évolutive, Upres 2202, case 05, université de Provence, 3 place Victor-Hugo, 13331 Marseille cedex 3, France

Reçu le 12 mars 1999 ; accepté le 14 septembre 1999 Présenté par Pierre Buser

Abstract – Hybridization and barriers to introgression between full-fledged species. The case of the butterflies Parnassius apollo and P. phoebus in the Alps. Two butterfly species living in the Alps, Parnassius apollo and P. phoebus, frequently hybridize in certain localities of this region. The features of this phenomenon have been previously studied by biometry and starch gel electrophoresis, but some points remained obscure. We present them in a study combining results from cellulose acetate electrophoresis and wing pattern biometry with a determination of the mitochondrial haplotype by a PCR–RFLP analysis in a sample of butterflies from the southern French Alps. It was already known that the male hybrids are fecund and thus that interspecific gene exchange could take place via backcrosses with the parent species. In the present case, combining the identification of mtDNA with the analysis of nuclear genotypes allows us to demonstrate that hybridization can involve both sexes of both species. Moreover, it suggests that at least some female hybrids are not sterile. The impact of Haldane’s rule is therefore not very strong in the present case. However, although the prerequisites for introgression between the concerned species are fulfilled, at the level of both nuclear and mitochondrial genomes, no indication of such a phenomenon could be gathered in the studied sample. © 2000 Académie des sciences/ Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS Parnassius / hybridization / mitochondrial DNA / biometry / allozymes Résumé – Une première approche de l’hybridation entre Parnassius apollo et P. phoebus, espèces de lépidoptères vivant en sympatrie, avait déjà été réalisée par électrophorèse d’enzymes sur amidon et par biométrie. Nous exposons ici des résultats complémentaires aux précédents, ainsi que d’autres obtenus en observant le polymorphisme de longueur des fragments de restriction d’un segment mitochondrial amplifié par réaction de polymérisation en chaîne. Ces trois méthodes, complémentaires, fournissent des informations sur les échanges géniques qui peuvent avoir lieu à l’occasion d’hybridations entre ces deux espèces. Nous avons pu confirmer l’existence d’hybrides de rang postérieur à la F1. D’une manière plus inédite, les RFLP ont démontré que les deux sexes des deux espèces pouvaient être impliqués et que les femelles hybrides ne sont pas toujours stériles ; la règle de Haldane n’a donc pas un impact très fort dans le cas présent. Cependant, dans aucune des populations étudiées il n’a été possible de mettre en évidence une introgression, ni au niveau du génome nucléaire, ni à celui des mitochondries. © 2000 Académie des sciences/Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS Parnassius / hybridation / ADN mitochondrial / biométrie / allozymes

* Correspondance et tirés à part : [email protected]

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Abridged version The two Papilionid butterflies, Parnassius apollo and P. phoebus, hybridize regularly in some localities of the southern Alps, although they are generally considered as completely separate ‘full species’ and conforming to biological species concept (BSC) criteria: internal coherence (or recognition) and mutual isolation. The study of this phenomenon has been conducted over 25 years using complementary approaches: field observations, breeding, biometry and use of molecular tools. The present paper presents novel insights in its understanding, in particular using the identification of the mother parent by mtDNA RFLPs. A sample of 79 individuals was collected in four localities where hybridization was known to occur and preserved under deep freeze. The following studies were carried out. 1) Biometry: 15 wing pattern and antennae characters, with a more or less diagnostic value, were measured. These characters were used to compute a ‘hybrid index’, which allowed each individual to be assigned to ‘apollo’, ‘hybrid’ or ‘phoebus’ categories. 2) Enzyme electrophoresis: 16 enzyme loci were scored. Two of them proved to be diagnostic; a third one, AK, also yielded differential band patterns, but heterozygotes were not interpretable. The data were studied using factorial correspondence analysis (FCA); in that way, each individual was located on the 1–2 plane of the analysis according to its allele composition. 3) Amplification of a 1 300 bp fragment by PCR. This fragment had been previously sequenced, which revealed some constant sequence differences between the two species; some of them were recognized by Ssp1 restriction enzyme, which yielded different band patterns after polyacrylamide gel electrophoresis. It was therefore possible to ascertain the hybrid character of the studied individuals, their rank (F1 or backcross) and their maternal parent. Five bred F2 hybrids ([female P. apollo × male P. phoebus] male × P. apollo female) were also analysed as a reference. In the collected sample, three well-defined categories of individuals were disclosed by the two kinds of nuclear genome markers (multifactorial wing pattern characters and single Mendelian enzyme loci), corresponding to ‘pure’ individuals of each species and hybrids. FCA projection of the individual enzyme data was particularly eloquent, since the individuals were grouped in well-defined clusters, hybrids being located in an intermediate position. The indications of both kinds of markers were fully congruent. Three hybrid individuals were found. Two males were very likely to be F1 hybrids, but another one, a female, was certainly issued from a backcross. MtDNA analysis allowed us to

