Implications de l'apoptose en pathologie

Revues g&&ales

Implications

rhlrnc!

t’apoptose d’execution

est une

nombreuses

maladies.

ainsi

la disparition

qu’ti

la comprehension de

concevoir

reste

encore

deleteres ~

un defout

de l’apoptose des

strategies

therapeutiques

nombreuses

questions

/ pathologic

/

se traduira

CD4+

terme

suspens,

aussi

qui de

peut

une

done

proliferation

ioue

un

leur

Des

progres

A present, bien

preventives aussi

traitements

0

bien 1999

role

potentiellement ceilulaire

considerobles 6 relever

que

curatives.

la transduction

dans Tout

contribuer

tr la physiopathogenie

ont Des du

(cancer],

les maladies

essais signal

alors

ces dernieres ces nouvelles

pilotes apoptotique

ont

des

dereglement

d’Alzheimer

ete effect&s

est d’exploiter

le developpement

tissulaire.

incontrolee

comme

le defi

Elsevier,

fondomental

homeostasie

neurodegeneratives

du sida.

concernnnt

de ces nouveaux

cellulaire

par

de I’apoptose.

en patbologie

le maintien

maladies

ou tours

innovantes, en

mort dons

apoptotique

ti certaines

introcellulaires

des

de que

processus

d’apoptose

lymphocytes

long

du

conduira

de

ou moins

active ainsi

le controle

des meconismes

?I plus

apoptose

dans

Ainsi,

ou excessive

methode

multicelluloires,

ou

inadaptee

prospectir?es

de l’apoptose

organismes programme

et ana&ses

dans

qu’une

le de

stimulation

ou de Parkinson, an&es

quant

connoissonces

de@

commence,

que

les possibles

o afin

mais

il

effets

Paris.

therapeutique

Introduction L’apoptose est un phenomttne nature1 qui va de pair avec la proliferation afin d’assurer le maintien de I’homtostasie tissulaire des organismes multicellulaires. Elle incervient d&s I’embryogenese, mais participe egalemenr a des processus aussi divers que la maturation du systeme immunitaire, le maintien dynamique du nombre de cellules foncrionnelles, I’tlimination de cellules anormales ou endommagees de meme que le vieillissement. Le deroulement du processus apoptotique peut etre divise en trois phases : une phase d’initiation enclenchee par le stimulus, une phase effeccrice oh la cellule s’engage vers un point de non retour et une phase de degradation ou les caracteristiques morphologiques de l’apoptose deviennent evidentes. Toute anomalie de ce mtcanisme regulateur peut done etre responsable du declenchemerit ainsi que de la progression de nombreuses pathologies, caracterisees soit par un exces soit par un defaut d’apoptose. Une meilleure comprehension moleculaire de l’apoptose pourrait apporter la cle de strategies therapeutiques innovanres. Mhcanismes de I’apoptose ~~~j~jtj~~

moliculaires

et cellulaires

de I’qx?pt05e k? des C~~~~~~S ap

t~tj~~~~

Le phenomene de mort cellulaire programmee a Pte decrit pour la premiere fois par Lockshin et Williams [76, 771 mais ^_^^~~~_~,xx~x^I^--__I^-~.^,~~ ‘Insem Courtoboeuf,

U461,

facuk tes Ulis,

de France

pharmacie

Paris-Sud,

5 rue

km-Baptiste

Clkrnent,

reconnu a part entiere et de&i comme &ant de I’apoptose par Kerr [65]. L’apoptose est une forme active de mort cellulaire au cows de laquelle on observe morphologiquement une diminution du volume cellulaire, une condensation de la chromatine en ptripherie du noyau, une fragmentation de I’ADN, un bourgeonnement de la membrane plasmique et la formation de corps apoptotiques [38]. _-Ix-.- -l~l.~-~.l---_l~---~.-.~92296

Chbtenay-Molobry

cedex.

France

; 21nstitut

Henri

Beaufour,

ZA

n

Apoptose

et pathologies

Au niveau de la membrane plasmique, une des caracteristiques de I’apoptose est l’externalisation des phosphatidylstrines qui, dans des conditions normales sont sur le feuillet interne de la membrane plasmique. Aux stades initiaux de la fragmentation de I’ADN, des fragments de 300 kb puis de 50 kb sent produits, ce qui suggtre que le clivage commence au niveau des sites d’attachement de 1’ADN a la matrice nuclCaire. Dans un deuxitme temps, mais de faGon non systematique et en fonction du type cellulaire, des coupures s’operent au niveau des sites internucleosomiques, lib&ant les oligonucleosomes [ 1401. L’analyse de 1’ADN genomique des cellules apoptotiques par electrophorese en gel d’agarose rtvele alors une (( echelle )) de fragments multiples de 180 a 200 paires de bases, ce qui correspond a la longueur dun fragment d’ADN enroule autour dun seul octamere d’histone. La degradation de I’ADN est detectee dans des cellules viables, ce qui confirme la notion que ce n’est pas un effet post mortem associe avec la cytolyse. La cellule se scinde ensuite en corps apoptotiques dont la taille et le nombre varient en fonction des dimensions cellulaires. Ces corps apoptotiques contiennent des organelles intacts, des fragments nucleaires et un cvtoplasme condense. Les corps apoptotiques sont dotes d’une membrane intacte et ils excluent les colorants vitaux jusqu’a leur degradation : il n’y a done jamais contact des composants intracellulaires avec les tissus environnants et reaction inflammatoire. 11spresentent aussi des marqueurs de surface qui permettent leur reconnaissance et leur phagocytose par des phagocytes professionnels ou B defaut des cellules parenchymateuses voisines, dans lesquelles ils subissent une degradation rapide 11211. En consequence, l’absence d’inflammation dans les tissus subissant une apoptose est une des caracteristiques essentielles differenciant ce phtnomene de la n&rose. L’apoptose peut etre induite par differents stimuli endogenes ou exogenes comme la depletion en facteurs de croissance, les hormones (ex : glucocortico’ides), le ligand de Fas (FasL), le TNF-a (tumor necrosis factor-alpha), le choc thermique, les agents physiques (radiations) ou chimiques (agents des endommageant I’ADN), 1es virus. La transduction signaux apoptotiques induits par ces differents traitements converge vers une voie commune mettant en jeu une cascade proteasique, et regulee positivement ou negativement par les proteines de la famille Bcl-2 (figwe I). Le processus apoptotique peut itre divise en trois phases bien distinctes : la phase d’initiation, la phase effectrice et la phase de degradation. Durant la phase d’initiation, les cellules re$oivent un stimulus dont la nature va determiner les consequences biochimiques observees. C’est lors de la phase effectrice que la cellule va s’engager vers la mort en utilisanr probablement une voie commune B tous les stimuli. Des mecanismes regulateurs peuvent encore intervenir mais lorsque la phase de degradation est enclenchee, c’est le point de non retour, et les caracteristiques morphologiques et biochimiques de l’apoptose deviennent apparentes [69]. 11existe en fonction des types cellulaires et du stimulus employe un certain nombre de similitudes dans le processus apoptotique mais des differences

Fig 1.

Les differentes phases de la cascade apaptatique, d’apres [2]. On distingue trois formes d’apoptose : directe, active ou passive. L’apoptose directe est induite par le granzyme B, lib&e par les lymphocytes T cytotoxiques. L’apoptose active resulte de I’engagement de recepteurs de surface, comme Fas, le recepteur de I’antigene des lymphocytes T, ou le recepteur aux glucocortico’ides. L’apoptose passive est declenchee par la deprivation en facteurs de survie (facteurs de croissance, cvtokinesl.

notables existent aussi. La fragmentation oligonucleosomale de I’ADN n’est pas un phenomttne observe dans tous les types cellulaires ; de meme, la transduction du signal apoptotique dans la cellule n’utilise pas toujours les memes voies en fonction du type cellulaire.

