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Immunofluorescence directe en dermatologie : principales indications
Dossier scientifique Immunofluorescence directe en dermatologie : principales indications Sébastien Menzinger, Annonciade Frassati-Biaggi, Sylvie Fraitag, Stéphanie Leclerc-Mercier Service d’Anatomie et Cytologie Pathologiques, Hôpital Necker-Enfants Malades,149 rue de Sèvres, 75015 Paris, France.
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*Auteur correspondant : [email protected] (S. Menzinger).
RÉSUMÉ MOTS CLÉS dermatologie dermatoses bulleuses auto-immunes ◗ immunofluorescence directe ◗ lupus ◗ vascularite ◗ ◗
KEY WORDS autoimmune blistering diseases ◗ dermatology ◗ direct immunofluorescence microscopy ◗ lupus ◗ vasculitis ◗
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Le pathologiste doit se familiariser avec les principaux aspects de l’immunofluorescence directe en dermatologie, poser au mieux les indications de celle-ci, et apprendre à éviter les pièges potentiels. L’immunofluorescence directe est une technique de microscopie permettant la détection d’immunoglobulines/complexes immuns et de fractions du complément (IgG, IgA, IgM et C3) dans les tissus en utilisant des anticorps spécifiques conjugués à de la fluorescéine et un microscope à fluorescence. Elle est indispensable en dermatopathologie pour le diagnostic des maladies bulleuses auto-immunes, telles que la pemphigoïde bulleuse, le pemphigus, la dermatite herpétiforme, et peut se révéler utile également dans d’autres indications, telles que le lupus et les vascularites.
ABSTRACT Direct immunofluorescence microscopy in Dermatology: main indications The main aspects of direct immunofluorescence testing in dermatology, its indications, and potential pitfalls should be taken into account by the pathologist. Direct immunofluorescence microscopy is a technique that allows the detection of immunoglobulins/immune complexes and complement fractions (IgG, IgA, IgM and C3) in tissues, using specific fluorescein-conjugated antibodies and a fluorescence microscope. This technique is essential in dermato-pathology for the diagnosis of autoimmune blistering diseases, such as bullous pemphigoid, pemphigus, dermatitis herpetiformis, and may also be useful in other indications, such as lupus and vasculitis.
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Dossier scientifique Anatomie et cytologie pathologiques Introduction L’immunofluorescence directe (IFD) est une technique de microscopie permettant la détection d’immunoglobulines/complexes immuns et de fractions du complément dans les tissus en utilisant des anticorps spécifiques conjugués à de la fluorescéine et un microscope à fluorescence. Cette technique, découverte au milieu du XXe siècle, a encore toute sa place en dermatologie dans le diagnostic de certaines dermatoses auto-immunes, et ce malgré l’utilisation de nouvelles techniques de détection d’auto-anticorps (ELISA, Immunoblot…). Une biopsie doit être pratiquée en peau péri-lésionnelle dans le cas des dermatoses bulleuses auto-immunes, ou en pleine lésion pour les autres indications. Il est important qu’il n’y ait pas eu de traitement topique préalable, en particulier de dermocorticoïdes, et de le signaler sur le bon de demande si c’est le cas. Le prélèvement sera ensuite transporté au laboratoire soit frais dans une compresse imbibée de sérum physiologique, soit en Milieu de Michel. Ce dernier existe dans des flacons prêts à l’emploi et peut être obtenu auprès de certains fabricants, ou il peut être préparé directement au laboratoire (tableau 1). Il doit impérativement être stocké à +4 °C et sa date de péremption doit être soigneusement notée car il se périme au bout de trois mois. Il permet l’acheminement des prélèvements à température ambiante dans de très
Tableau 2. Indications de l’immunofluorescence directe en dermatologie. IFD à visée diagnostique Dermatoses bulleuses auto-immunes Groupe des Pemphigoïdes Pemphigoïde bulleuse Pemphigoïde des muqueuses/cicatricielle Pemphigoïde gestationnelle Pemphigoïde anti-p200/laminin-␥1 Lichen Plan Pemphigoïde Epidermolyse bulleuse acquise Dermatoses bulleuses avec dépôts majoritaires d’IgA Dermatose bulleuse à IgA linéaire Dermatite Herpétiforme
Tableau 1. Préparation du liquide de Michel.
Groupe des Pemphigus
1. Tampon de base
Pemphigus vulgaire (dont pemphigus végétant) Pemphigus foliacé (dont pemphigus érythémateux et fogo selvagem) Pemphigus herpétiforme Pemphigus paranéoplasique Pemphigus médicamenteux Pemphigus à IgA
Phosphate de potassium Peser 19,95g Diluer dans 87,5mL d’eau distillée Acide citrique Peser 6,625g Diluer dans 12,5mL d’eau distillée Mélanger les deux solutions (100ml en tout) Vérifier le pH (doit être à 7)
IFD avec valeur diagnostique
2. Tampon citrate Maléïmide
Vascularites
Sulfate de magnésium Peser 0,616g Diluer dans 25mL d’eau distillée N’Ethylmaléïmide Peser 0,3125g Diluer dans 25mL d’eau distillée Mélanger 12,5mL de tampon de base avec les 25mL de sulfate de magnésium et les 25mL de N’Ethylmaléïmide Rajouter de l’eau distillée pour obtenir 500ml en tout Ajuster le pH final à 7 (si < à 7 avec KOH à 0,1 mole ; si > à 7 avec acide citrique) 3. Milieu de transport final
Vascularite à IgA Vascularite leucocytoclasique d’autre origine Vascularite cryoglobulinémique (Moins d’intérêt : vascularites à ANCA) Connectivites Lupus (Moins d’intérêt : Dermatomyosite, MCTD, sclérodermie) Autres pathologies avec profil IFD particulier
Peser 275g de sulfate d’ammonium Les diluer dans les 500mL de tampon citrate Maléïmide du paragraphe 2 Conservation 3 mois au réfrigérateur
bonnes conditions de conservation (plusieurs jours). À l’arrivée au laboratoire, le prélèvement est rincé et congelé puis coupé au cryostat. Les sections sont incubées avec des anticorps anti-immunoglobuline G, A, M et parfois E, et la fraction C3 du complément (d’autres fractions peuvent parfois être utilisées), couplés à de la fluorescéine. Classiquement, l’intensité de la fluorescence doit être évaluée, et notée soit comme faible (+), modérée (++), intense (+++). Dans cet article, les indications de l’immunofluorescence directe en dermatologie seront discutées, et les aspects les plus classiques seront présentés. Le tableau 2 résume ces indications.