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ascertain that one of the hybrids was issued from a P. phoebus mother and two from a P. apollo mother; this demonstrates that hybridization can occur in both directions. Moreover, the combined enzyme and mtDNA data strongly suggest that at least one individual was issued from a female hybrid, a fact in contradiction with previous findings, based on laboratory crosses, stating that hybrid females were sterile. However, it is likely that ‘Haldane’s rule’ acts in these Lepidoptera as in other ones; it is indeed the female sex that is heterogametic in this insect group. In this case, the female hybrids should display low viability and/or fecundity. Under these conditions, it is not surprising that mitochondrial introgression has not been detected in these hybridizing species as in other studied cases (in particular in the allied genus Papilio). It was also impossible to detect any gene flow indication at a nuclear genome level; this fact is less general and may be due to the insufficient sensitivity of the markers used. The present findings both question and reinforce BSC. Indeed, on the one hand, they reveal the existence of hybridization between taxa usually considered as full species, with hybrids being neither completely sterile nor unfit. On the other hand, they underline the low impact of this phenomenon on the genetic structure of the implied species. They also provide support for and illustrate Mallet’s definition of species as a ‘genotype cluster’, by the clear grouping of the members of a species on the individual enzyme genotype FCA 1–2 plane. On the whole, the present work provides more support for the ‘recognition’ (or, better, ‘genetic cohesion’) side of BSC than for the ‘isolation’ side. Indeed, the ‘isolation mechanisms’ or ‘barriers’ appear to work rather poorly in the two ‘good’ species considered. Introgression is hindered simply because intraspecific genic coadaptation is so tight that different genes coming from a different species work poorly in a foreign context. In most parts of the habitats where both species live in close proximity – that is the whole subalpine zone of the Alps – hybridization is prevented by very relevant differences in habitat choice and phenology. In some places, the flight period of P. phoebus is delayed, which leads it to fly at the same time as P. apollo, so that hybridization is allowed to take place. In this case, at each generation, a ‘hybrid load’, associated with selection against hybrids, is to be withstood by the populations; in one case, there is a presumption that the extinction of a P. apollo colony could be due to such a perturbation. If selection appears to be able to reject the genes of a species from the gene pool of the other one, it seems to be unable to eliminate the tendencies towards illegitimate pairings which weights down the global viability of the two species.

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1. Introduction Le concept de l’espèce le plus utilisé à l’heure actuelle reste le concept biologique établi par Mayr [1] ; l’espèce y étant définie comme « un ensemble d’individus susceptibles d’avoir des descendants féconds et séparé d’entités semblables par des barrières ». Cette définition comporte en fait deux volets : d’une part, les échanges géniques doivent s’exercer librement à l’intérieur d’une espèce, réellement ou potentiellement ; d’autre part, ces échanges devraient être nuls entre espèces différentes. Elle implique donc deux concepts : respectivement, la « reconnaissance » (« cohésion » nous semblerait préférable) et l’« isolement » [1, 2]. C’est effectivement ce qui est usuellement observé pour les « bonnes espèces ». Mais il existe une grande variété de situations intermédiaires et bien plus intéressantes pour l’étude de l’évolution, où des échanges géniques limités [3, 4] sont observés entre les entités concernées. Un cas fréquent et très étudié [5] est celui des « zones hybrides ». Des entités taxinomiques nettement différenciées génétiquement et occupant des aires géographiques habituellement distinctes y entrent en contact. Elles y échangent des gènes avec une certaine intensité, mais à un niveau inférieur à celui impliqué par la panmixie. Par ailleurs, des espèces sympatriques peuvent former localement des « essaims hybrides » [6] ; dans les populations concernées, des échanges notables s’effectuent entre leurs « pools » géniques. L’étendue, la signification et les conséquences de cette introgression, les mécanismes qui la limitent, restent mal évalués, en particulier chez les animaux. Dans la pratique, depuis l’avènement de la « nouvelle systématique » [7], l’étude des rapports entre les taxa du groupe espèce a utilisé d’une manière croissante les concepts issus de la génétique. Buffon, le premier, a utilisé les critères de fécondité et de stérilité, mais ce n’est que depuis la mise au point des approches moléculaires de la variation génétique, que des informations sûres et abondantes permettent d’évaluer les échanges géniques entre les entités taxinomiques. Les lépidoptères, bien étudiés taxinomiquement, fournissent un contingent important de « mauvaises » espèces, qui s’avèrent être un bon matériel pour l’étude de l’évolution et de la spéciation [8]. Des travaux récents sur les Heliconius ont permis d’évaluer les forces agissant sur l’intensité des échanges à travers une zone hybride [9]. Chez les Papilio d’Amérique du Nord, des « essaims hybrides » ont été mis en évidence [6] ; dans le même genre, il a été possible de montrer que les deux « bonnes » espèces Papilio machaon et P. hospiton, qui cohabitent en Corse, s’hybrident fréquemment et que l’introgression de gènes nucléaires y est probable [10]. Mais une particularité importante des lépidoptères est que le sexe hétérogamétique est représenté par la femelle, et c’est ce sexe précisément qui, selon la « règle de Haldane » [11], est le plus frappé par les phénomènes d’incompatibilités en cas d’hybridation. Les mitochondries étant transmises par voie matrilinéaire, cette règle permet de prévoir que l’introgres-

sion mitochondriale sera inexistante ou réduite, ce qui a été vérifié, en particulier chez les Papilio [10, 12]. Chez les Papilionidés du genre Parnassius, les hybrides interspécifiques sont fréquents [13]. Des études portant sur la biométrie [14] et l’électrophorèse des enzymes [15] ont montré que deux espèces du genre, usuellement considérées comme de « bonnes espèces », P. apollo L. et P. phoebus Fabr., qui cohabitent dans les Alpes, s’hybrident régulièrement dans certaines localités. Ces publications établissaient clairement que les hybrides mâles (au moins) ne sont pas stériles et que des hybrides de rang supérieur à la F1 peuvent être rencontrés dans la nature. Néanmoins, elles présentent des lacunes importantes ; en particulier, les données biométriques et électrophorétiques n’ont pas été associées et corrélées, et les croisements en laboratoire n’ont pas mis en jeu toutes les combinaisons de parents possibles. Le présent travail tente donc d’aller plus loin dans la compréhension du phénomène en présentant une approche intégrée combinant les marqueurs phénotypiques, allozymiques et mitochondriaux ; l’avènement de méthodes simples ayant permis d’utiliser l’ADN mitochondrial comme caractère diagnostique, particulièrement intéressant pour sa transmission matrilinéaire.