Les membres de la superfamille des recepteurs du TNF comme TNFRl (~55) et Fas (CD95 ou APO-l) caracttrists par la presence de motifs riches en cvsteines dans leur domaine de liaison au ligand jouent un r&e cl6 dans la regulation de la rtponse immunitaire. Ainsi, le systttme Fas-FasL est impliqut principalement dans 1’arrCt de la reponse immunitaire. Lorsque les cellules T matures rencontrent leurs cibles, elles sont activees et proliferent. Cependant, une fois leur t&he accomplie, et afin d’eviter leur accumulation, ces cellules subissent une forme de suicide appelee activation induced cell death impliquant l’interaction entre Fas et son ligand (FasL). La voie Fas serait tgalement partie prenante dans la deletion des lymphocytes B actives ou autortactifs

A Biola

i92]. Les recepceurs de cette famille, ont la propriete de transmettre un signal de mort apres interaction avec leur ligand nature1 au avec un anticorps monoclonal agoniste. Des etudes cristallographiques et biochimiques ont montre que le TNF ainsi que FasL provoquaient la trimtrisation de leur recepteur, et done I’agrtgation des regions cytoplasmiques, necessaire a la transduction du signal [92]. Ces deux recepteurs possedent en effet une sequence intracellulaire de 70-80 aa, appelee death domain, permettant le recrutement de proteines cytoplasmiques partageant le m&me motif: FADD (Fas-associated death domain protein) et RIP (receptor interactingprotein) pour Fas, TRADD (TNFRI-associated death domain protein) pour TNFRI. Ces interactions proteiques constituent les premieres &apes conduisant a l’assemblage d’un complexe multiproteique appele DISC (death inducing signaling complex). Les caspases sont des cysteines proteases participant a la transduction du signal apoptotique. Par son interaction avec UIL des membres de cette famille de proteases, la caspase-8, FADD active cette protPase et enclenche la cascade apoptotique. Pour le TNF-a, le complexe TNFRl-TRADD s’assotie secondairement B FADD, suggtrant que TRADD sert de proteine adaptatrice [ 1571. La stimulation de Fas conduit egalement a I’activation de la sphingomyelinase acide et done i la generation de c&amide, avec activation de la Jun kinase et de la ~38 kinase, l’ensemble de ces processus Ptant regule par les caspases [ 1 I].

Lors du processus apoptotique, la structure et les fonctions de la mitochondrie font t&s pr&ocement l’objet de profondes modifications. Dans la plupart des types cellulaires, une baisse du potentiel mitochondrial (tableau I) precede l’apoptose nucleaire. Les inhibiteurs de la permeabilite de transition (acide bongkrekic, cyclosporine A) s’opposent a cette chute de potentiel et a l’induction de la mort, soulignanr son role cl& dans la cascade apoptotique [158]. La chute du potentiel mitochondrial s’accompagne de la sortie dans le cytosol dun facteur apoptogenique appelt AIF pour apoptosis inducingfactoy. AIF est une proteine preform&e d’environ 50 kDa qui induit in vitro sur des noyaux isoles une condensation de la chromatine et une fragmentation internucleosomale de I’ADN, caracdristiques de l’apoptose nucleaire. AIF est un facteur ubiquitaire local& dans l’espace intermembranaire et capable d’agir seul sans l’intervention de facteurs additionnels. Depourvu d’activitt: DNase propre, AIF serait capable d’activer des DNases nucleaires preform&es [ 1291. Le cytochrome c est aussi lib&P par la mitochondrie pendant I’apoptose mais independamment de la depolarisation de la membrane mitochondriale. La fonction redox de cette proteine, indispensable a ses fonctions dans la phosphorylation oxydative, n’est pas requise pour son activitt proapoptotique. Avec l’aide d’un ou de plusieurs facteur(s) cytoplasmiques, le cytochrome c est capable, in vitro, d’induire l’apoptose nucleaire [67],

Durant le dCveloppement normal du nematode Caenorhabditis elegant, 131 des 1 090 cellules g&t&ees vont mourir par apoptose. L’etude genetique a permis l’identification d’au moins 14 genes impliques dans cette mort cellulaire developpementale. Si certains d’entre eux (ted-3, ted-4) ont des propriet& ro-apoptotiques, d’autres sont anti-apoptotiques (ted-9). 1%partir de ce nematode, le clonage de I’ADN compltmentaire de ces genes a permis d’identifier les homologues humains des protCines CED-3 et CED-9 qui sont respectivement ICE (pour interleukin-I (b&a) converting en.zyme appelee maintenant caspase-1 pour cysteine aspartase-1), et Bcl-2. Ces deux familles de genes sont les principaux acteurs de l’apoptose : la famille ted-3 codant pour des proteases appartenant au groupe des caspases et la famille ted-9 codant pour des r+tlateurs de l’apoptose du type bcl-2.

Le po+~&!

trorwmmnbro~

mito&ondrld

lo

membrane interna mitcxhondriok ganelle Loo de la pUm6AiW me&wane incstne 6 des soI&s ou niveau des point, & contact une chub &onion.

du gmtent&l superoxydo

mirochonckiol, 1691.

r6sulte

ce qui donne do bande taille i&ieure onto rnernbmne I’dRux

du

et al w

La principale difference physiologique existant entre apoptose et n&rose est le taux intracellulaire d’ATP, qui demeure inchange! jusqu’a la fin du processus apoptotique. La chute du potentiel mitochondrial de membrane Ptant une &ape precoce de l’apoptose, I’ATP necessaire pour la suite du processus est fourni en majorite ensuite par la glycolyse [135]. Certains signaux apoptotiques peuvent se transformer en signaux necrotiques en cas de depletion en ATE’. Ainsi, l’incubation de cellules dans un milieu sans glucose et en presence d’oligomycine, inhibiteur de I’ATP synthetase mitochondriale, bloque completement I’apoptose induite par Fas, le wl6, la dexamethasone ou Ies ionophores calciques [35]. De m&me, les cellules Jurkat traittes par l’anticorps anti-Fas activateur, ou par la staurosporine, meurent par n&rose dans des

de lo distrlbutlon

osytitrlque

de protons

et o&es

Ions

de part

et d’outre

de

nalwnce ir un gradient chimlque (pH) et &ctrlque essentiel au fonctiannement de I’orrsdtoc-, an observe une ougrnentotlon saudaine de lo perm&obil~?6 de la 6 1 500 Da @ratanr, cakium, glutafhion..) en roiw de I’auverture d’un pare ghnt interno d mmbtone owna. II en rh~lre un d&ou+ge & b chaine rwpirctoire avec cakium

m~bicii.

b

d&&an

en glurarhion

tiit

M en

W(P)H,

ef I’hyperpraduction

n Apoptose

et pathologies

conditions de depletion en ATP [98]. Ces effets sont inverses par la restauration de la glycolyse ou de la phosphotylation oxydative mitochondriale. La generation d’ATP est necessaire pour l’execution de la phase finale de l’apoptose (condensation de la chromatine et degradation de I’ADN), et pour l’exposition de la phosphatidylserine a la membrane plasmique, &ape permettant la reconnaissance et la phagocytose des cellules apoptotiques par les cellules macrophagiques voisines [98]. La necessite d’ATP pour l’apoptose pourrait expliquer la presence concomitante de cellules apoptotiques et de cellules necrotiques dans certaines zones pathologiques in viva, comme par exemple au centre de tumeurs solides ou de tissus nerveux ischemiques [ 1351.