Lichen plan Porphyrie cutanée tardive Pseudoporphyrie Bullosis diabeticorum
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Figure 1. Pemphigoïde bulleuse.
A) Manifestations cliniques : macules et plaques érythémateuses avec bulles tendues à contenu séreux, érosions et croûtes postbulleuses, chez un adulte.
Dermatoses bulleuses auto-immunes Les dermatoses bulleuses représentent l’indication la plus importante de l’IFD.
Groupe des pemphigoïdes Les pemphigoïdes sont des maladies auto-immunes dont les antigènes se situent à la jonction dermo-épidermique (JDE), classiquement au niveau des hémi-desmosomes. La forme la plus fréquente est la pemphigoïde bulleuse. Les antigènes principaux sont des protéines structurelles appelées BP180 (ou BPAG2, COLXVII) et BP230 (BPAG1). L’IFD est le test diagnostique le plus sensible, positif dans la grande majorité des cas. La biopsie doit porter en zone érythémateuse péri-bulleuse [1]. Elle montre classiquement des dépôts linéaires fins et continus d’IgG, de C3, et plus rarement d’IgA et d’IgM, à la JDE (figure 1). Dans le cas de la pemphigoïde gestationnelle, on retrouve le plus souvent des dépôts de C3 et rarement d’IgG. La pemphigoïde des muqueuses/ cicatricielle peut avoir d’autres antigènes cibles (laminine 332 ; intégrine ␣64) mais aura le même aspect que la pemphigoïde bulleuse à l’étude en IFD. Elle a plus de chances d’être positive si le prélèvement est fait sur une muqueuse que sur la peau [2,3]. Il arrive que les auto-anticorps soient à la limite du seuil de détection. Une méthode encore plus sensible que l’IFD existe, il s’agit de l’immuno-microscopie électronique. Cependant cette technique est plus complexe à organiser, coûteuse, chronophage, et seulement de rares centres peuvent la pratiquer [4]. Une difficulté majeure dans ce groupe sera de différencier une pemphigoïde d’une épidermolyse bul-
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B) IFD : dépôts linéaires fins et continus d’IgG à la jonction dermo-épidermique
leuse acquise (EBA), qui peut avoir, quoique rarement, la même présentation clinique et histologique, et montrer le plus souvent le même aspect en IFD. Des auteurs ont montré qu’il était malgré tout possible de les différencier. En effet, lorsque les dépôts sont examinés à fort grandissement, il existe souvent, en plus de l’aspect linéaire, un aspect en dent de scie (serrated). Il est en forme de « n » dans le cas des pemphigoïdes et de la dermatose à IgA linéaire, dont les antigènes se situent au-dessus de la lamina densa, et en forme de « u » dans l’EBA et le Lupus bulleux, dont l’antigène cible est le collagène VII, qui se situe sous la lamina densa. Cette approche est fiable et reproductible, mais nécessite des objectifs spéciaux à fort grandissement [5,6]. Un autre moyen de les différencier est de pratiquer l’IFD en peau clivée, permettant ainsi de mieux localiser les dépôts. Il faut incuber la peau dans une solution de chlorure de sodium, permettant la séparation de l’épiderme et du derme. Le clivage se situe dans la partie basse de la lamina lucida. Les dépôts seront donc “au toit” de la bulle ou versant épidermique, dans le cas de la pemphigoïde bulleuse, pemphigoïde gestationnelle, pemphigoïde cicatricielle, en dehors des formes dirigées contre la laminine 332, et Dermatose à IgA linéaire (DIGAL) ; « au plancher » de la bulle ou versant dermique, dans le cas de l’EBA, du Lupus bulleux, de la pemphigoïde anti-laminine-␥1, la pemphigoïde cicatricielle anti-laminine 332 et de rares cas de DIGAL [3].
Épidermolyse bulleuse acquise L’EBA est une dermatose auto-immune de présentation clinique hétérogène caractérisée par des auto-anticorps dirigés contre le collagène VII. On retrouve à l’IFD des dépôts d’IgG, de C3 et plus rarement d’IgA à la JDE. Comme cité précédemment (cf. pemphigoïdes), l’aspect
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Figure 2. Dermatose à IgA linéaire.
au fort grandissement en dent de scie en « u » permet de différencier l’EBA des autres maladies du groupe des pemphigoïdes [7,8], l’autre possibilité étant d’effectuer l’IFD en peau clivée, où les dépôts se situeront au plancher de la bulle (sous la lamina densa).