2. Matériel et méthodes Aperçu de la biologie et de l’écologie des deux espèces et de leurs hybrides : Ces deux lépidoptères sont associés aux milieux montagnards. Ils sont fortement liés à leur biotope et s’y maintiennent fidèlement, leur choix de l’habitat étant toujours très précis. Les Parnassius sont monophages ou oligophages, avec une grande capacité d’adaptation suivant les stations. En Europe, la distribution de Parnassius phoebus est limitée à l’arc alpin. Il se rencontre de 1 400 mètres à 2 800 mètres, sur les bords des torrents, les pentes humides et graveleuses où pousse sa plante nourricière, un saxifrage, Saxifraga aizoïdes. Cependant, un taxon isolé du Mercantour, P. phoebus gazeli Praviel, est rigoureusement inféodé à une crassulacée, Sedum roseum, qui vit aussi au bord des torrents. Parnassius apollo est connu dans tous les massifs montagneux français. On peut le rencontrer de 600 à 2 400 m d’altitude. Cette espèce affectionne les pentes sèches et rocailleuses ou les plateaux calcaires sur lesquels le taux de recouvrement végétal est faible. Les chenilles sont oligophages, elles consomment de nombreuses espèces de Crassulacées, des genres Sedum et Sempervivum. Bien que fréquente et ayant lieu dans de nombreuses localités des Alpes [13, 14], l’hybridation entre ces deux espèces ne s’observe que sur des sites précis, et dans ce cas elle a souvent lieu avec régularité au cours des années. En règle générale, les deux espèces voisinent, mais elles ne volent pas ensemble car leurs lieux de vol ne sont que contigus et leurs périodes d’apparition sont décalées,

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Tableau I. Matériel congelé : provenance et quantité.

Provenance

n

G - Crévoux A - Ravin des Roches noires B - Les Ayes D - Abries en Viso Hybrides d’élevage* Total

50 4 6 14 5 79

* Les hybrides d’élevage correspondent à des rétrocroisements (« apollo »× « phoebus ») × « apollo », ils seront par la suite numérotés 75, 76, 77, 78, 79.

P. phoebus étant plus précoce de 15 j. On constate l’apparition d’hybrides uniquement dans les endroits où cette séparation spatio-temporelle est perturbée [14], généralement vers 1 800-2 400 m d’altitude, sur des éboulis d’anciennes moraines dont la pente est souvent importante et généralement exposée au sud, avec des coulées humides et de petits couloirs. On retrouve toujours dans ce type de station l’intrication de deux biotopes bien caractéristiques : un biotope humide pour P. phoebus et un biotope sec et relativement chaud pour P. apollo, qui permettent aux chenilles des deux espèces de croître et de se métamorphoser côte à côte et aux imagos d’éclore presque simultanément. Lors d’années très enneigées, par exemple, l’accumulation de la neige dans les dépressions formées par les torrents peut entraîner des retards dans l’éclosion des P. phoebus, alors que les zones bien exposées où sont localisés les P. apollo sont libérées plus tôt de la neige. De telles conditions peuvent favoriser la rencontre des deux espèces et donc l’hybridation. Ce décalage de la période de vol et la protandrie notoire chez ces deux espèces favorisent l’orientation de l’hybridation : mâle « apollo » × femelle « phoebus ».

3. Matériel Au total, 79 individus (majoritairement des mâles) ont été récoltés dans les Alpes du Sud au cours des années 1994 à 1996, rapidement congelés dans de l’azote liquide après capture, puis conservés à –80 °C jusqu’à leur analyse (tableau I). À titre de témoins, cinq individus parmi ces 79 sont issus de deux croisements délibérés et successifs (une F1 mère « apollo » × père « phoebus », puis un rétrocroisement avec une mère « apollo »). Par ailleurs, des individus secs, dont certains avaient déjà été analysés dans les travaux précédents, ont été inclus dans les données biométriques à titre de référence. En revanche, même si l’amplification par PCR, d’ADN de papillons conservés secs s’avère possible, l’irrégularité des résultats ne permet pas d’effectuer des manipulations en série et nous avons dû nous abstenir de les mettre en jeu pour l’identification de l’ADNmt.

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4. Méthodes 4.1. Morphologie antennaire et biométrie sur le graphisme alaire

Nous souhaitions discriminer les deux espèces ainsi que leurs hybrides par une approche morphologique, selon la méthode déjà employée par Descimon et al. [14]. Le caractère n° 15 (envergure totale) a été remplacé par la mesure du rayon de l’aile antérieure, le corps ayant été prélevé pour les électrophorèses. Ce caractère a été divisé en trois classes, de la même façon que le paramètre auquel nous l’avons substitué. Le tableau II résume les différents caractères discriminants retenus évalués. Nous avons utilisé les mêmes paramètres pour les mâles et les femelles, ce qui a engendré certains problèmes dont nous discuterons lors de l’analyse des résultats. 4.2. Analyses moléculaires 4.2.1. PCR et digestion enzymatique par Ssp I