Au tours de l’apoptose, il y a prottolyse de nombreux substrats, phenomene responsable des caracteristiques morphologiques et biochimiques observees [ 16, 1281. Les changements du cytosquelette peuvent en partie s’expliquer par le clivage proteolyrique de l’actine, de la fodrine (proteine associee a l’actine) et de Gas2, proteine impliquee dans la reorganisation du cytosquelette. La degradation proteolytique de nombreuses proteines nucltaires contribue a la condensation et a la fragmentation de la chromatine : les lamines, les topoisomtrases, I’unite de 70 kDa constituant la petite ribonucleoproteine Ul, les ribonucleoproteines C. Au niveau nucleaire, on observe la degradation de proteines regulatrices du cycle cellulaire, comme le produit du gene du retinoblastome, ou I’isoforme 6 de la proteine kinase C (PKC). Les changements nucleaires et cytoplasmiques observes pendant l’apoptose peuvent aussi @tre facilites par le clivage de la proteine NuMA (NuclearMitotic Associatedprotein) [96].

Tableau

II. Spkificitks

Graupe

1

Caspase-1 Caspase-4 Caspase-5(ICEreLlll, mC:aspose-11

(ICE) (ICEreM,

de substrat

TX, KH-2) TY)

(mlCH-3)

?

des

Une nouvelle classe de proteases participe a la transduction du signal apoptotique dans la cellule : les caspascs. Les caspases (quteinyl aspartate-spec.$cproteinases) sont des cysteines proteases caracterisees par une sptcificite absolue pour un aspartate en position Pl dans leur site de clivage. Elles contiennent toutes un motif pentapeptidique QACXG (X = R, Q ou G) dans leur site actif et participent, avec d’autres proteases comme la calpaine, aux nombreux tvtnements proteolytiques qui ont lieu dans une cellule en apoptose [20]. Les caspases sont numerotees selon l’anteriorite du clonage de leur ADNc. Certaines d’entre elles ayant ete identifiees simultanement par plusieurs groupes, et portant en consequence des denominations differentes, une nomenclature unifite a et& adoptee en 1996 [2]. Elles ont alors ete r&f& rencees de 1 B 10 dans l’ordre chronologique de leur publication. Leur analyse phylogenttique revele I’existence de trois sous-familles : la sous-famille ICE comprenant les caspases 1, 4 et 5, et qui jouerait egalement un role dans l’inflammarion, la sous-famille CED-3/CPP-32 (caspases 3, 6, 7, 8 et 9) et enfin la sous-famille ICH-l/Nedd2 (caspase 2). Trois nouvelles caspases viennent B present completer cette liste (casp11, -12, -13) et actuellement, les genes codant pour 13 caspases ont et& clones (caspases 1 a 13) [60, 1441. Ntanmoins, ce sont les residus entourant l’aspartate dans la sequence polypeptidique des substrats qui influencent la spec&cite des differentes caspases et il existerait une certaine spCc&cite de substrat : la caspase-3 clive preferentiellement la poly(ADP-ribose) p o 1,vmerase (PARP), alors que la caspase-6 est la seule caspase d&rite capable de cliver la lamine [ 1391. Les differentes caspases peuvent aussi Otre class&es en trois groupes selon la specificite de leur sequence consensus de clivage (tableau Cr). Les caspases du groupe 1 (caspases- 1, -4, -5)

caspases

WEHD (W/L)EHD (W/t]EHD 2

WEHD

Maturation

cytokines

de nombreuses prdthmmatoires

A Biola

ont un motif specifique de clivage WEHD, les caspases du group 2 (caspases-2, -3, -7), DExD et les caspases du groupe 3 (caspases-6, -8, -9, -lo), (1VL)ExD [96]. Tomes les caspases sont synthetisees sous forme de proenzymes inactives qui necessitent un clivage au niveau d’un residu aspartate; elles libtrenr ainsi une petite (lo-12 kDa) et une grande (17-22 kDa) sous-unite qui s’associent en tetramere a#: pour former l’enzyme active. Ces deux sous-unites sont essentielles pour I’activite catalytique de l’enzyme. Cette prottolyse rtsulte d’une autoactivation ou bien dun clivage par d’autres caspases ou d’autres proteases comme le granzyme B, une serine-pro&se a activite catalytique aspartate qui fait partie de la machinerie utilisee par les lymphocytes T cytotoxiques. Les caspases peuvent Ctre divisees en deux categories selon la longueur de leur prodomaine N-terminal [ 1391. Les caspases-1 , -2, -4, -5, -8 ont des prodomaines longs alors que les caspases-3, -6, -7 et -9 ont des prodomaines courts. Cette difference aurait une importance fonctionnelle; en effet, un prodomaine long serait implique dans le ciblage et la regulation de l’activation des caspases. Les caspases-8 et - 10 par exemple ont des prodomaines qui contiennent deux motifs d’interaction proteine-proteine appeles domaines DED (death effector domains), impliques dans la cascade de caspases dans le mod&le d’apoptose sous Fas. Les caspases pourraient faire partie d’une cascade proteolytique, mais la sequence des evenements n’est pas encore etablie. II a Pte montre in vitro que certaines caspases Ctaient capables d’en activer d’autres, ce qui etablirait une hierarchic entre ces enzymes et produirait une amplification du signal. La localisation des caspases peut Ctre cytoplasmique ou nucleaire, et leur abondance et leur regulation varient selon les types cellulaires et les stimuli apoptotiques. La caspase-3 par exemple est tres exprimee dans les cellules d’origine lymphocytaire.

La famille M-2 regroupe des genes regulant soit positivement soit negativement la mort cellulaire programmee (tableau Zrr). Chez les mammiferes, elle inclut bien sGr bcl-2, mais aussi bcl-x, bcl-w, bax, bak, mcl-I, Al, bad, bid, bik et him. L’homologie entre les differentes proteines de cette famille est concentree au niveau de trois regions appelees BHl, BH2 et BH3 (Bcl-2 homology 1, 2 et 3), qui contrblent leurs capacites de dimerisation avec d’autres membres de la mCme famille ainsi que leurs fonctions de regulation de l’apoptose. Tous les membres anti-apoptotiques contiennent de plus un domaine BH4 localise pres de leur extremite Nterminale. Les mutants de Bcl-2 depourvus du domaine BH4 deviennent paradoxalement pro-apoptotiques, ce qui montre l’importance fonctionnelle de ce domaine [59]. Ces proteines posstdent en outre a leur extremite C-terminale des acides amines hydrophobes qui semblent importants pour leur ancrage dans les membranes intracellulaires [ 1021. Les niveaux relatifs des proteines pro- et anti-apoptotiques deter-

Tableau

III. Les diffkrents

ar:

- c elegons - homokgues

wow

membres

de la famille

et al

n

Bcl-2.

Bc1.2 &LX1 BCCW W-I Al

cod9 El6 19k BHRF.1 Lmws-hl

minent la sensibilite de la cellule a un stimulus de nature apoptotique. Bcl-2 (B-cell lymph oma/leukemia-2) est une prottine membranaire de 26 kDa 1ocalisCe au niveau de la membrane interne de la mitochondrie, du reticulum endoplasmique et de la membrane nucleaire [ 1361. Elle a d’abord ete identifiee comme le produit de la translocation chromosomique t( 14; 18) qui se rencontre avec une frequence &levee dans les lymphomes folliculaires. Dans cette translocation, la region codante du gene bcf-2 est deplacee de sa localisation chromosomique normale en 18q2 1, pour se trouver au locus 14q32, juxtaposee au promoteur tres puissant de la chaine lourde des immunoglobulines, ce qui occasionne une expression constitutive Plevte de la proteine Bcl-2 [ 1121. L’expression anormale de Bcl-2 et de ses homologues a ttC d&rite comme associee a de nombreuses pathologies caracterisees par une accumulation anormale de cellules (cancer, auto-immunite, maladie ischemique) ou par un exces de mort cellulaire (maladies neurodegeneratives) [ 1331. Bcl-2 semble posseder deux fonctions distinctes: inhiber la mort cellulaire et freiner l’entree des cellules dans le cycle cellulaire. La surexpression de Bcl-2 augmente la survie de cellules privees de leur facteur de croissance [3O], et occasionne un allongement substantiel de la phase G 1 (de 30 a 60 %), ce qui permettrait de fournir a la cellule le temps necessaire pour reparer les dommages de I’ADN causes par le metabolisme oxydatif [84]. D’autre part, Bcl-2 interagit avec de nombreuses proteines impliquees dans la signalisation cellulaire [40, 124, 142, 1431. Bcl-xL prtsente une tres forte homologie avec Bcl-2 et la transfection de bclXL dans des cellules dependantes de I’IL-3 les protege de l’apoptose induite par la deprivation en facteur de croissance. La transfection de bcl-xS, un autre transcrit du gene bcl-x, ne permet pas de proteger les cellules de l’apoptose, mais facilite plutot ce phenomene en inhibant l’action suppressive de Bcl2 [I&T]. Bax (Bcl-2 associatedXprotein) est une proteine de

