Immunoelektrophoretische untersuchungen auf acetatfolien

CLINICA CHIMICA ACTA

IMMUNOELEKTROPHORETISCHE

2%

UNTERSUCHUNGEN

AUF

ACETAT-

FOLIEN

SUMMARY

Immnzlnoelectro~horetic Separation of Proteins Using Cellulose Acetate Strips Based on the findings of Kahn, a method is described in detail for the immunoelectrophoretic analysis of proteins on cellulose acetate strips. The usefulness of the method is shown by working with normal and pathological sera. With commercial anti-human sera, up to 20 precipitation lines could be obtained. This technique permits also the demonstration of serum lipoproteins using specific anti-lipoprotein sera. Immunoelectrophoresis on cellulose acetate strips permits the direct association of subfractions with the classic main fractions, as obtained with paper electrophoresis. The use of acetate strips for immunoelectrophoresis has certain advantages over the agar technique. The strips are always ready for use, the precipitation lines are distinct and very clear and, finally, the preparations may be kept for documentary evidence.

In der vorliegenden Arbeit wird in Anle~~nung an die Angaben von Kohnil-l” iiber Erfahrungen mit Z~llulo~e-Acetat-Folien fiir inlmunoelektrophoretische Analyjen berichtet. Wahrend Kohn mit der englischen Oxofolie (Hersteller: Fa. Courtaulds Ltd., London) arbeitete11y12.14, verwendeten wir die in Deutschland hergestellMembranfiltergesellschaft Gettingen und Fa. C. ten Membranfolien (Hersteller: Schleicher u. Schtill, Dassel) und entwickelten eine fur Membranfolien als Tragermaterial geeignete Arbeitstechnik, die sowohl fiir in~munoelektrophoretische Untersuchungen normaler und pathologischer Seren als such fur die Darsteliung der Serum-Lipoproteide unter Verwendung monospczifischer Anti-Lipoproteid-Seren brauchbar ist. METHODIK

I. Priiparation der Folien Grundsatzlich sollten Membranfolien wahrend des Arbeitsvorganges nie mit den Fingern beriihrt werden! Man setzt der Pufferlijsung (Veronal-Acetat-Puffer, * Ehem.

Direktor:

Prof. Dr. N. Henning. C&-z. Chim.

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pH 8.6, Verdiinnung I:I) unmittelbar vor dem Anfeuchten der Folien (Format 3g x 155 mm) als Konservierungsmittel einige Tropfen o.4%iges Merfen (Phenylhydrarg. boric.) zu. Darauf fasst man die Folie mittels zweier Deckglaspinzetten an ihren beiden Enden und legt sie flach auf die Pufferlosung. Durch kapillaren Sog wird die Folie von unten benetzt. Nach vollstandiger Durchtrankung wird der Streifen mit einer Pinzette eingetaucht. Anschliessend wird die Folie herausgenommen, auf eine Glasplatte gelegt und unter Abrollen eines mit Filtrierpapier bespannten Loxhers von iiberfhissiger Feuchtigkeit befreit. Es ist besonders darauf zu achten, dass eine optimalc Feuchtigkeit resultiert, die nur dtxrch Erfahrung richtig eingeschatzt werden kann. Zu starkes Trocknen ist zu vermeiden. 2. Auftragen

des Semmm Zum Auftragen des Serums wurde ein Stempel konstruiert, der aus einem Btigel mit zwei parallel verbundenen Drahten besteht und durch einen Federmechanismus in einem Kunststoffrahmen bewegt werden kann. Die Lange der beiden Drahte betrlgt IO mm, ihr gegenseitiger Abstand I mm. Diese Grossen hatten sich bei Voruntersuchungen als zweckmassig erwiesen. Die Auftragestelle fur das Serum wird in 3.5 cm Abstand vom Folienrand mit einem Kugelschreiber markiert. Gleichzeitig erfolgt die Kennzeichnung der Folie unter Angabe der notwendigen Daten (Name des Patienten, aufgetragene Serummenge, Datum usw.). Die markierte Startlinie sollte eine LHnge von IO mm aufweisen und beidseitig je 5-8 mm vom aufgelegten Antiserumstreifen entfernt sein (Fig. I). Die mit einer Pipette abgemessene Ser~mmenge