Les acides nucléiques totaux ont été extraits suivant la méthode de Sambrook [16] après homogénéisation dans un tampon (0,1 M Tris pH8, 10 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0,1 % SDS, 50 mM dTT) et digestion par de la protéinase K. Une ou deux pattes de chaque individu ont suffi. Le séquençage d’un fragment de 1 300 paires de bases (pb) de l’ADN mitochondrial de ces deux espèces avait déjà été effectué par J. Aubert lors d’une étude préliminaire, ainsi que la recherche et la détermination d’endonucléases de restriction diagnostiques. L’analyse de ces séquences par le logiciel DNA-Strider [17] avait montré un nombre restreint de sites dont certains étaient spécifiques. L’emplacement de ces sites a restreint le fragment utile à une longueur de 849 pb correspondant à l’extrémité 3’ terminale du gène LSU (petite sous unité ribosomale, 16 S) et aux 618 premières paires de bases de la région codante ND1 (NADH-dehydrogenase subunit I). Ce fragment présente l’avantage de fournir deux patternes de restriction spécifiques aisément identifiables sur gel de polyacrylamide, quand il est digéré par l’endonucléase de restriction SspI (AAT/ATT, New England Biolabs). Cette enzyme coupe l’ADN au niveau de la séquence palindromique AAT/ATT. Plusieurs séquences de chaque espèce ont été testées pour s’assurer de la nature non aléatoire des variations sur ce site de restriction. La figure 1 représente les patterns de restriction respectifs de P. phoebus et P. apollo. Les amorces 5’CTGTTCGACCATTAAAATCTTAC3’ et 5’ATCAAAAGGAGCTCGATTAGTTTC3’ (Aubert et al., 1997) ont été utilisées pour amplifier par PCR [18], le fragment d’ADN mitochondrial de 849 pb. Les cycles d’amplification étaient les suivants : un cycle (2 min à 92 °C) ; cinq cycles (15 s à 92 °C, 45 s à 45 °C, 2 min 30 s à 62 °C avec une montée en température ralentie : «ramping») ; 35 cycles identiques mais sans « ramping » et avec un « annealing » à 52 °C ; un cycle (7 min à 62 °C).

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Tableau II. Caractères discriminants entre P. apollo et P. phoebus (d’après Descimon et al., 1989, modifié).

Caractères 1. Antennes Ailes antérieures 2. Bande hyaline marginale 3. Bande antémarginale noire 4. Taches subcostales 5. Tache en 1b 6. Tache intracellulaire 7. Semis basilaire Ailes postérieures 8. Bande hyaline marginale 9. Bande antémarginale en chevrons 10. Ocelles antérieurs (elliptique) 11. Ocelles postérieurs 12. Taches anales 13. Semis basilaire 14. Couleur du fond 15. Taille (rayon de l’aile antérieure)

État « apollo » (+1)*

État « neutre » (0)*

État « phoebus » (–1)*

unicolores grises ou faiblement annelées chez un individu ménalisant

cf. « phoebus »

nettement annelées de noir et de blanc

se termine en 1b continue jusqu’en 2 ou 1

se termine en 2 intermédiaire (quelques écailles en 2) cf. « apollos » petite faiblement séparée de Cu

n’atteint pas 2 plus ou moins discontinue

noires grosse bombée distalement touche la nervure cubitale (Cu) présent entre anale 1b et bord dorsal souvent jusqu’en 1b

intermédiaire

centrées et piquetées de rouge nulle ou vestigiale rectiligne distalement nettement séparée de Cu cantonné près du corps

présente présente

vestigiale vestigiale

nulle nulle

grands axes convergeant en arrière pupillés de blanc présentes en crochet, entourant la cellule, le long de la discocellulaire blanc vitreux (écailles non jointives) supérieure ou égale à 36 mm

grands axes parallèles

grands axes convergeant en avant non pupillés de blanc absentes en pointe, s’arrêtant au bord distal de la cellule

pupille blanche vestigiale vestigiales intermédiaire blanc mat (écailles jointives) comprise entre 35 et 33 mm inclus

crème ou jaunâtre mat (écailles jointives) inférieure ou égale à 32 mm

* Codage.

Figure 1. Patternes de restriction de P. phoebus et P. apollo après amplification par PCR d’un fragment mitochondrial de 849 pb et digestion par l’endonucléase de restriction SspI. La taille des fragments est donnée en paires de bases.

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4.2.2. Polymorphisme enzymatique

L’approche par les marqueurs enzymatiques [15] avait pour but de déterminer s’il existait des loci diagnostiques des deux espèces ; auquel cas un état hétérozygote sur les loci diagnostiques mettrait automatiquement en évidence les hybrides, ainsi que leur niveau d’hybridation (individus F1, F2, etc.). Le thorax et une partie de l’abdomen de chaque individu ont été homogénéisés dans un volume de la solution d’extraction suivante : Sucrose 15 % W/V, Tris-HCl buffer 50 mM pH7, Bromophenol blue 10,6 g (W/V). Les molécules ont ensuite été séparées par électrophorèse sur plaques d’acétate de cellulose (Helena), au lieu de l’amidon utilisé comme support dans les études précédentes, et révélées selon les méthodes de Richardson [19] adaptées de Wynne [20]. Parmi les seize systèmes enzymatiques testés lors des expérimentations, nous en avons retenu onze : phosphogluco-isomérase (Pgi, EC 5.3.1.9), adénylate kinase (Ak, EC 2.7.4.3) (2 loci), glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6pdh, EC 1.1.1.49), 6-phosphogluconate déshydrogénase (6Pgd, EC 1.1.1.44), phosphoglucomutase (Pgm, EC 2.7.5.1), glycérol-3-phosphate déshydrogénase (αGpdh, EC 1.1.1.8), β-hydroxybutyrate déshydrogénase (Hbdh, EC 1.1.1.30), mannose-phosphate-isomérase (Mpi, EC 5.3.1.8), aspartate aminotransférase (Aat, 2.6.1.1) (2 loci). Deux tampons différents ont été utilisés : le TrisCitrate pH 6 (100 mM Tris, 34,5 mM Aide Citrique) pour 6Pgd et Ak et le Tris-Glycine pH 8,5 (25 mM Tris, 192 mM Glycine) pour Pgi, Aat, G6pdh, Hbdh, αGpdh, Pgm, Mpi.