w Apoptose

et pathologies

21 kDa qui presente 21 % d’homologie avec B&2 (au niveau des domaines BHI er BH2) et possede une fonction proapoptotique [ 1051. Les membres de la famille Bcl-2 ont la capacite de former entre eux des homo- ou des h&rodim&res. Ainsi, Bad peut se dimCriser avec B&2 ou Bcl-XL, et la surexpression de Bad abolit les effets cytoprorecteurs de ces deux protkines. Bax est egalement capable de s’h&!rodimtriser avec B&2 et Bcl-XL, mais avec une plus faible affnitC que Bad. Le rapport Bcl2/Bax va d&cider du sort de la cellule: si Bcl-2 est en exc&s, la cellule survit, mais si Bax est en exc&s, celle-ci va s’engager vers la mort. Ce seraient les homodim&res Bax/Bax qui seraient proapoptiques. En revanche, un excks de B&2 ou de Bcl-XL, qui impose la formation d’h&&odimeres, permet la survie de la cellule [ 1201. Bad entre en competition avec Bax pour la liaison a B&2 et Bcl-XL, lib&ant ainsi Bax qui peut s’homodimeriser et promouvoir la mort cellulaire [43]. La surexpression de Bcl-2 empeche l’efflux de cytochrome c de la mitochondrie et l’initiation de l’apoptose (figure 2). II est possible que Bcl-2 fasse partie du pore contrblant la lib& ration du cytochrome c, mais cette hypothhse reste Q explorer [ 156 ; 671. D’autre part, le cytochrome c coimmunoprCcipite avec B&XL. Cette interaction directe et specifique permettrait de bloquer l’accumulation de cytochrome c dans le cytosol lors de I’induction de I’apoptose par les radiations ionisantes et autres agents gtnotoxiques [66]. Bcl-2 n’affecte pas la formation d’AIF et n’interfere pas avec l’action d’AIF sur le noyau. En revanche, la surexpression de Bcl-2 au niveau de la membrane externe de la mitochondrie empCche la liberation d’AIF. B&2 serait done surtout un inhibiteur de la permeabilitC de transition, ce qui est en accord avec sa localisation au niveau des points de contact entre membrane interne et membrane externe de la mitochondrie, Ia oh se forment les pores giants [129].

Apoptose

et pathologies

Apuptose et cancer Les pathologies tumorales peuvent Ctre definies comme une accumulation anormale de cellules r&&ant soit d’un exces de prolifbration, soit d’un dkfaut d’apoptose ou encore de la combinaison des deux processus. 11 est probable que la pr&sence d’anomalies dans les voies de transduction du signal apoptotique contribue au dCveloppement initial des cancers et B I’apparition de cellules tumorales resistantes i la chimiotherapie. L’avancee recente des connaissances sue les voies moleculaires d’induction de I’apoptose a permis d’identifier des g&es jouant un r8le critique dans la regulation du processus apoptotique, et prtsentant des anomalies (mutations, translocations, pertes ou gains de fonctions) dans certains cancers (tableau N) . Lors d’un dommage sub&l de I’ADN, le produit du gPne suppresseur de tumeurs ~53 provoque un arr& du cycle cellulaire afin de permettre g la cellule d’entreprendre la reparation de son materiel gCnetique avant toute nouvelle replica-

Fig 2. MBcanismes mol&tlaires de I’apoptose. En presence de dATP et de cytochrome c, Apaf-1 (Apoptosis Acfivating factor-l) [ 1601, homologue humain de CED-4, interogit avec la procaspase9 (ou Apaf-3), conduisant oinsi au clivage et ti I’octivation de la cospase-9, qui vo olors pouvoir octiver la caspase-3 [74]. La caspase-3 activee est ensuite capable de cliver et d’octiver la sousunite de 45 kDo du DNA-Fragmentation Factor [DFF45), responsable de lo degradation de I’ADN en fragments nu&osomaux. coract&stiaues de lo mort oar aoootose 1751.

tion. Si le dommage est trop important, la cellule va plutbt s’engager vers la mort : p53 apparait done comme le gardien de la stabilite et de I’integritt du genome. Facteur de transcription tetramerique contralant l’expression de gtnes impliq&s dans la rCgulation du cycle cellulaire (pZl/wafl), ainsi que dans l’apoptose (bax), ~53 voit ses taux intracellulaires augmenter sous I’effet des radiations y, des rayons ultraviolets ou apr&s un dommage chimique de 1’ADN [I]. Par l’induction de I’expression de la prottine p21\X’af”C1p-1, inhibiteur des kinases dipendantes des cyclines, ~53 favorise 1’arrCt en phase Gl du cycle cellulaire [36], mais p53 peut tgalement influencer I’expression des membres de la famille B&2, augmentant ainsi la sensibilite des cellules a l’apoptose : des eltments de reponse, respectivement negatif et positif, ont en effet et& localis& dans les promoteurs des g&nes bcl-2 et bm [87 ; 881. Un autre mediateur potentiel de I’induction de l’apoptose

A

P53-dcpendante serait Fas, dont I’expression est augment&e par ~53 [ 106]. Des mutations du gene ~53 sont retrouvtes dans plus de la moitie des cancers humains, une majorite d’entre elles affec-. rant les fonctions de liaison de la protCine a I’ADN [73]. Dans les lymphomes, la frequence des mutations differe selon le type histologique, et elle augmente lors de la progression tumorale : dans les lymphomes folliculaires, les mutations de p53 sont associees avec la transformation histologique dans 25 a 30 % des cas [ 1181. L’inactivation de p53 peut Cgalement resulter de son interaction avec des proteines cellulaires comme MDM2, qui en se fixant sur le domaine transactivateur de ~53, inhibe specifiquement son activite transcriptionnelle [9O]. Or, le gene mdm2 est amplifie dans certains types de tumeurs solides humaines, incluant les sarcomes [ 1041. La presence de mutations dans le gene ~5.3 est souvent correlee avec une resistance pleiotropique a la chimiotherapie antican&reuse ainsi qu’a la radiotherapie [ 1081, mais les cellules can&reuses pouvant avoir subi plusieurs modiftcacions genetiques, le statut de p53 n’est pas toujours predictif de la reponse au traitement [73]. Consequence de la translocation chromosomique t (14 ; 18) (q32 ;q21) retrouvee dans plus de 70 % des lymphomes folliculaires et dans 20 a 30 % des lymphomes diffus a grandes cellules, la surexpression du gene bcl-Z pourrait contribuer au diveloppement de ces ntopiasies. Dans une etude menee sur une importante cohorte de patients atreints de lymphome non-hodgkinien de grade intermediaire, et trait&s de faGon standardisee par le protocole CHOP (cyclophosphamide, doxorubicine, vinblastine et prednisone), 17 % presentaient la translocation chromosomique, et 55 % exprimaient la proteine Bcl-2 (determination immunohistochimique). L’analyse multivariee a montre une correlation significative entre l’expression de Bcl-2 et le taux de rechute [57]. L’analyse immunohistochimique de l’expression de Bcl-2 dans des prelevements tumoraux de patients atteints de lymphome non hodgkinien dans le cadre du GELA (groupe d’etude des lymphomes de l’adulte) a montre que dans les lymphomes B diffus a grandes cellules, la forte expression de Bcl-2, plus frCquemment detectee aux stades II et IV de la maladie, etait associee avec un pronostic d&favorable [55]. Dans certains cas, l’expression de Bcl-2 pourrait done Ctre un paramttre pronostic dgterminant pour la constitution de groupes de risque. A l’oppose, bax pourrait Etre defini comme un (< gene suppresseur de tumeurs )). Des mutations de Bax ont d’ailleurs pu @tre detect&es dans plusieurs hemopathies malignes, consistant soit en un deplacement du cadre de lecture avec apparition d’un codon stop et perte de la prottine, soit en des mutations ponctuelles dans les domaines BH 1 et BH3 conduisant a un dtfaut de fonctionnalite de la proteine [12]. Le chromosome Philadelphie, resultat de la translocation reciproque entre les chromosomes 9 et 22, est retrouve chez 95 o/b des patients atteints de leuctmie myelo’ide chronique. 11 en resulte l’expression constitutive de la proteine tyrosine kinase Bcr-Abl, dont I’activite anti-apoptotique, en cooperation avec des lesions genetiques additionneiles, favorise la pro-