B) IFD : dépôts linéaires fins et continus d’IgA à la jonction dermo-épidermique
Figure 3. Dermatite herpétiforme.
Dermatoses bulleuses avec dépôts majoritaires d’IgA Dermatose à IgA linéaire (DIGAL) Cette dermatose est caractérisée en IFD par des dépôts linéaires d’IgA le long de la JDE (figure 2). On peut parfois observer des dépôts d’IgG et de C3. La difficulté viendra des cas où l’intensité des dépôts d’IgA et IgG sera égale, pour différencier une DIGAL d’une pemphigoïde bulleuse ou plus rarement d’une EBA. L’intégration des données cliniques (âge, aspect des lésions, topographie), histologiques, bien que parfois très proches entre ces différentes entités, et des tests immuno-sérologiques, permettra alors de les différencier [7,8].
Dermatite herpétiforme Elle correspond à la manifestation clinique de la sensibilisation au gluten et est associée à la maladie cœliaque. L’antigène principal est la transglutaminase. On retrouve le plus souvent des dépôts granuleux et micro-fibrillaires d’IgA, plus rarement de C3, prédominant au sommet des papilles dermiques (figure 3). Il arrive d’observer des dépôts granuleux le long de la JDE, ce qui peut parfois poser un doute diagnostique avec une DIGAL. Par ailleurs, il est important que le clinicien ait biopsié en périphérie de la lésion car le risque est un faux négatif par destruction des complexes immuns par l’inflammation. Ici il est recommandé de biopsier en zone péri-érythémateuse.
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A) Manifestations cliniques : vésicules et bulles tendues avec disposition caractéristique en rosette, et croûte centrale, chez un enfant.
IFD : dépôts granuleux et micro-fibrillaires d’IgA, prédominant au sommet des papilles dermiques
Groupe des pemphigus Les pemphigus sont un groupe de dermatoses autoimmunes caractérisées par la présence d’auto-anticorps dirigés essentiellement contre des éléments des desmosomes, qui sont des systèmes complexes de jonction interkératinocytaire. Les desmosomes sont composés de plusieurs protéines structurelles, parmi lesquelles les cadhérines desmosomales, appelées desmogléines et desmocollines. Les desmogléines sont les principaux antigènes cibles. Les pemphigus vulgaire (PV) (figure 4), foliacé et paranéoplasique (PN) en sont les trois principales entités et sont caractérisés en IFD par la présence de dépôts
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Figure 4. Pemphigus vulgaire.
A) Manifestations cliniques : plaque érythémateuse avec squames périphériques et érosions superficielles
B) IFD : dépôts interkératinocytaires en « résille » d’IgG sur toute la hauteur de l’épithélium (muqueuse sur cette image)
interkératinocytaires en « résille » d’IgG et de C3. Dermatoses bulleuses Le pemphigus à IgA est lui caractérisé par la présence non auto-immunes avec de dépôts interkératinocytaires d’IgA. Dans le PN, il profil IFD particulier est possible de retrouver à la fois un marquage en Porphyrie cutanée tardive résille et un marquage linéaire fin à la JDE. En effet, et pseudo-porphyrie d’autres antigènes cibles ont été décrits dans cette Il s’agit de deux maladies avec formation de bulles sur entité, notamment des protéines de la famille des site photo-exposé dont l’étiologie n’est pas autoplakines, dont certaines se situent à la JDE, immune. On retrouvera à l’étude en IFD comme le BP230 (BPAG1). des dépôts de toutes les classes d’imLe clinicien peut rencontrer des diffimunoglobulines et du complément cultés techniques pour effectuer la le long de la JDE et des dépôts biopsie car la maladie, notamment épais et hyalins dans la paroi Comme dans le cas dans les cas du PV et du PN, peut vasculaire [3]. se manifester uniquement au des pemphigoïdes, niveau des muqueuses. Bullosis diabeticorum l’IFD est le test Comme dans le cas des pemphiLa plupart du temps l’IFD sera goïdes, l’IFD est le test diagnosdiagnostic le plus négative, mais il peut être raretic le plus sensible. Un diagnostic ment observé des dépôts dans la sensible de pemphigus doit être sérieuparoi vasculaire, comme dans le cas sement remis en question si l’IFD des porphyries [10]. est négative. Il conviendra cependant de se méfier Dermatoses bulleuses non de faux-positifs dans le cadre de dermaauto-immunes avec IFD négative toses inflammatoires, en particulier en cas de Il existe de nombreuses dermatoses qui sont caracspongiose, où il peut exister une faible fluorescence térisées cliniquement par la présence de bulles/vésiinterkératinocytaire non spécifique. Classiquement, cules, et pour lesquelles l’étude en IFD montrera l’hyperfluorescence se verra avec tous les marqueurs, l’absence de dépôt, bien que de rares cas de faux contrairement au pemphigus. Il a également été décrit positifs soient décrits [9]. L’intérêt réside dans le de faux positifs dans la maladie de Grover, une derfait que si le test est négatif, il permettra d’exclure matose acantholytique non auto-immune dont l’asavec quasi-certitude une dermatose bulleuse autopect histologique peut parfois être très proche du immune. Le tableau 3 expose une liste non exhauspemphigus. C’est, encore une fois, l’intégration de tive de dermatoses bulleuses avec IFD négative ou toutes les données qui permettront d’aboutir au bon non spécifique. diagnostic [2,8,9].
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Tableau 3. Dermatoses vésiculo-bulleuses et érosives avec profil IFD négatif ou non spécifique (liste non-exhaustive).