5. Résultats 5.1. Observations de terrain

Quatre des six localités précédemment décrites [14, 15] et dont nous conserverons la désignation ont été revisitées durant la période 1990–1999. La localité A (environs du Lautaret, Nord-Briançonnais), où l’hybridation était le plus régulièrement observée, a vu la colonie de P. apollo s’éteindre dans les années 1980, dans des conditions qui seront commentées plus loin. La localité F (vallée du Boréon, Mercantour) n’a été visitée que dans des conditions météorologiques et phénologiques défavorables. Les localités C (haute vallée de la Cerveyrette, SudBriançonnais) et D (Abriès, Queyras) ont été suivies très régulièrement mais en vain. La localité B (vallée des Ayes, Sud-Briançonnais) n’a livré que trois hybrides potentiels en trois ans. Deux nouveaux sites d’hybridation ont été découverts, toujours dans les Alpes du Sud. Le premier (G, en amont de Crévoux, Embrunais, Hautes-Alpes) a été trouvé par R. Descimon en 1993, puis a ensuite été suivi par les auteurs. Il s’agit d’une pente exposée au sud, entre 1 700 et 2 200 m d’altitude, où des couloirs parcourus par un torrent sont fréquentés par P. phoebus et les pentes par une colonie étendue mais peu

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dense de P. apollo. À l’intrication des habitats s’ajoute le retard occasionnel apporté par les coulées d’avalanche. Un hybride a été observé par R. Descimon en 1993, puis un autre par H. Descimon en 1996. Sur le second (H, aux environs du col Agnel, Queyras, Hautes-Alpes) deux individus mâles ont été trouvés le 25 juillet 1995 par X. Mérit (comm. pers.). Le premier, d’indice hybride –4, présente une tendance « phoebus » marquée ; le second, dont l’indice est de –2, est plus franchement intermédiaire. Située à une altitude d’environ 2 400 m, cette station présente, elle aussi, une intrication des territoires de vol des deux espèces, avec des coulées neigeuses pouvant occasionnellement recouvrir les biotopes des chenilles de P. phoebus. 5.2. Analyses en laboratoire 5.2.1. Biométrie

Le tableau III résume les résultats de la biométrie. Le total des cotes attribuées à chaque paramètre donne un nombre compris entre (–15) et (+15). Nous proposons une identification de l’espèce à partir de cet indice ; s’il est inférieur à (–3) l’individu est considéré comme un « phoebus », si l’indice est supérieur à (+3) comme un « apollo », et s’il est compris entre (–3) et (+3) il est considéré comme un « hybride ». Six individus (1, 18, 75, 77, 78, 79) sont identifiés comme hybrides par cette approche. L’identification morphologique intuitive (symbolisée par le nom de l’espèce en caractères ordinaires) des mâles est confirmée dans tous les cas par l’analyse biométrique. Par contre, le cas des femelles est différent. En effet, cet indice a été conçu à l’origine pour analyser des mâles exclusivement et comporte donc certains biais lors de son application à des individus femelles. On remarque que les femelles « apollo » sont identifiées en tant que telles, alors que les femelles « phoebus » ont tendance à être confondues avec des femelles « apollo » (principalement à cause de leur plus grande taille et de leur mélanisme plus important que leurs mâles). C’est le cas pour les femelles 65, 83, 84, 87. 5.2.2. ADN mitochondrial

Les résultats de l’identification de l’ADN mitochondrial (ADNmt) pour chaque individu sont résumés dans le tableau III. Les femelles « phoebus » identifiées comme étant « apollo » par la biométrie ont bien un ADNmt « phoebus ». Parmi les six hybrides détectés par la biométrie, deux ont un ADNmt de type « phoebus » et deux de type « apollo ». Les deux autres restent à identifier. 5.2.3. Polymorphisme enzymatique

Nous ne fournissons pas ici de tableau de fréquences alléliques, car les échantillons récoltés dans la plupart des localités sont trop peu nombreux ; de même, le calcul du déséquilibre de liaison entre les allèles des différents loci n’a pas pu être pratiqué de manière significative. Nous nous sommes limités à une étude des génotypes indivi-

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Tableau III. Identification des individus par les caractères biométriques et par l’ADNmt, A (P. apollo), P (P. phoebus), H (hybride).

Localité Individu 1 G G G G G G G G G G G G G G G G G G A A A A G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G Hybrides d’élevage

B B B B B D D

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Total

Sexe

1 –1 –1 1 1 1 1 1 1 1

–1 –1 –1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 –1 –1 –1 –1 –1 1 –1 1 1 1 1 1 1 0 1 –1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 –1 1 0

1 –1 –1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 –1 –1 –1 –1 0 1 –1 1 1 1 1 1 –1 1 1 –1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

–1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 –1 –1 –1 –1 –1 1 –1 0 1 1 0 1 –1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1

1 –1 –1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 –1 –1 0 –1 0 1 –1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1

0 –1 –1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 –1 0 0 –1 –1 –1 –1 –1 –1 1 –1 1 1 0 0 0 –1 1 1 –1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1

0 –1 –1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 –1 –1 –1 –1 –1 0 –1 1 0 0 0 0 –1 1 1 –1 0 –1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0

–1 –1 0 0 0 1 –1 1 –1 –1 –1 1 0 –1 0 –1 0 –1 –1 0 0 –1 –1 0 0 –1 0 0 –1 1 –1 1 –1 –1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 –1 –1 0 –1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0