Biola

et al n

gression vers des formes agressives de la maladie resistantes a tout traitement [85].

L’etiologie de certaines maladies auto-immunes met en jeu la voie Fas, ce que nous allons illustrer a travers deux exemples. Fas joue un role cl6 dans la regulation de l’homeostasie du systeme immunitaire. Ainsi, les souris Ipr (lymphoproliferation) et gld (generalized lymphoproliferative disease) qui portent des mutations recessives spontanees respectivement dans les genes codant pour Fas [ 1451 et FasL [ 1301, souffrent d’une lymphadenopathie generalisee, dune lymphocytose massive, de splenomegalie et d’hepatomegalie, symptomes rappelant ceux du lupus erythemateux dissemint. Chez l’homme, le phenotype clinique et immunologique de la souris Ipr est retrouve en partie chez les patients atteinrs du syndrome de lymphoproliferation auto-immune non malin (ALPS) (tableau m. Cette pathologie se manifeste en effet par une accumulation de lymphocytes T immatures dans les organes lympho’ides secondaires conduisant B une lymphadenopathie massive, une hypergammaglobulinemie polyclonale, une production d’auto-anticorps, une thrombocytopenie, une neutropenie et une glomCrulonephrite. Dans une etude menee chez cinq patients atteints de ce syndrome, l’induction de l’apoptose des lymphocytes T par la voie Fas a et6 trouvee dtfectueuse, et ce en association avec diverses mutations du gene Fas [4 I]. La thyroi’dite de Hashimoto est une maladie auto-immune caractirisee par une destruction progressive du tissu thyroidien conduisant 1 une hypothyroidie clinique. L’analyse histologique rtvele l’infiltration de cellules mononucleaires (lymphocytes B et T) et de macrophages. Les phases pathologiques sont caracttrisees par une acceleration anormale de l’apoptose des thyrocytes. La presence d’anticorps anti-thyroglobuline et anti-peroxydase est variable, et ceux-ci, egalement detect& chez des sujets sains, ont un faible acces a leur cible, ce qui semble limiter leur role dans la get&e de la maladie [27]. En revanche, la production massive d’interleukine1 beta par la thyroi’de en raison de l’intense processus inflammatoire induit l’expression de Fas sur les thyrocytes qui expriment deja FasL de facon constitutive. L’expression concomitance de Fas et FasL a la surface des thyrocytes serait alors responsable du suicide, ou du fratricide de ces cellules [46].

De nombreux virus exploitent la regulation des signaux apoptotiques, soit pour assurer le maintien d’une infection virale latente, soit pour garder viable la cellule hate et ainsi augmenter l’efftcacite de la replication virale. Les strategies developpees par les virus afin d’empecher la mise en route de l’autodesrruction cellulaire interviennent a tous les stades de la cascade apoptotique. Le cycle de replication de l’adenovirus a lieu dans les cellules &pith&ales diffe’renciees selon une sequence d’&enements

n Apoptose

et pathologies

bien etablie : le g&ne ElA est exprimP de faGon precoce, et son produit, la protCine ElA, active B son tour la transcription d’autres gi-nes crprtcoces)) comme EIB, EZ, E3 et E4 [9, IO]. La proteine ElA provoque I’accumulation de p53 par un mecanisme moleculaire encore inconnu, et induit l’apoptose des cellules h&es selon deuxvoies distinctes, l’une dipendante et l’autre independante de p53 [29 ; 791. Les protCines ElB quant a elles s’opposent B la mort des cellules infect&es : ElB 55K se lie & ~53, conduisant B son inactivation, alors que ElB 19K est un analogue fonctionnel de Bcl-2 [ 1 lo], agissant via son interaction avec Bax [ 141, mais aussi avec Bak [33] er Bik [Sl]. Le virus Epstein-Barr (EBV) code Cgalement pour une protCine homologue de Bcl-2 : BHRFl [53], ainsi que pour la protCine LMP-1, qui inhibe l’apoptose de cellules B infecttes en regulant positivement l’expression de bcl-2 endogene [54]. Le gene cmzA du virus COW-poxcode pour un inhibiteur spCc&que des protCases de type ICE, ce qui entraine une inhibition de Yen&e en apoptose de la cellule hbte ainsi que de la rtaction inflammatoire causCe par la production d’interleukine-1 p [l Ill. Les b aculovirus (virus infectant les cellules d’insectes) comportent deux gttnes ayant la propri& de bloquer l’apoptose des cellules infect&es : ~35 et iap (inhibitor of apoptosis). Ces deux gt-nes, bien que fonctionnellement &quivalents, ne possildent cependant pas d’homologie de sequence. P35 inhibe aussi bien la mort d&eloppementale chez le nematode C. elegans [ 1541, que l’apoptose de cellules d’insecte infecttes par le baculovirus [18] ou de cellules de mammiferes sous l’effet de diffkrents stimuli comme les glucocortico’ides [ 1131, Fas ou le TNF-CY. [6]. Des etudes in vitro ont montre que I’35 Ptait un substrat suicide des caspases. Ses produits de clivage forment un complexe stable avec les caspases, ce qui conduit a la perte de l’activite prottolytique de ces enzymes [ 1541. Des homologues humains de IAP ont recemment ttt identifies, devoilant ainsi une nouvelle classe de rigulateurs de l’apoptose. Ainsi, les protCines cIAP-1 et cIAP-2 sont capables de s’associer aux caspases-3 et -7, et de les inhiber, selon un mecanisme diff&ent de celui de P35 [116]. Lors de l’infection par le virus de l’immunodtficience humaine (VIH), la progression de la maladie se traduit par une destruction des lymphocytes T CD4+ corr&e avec la charge virale, selon un mecanisme encore ma1 compris [19]. 11 a d’abord et6 postult que la disparition des CD4 ttait due g l’induction d’une mort apoptotique. En effet, l’enveloppe du VIH de type I se compose de deux glycoprotCines virales, ins&Ces dans la bicouche lipidique : I’une est externe (gpl20), l’autre transmembranaire (gp41), et leur association par des liaisons non covalentes conduit & la formation de dimtres ou de t&ram&es [34]. Or, dans la gpl20 se trouve un site de liaison pour le CD4, et la liaison du complexe viral transmembranaire gp120-gp41 sur le rCcepteur CD4 des cellules non infectees induirair directement l’apoptose de ces cellules [3]. La voie Fas semble egalement impliquee dans les mecanismes d’apoptose des cellules CD4+ : une augmentation de l’expression de Fas B la surface des lymphocytes a en effet et6 mesuree chez les sujets infect&, ainsi qu’une augmentation de

la sensibilite de ces cellules g entrer en apoptose 101-sde 1~ srimulation de la voie Fas [ZS]. 11 apparaEt maintenanr de plus en plus clairement que le mecanisme en cause dans la diaparition des CD4 est multifactoriel, et plusieurs observarions rCcentes sent en opposition avec un simple effet cytopathique direct du virus. En particulier, la rtplication virale ne peut &rre le seul facteur responsable de la d&plPtion des cellules CD4 : la reduction de la charge virale B des niveaux indkcelabies conduit B une restauration seulement partielle des taux de CD4 circulants [22]. Les hypotheses avancees sonr un changement de la distribution des lymphocytes T entre le sang et les tissus [ 1151, ou une alteration de leur capacitC de renouvellement [ 1501.