Figure 5. Vascularite.
Inflammatoire Dermite de contact allergique Dermatite atopique au stade aigu Dysidrose Maladie de Grover (rares faux positifs) Toxique/Médicamenteux Toxidermie bulleuse : ◗ Syndrome de Stevens-Johnson/Lyell ◗ Erythème pigmenté fixe bulleux Réaction sur piqûre d’insecte/hyménoptères/morsure de serpent Infectieux/Para-infectieux
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Dépôts granuleux de C3 dans la paroi des vaisseaux du derme superficiel
Dermatophytie bulleuse Impétigo bulleux Infections virales (Coxsackie notamment) Gale bulleuse Erythème polymorphe (HSV)
De même la détection de tels dépôts isolément, sans image de vascularite est possible dans de nombreuses maladies à CIC et ne permet pas à elle seule de porter le diagnostic de vascularite qui est avant tout histologique. Dans notre expérience, la principale indication est la vascularite à IgA, anciennement nommée purpura rhumatoïde ou maladie de Henoch-Schönlein. Cette entité clinico-pathologique est bien caractérisée et il est important de la différencier d’autres formes de vascularite, notamment pour la prise en charge. Une IFD avec dépôts intravasculaires d’IgA fait partie des critères diagnostiques et est même, pour certains auteurs, indispensable au diagnostic. Il existe cependant des faux-positifs (par exemple de cause médicamenteuse), et des faux-négatifs (tous les autres critères de vascularite à IgA remplis mais pas de dépôts d’IgA à l’IFD). Deux séries récentes ont retrouvé une sensibilité de 86 % et 81 % et une spécificité de 84 % et 83 % respectivement [12,13]. Dans la moitié des cas, l’étude en IFD montrera des dépôts d’IgA seuls dans la paroi des vaisseaux [11,14].
Photoinduit Réaction photo-allergique Réaction photo-toxique Phyto-photo-dermatose « Coup de soleil » sévère Génodermatoses Epidermolyse bulleuse héréditaire Maladie de Hailey-Hailey Ichtyose kératinopathique Néoplasique Mastocytose bulleuse Mécanique Bulle de friction Oedèmes Pathomimie
Autres vascularites
Vascularites des petits vaisseaux/leucocytoclasique Le diagnostic de vascularite leucocytoclasique est histologique. Il est fréquent (60 % dans cette série [11]), de retrouver des dépôts d’immunoglobulines et/ ou de C3 dans les vaisseaux du derme (figure 5). Bien que cela puisse représenter un argument supplémentaire au diagnostic, leur absence ne l’exclut pas, la biopsie pouvant être réalisée trop précocement ou trop tardivement. Les dépôts détectés sont granuleux (Complexes Immuns Circulants, CIC).
Vascularite avec cryoglobulinémie mixte L’IFD peut être utile et révèle des dépôts intravasculaires et dans la paroi vasculaire, le plus souvent d’IgG.
Vascularites à ANCA Il est possible d’observer des dépôts vasculaires d’IgM et de complément, comme dans toute lésion avec souffrance vasculaire, et rarement d’IgG.
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Figure 6. Lupus.
Bande lupique : (A) dépôts granuleux à la jonction dermoépidermique, épais, d’IgM ; (B) et modérément épais, d’IgG.
Connectivites Lupus Le diagnostic de lupus cutané, quel qu’en soit le type, est avant tout clinique et histologique. L’IFD peut être ajoutée pour étayer le diagnostic mais elle ne permettra pas de poser le diagnostic avec certitude ni de l’exclure. L’étude en IFD montre parfois une « bande lupique ». Il s’agit de dépôts granuleux, épais, à la JDE, d’IgM le plus souvent, plus rarement d’IgG et d’IgA, et de C3 (figure 6) [3]. Les dépôts d’IgM à la JDE ne sont cependant pas spécifiques et peuvent se rencontrer fréquemment dans d’autres dermatoses et même chez des patients sains. La spécificité augmente si plusieurs immunoréactivités sont positives, en particulier l’IgG, et si la bande est large. Une bande lupique en peau lésionnelle se retrouve chez la plupart des patients souffrant de lupus discoïde, chez la moitié des patients avec lupus subaigu, et chez environ 80 % des patients en peau non-lésion-
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(C) Marquage nucléaire des kératinocytes avec l’IgG. (D) Dépôts périfolliculaires de C3.
nelle exposée au soleil en cas de lupus systémique. Le fait de retrouver une bande lupique en peau nonexposée serait corrélé avec la sévérité de la maladie lupique [3]. Il est également possible d’observer des dépôts autour des annexes, des corps colloïdes, un marquage nucléaire des kératinocytes (figure 6), et des dépôts intravasculaires en cas de vascularite associée. Le lupus bulleux, déjà cité plus haut, est une manifestation rare de lupus caractérisée par une éruption vésiculo-bulleuse, en lien avec la production d’anticorps anti-collagène VII. L’étude en IFD montrera des dépôts à la JDE, en IgG, IgM et IgA. Classiquement les dépôts forment une bande plus large que celle observée dans la pemphigoïde bulleuse et l’EBA.
Autres connectivites Il est possible d’observer un aspect de bande lupique en peau lésionnelle en cas de dermatomyosite et de connectivité mixte (MCTD, Mixed Connective Tissue Disease). Dans la sclérodermie on peut observer un marquage nucléaire kératinocytaire [15].
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Figure 7. Corps colloïdes
d’origine lupique. Dans cette indication l’IFD est systématique.