1 0 –1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 –1 0 –1 –1 0 0 0 1 1 1 1 1 –1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 –1 –1 0 –1 1 0 1 1 1 1 1 –1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 –1

1 0 –1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 –1 –1 –1 –1 –1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 –1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 –1

0 0 –1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 –1 0 0 –1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 –1

3 –8 –10 10 10 12 12 11 9 10 8 13 13 9 7 10 13 0 –12 –9 –11 –12 –8 9 –9 12 13 12 8 13 –8 12 12 –8 8 9 12 10 12 11 13 13 12 13 14 9 9 12 11 6 10 3

F M M M M M M M M M M F M M M M M M M M M M M M M M M M M M M M F M M M M M M M M M M M M M M M M F M F

H P P A A A A A A A A A A A A A A H P P P P P A P A A A A A P A A P A A A A A A A A A A A A A A A A A H

1 1 1 1 –1 1 1 –1 –1 1 1

1 1 1 1 0 –1 1 1 1 1 1

1 1 0 0 –1 –1 1 –1 0 1 1

1 0 0 0 0 –1 1 1 1 1 1

1 0 0 –1 –1 –1 1 0 1 1 0

0 0 –1 –1 –1 –1 0 1 1 0 0

–1 –1 –1 –1 0 –1 0 –1 –1 –1 0

1 –1 1 1 0 0 1 0 0 1 0

1 0 1 –1 1 –1 1 1 1 1 1

–1 0 –1 0 0 –1 1 0 1 1 1

0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1

1 –1 1 0 –1 –1 1 0 1 1 0

8 2 2 –2 –7 –11 12 4 8 11 10

F M M M M M M F F M M

A H H H P P A A A A A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 75

–1 –1 –1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 –1 –1 –1 –1 –1 –1 1 –1 1 1 1 1 1 –1 0 1 –1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 –1 –1 0

1 1 1 0 1 1 0 –1 0 –1 –1 0 1 –1 1 1 1 1 1 0 1 1 –1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 –1 –1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 –1 –1 –1 –1 0 1 –1 1 1 1 1 1 –1 1 1 –1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86

0 0 0 –1 –1 –1 0 1 1 0 1

1 1 0 0 –1 –1 1 1 1 1 1

1 1 0 0 –1 –1 1 1 1 1 1

Identification Identification intuitive ADNmt P P P A A A A A A A A A A A A A P P P P P P A P A A A A A A

A A A A A A A A A A A A A A A P A A A A

P P P P A A

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Tableau III. (Suite).

Localité Individu 1 D D D D D D D D D D D D D G G G B

86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 C

1 –1 –1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Total

Sexe

1 1 0 –1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1

1 1 –1 –1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 –1 –1 –1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 0 –1 –1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1

1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0

0 1 –1 –1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1

0 1 –1 –1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0

0 –1 –1 –1 1 0 0 0 0 1 –1 0 0 0 0 0 0

0 0 –1 –1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1

1 1 –1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 –1 –1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1

0 0 –1 –1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1

10 4 –11 –10 14 12 10 10 12 13 10 11 11 13 12 14 11

M F F M M M M M M M M M M F F F M

duels par l’analyse factorielle des correspondances (AFC), méthode qui a prouvé son efficacité dans une étude précédente [10]. Elle permet de synthétiser et de visualiser l’ensemble des résultats d’électrophorèse (figure 2), La matrice de données est constituée par les individus en lignes, et les allèles de chaque système enzymatique en colonnes (la fréquence d’un allèle est de 1 pour un homozygote, 0.5 pour un hétérozygote et de 0 pour l’absence de

Identification Identification intuitive ADNmt A A P P A A A A A A A A A A A A A

A P P

A A A A A A A A

cet allèle). Parmi les quatre loci diagnostiques cités par Descimon et al. [15] sur amidon (G6PDH, 6PGD, AK et IDH), seuls trois le demeurent dans les conditions de l’analyse sur acétate de cellulose (tableau IV) le locus AK présentant des anomalies sur lesquelles nous reviendrons plus loin. Les individus ayant révélé des indices d’hybridation en biométrie et en ADNmt ont été confirmés par les résultats

Figure 2. Plan 1-2 de l’analyse factorielle des correspondances sur les fréquences alléliques individuelles (set de données complet, 42 % de l’inertie totale).

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Tableau IV. Nombre d’allèles par locus et identification des loci diagnostiques.

PGI Nombre 5 d’allèles Diagnostique

AK

G6PDH

6PGD

PGM

α GPDH

HBDH

MPI

AAT2

Total

2

2

2

3

2

3

3

5

27

oui*

oui

oui

3

* Aucun hétérozygote n’a été révélé pour le locus AK, mais ceci n’est peut être pas du au fait qu’il n’y en a pas, mais plutôt à des problèmes pour les mettre en évidence lors de la révélation.

des électrophorèses de protéines. À l’aide des loci diagnostiques, l’individu « C » a également été révélé comme étant un « hybride ». L’AFC a été établie à partir de l’ensemble des données d’électrophorèses obtenues au cours de cette étude. Pour une compréhension plus aisée nous n’avons figuré sur le plan 1-2 (seul fourni ici) que les individus. Signalons que les allèles qui contribuent le plus à l’axe 1 (représentant un tiers de l’information globale du nuage) sont les deux loci dialléliques et diagnostiques (G6PDH et 6PGD, contribution : 0,23 et 0,22 respectivement) dont les résultats sont clairs, mais aussi deux des allèles du locus triallélique, non diagnostique HBDH (contribution : 0,19). Il est fréquent qu’un locus non diagnostique soit néanmoins bien discriminant [10]. Les individus clairement assignés par les caractères alaires à une des deux espèces sont regroupés également en deux nuages bien définis par les données enzymatiques. En revanche les hybrides se positionnent entre les deux nuages. Il en est de même avec les hybrides d’élevage (F2), qui se situent néanmoins plus près du nuage « apollo ». On notera la position de l’individu C que ses caractères alaires avaient inclus dans le groupe « apollo ». Une autre AFC a été pratiquée en enlevant les deux loci diagnostiques. Nous n’en fournissons pas de diagramme : les résultats sont similaires à ceux de l’analyse précédente.