Dans le systttme nerveux, l’apoptose joue un r81e fondamental au tours du dheloppement. Les neurones qui ont fait des erreurs de connexions synaptiques dCgen&rent au tours de la ptriode ptrinatale, en partie par defaut de facteurs trophiques qui supprimerait un signal intrinseque dtclenchant le suicide cellulaire. Les voies de la mort cellulaire programmee seraient B nouveau activees dans les neurones qui dCgCn&rent lors de pathologies aigues (ischCmie c&Gbrale, traumatisme cr9nien) ou chroniques (maladies neurodtg&ntratives) du sys&me nerveux central (tableauZr/l. Les cascades d’&&nements conduisant B la mort neuronale dans ces pathologies font intervenir la stimulation excessive des rPcepteurs glutamatergiques (excitotoxicite), les formes oxygenees rCactives (ROS) et le monoxyde d’azote (NO) susceptibles de jouer un rBle dans le processus apoptotique (figure 3).

Les accidents vasculaires &Pbraux d’origine ischemique sent une des causes les plus courantes de mort neuronale. Dans les modeles expCrimentaux d’ischemie focale, l’occlu-

Fig

3. Les diffbrentes apoptotique dans la Amyotrophique, NO ribose) polym6rase.

voies possibles neurodkgknkation. : monoxyde d’ozote

de SLA

IO mort cellulaire : Sckrose Lot&ale ; PARP : Poly (ADP-

A Biola et al n

sion dr l‘at+re certbrale moyenne va entrainer la formation d’un in far-ctus c&tbral dam lequel les caracteristiques de mart neuronale par n&rose (gonflement et lyse de la cellule) sont clairement observees ainsi que celles de l’apoptose (condensation de la cellule, du noyau et de la chromatine, fragmentation de I’ADN en fragments oligonuclCosomiques). L’expression de proteines likes aux atteintes de I’ADN (P53, Bax, MDM2, Gadd45), Q sa reparation (PCNA) et au cycle cellulaire (cyclin A, cyclin D, cdk2, cdk4) est aussi modifiee. Dans les modeles d’ischemie globale transitoire caract&is& par une mort neuronale retardCe des cellules pyramidales dc: l’hippocampe, la fragmentation de I’ADN et l’expression des proteines likes & l’apoptose sont aussi decrites [ 13, 8 1, 1261. Des souris transgbniques qui surexpriment bcl-2 ou bien qui sont dkficientes par invalidation genique en p53 ou ICE, ont des atteintes ischemiques infirieures a celles des souris temoins 126, 83, 1221 indiquant que ces protPines joueraient un rBle important dans le processus conduisant B la mort neuronale. L’implication de la caspase-3 est aussi demontrte : son induction ou son expression est augment&e au cows de la pkriode de reperfusion qui suit l’isch&mie [ 15, 17, 931.

Les maladies neurodeg&ratives se caractirisent par une degCnCrescence touchant de faGon selective certaines populations neuronales, tvoluant lentement au tours du temps et dont le mecanisme est inconnu. L’analyse post mortem d’tchantillons de malades a permis de mettre en evidence les caracteristiques morphologiques et moleculaires de I’apoptose dans les zones l&s&es specifiques de chaque pathologie : le cortex et l’hippocampe pour la maladie d’Alzheimer [32], le striaturn pour la choree de Huntington [ 1321, la substance noire pour la maladie de Parkinson [5] et la come antCrieure de la moelle &pin&e pour la sclerose la&ale amyotrophique (SLA) [86]. Dam les regions l&es, des changements dans l’expression de proteines likes a l’apoptose telles que Bcl-2, Bcl-x et Bax et le clivage de ICE sont decrits [ 10 1, 1271. L’administration de MPTP (l-mCthyl-4-phCnyl1, 2, 3, 6tetrahydropyridine) chez l’animal produit la destruction sClective des neurones dopaminergiques de la substance noire comparable B celle retrouvCe chez les patients atteints de la maladie de Parkinson et fait apparaEtre le processus de mort apoptotique [131]. In vitro, le metabolite du MPTP, le MPP+ (1-mithyl-4-phCnylpy ri d inium) est un inducteur de l’apoptose sur des neurones mesencephaliques en culture [89]. De meme, les proteines P-amyloi’de et prtsCnilines dont les genes sont mu& dans les formes familiales de la maladie d’illzheimer sont capables dans certaines conditions d’entrafner la mort cellulaire programmte [24]. Dans le modele de choree de Huntington produit par injection intrastriatale d’acide quinolinique, les mtcanismes de mort neuronale par apoptose sent aussi dCtect& [I 071. La forme mutee de la prottine huntingtine, exprimee par le gPne trouvC associe a la maladie, Porte un domaine polyglutaminique de taille superieure B la normale code par l’expansion CAG. In vitro, l’huntingtine est clivee par la caspase-3 et ce

Tableau programmes

IV. Principales

pathologies

Maladles neurodbgCn8ratwes role omyohophique, &or&e Ixbmie. cbrbbrol)

reprfuslon

Melodies pkoproIif&ak4

oubimmwr

Mopbirs -...I

likes

6 une

d&bgulation

des

apoptotiques. (Alzhelmer. de tiunhngton)

(inforctus

du

(thyroidits oubimmune)

(Mmopdiw

Parkinson,

myocorde.

occident

de Hashim,

maligner,

S&rose

astrocy)onws.

ryndrane

la&

vosculove de lym bpabmer,

clivage se fait de faGon proportionnelle B la taille du domaine polyglutaminique de l’huntingtine [49]. Les cellules transfect&es avec des formes mutees de l’huntingtine sont plus sensibles aux agents capables d’induire l’apoptose [23]. Chez les souris ayant le g&e de la huntingtine invalid& la mart cellulaire apoptotique au tours du dCveloppement est t&s augmen&e, indiquant que I’huntingtine interviendrait dans l’apoptose [ 1591. Les souris transgeniques surexprimant le gene humain mute de la SOD1 trouve dans les formes familiales de SLA diveloppent le msme type de symptames que ceux observes chez les malades, B savoir une d&Crioration rapide au tours du vieillissement des fonctions matrices due a la dCgPn&rescence des motoneurones du cortex, du tronc cerebral et de la moelle PpiniPre. In vitro, la mutation de la SOD1 convertirait cette proteine en molCcule proapoptotique [45, 1091. Une augmentation de 15 % du temps de survie est obtenue chez ces souris transgeniques croistes avec des souris qui surexpriment le gene bcl-2 [68] ou q ui expriment un inhibiteur de ICE [42]. Ainsi, les connaissances acquises sugg&rent qu’un d&&glement de l’apoptose intervient dans de nombreuses pathologies du systkme nerveux central. Utilisation