5-8 rnm

I tl

4mm

Fig. I. Model1 einer beschickten

J Membranfolie.

von 4.x0-~ bis 6.1o-~ ml wird auf den Auftragestempel gebracht, so dass sich das Serum als diinner Film zwischen den parallel verlaufenden Metalldr~hten ausspannt. Durch leichten Stempeldruck wird das Serum am Markierungsstrich aufgetragen. Spannen der Folien Nach dem Auftragen des Serums werden die Folien mit Deckglaspinzetten auf Immunobrticken (Hersteller: Fa. Bender & Hobein, Mtinchen) gelegt und an beiden Enden mit puffergetrankten (Veronal-Acetat-Puffer, pH 8.6, Verdtinnung I : I) Filtrierpapierkontakten versehen. Die Filtrierpapierverbindungen werden nun so fest an die Aussenseiten der Streifenhalter gepresst, bis eine optimale Folienspannung erreicht ist. 3.

4. ~Lekt~opho~et~sGhe Trennmg Die Trennung des Serums wird bei Zimmertemperatur durchgeftihrt. Nach Einsetzen der Folientrager in die Immunokammer erfolgt die elektrophoretische Auftrennung. Die besten Ergebnisse wurden unter folgenden Trennbedingungen erzielt :

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~MMUNOEI.E~TROPHORE~E

AUFACETATFOLIEN

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Trennzeit: 2 Std. 20 min, Gleichspannung: 200 V, Stromstarke : 7-g mA, Ionenstarke : 0.05. Gleiche Ergebnisse konnten mit einer Gleichspannung Trennzeit von 2 Std. 45 min erreicht werden.

vou r8o V und einer

5. Immwzodiffusion Nacb beendeter Elektrophorese werden zwei Filtrierpapierstreifen {Whatman No. I) mit Anti-Serum (Behringwerke) beschickt und beidseitig parallel zur Laufstrecke der g&en&en Serumfraktionen aufgetegt. Fur die gew~hnlic~~~ll fmmunoefektrophoresen ist ein Streifenformat von 4 mm x 85 mm, fiir die Darstellung einzelner Li~~dfraktionen Streifenformate von 4 mm x 6o mm am besten geeignet. Vergleichende Untersuchungen ergaben, dass fiir die aufgetragenen Serummengen von 4 - IO-~ his 6. IO@ ml Antiseren in einer Menge von 4. IO-~ bis 6’ IO-" ml zur optimalen PrPzipitationsbildung erforderlich sind. Das Verhaltnis von Serum zu Antiserum betrggt demnach I : IO. Das Antiserum in einer 17erdtinnung 7: z o&r 7 :3 liefert gleichwertige Resultate. Die mit Antiserum getrankten Filtrierpapierstreifen mtissen mit zwei Pinzetten vorsichtig auf die Folienrander gelegt werden. Anschliessend wird der Folientr@er in eine feuchte Kammer gestellt. Es ist sorgfaltig darauf zu achten, dass alle Streifen vor dem Diffusionsprozess nochmals nachgespannt werden und die Immunobriicke waagerecht in der Kammer steht. Selbst eine minimate Abweichung von der Horizontallage ffihrt zu Artefakten und ungenauen Ergebnissen. Deshalb sollte die Lage der Immunobrticke stets mit der Wasserwaage geprtift werden, Die Diffusion erfolgt bei ~immertem~eratur. Temperatursch~~ankungen sind in jedem Falle zu vermeiden. Die optimale Diffusionszeit liegt zwischen 40 und 48 Stunden. 6. Wiissewt und Trocknen der Folielz Nach beendeter Immunodiffusion werden die Streifen der feuchten Kammer entnommen und in mehreren BZdern physiologischer Kochsalzli%ung von tiberschiissigem Eiweiss befreit. Das Wassern sollte xo bis 15 min unter leichtem Win- und Herbewegen der Folien durchgefiihrt werden. Anschliessend kommen die Streifen auf einen Metalltrockenstander, der sich fur jedes Streifenformat beliebig verstellen lasst. Die Folien werden im Trockenschrank bei rooO 7 min lang getrocknet.