6. Discussion et conclusion Parmi les 79 individus analysés, 73 peuvent être affectés sans discordance à une des deux espèces : les caractères du graphisme alaire, les loci enzymatiques et les séquences de l’ADNmt sont dans ce cas en parfaite coïncidence. Il est remarquable que, par ailleurs, l’AFC pratiquée, après retrait des deux loci diagnostiques, sur les génotypes enzymatiques affecte tous les individus en concordance avec les autres critères. Empiriquement, il semble évident que ce fait est déterminé par l’association gamétique (déséquilibre de liaison). Comme dans le cas de P. machaon et P. hospiton, où des faits similaires ont été observés [10] cette association génotypique appuie la définition de l’espèce comme une « faisceau de génotypes » (genotype cluster), proposée par Mallet [21]. Parmi les huit hybrides analysés, les cinq témoins issus d’élevage, étant de mère « apollo », présentent, comme attendu, l’ADNmt de cette espèce. Les résultats des élec-

trophorèses aux loci diagnostiques montrent, pour les loci G6PDH et 6PGD, soit des génotypes hétérozygotes, soit des génotypes homozygotes « apollo », ce qui signifie que les loci concernés ne sont pas liés au sexe. Au locus AK, ne sont observés que des génotypes homozygotes « apollo »; on peut admettre que ce résultat est dû au hasard, mais d’extrême justesse (la probabilité d’un tel événement étant de 0,05 dans le cas présent). Sur le plan 1-2 de l’AFC, ces individus sont proches du nuage « apollo » mais décalés, ce qui est conforme à leur composition génotypique attendue. L’indice morphométrique tiré des caractères externes les situe aussi comme hybrides. Le problème posé par l’individu n° 76 est particulier : non seulement il comporte trois quarts de gènes « apollo » mais en plus il s’agit d’une femelle. Nous avons remarqué que l’espèce est difficile à identifier par l’habitus alaire chez les individus de ce sexe, et il n’y a rien d’étonnant à ce que les caractères « phoebus » soient passés inaperçus. Si un tel individu avait été rencontré dans la nature, son caractère hybride n’aurait pas été détecté. Le cas s’est déjà présenté dans un travail précédent [15] pour un individu mâle, identifié comme « apollo » mais présentant un allèle « phoebus » à un de ses loci. Trois individus pris dans la nature, désignés sous les codes 1, 18 et C, révèlent des caractères hybrides. « 1 » et « 18 » sont classés comme hybrides par l’analyse des loci enzymatiques et des caractères de l’habitus ; leur ADNmt est de type « phoebus ». L’individu « 18 » est hétérozygote aux deux loci diagnostiques G6PDH et 6PGD mais l’individu « 1 », une femelle, est homozygote « phoebus » à ces mêmes loci. L’individu « C », nettement « apollo » par son graphisme alaire et possédant l’ADNmt de cette espèce, est classé comme « hybride » par ses enzymes ; il est hétérozygote au locus G6PDH et homozygote « phoebus » au locus 6PGD. Si on ne tient compte que de ces données, « 18 » serait vraisemblablement le résultat d’une F1 de mère « phoebus » ; « 1 » résulterait du croisement d’une F1 du même type avec un mâle « phoebus » ou « hybride ». « C » n’est pas non plus un hybride de première génération ; sa grand-mère était » apollo » et il faut admettre que de toutes façons sa mère était « hybride » et son père « phoebus », voire hybride. Les trois individus présentent une patterne de bandes « apollo » au locus AK. La prise en compte de cette donnée forcerait à considérer que les trois individus résultent de croisements entre hybrides. Vu ce qui a déjà été noté pour les hybrides témoins, il nous apparaît plus raisonnable d’envisager soit une particularité dans