de I’apoptose

en thkapeutique

L’un des principaux mecanismes d’action de la chimiotherapie anticancCreuse est d’induire l’apoptose des cellules cibles en generant des modifications de la physiologie cellulaire (par exemple, en endommageant I’ADN). En revanche, les m&anismes conduisant B la mise en route du programme apoptotique sont parfois encore ma1 compris, ce que nous allons illustrer par les exemples suivants. Les topoisomerases sent des enzymes qui jouent un r61e crucial dans le maintien de l’intigrit6 du materiel gCnetique et sont pour cela une cible privilPgi&e de la therapeutique anticancCreuse. Ces enzymes permettent la modification de 1’Ctat d’enroulement de I’ADN, en realisant la coupure d’un seul brin pour le type I, ou des deux brins pour le type II. Les inhibiteurs de topoisomerases I (CamptothCcine) et II (Ptoposide) stabilisent l’intermtdiaire catalytique formt par l’enzyme et I’ADN en empechant l’etape de dissociation, et induisent un clivage endonuclColytique de I’ADN conduisant B I’apoptose des cellules [56]. Le taxol ou Paclitaxel, qui a prouve son efflcacite dans le traite-

n Apoptose

et pathologies

ment des cancers du sein et de I’ovaire metastatiques [ 1491 est un agent antimitotique appartenant g une nouvelle classe d’agents anti-tumoraux : les taxanes. En se liant directement avec une haute affinite sur la tubuline, ces molCcules one la propriCtt? de modifier I’organisati.on des microtubules en induisant la formation irreversible de faisceaux parallkles dans les cellules [82]. 11 en r&ulte un blocage en phase G2/M du cycle cellulaire suivi de l’entree en apoptose de la cellule avec fragmentation internucleosomale associke aux changements morphologiques caracteristiques [7]. Les glucocorticoydes representent un element cl& de la chimiothtrapie de nombreuses hemopathies malignes comme la leucemie aigu? lymphoblastique, les lymphomes malins non hodgkiniens, la maladie de Hodgkin ou encore le myelome multiple. Ce n’est que depuis quelques annees que I’effcacitC de ce traitement a pu ctre reliee 2 l’induction de l’apoptose des cellules tumorales sensibles. Ces molecules exercent leurs effets par l’intermediaire d’un rtcepteur B localisation cytoplasmique, le recepteur aux glucocorticoi’des (ou GR) qui appartient g la superfamille des recepteurs nucleaires. Une fois acrive par la liaison de son ligand, ce recepteur migre dans le noyau et se comporte comme un facteur de transcription capable de reguler, positivement ou negativement, I’expression de g&nes cibles. L’effet lytique des glucocorticoi’des serait dfi Q l’induccion par le GR active de gPnes (( de mort )) ou g la ripression de facteurs ou de genes indispensables a la survie des cellules, les mCcanismes dCcrits diffirant en fonction de I’espt7ce et du type cellulaire 6tudiC. Ainsi, dans les thymocytes [2 11, ainsi que dans les cellules de thymome murin S49 [3 I], l’induction de l’apoptose par les glucocortico’ides nPcessite l’activation de la transcription par le GR. En revanche, dans les cellules CEM-C7 isolees chez un patient atteint de leuc& mie aigu? lymphoblastique, seul le domaine de liaison g I’ADN semble ntcessaire B l’induction de l’apoptose par la dexam&hasone, indiquant que les fonctions transactivatrices du GR ne sont pas requises [94]. Un des mecanismes proposes est une rtduction par la dexamethasone de l’expression de c-mycen dessous du niveau requis pour le maintien de la croissance et de l’integrite cellulaire [134]. Enfin, dans la lignee Jurkat l’apoptose serait induite non pas par l’induction de la transcription de genes de mort par le GR mais plutat par la repression de facteurs de survie comme Al?- 1 [52]. De faGon g&&ale, et pour toutes les thCrapies anticandreuses actuellement utilist?es, la capacite des cellules tumorales B entrer en apoptose en reponse B un stimulus cytotoxique va conditionner I’efficacitt du traitement. La d&rCgulation de l’expression de certains g&es participant au contrble du processus apoptotique, comme Bcl-2 [ 1121, peut done participer non seulement g l’&iologie des cancers, mais aussi aux m&anismes de rCsistance B son traitement [ 1001. La frequence &levee des mutations de p53 dans les cancers humains a motive l’tlaboration de strategies de thPrapie gknique qui sont actuellement au stade clinique, puisque des essais de phase I, et meme de phase II sent actuellement en tours, en particulier dans les cancers de la t&e et du cou. Le but de cette thPrapie est de restaurer, au sein des tumeurs, l’ex-

pression d’une prottine P53 normale au moyen dr \ectcurs adinoviraux exprimant le g&e ~53 sauvage sous la d&pendance d’un promoteur comme le CMV (cytomPgalovirus). L’efflcacitt d’un tel traitement a et6 montree in vitro, par I’inhibition de la croissance de diffkrentes lignees cellulaires en culture, de meme que ex vivo par l’injection intratumorale chez la souris nude de vecreurs adknoviraux exprimant le gene de ~53. Cette derniitre approche, qui est utile pour la sClection de vecteurs efficaces, a montrt qu’il trait possible de supprimer totalement in vivo la croissance des cellules tumorales, I’efficacite &ant fonction de la dose et done de la prCsence eventuelle de cellules non infectees par le vecteur utilist [ 1481. La combinaison de cette therapie avec le paclitaxel (taxol), testee sur un ensemble de lignees cellulaires dtrivees de cancers humains du sein, de la prostate, de l’ovaire, et de la tCte et du cou, a montre une efficacite soit synergique soit additive [99]. Une etude pilote de traitement par des oligonuclCotides antisens de bcl-2 de patients atteints de lymphome non-hodgkinien en rechute a et6 conduite recemment. Les patients in&s dans cette ktude ont re$u pendant 15 j une injection quotidienne d’un oligonucleotide antisens de 18 paires de bases complementaire des six premiers codons de I’ARN messager du gtne bcf-2. Le traitement n’a pas present6 d’effets toxiques, si ce n’est une inflammation locale au niveau du site d’injection. Sur les neuf patients inclus dans cette etude, deux ont present& une reduction de la taille de la tumeur (dont une reponse complete), deux une reduction du nombre de cellules lymphomateuses circulantes, quatre une chute des concentrations sCriques de lactate dCshydrog&nase [ 1461. Les inhibiteurs de caspases sonc des candidats potentiels pour le traitement symptomatique d’affections aigutis caract&isees par un exct-s d’apoptose. Leur administration in situ pourrait $tre une nouvelle arme thirapeutique dans la prise en charge de l’insuffisance coronaire aigu? ou de l’ischemie ctr& brale, en confbrant une bonne neuroprotection le temps que les cellules r&up&ent un apport trophique normal. Dans les modeles animaux d’ischtmie c&&brale, l’administration par voie intracertbrale de hoc-aspartyl(OMe)-fluorom&thylk& tone (BAF ; inhibiteur non selectif de caspases), de zVAD.FMK (inhibiteur ubiquitaire des caspases) ou de zDEVD.FMK (inhibiteur des caspases 2, 3 et 7) diminue la taille des l&ions et ameliore l’etat neurologique des animaux [ 17, 371. Ces auteurs ont montre que dans le modPle d’ischCmie-hypoxie chez le rat nouveau-n6 et lors d’une ischemie focale d’intensitk moderee, la neuroprotection est obtenue m;me avec un traitement administre 3 h ou 6 h apres I’ischtmie. La fenCtre d’opportunite therapeutique de ce type de composC beaucoup plus Ptendue que celles des antagonistes du recepteur glutamatergique permet d’envisager l’inhibition de l’apoptose comme une cible thkrapeutique. L’utilisation de modeles animaux et de souris transgkniques notamment permettra de valider cette cible therapeutique dans les maladies neurodegCn&ratives. Mais ces traitements, bien que prometteurs, comportent cependant leurs limites : les inhibiteurs de caspases agissent en bloquant les cellules a un stade intermediaire du processus, et la prevention de la mort apoptotique