Conclusion L’immunofluorescence directe est une technique microscopique qui tient une place prépondérante dans le diagnostic de nombreuses pathologies cutanées autoimmunes, surtout bulleuses. Il est donc important pour le pathologiste de bien en connaître les indications, les aspects principaux, de même que les pièges potentiels. QQ Liens d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d'intérêts.
Points à retenir
Dépôts sous-épidermiques globuleux d’IgM. ◗tL’immunofluorescence directe est une technique
Autres indications relatives
microscopique qui tient une place prépondérante dans le diagnostic de nombreuses pathologies cutanées auto-immunes
Lichen Plan On observe assez souvent des dépôts globulaires groupés d’immunoglobulines et de complément dans le derme papillaire, correspondant aux corps colloïdes (figure 7). S’ils sont nombreux et groupés, cela oriente vers le diagnostic de lichen plan par rapport au lupus par exemple [15]. Cela peut être d’une grande aide dans les alopécies cicatricielles pour différencier un lichen plan folliculaire d’une alopécie
◗tLes maladies bulleuses auto-immunes représentent
la principale indication à l’IFD. ◗tElle peut être également utile dans d’autres dermatoses,
telles que les vascularites et le Lupus ◗tIl existe des pièges et il faut se méfier de faux-positifs et
de faux négatifs selon le contexte. Il est important en cas de doute d’effectuer une corrélation anatomo-clinique.
[8] Arbache ST, Nogueira TG, Delgado L, et al. Immunofluorescence
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ABSTRACT Direct immunofluorescence microscopy in Dermatology: main indications The main aspects of direct immunofluorescence testing in dermatology, its indications, and potential pitfalls should be taken into account by the pathologist. Direct immunofluorescence microscopy is a technique that allows the detection of immunoglobulins/immune complexes and complement fractions (IgG, IgA, IgM and C3) in tissues, using specific fluorescein-conjugated antibodies and a fluorescence microscope. This technique is essential in dermato-pathology for the diagnosis of autoimmune blistering diseases, such as bullous pemphigoid, pemphigus, dermatitis herpetiformis, and may also be useful in other indications, such as lupus and vasculitis.
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Tableau 2. Indications de l’immunofluorescence directe en dermatologie. IFD à visée diagnostique Dermatoses bulleuses auto-immunes Groupe des Pemphigoïdes Pemphigoïde bulleuse Pemphigoïde des muqueuses/cicatricielle Pemphigoïde gestationnelle Pemphigoïde anti-p200/laminin-␥1 Lichen Plan Pemphigoïde Epidermolyse bulleuse acquise Dermatoses bulleuses avec dépôts majoritaires d’IgA Dermatose bulleuse à IgA linéaire Dermatite Herpétiforme
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Groupe des Pemphigus
1. Tampon de base
Pemphigus vulgaire (dont pemphigus végétant) Pemphigus foliacé (dont pemphigus érythémateux et fogo selvagem) Pemphigus herpétiforme Pemphigus paranéoplasique Pemphigus médicamenteux Pemphigus à IgA
Phosphate de potassium Peser 19,95g Diluer dans 87,5mL d’eau distillée Acide citrique Peser 6,625g Diluer dans 12,5mL d’eau distillée Mélanger les deux solutions (100ml en tout) Vérifier le pH (doit être à 7)
IFD avec valeur diagnostique
2. Tampon citrate Maléïmide
Vascularites
Sulfate de magnésium Peser 0,616g Diluer dans 25mL d’eau distillée N’Ethylmaléïmide Peser 0,3125g Diluer dans 25mL d’eau distillée Mélanger 12,5mL de tampon de base avec les 25mL de sulfate de magnésium et les 25mL de N’Ethylmaléïmide Rajouter de l’eau distillée pour obtenir 500ml en tout Ajuster le pH final à 7 (si < à 7 avec KOH à 0,1 mole ; si > à 7 avec acide citrique) 3. Milieu de transport final
Vascularite à IgA Vascularite leucocytoclasique d’autre origine Vascularite cryoglobulinémique (Moins d’intérêt : vascularites à ANCA) Connectivites Lupus (Moins d’intérêt : Dermatomyosite, MCTD, sclérodermie) Autres pathologies avec profil IFD particulier
Peser 275g de sulfate d’ammonium Les diluer dans les 500mL de tampon citrate Maléïmide du paragraphe 2 Conservation 3 mois au réfrigérateur
bonnes conditions de conservation (plusieurs jours). À l’arrivée au laboratoire, le prélèvement est rincé et congelé puis coupé au cryostat. Les sections sont incubées avec des anticorps anti-immunoglobuline G, A, M et parfois E, et la fraction C3 du complément (d’autres fractions peuvent parfois être utilisées), couplés à de la fluorescéine. Classiquement, l’intensité de la fluorescence doit être évaluée, et notée soit comme faible (+), modérée (++), intense (+++). Dans cet article, les indications de l’immunofluorescence directe en dermatologie seront discutées, et les aspects les plus classiques seront présentés. Le tableau 2 résume ces indications.
Lichen plan Porphyrie cutanée tardive Pseudoporphyrie Bullosis diabeticorum
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Figure 1. Pemphigoïde bulleuse.
A) Manifestations cliniques : macules et plaques érythémateuses avec bulles tendues à contenu séreux, érosions et croûtes postbulleuses, chez un adulte.
Dermatoses bulleuses auto-immunes Les dermatoses bulleuses représentent l’indication la plus importante de l’IFD.