Die getrockneten Streifen lasst man Aach auf das Farbebad (Amidoschwarz IO B) fallen Erst nach vijlliger Benetzung taucht man sie unter. Eine Farbedauer von 5 ibis ro min ist ausreichend. Darauf werden die Folien in Methanoi-Eisessig unter mehrmaligem Baderwechsel etwa rg min lang entfarbt.

der Folien Nach dem Entfarben werden die Folien mit Hilfe einer Gummirolle blasenfrei auf Glasplstten aufgezogen. Dabei miissen die Streifen unbedingt feucht bleiben. Nun wird die Glasplatte schrgg unter dem Abzug aufgestellt und mit Eisessig bis zur Durchsichtigkeit bespriiht. Dazu benutzt man ein Reagenzglas oder eine Glasfiasche mit Zerst&uber und angeschlossenem GebEise. Anschliessend werden die Folien erneut bei IOO' innerhalb von 15 bis 20 min getrocknet, 8. Transparentmachen

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ERGEBNISSE

Mit der beschriebenen Technik wurden immunoelektrophoretische Analysen normaler und pathologischer Seren auf Membranfolien unter Verwendung von AntiHumanseren vorgenommen. Ferner wurde die Brauchbarkeit der Methode fiir die Darstellung der Serum-Lipoproteide unter Verwendung spezifischer Anti-lipoproteidSeren gepriift. I. Ilnmunoelektro~horetische

An.alysen

no~~k~le~ und ~atholo~~sckey

SereFz

Das kasuistische Material umfasste 40 Falle, an denen insgesamt rund 500 Einzeluntersucllungen ausgef~hrt wurden. Darin enthalten sind Einzelversuche zur Feststellung giinstiger Auftrage- und Trennbcdingungen, zur Priifung der geeigneten Pufferverdtinnung, zur Testung der optimalen Serum- und Antikorpermengen, der erforderlichen Diffusionszeit sowie der Weiterbehandlung nach erfolgter Prazipitatbildung mit nachfolgender Farbung. Bei den immunoelektrophoretischen Analysen normaler und pathologischer Seren konnten unter genauer Einhaltung der genannten Technik und der Verwendung von IEP-Anti-Humanserum vom Pferd (Hersteller Hyland Laboratories, Los Angeles) bis zu 20 Prazipitationslinien dargestellt werden. Als Beispiele fiir die Qualitlt der durchgefiihrten analysen seien nachfolgende Resultate angeftihrt (Fig. z bis Fig. 4).

+ Anti-HS Fig. 2. ltnmunoelektrophorese eines Normalserums. Folienformat: 39x 155 mm; Veronalpuffer: pH 8.6, IoncnsCrke 0.05 ; Verdiinnung I : I ; Strum : 5. IO+ ml; IEP-Anti-Humanserum : 5. IO-~ml (Vcrd. 7: 2) ; Trcnnzcit: 160 min; Gleichspannung: LOOV; Diffusionszeit: 48 Std. 2.

Die

folien

immunoelektrophoretische Darstellung der Serum-Lipoproteide u&er Yerwe&mg monospeziJisch,er Anti-Lipo+oteid-Seren

auf Membran-

In der vorliegenden Arbeit wird erstmals der Nachweis von Serum-Lipoproteiden auf ~embranfolien mittels immunologischer Technik beschrieben. Auf der einen Seite der Folie wird das normale f~ntigenverteilungsmuster des untersuchten Serums unter Ver~endung eines Anti-~umanserums dargestellt, auf der Gegenseite jeweils tin Lipoproteid unter Verwendung des spezifischen Antiserums gezeigt. Auf Clin.