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l’expression des allèles à ce locus, soit un artefact de révélation, rendant ce caractère diagnostique inutilisable chez les hybrides. Malgré le petit nombre d’hybrides naturels analysés ici, il est donc possible de confirmer des présomptions énoncées dans les précédents travaux [14, 15] et d’affiner sensiblement l’analyse des phénomènes d’hybridation entre les deux espèces. Ces derniers ont lieu dans les deux sens et peuvent se poursuivre au-delà de la F1. Contrairement à ce qui avait été précédemment supposé, d’après des résultats d’élevage mettant en jeu uniquement le croisement P. apollo femelle × P. phoebus mâle, les femelles hybrides ne sont pas forcément stériles ; ce qui permet de comprendre les données d’Eisner [22], qui citait l’obtention d’hybrides F2 (F1 × F1). Par ailleurs, l’hypothèse selon laquelle la phénologie favoriserait le croisement femelle phoebus × mâle apollo n’est pas complètement confirmée. Les nouveaux sites d’hybridation découverts confirment pleinement les hypothèses des travaux précédents : il s’agit de localités où les territoires de vol sont intriqués et où les phénologies, normalement distinctes, peuvent se chevaucher ; l’hybridation se répète régulièrement là où ce chevauchement est fréquent (sites où l’accumulation de névés retarde l’éclosion de P. phoebus). Il est apparu que les méthodes morphométriques permettent de déceler des hybrides F1 avec sûreté mais que des hybrides de rang ultérieur (comme l’individu n° 76) peuvent ne pas être reconnus. Dans un survol sur le terrain sans prélèvement (cas fréquent avec ces espèces protégées), de tels individus peuvent échapper aux recherches. Pour résumer, nous avons pu confirmer l’existence d’hybrides de rang postérieur à la F1. D’une manière plus inédite, les RFLP ont démontré que les deux sexes des deux espèces pouvaient être impliqués et que les femelles hybrides ne sont pas toujours stériles ; la règle de Haldane n’a donc pas un impact très fort dans le cas présent qui ne fournit pas de support factuel à cette règle ; en effet, il apparaît que la stérilité des femelles, précédemment généralisée à partir de données d’élevage partielles, n’est à tout le moins pas totale. D’autre part, les anomalies de régulation de la diapause, dont il a été montré qu’elles constituent un facteur majeur d’inviabilité chez les femelles hybrides de Papilio [11], ne sont pas présentes chez les Parnassius. Il semble donc que les conditions soient réunies pour qu’il y ait introgression au niveau des gènes nucléaires, mais également au niveau des gènes mitochondriaux. Cependant, l’analyse d’un nombre déjà relativement important d’individus n’a révélé que deux catégories : ou bien des hybrides parfaitement détectables, ou bien des représentants des deux espèces que tous les marqueurs à notre disposition assignent de manière cohérente à l’une d’entre elles. Même si l’hybridation peut aller au-delà de la F1, il n’y a aucune gradation entre les deux espèces et pas d’« essaim hybride ». Dans aucune des populations étudiées il n’a été possible de mettre en évidence une introgression, ni au niveau du génome nucléaire, ni à celui des mitochondries. Il s’agit donc

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d’une situation parallèle à celle qui avait déjà été mise en lumière dans le couple P. machaon – P. hospiton [10]. Il est vraisemblable que des forces sélectives importantes agissent contre l’introgression, ainsi qu’il a été démontré dans des zones hybrides chez d’autres Lépidoptères [9, 23, 24]. Dans les génomes des deux espèces, il y a probablement un nombre suffisant d’allèles incompatibles pour que, par liaison chromosomique ou association gamétique, la barrière soit très efficace. Cependant, comme dans le cas des Papilio précités, l’asymétrie des distributions, dans le cas présent, ne permet pas d’écarter totalement la possibilité d’un échange, parvenu à l’heure actuelle à l’équilibre – ce qui pouvait « passer » étant « passé ». En effet, dans les deux cas, une des deux espèces, de distribution restreinte, vit en totale cohabitation avec l’autre (hospiton dans le cas des Papilio et phoebus dans celui des Parnassius) ; on ne peut donc pas comparer des populations en cohabitation, susceptibles d’introgression, et des populations isolées servant de témoins. Cela est en revanche possible chez l’espèce à large distribution (P. machaon et P. apollo). Dans le cas des Papilio, une indication assez forte en faveur du passage d’un allèle d’hospiton à machaon avait été recueillie ; cela n’a pas été le cas chez les Parnassius. Cependant, les techniques utilisées ici sont encore trop grossières pour détecter des échanges limités et le séquençage d’une partie significative du génome nucléaire permettrait une analyse bien plus fine. Le débat entre ceux qui, à l’intérieur du « concept biologique de l’espèce », privilégient la cohésion interne et ceux qui insistent sur l’isolement trouve encore des échos récents [21, 25]. Les faits exposés ici appuieraient plutôt le concept de la cohésion : chez P. apollo et P. phoebus, comme chez P. machaon et P. hospiton, les espèces apparaissent avant tout comme des unités génétiquement cohérentes ; le rejet des gènes introduits dans le pool génétique de l’autre ne serait qu’un sous-produit de l’extrême précision des coadaptations. Le renforcement des barrières précopulatoires par la sélection contre les hybrides [25], s’il existe, n’est en tout cas pas arrivé à son terme. Le « fardeau d’hybridation » résiduel qui découle de l’imperfection de l’isolement génétique peut-il avoir des conséquences au niveau des populations ? À ce point de vue, l’extinction de la colonie de P. apollo dans le site d’hybridation majeur, étudié depuis 1971 [14], est troublante. En effet, une analyse du polymorphisme enzymatique (Braconnot, comm. pers., 1997), effectuée juste avant la disparition, y avait révélé des anomalies génétiques importantes ; en particulier, un fort déséquilibre d’association gamétique, sans équivalent dans d’autres populations, avait été observé entre plusieurs loci. Il n’était pas associé à des allèles caractéristiques de P. phoebus, mais il faut garder présent à l’esprit que les marqueurs enzymatiques sont des outils peu sensibles, comme noté plus haut. Les deux espèces concernées, ainsi que P. hospiton, sont menacées dans certaines de leurs localités ; P. apollo et P. hospiton sont d’ailleurs inclus dans l’annexe 2 de la

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Convention de Washington. Que l’hybridation puisse jouer un rôle, parmi d’autres facteurs, dans l’extinction serait évidemment préoccupant.

Remerciements : Le présent travail a été effectué dans le cadre de programmes de recherches financés par le ministère de l’Aménagement du Territoire et de l’Environnement, l’Opie (95/138) et le Bureau des

recherches génétiques (DGAD/SRAE/97117). Les autorisations de prélèvement d’individus d’espèces protégées ont été accordées par le ministère précité. Nous remercions les entomologistes amateurs qui ont bien voulu nous communiquer leurs données, en particulier R. Descimon et X. Mérit. Nous remercions également M. Zimmermann et J.-F. Martin pour avoir relu les premières versions de ce manuscrit.

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