Groupe des pemphigoïdes Les pemphigoïdes sont des maladies auto-immunes dont les antigènes se situent à la jonction dermo-épidermique (JDE), classiquement au niveau des hémi-desmosomes. La forme la plus fréquente est la pemphigoïde bulleuse. Les antigènes principaux sont des protéines structurelles appelées BP180 (ou BPAG2, COLXVII) et BP230 (BPAG1). L’IFD est le test diagnostique le plus sensible, positif dans la grande majorité des cas. La biopsie doit porter en zone érythémateuse péri-bulleuse [1]. Elle montre classiquement des dépôts linéaires fins et continus d’IgG, de C3, et plus rarement d’IgA et d’IgM, à la JDE (figure 1). Dans le cas de la pemphigoïde gestationnelle, on retrouve le plus souvent des dépôts de C3 et rarement d’IgG. La pemphigoïde des muqueuses/ cicatricielle peut avoir d’autres antigènes cibles (laminine 332 ; intégrine ␣64) mais aura le même aspect que la pemphigoïde bulleuse à l’étude en IFD. Elle a plus de chances d’être positive si le prélèvement est fait sur une muqueuse que sur la peau [2,3]. Il arrive que les auto-anticorps soient à la limite du seuil de détection. Une méthode encore plus sensible que l’IFD existe, il s’agit de l’immuno-microscopie électronique. Cependant cette technique est plus complexe à organiser, coûteuse, chronophage, et seulement de rares centres peuvent la pratiquer [4]. Une difficulté majeure dans ce groupe sera de différencier une pemphigoïde d’une épidermolyse bul-
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B) IFD : dépôts linéaires fins et continus d’IgG à la jonction dermo-épidermique
leuse acquise (EBA), qui peut avoir, quoique rarement, la même présentation clinique et histologique, et montrer le plus souvent le même aspect en IFD. Des auteurs ont montré qu’il était malgré tout possible de les différencier. En effet, lorsque les dépôts sont examinés à fort grandissement, il existe souvent, en plus de l’aspect linéaire, un aspect en dent de scie (serrated). Il est en forme de « n » dans le cas des pemphigoïdes et de la dermatose à IgA linéaire, dont les antigènes se situent au-dessus de la lamina densa, et en forme de « u » dans l’EBA et le Lupus bulleux, dont l’antigène cible est le collagène VII, qui se situe sous la lamina densa. Cette approche est fiable et reproductible, mais nécessite des objectifs spéciaux à fort grandissement [5,6]. Un autre moyen de les différencier est de pratiquer l’IFD en peau clivée, permettant ainsi de mieux localiser les dépôts. Il faut incuber la peau dans une solution de chlorure de sodium, permettant la séparation de l’épiderme et du derme. Le clivage se situe dans la partie basse de la lamina lucida. Les dépôts seront donc “au toit” de la bulle ou versant épidermique, dans le cas de la pemphigoïde bulleuse, pemphigoïde gestationnelle, pemphigoïde cicatricielle, en dehors des formes dirigées contre la laminine 332, et Dermatose à IgA linéaire (DIGAL) ; « au plancher » de la bulle ou versant dermique, dans le cas de l’EBA, du Lupus bulleux, de la pemphigoïde anti-laminine-␥1, la pemphigoïde cicatricielle anti-laminine 332 et de rares cas de DIGAL [3].
Épidermolyse bulleuse acquise L’EBA est une dermatose auto-immune de présentation clinique hétérogène caractérisée par des auto-anticorps dirigés contre le collagène VII. On retrouve à l’IFD des dépôts d’IgG, de C3 et plus rarement d’IgA à la JDE. Comme cité précédemment (cf. pemphigoïdes), l’aspect
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Figure 2. Dermatose à IgA linéaire.
au fort grandissement en dent de scie en « u » permet de différencier l’EBA des autres maladies du groupe des pemphigoïdes [7,8], l’autre possibilité étant d’effectuer l’IFD en peau clivée, où les dépôts se situeront au plancher de la bulle (sous la lamina densa).
B) IFD : dépôts linéaires fins et continus d’IgA à la jonction dermo-épidermique
Figure 3. Dermatite herpétiforme.
Dermatoses bulleuses avec dépôts majoritaires d’IgA Dermatose à IgA linéaire (DIGAL) Cette dermatose est caractérisée en IFD par des dépôts linéaires d’IgA le long de la JDE (figure 2). On peut parfois observer des dépôts d’IgG et de C3. La difficulté viendra des cas où l’intensité des dépôts d’IgA et IgG sera égale, pour différencier une DIGAL d’une pemphigoïde bulleuse ou plus rarement d’une EBA. L’intégration des données cliniques (âge, aspect des lésions, topographie), histologiques, bien que parfois très proches entre ces différentes entités, et des tests immuno-sérologiques, permettra alors de les différencier [7,8].
Dermatite herpétiforme Elle correspond à la manifestation clinique de la sensibilisation au gluten et est associée à la maladie cœliaque. L’antigène principal est la transglutaminase. On retrouve le plus souvent des dépôts granuleux et micro-fibrillaires d’IgA, plus rarement de C3, prédominant au sommet des papilles dermiques (figure 3). Il arrive d’observer des dépôts granuleux le long de la JDE, ce qui peut parfois poser un doute diagnostique avec une DIGAL. Par ailleurs, il est important que le clinicien ait biopsié en périphérie de la lésion car le risque est un faux négatif par destruction des complexes immuns par l’inflammation. Ici il est recommandé de biopsier en zone péri-érythémateuse.