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Fig. 3. “J-Myclom (Pat. Ze., 70 J.). Das y-Myelom stellt sich durch die aussen liegende Myelomfraktion bei Spaltung der y-SS Linie dar. Folienformat: 39 x 155 mm; Veronalpuffer: pH 8.6, Ionenstgrke 0.05, Verdiinnung I : I ; Serum : 5. IO-~ ml; lEP-Anti-Humanserum : 5. IO-~ ml (unverdiinnt); Trennzeit: 150 min; Gleichspannung: zoo V; Diffusionszeit: 45 Std.

Fig. 4. y-Mpelom (Pat. Mii.). Die aussen liegende y-Myelomfraktion 12sst eine geringe Wanderungsgeschwindigkcit als das y-Normalglobulin erkennen. Folienformat : 39 x 155 mm; Veronalpuffer: pH 8.6, Ionenstsrke 0.05, Verdiinnung I : I ; Serum: 5.10-3 ml; IEP-.lnti-Humanserum: 5’ IO-~ ml (unverdtinnt) ; Trcnnzeit : 160 min; Gleichspannung: zoo T.‘; Diffusionszeit: 46 Std.

diese Weise ist eine exakte Zuordnung der einzelnen Lipoproteidfraktionen in die entsprechenden Proteinbereiche moglich. Unter Verwendung eines Anti-cl,-Lipoproteidserums (Hersteller Behringwerke) erhalt man eine flach verlaufende Prazipitationslinie, die im Albuminbereich beginnt und sich bis hin zur cr,-Globulin-Fraktion erstreckt. Die a,-Linien farben sich bei Normalseren infolge des geringen Eiweissanteils der cr,-Lipoproteide nur sehr schwach an. Dagegen konnte bei essentieller Hyperlipamie eine starker angefarbte Prazipitationslinie beobachtet werden. In Fig. ga ist dieser Befund dargestellt. Es wird hier deutlich, dass sich ein Anteil der a,-Lipoproteide im Albuminbereich befindet und deshalb such die gleiche Wanderungsgeschwindigkeit wie das Albumin besitzen muss. In der Fortsetzung dieses Hauptanteils erstreckt sich eine weitere, von der ersteren deutlich abgesetzte Komponente infolge geringerer W’anderungsgeschwindigkeit bis in Clin. Chim.

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+,5-tipoproteid

Fig. 5a~c. Folienformat: 39 x ‘55 mm; Veronalpuffer: pH 8.6, Ionenst2irke 0.05, \‘crdtinnung I : I ; 5.10-3 ml; IlZP-Anti-HS: ~.Io-* ml (Verd. 7:3); Anti-LPS: 4’ IO-~ ml (unvcrdlinnt); Trennzeit: 160 min; Gleichspannung: zoo V; Diffusionszeit: 48 Std.

Strum:

Fig. 5a. Essentielle Hypcrlip%mie (Pat. Fei.). Oben: die mit Hilfe eines lEP-Anti-Humanscrums erhaltcne Pr%zipitatbildung. Cnten: die mitt& eincs i\nti-a,-1,lpoproteidscrums (sichc untcr Mcthodik) dargestellte cr,-Lipoproteid-Fraktion.

+ i

+Anti+-CPS c+Lipoproteid Fig. 5b. Normalserum. Obcn: die mit Hilfe tines lEP-Anti-HS erhaltenc PKzipitatbildung. 1Jnten : die mittels eines Anti-cc,-Lipoprotcidserums (in Methodik) dargestelltc a,-LipoproteidFraktion.

. - ,, “(I- -. Anti-HS

+

.,

1 “:

:

Anti+LE

@:Lipopro+eid

Fig. 5~. Normalserum. Oben: die mit Hilfe eines IEP-Anti-HS erhaltene Prkzipitatbildung. Unten: die mittels eines Anti-B-Lipoproteidserums (in Methodik) dargestelltc B-LipoproteidFraktion, medial davon das schwach angefgrbte ar,-Lipoproteid. Clin. Chim. Acta,

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den a,-Bereich. Aufgrund dieser immunologischen Befunde kann die Existenz zweier a,-Fraktionen best3igt werden**s. Die unterschiedliche Lage der a,B-Fraktion (Fig. 5”) im Vergleich znr Agartechnik ist auf die unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften der beiden Tragermedien zuriickzufiihren. Das cc,-Lipoproteid stellt sich unter Anwendung eines Anti-a,-Lipoproteidserums als bogige Prazipitationslinie im Bereich der a,-$-Globuline dar (Fig. sb). Das p-Lipoproteid laisst sich unter Anwendung eines Anti-fl-Lipoproteidserums ebenfalls im Bereich der a,,6-Globulinfraktion nachweisen (Fig. 5~). Dieser Befund spricht daft&, dass die Proteinanteile beider Lipoproteidfraktionen immunologisch verwandt sind. Die Prazipitationslinie der ~-LipoI)roteidfraktion ist in der Regel weniger gekrtimmt und etwas Ianger gestreckt als die der a~-Lipoproteidfraktion (Fig. SC). DISKUSSION

Die vorliegenden Resultate beweisen, dass Membranfolien unter Anwendung der beschriebenen Arbeitstechnik fur Immunoelektrophoresen gee&net sind. Dass die Anwendung von Acetatfolien noch keine allgemeine geworden ist, diirfte in erster Linie auf den vermeintlich hohen Kostenaufwand und auf Schwierigkeiten der Anwendungstechnik zuriickzufiihren sein. Schwierigkeiten der Anwendung werden durch eine geeignete Methodik und sorgfaltiges Arbeiten schnell iiberwunden. Der Kostenaufwand kann durch Verwendung von Kleinformaten erheblich reduziert werden. Entscheidend fur die Einf~hrung der Folien in die Routinediagnostik sollten vielmehr ihre Vorteile gegeniiber anderen Tragermedien sein. Die im Schrifttum veroffentlichten Immunoelektrophoresen auf Acetatfolien lassen gelegentlich Diffusionsartefakte und vereinzelt Mikroorganismen erkennen. Diese Fehler kiinnen nur durch geniigende Sorgfalt in der Arbeitstechnik vermieden werden. Zur Verhinderung des Bakterienwachstums sollte stets ein Konservierungsmittel hinzugesetzt werden. Ausser Merfen kiinnen such Lijsungen von Merthiolat oder Thymol Verwendung finden. Kohn berichtet, dass es zweckmassig sei, die Folien mit einer etwa 20% hijheren Pufferkonzentration zu tr&nken als der zur Elektrophorese benutzten14. Dem Vorschlag wurde durch vergleichende Untersuchungen Rechnung getragen. Dabei zeigte sich, dass die Anf~uchtung der Membranfolien bei hijherer Pufferkonzentration keine wesentlichen Vorteile bringt. Wichtig ist dagegen, dass die Pufferliisung nach fiinf Elektrophoresen erneuert wird, urn die Qualitat der Trennungen nicht zu beeintrachtigen. Von den englischen Fabrikaten ist bekannt, dass sie gelegentlich Wijlbungen durch Hochstehen ihrer Langskanten aufweisen. Dieses Phanomen wurde bei Membranfolien nicht beobachtet. Nach der tiblichen Trennung wurde das Antiserum mittels Filtrierpapierstreifen aufgetragen. Kohn verwendet dazu eine feine Kapillare, die entlang eines Lineals geftihrt wirdl*. Die angegebene Technik mit serumgetrankten Filtrierpapierstreifen erbrachte gleichwertige Ergebnisse. Ausserdem ist sie leichter ausfiihrbar. Die ~embranfolien wurden nach Auftragen des Anti-Serums in feuchte KamC&n. Chim.