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A) Manifestations cliniques : vésicules et bulles tendues avec disposition caractéristique en rosette, et croûte centrale, chez un enfant.
IFD : dépôts granuleux et micro-fibrillaires d’IgA, prédominant au sommet des papilles dermiques
Groupe des pemphigus Les pemphigus sont un groupe de dermatoses autoimmunes caractérisées par la présence d’auto-anticorps dirigés essentiellement contre des éléments des desmosomes, qui sont des systèmes complexes de jonction interkératinocytaire. Les desmosomes sont composés de plusieurs protéines structurelles, parmi lesquelles les cadhérines desmosomales, appelées desmogléines et desmocollines. Les desmogléines sont les principaux antigènes cibles. Les pemphigus vulgaire (PV) (figure 4), foliacé et paranéoplasique (PN) en sont les trois principales entités et sont caractérisés en IFD par la présence de dépôts
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Figure 4. Pemphigus vulgaire.
A) Manifestations cliniques : plaque érythémateuse avec squames périphériques et érosions superficielles
B) IFD : dépôts interkératinocytaires en « résille » d’IgG sur toute la hauteur de l’épithélium (muqueuse sur cette image)
interkératinocytaires en « résille » d’IgG et de C3. Dermatoses bulleuses Le pemphigus à IgA est lui caractérisé par la présence non auto-immunes avec de dépôts interkératinocytaires d’IgA. Dans le PN, il profil IFD particulier est possible de retrouver à la fois un marquage en Porphyrie cutanée tardive résille et un marquage linéaire fin à la JDE. En effet, et pseudo-porphyrie d’autres antigènes cibles ont été décrits dans cette Il s’agit de deux maladies avec formation de bulles sur entité, notamment des protéines de la famille des site photo-exposé dont l’étiologie n’est pas autoplakines, dont certaines se situent à la JDE, immune. On retrouvera à l’étude en IFD comme le BP230 (BPAG1). des dépôts de toutes les classes d’imLe clinicien peut rencontrer des diffimunoglobulines et du complément cultés techniques pour effectuer la le long de la JDE et des dépôts biopsie car la maladie, notamment épais et hyalins dans la paroi Comme dans le cas dans les cas du PV et du PN, peut vasculaire [3]. se manifester uniquement au des pemphigoïdes, niveau des muqueuses. Bullosis diabeticorum l’IFD est le test Comme dans le cas des pemphiLa plupart du temps l’IFD sera goïdes, l’IFD est le test diagnosdiagnostic le plus négative, mais il peut être raretic le plus sensible. Un diagnostic ment observé des dépôts dans la sensible de pemphigus doit être sérieuparoi vasculaire, comme dans le cas sement remis en question si l’IFD des porphyries [10]. est négative. Il conviendra cependant de se méfier Dermatoses bulleuses non de faux-positifs dans le cadre de dermaauto-immunes avec IFD négative toses inflammatoires, en particulier en cas de Il existe de nombreuses dermatoses qui sont caracspongiose, où il peut exister une faible fluorescence térisées cliniquement par la présence de bulles/vésiinterkératinocytaire non spécifique. Classiquement, cules, et pour lesquelles l’étude en IFD montrera l’hyperfluorescence se verra avec tous les marqueurs, l’absence de dépôt, bien que de rares cas de faux contrairement au pemphigus. Il a également été décrit positifs soient décrits [9]. L’intérêt réside dans le de faux positifs dans la maladie de Grover, une derfait que si le test est négatif, il permettra d’exclure matose acantholytique non auto-immune dont l’asavec quasi-certitude une dermatose bulleuse autopect histologique peut parfois être très proche du immune. Le tableau 3 expose une liste non exhauspemphigus. C’est, encore une fois, l’intégration de tive de dermatoses bulleuses avec IFD négative ou toutes les données qui permettront d’aboutir au bon non spécifique. diagnostic [2,8,9].
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Tableau 3. Dermatoses vésiculo-bulleuses et érosives avec profil IFD négatif ou non spécifique (liste non-exhaustive).
Figure 5. Vascularite.
Inflammatoire Dermite de contact allergique Dermatite atopique au stade aigu Dysidrose Maladie de Grover (rares faux positifs) Toxique/Médicamenteux Toxidermie bulleuse : ◗ Syndrome de Stevens-Johnson/Lyell ◗ Erythème pigmenté fixe bulleux Réaction sur piqûre d’insecte/hyménoptères/morsure de serpent Infectieux/Para-infectieux
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Dépôts granuleux de C3 dans la paroi des vaisseaux du derme superficiel
Dermatophytie bulleuse Impétigo bulleux Infections virales (Coxsackie notamment) Gale bulleuse Erythème polymorphe (HSV)
De même la détection de tels dépôts isolément, sans image de vascularite est possible dans de nombreuses maladies à CIC et ne permet pas à elle seule de porter le diagnostic de vascularite qui est avant tout histologique. Dans notre expérience, la principale indication est la vascularite à IgA, anciennement nommée purpura rhumatoïde ou maladie de Henoch-Schönlein. Cette entité clinico-pathologique est bien caractérisée et il est important de la différencier d’autres formes de vascularite, notamment pour la prise en charge. Une IFD avec dépôts intravasculaires d’IgA fait partie des critères diagnostiques et est même, pour certains auteurs, indispensable au diagnostic. Il existe cependant des faux-positifs (par exemple de cause médicamenteuse), et des faux-négatifs (tous les autres critères de vascularite à IgA remplis mais pas de dépôts d’IgA à l’IFD). Deux séries récentes ont retrouvé une sensibilité de 86 % et 81 % et une spécificité de 84 % et 83 % respectivement [12,13]. Dans la moitié des cas, l’étude en IFD montrera des dépôts d’IgA seuls dans la paroi des vaisseaux [11,14].