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mern gebracht. Consden und Kohn bevorzugen das Einlegen der Folien in Paraffinols, da es nach ihrer Meinung in einer feuchten Atmosphare nicht moglich sei, eine ungleiche Verdunstung von der Membranoberflache zu vermeiden. Diesem Einwand muss entgegengehalten werden, dass bei konstantem Feuchtigkeitsgehalt iiber 950/b keine Artefakte oder verzerrte Linien zu beobachten sind. Allerdings muss eingeschrankt werden, dass dazu eine Feuchtigkeitskontrolle mit dem Hygrometer und ein absolut luftdichter Abschluss der Kammer und konstante Umgebungstemperatur erforderlich sind. Die durchgeftihrten Untersuchungen lassen nicht darauf schliessen, dass die Kohn’sche Technik gegeniiber der in der vorliegenden Arbeit beschriebenen besondere Vorziige garantiert. Die in den Abbildungen gezeigten Befunde sind jederzeit reproduzierbar. StidhofZ1 teilte mit, dass die Darstellung der Prazipitationslinien auf Membranfolien vor allem die Proteine des c(~-, ,& und y-Bereiches betreffe, und die schneller wandernden Prot,eine nur in unvollkommenem Ausmass dargestellt werden. Dagegen beweisen die gezeigten Befunde eindeutig, dass unter optimalen Trennbedingungen such die Prazipitationslinien im a,-Bereich nachweisbar sind. Immunoelektrophoresen werden derzeit im Agar ausgeftihrt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Membranfolien als Tragermedium dem Agargel ebenbiirtig, in einigen Punkten sogar tiberlegen sind. Die Vorteile gegentiber der gebrauchlichen Agarmethode sind nach Kohn11p12 und eigenen Erfahrungen folgende : Membranfolien sind stets gebrauchsfertig, griissere Scharfe der Prazipitationslinien, die Praparate kiinnen fur Dokumentationszwecke besser aufbewahrt werden als getrocknete Agarstreifen. Einziger Nachteil der Membranfolien ist die Tatsache, dass die Bildung der Prazipitationslinien wahrend des Diffusionsvorganges nicht beobachtet werden kann. Die Acetatfolie liefert ein Fraktionierungsergebnis, wie es such mit Papierstreifen erhalten wird. Damit ist ein direkter Vergleich der mit den beiden Tragermedien gewonnenen Resultate moglich. Demgegentiber crhalt man bei der Trennung im Agar ein zwar ahnliches, in einigen Punkten aber doch von der genannten Technik abweichendes Fraktionierungsresultat. Agar bewirkt infolge seines grossen Molekulargewichtes und seiner physikalisch-chemischen Eigenschaften einen relativ grossen elektroosmotischen Effekt mit einer kathodischen Wanderung des y-Globulins, was bei der Acetatfolie nicht der Fall ist. Ferner werden manche Proteinkomponenten in ihrer Wanderungsgeschwindigkeit durch die Agareigenschaften so beeinflusst, dass sie eine andere Position als bei der Trennung auf Papier oder Acetatfolien aufweisen. Das gilt besonders fur die Lipoproteide. Die Immunoelektrophorese auf Acetatfolien schaltet diese Faktoren aus. Die Beurteilung immunoelektrophoretischer Analysen auf Acetatfolien darf sich nicht auf Vergleiche mit der Agartechnik sttitzen. Vielmehr mtissen normale Antigenverteilungsmuster auf Folien zur kritischen Interpretation der pathologischen Befunde herangezogen werden. ZLJSAMMENFASSUNG

In Anlehnung an die Angaben immunoelektrophoretischen Analyse ,Clin. Chim.

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von Kohn wird eine detaillierte von Proteinen auf Acetatfolien

Methodik zur beschrieben.

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Die Brauchbarkeit der Methode wird am Beispiel normaler und pathologischer Seren demonstriert. Mit den handelsiiblichen Anti-Humanseren liessen sich bis zu 20 Prszipitationslinien nachweisen. Unter Verwendung spezifischer Anti-Lipoproteid Seren konnten such die SerumLipoproteide mit dieser Technik dargestellt werden. Die Immunoelektrophorese auf Acetatfolien erlaubt eine direkte Zuordnung von Unterfraktionen zu den klassischen Hauptfraktionen, wie sie mit der Papierelektrophorese erzielt werden. Die Verwendung von Acetatfolien fiir die Immunoelektrophorese bietet gegeniiber der Agarmethode gewisse Vorteile. Die Folien sind stets gebrauchsfertig, die PGzipitationslinien zeichnen sich durch eine ausserordentlithe Schsrfe aus und die Prgparate kijnnen fiir Dokumentationszwecke aufbewahrt werden. LITERATUR I 2 3 4 5 6

9 IO

I2 13 14

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