Photoinduit Réaction photo-allergique Réaction photo-toxique Phyto-photo-dermatose « Coup de soleil » sévère Génodermatoses Epidermolyse bulleuse héréditaire Maladie de Hailey-Hailey Ichtyose kératinopathique Néoplasique Mastocytose bulleuse Mécanique Bulle de friction Oedèmes Pathomimie
Autres vascularites
Vascularites des petits vaisseaux/leucocytoclasique Le diagnostic de vascularite leucocytoclasique est histologique. Il est fréquent (60 % dans cette série [11]), de retrouver des dépôts d’immunoglobulines et/ ou de C3 dans les vaisseaux du derme (figure 5). Bien que cela puisse représenter un argument supplémentaire au diagnostic, leur absence ne l’exclut pas, la biopsie pouvant être réalisée trop précocement ou trop tardivement. Les dépôts détectés sont granuleux (Complexes Immuns Circulants, CIC).
Vascularite avec cryoglobulinémie mixte L’IFD peut être utile et révèle des dépôts intravasculaires et dans la paroi vasculaire, le plus souvent d’IgG.
Vascularites à ANCA Il est possible d’observer des dépôts vasculaires d’IgM et de complément, comme dans toute lésion avec souffrance vasculaire, et rarement d’IgG.
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Figure 6. Lupus.
Bande lupique : (A) dépôts granuleux à la jonction dermoépidermique, épais, d’IgM ; (B) et modérément épais, d’IgG.
Connectivites Lupus Le diagnostic de lupus cutané, quel qu’en soit le type, est avant tout clinique et histologique. L’IFD peut être ajoutée pour étayer le diagnostic mais elle ne permettra pas de poser le diagnostic avec certitude ni de l’exclure. L’étude en IFD montre parfois une « bande lupique ». Il s’agit de dépôts granuleux, épais, à la JDE, d’IgM le plus souvent, plus rarement d’IgG et d’IgA, et de C3 (figure 6) [3]. Les dépôts d’IgM à la JDE ne sont cependant pas spécifiques et peuvent se rencontrer fréquemment dans d’autres dermatoses et même chez des patients sains. La spécificité augmente si plusieurs immunoréactivités sont positives, en particulier l’IgG, et si la bande est large. Une bande lupique en peau lésionnelle se retrouve chez la plupart des patients souffrant de lupus discoïde, chez la moitié des patients avec lupus subaigu, et chez environ 80 % des patients en peau non-lésion-
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(C) Marquage nucléaire des kératinocytes avec l’IgG. (D) Dépôts périfolliculaires de C3.
nelle exposée au soleil en cas de lupus systémique. Le fait de retrouver une bande lupique en peau nonexposée serait corrélé avec la sévérité de la maladie lupique [3]. Il est également possible d’observer des dépôts autour des annexes, des corps colloïdes, un marquage nucléaire des kératinocytes (figure 6), et des dépôts intravasculaires en cas de vascularite associée. Le lupus bulleux, déjà cité plus haut, est une manifestation rare de lupus caractérisée par une éruption vésiculo-bulleuse, en lien avec la production d’anticorps anti-collagène VII. L’étude en IFD montrera des dépôts à la JDE, en IgG, IgM et IgA. Classiquement les dépôts forment une bande plus large que celle observée dans la pemphigoïde bulleuse et l’EBA.
Autres connectivites Il est possible d’observer un aspect de bande lupique en peau lésionnelle en cas de dermatomyosite et de connectivité mixte (MCTD, Mixed Connective Tissue Disease). Dans la sclérodermie on peut observer un marquage nucléaire kératinocytaire [15].
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Figure 7. Corps colloïdes
d’origine lupique. Dans cette indication l’IFD est systématique.
Conclusion L’immunofluorescence directe est une technique microscopique qui tient une place prépondérante dans le diagnostic de nombreuses pathologies cutanées autoimmunes, surtout bulleuses. Il est donc important pour le pathologiste de bien en connaître les indications, les aspects principaux, de même que les pièges potentiels. QQ Liens d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d'intérêts.
Points à retenir
Dépôts sous-épidermiques globuleux d’IgM. ◗tL’immunofluorescence directe est une technique
Autres indications relatives
microscopique qui tient une place prépondérante dans le diagnostic de nombreuses pathologies cutanées auto-immunes
Lichen Plan On observe assez souvent des dépôts globulaires groupés d’immunoglobulines et de complément dans le derme papillaire, correspondant aux corps colloïdes (figure 7). S’ils sont nombreux et groupés, cela oriente vers le diagnostic de lichen plan par rapport au lupus par exemple [15]. Cela peut être d’une grande aide dans les alopécies cicatricielles pour différencier un lichen plan folliculaire d’une alopécie
◗tLes maladies bulleuses auto-immunes représentent
la principale indication à l’IFD. ◗tElle peut être également utile dans d’autres dermatoses,
telles que les vascularites et le Lupus ◗tIl existe des pièges et il faut se méfier de faux-positifs et
de faux négatifs selon le contexte. Il est important en cas de doute d’effectuer une corrélation anatomo-clinique.
[8] Arbache ST, Nogueira TG, Delgado L, et al. Immunofluorescence
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