A Biolo

ne s’accompagne pas forcement du maintien de la fonctionnalitC des cell&s. L’inhibition de I’apoptose comme strategic de traitement ne pourra Ctre envisagCe qu’g condition de dis.poser de mol&ules actives par voie systemique. Enfin, il sera nkcessaire de determiner les effets de l’inhibition chronique des caspases sur le dCveloppement secondaire Cventuel de pathologies malignes ou auto-immunes avant d’envisager pour ces compos& des indications dans le traitement de maladies neurodCg&&atives chroniques [58]. Mise

en bvidence

de I’apoptose

Les techniques utilistes pour identifier les cellules apoptotiques sont basCes sur la detection de leurs modificarions morphologiques et biochimiques caractiristiques. 11 faut signaler d’emblCe que la plupart de ces merhodes ont t?& mises au point sur des cellules en suspension et que peu d’entre elles sont adaptables au coupes tissulaires. De plus, dans les t&us, les cellules apoptotiques sont rapidement phagocytbes et la fen&re de temps pendant laquelle elles sont observables est relativement courte. D’autre part, et bien que les modifications structurelles sur lesquelles esr basee la methodologie accuelle soient relativement ubiquitaires, il serait illusoire de vouloir retrouver dans chaque type cellulaire l’ensemble des critkres decrits. Enfm I’apoptose, oh la cellule dirige activement sa propre Plimination en consommant beaucoup d’tnergie, est en gtneral opposee B la n&rose, phenomi3ne passif, d&gMratif et toujours pathologique. Apoptose et n&rose peuvent cependant survenir simultanemenr dam des tissus ou cultures cellulaires exposPs g certains stimuli (stress oxydatif, hypoxie, agents toxiques, choc thermique, glutamate, etc.). Le destin d’une cellule individuelle semble alors dependre du rapport entre la quantitC d’ATP dont elle dispose et l’intensitt de l’agression subie [S, 35, 72, 1251. 11 en dtcoule que dans certains contextes, apoptose et n&rose peuvent i:tre consid&& comme deux extr&mes des ccvoies de mort )) possibles d’ol l’existence possible de phknotypes mixtes pour des cellules dans lesquelles la deplt+ion totale en ATP et done la n&rose surviennent au tours de l’ex&cution du programme apoptotique. 11 n’en reste pas moins que, sur le plan pratique, dCfinir au sein d’une l&ion la contribution relative de I’apoptose, au sens large de mort active et done potentiellement modulable pharmacologiquement, est important pour &aSuer le potentiel futur d’eventuelies interventions therapeutiques [62-641. De nombreux ouvrages sont didits B la description des diff&entes techniques couramment ucilisees [25, 78, 1231 et seules certaines d’entre elles seront commentees ici. no

ue

Les changements morphologiques, et en particulier nucleaires, qui sont a l’origine de la decouverte de l’apoptose [65] restent I’un des principaux critPres permettant de l’identifier. En microscopic optique, la condensation de la chromatine et la fragmentation du noyau peuvent &re dCtect& sur des preparations <(cytospin )) (ou des coupes tissulaires) colorees a

et al

n

l’hematoxyline ou autre colorant [33]. Cependant la centrifugation et 1’Ctalement des cellules apoptotiques sur une lame peut les endommager. La microscopic en fluorescence utilisee sur des cellules non fix&es est une meilleure mCthode. Un melange d’acridine orange, colorant vital, et de bromure d’e’thidium est ajourC B une goutte de cellules en suspension et la lecture est faite immtdiatement avec une combinaison de filtre identique B celle utilisee pour la fluorescPine (excitation 2 488 nm) [I 141. Les noyaux apoptotiques presentent une chromatine condensCe verte (acridine orange), la chromatine condensee est rouge dans les cellules apoptotiques entries en n&rose secondaire (bromure d’ethidium), tandis que les cellules mortes d’emblee de n&rose ont un noyau rouge de structure normale. L’acridine orange peut &re remplacee par du Hoechst 33342 qui donne des images beaucoup plus nettes mais dans ce cas une incubation de 30 min g 37 “C est n&essaire et la lecture est faite avec une excitation en UV (< 350 nm) [ 1351. Lorsque des cellules adherentes sont etudikes, les cellules apoptotiques qui se sont dCtachees, cons& quence classique de la r&traction cellulaire cauke par I’apoptose, sont recueillies et examinPes en parallele avec les cellules encore adh&entes que l’on peut colorer directement dans la boite de Petri. L’etude en microscopic Clectronique, qui reste irremplaFable pour la visualisation detaillie des modifications structurales (perte des pseudopodes et microvilli, dilatation du reticulum endoplasmique, conservation des mitochondries) n’est pas facilement utilisable en routine mais peut se r&eler n&essaire dans certains cas douteux particulierement en ce qui concerne les coupes tissufaires [I 521.

La digestion de la chromatine en oligonucleosomes est par Plectrophorese de I’ADN sur gel d’agarose qui r&Ple la distribution classique t( en barreaux d’&helle )) de la chromatine [ 1531. Cependant, dans certains types cellulaires, cette digestion s’arr&te B un stade anttrieur (fragments de 300-50 kb) et ne peut &tre analysee que par Plectrophor&e en champ ~~1st [141]. dCtectke

Les a&rations de la chromatine (condensation et digestion) conduisent a une intensite de marquage diminuee lors de l’utilisation d’intercalants tels que I’iodure de propidium (en prtsence de RNAse) aprts fixation B I’&hanol70 % ((, pit subGl ))). Une technique simple et quantitative consiste done a analyser la proportion de cellules prCsentes dans ce pit par cytomCtrie de flux [97], en prenant garde g exclure de l’analyse les cellules nCcrotiques et les debris cellulaires. Cette technique permet egalement de visualiser l’apoptose dans une sous-population de cellules hCttrogPnes par marquage avec un anticorps fluorescCinC reconnaissant un antigene de surface I speclfique suivi de la fixation, de l’addition de RNAse et d’iodure de propidium et de l’analyse des deux populations ainsi &tre d&nies skpartment. La fixation doit imperativement faire avec de I’Cthanol et non en paraformaldehyde qui peut interfirer avec le marquage de I’ADN.

N

Apoptose

et pathologies

La fragmentation de I’ADN a Pgalement pour consiquence I’exposition de terminaisons 3’-OH libres de I’ADN qui peuvent $tre marquees enzymatiquement par l’addition rtpetitive de nucleotides modi&%. L’intensitC de marquage est done supposee Ctre proportionnelle au nombre de cassures. Les cellules marquCes sont identifiees individuellement par des techniques d’histochimie SW les coupes tissulaires et pour les cellules en suspension par examen en microscopic optique ou en cytometric de flux. Deux types d’enzymes peuvent Ctre utilis&s pour catalyser cette reaction : la TdT et l’ADN-polym& rase. Dans le premier cas I’abrhiation TUNEL a &e donnCe B cette m&hode ( TdT-mediateddUTP nick end-labeling) [44] et dans le second cas les sigles ISEL (in situ end labeling) [ 1471 ou INST (in situ nick-translation) [48] sont utilis&. La TdT est l’enzyme le plus utilise dam les divers kits commerciaux disponibles car elle pew catalyser l’addition de nuclPotides sur les cassures simple et double-brin [91] et serait done plus sensible que la polym&ase qui ne reconnalt que certaines cassures simple-brin. Cependant, il semble que la fragmentation apoptotique de I’ADN soit, au moins dam certains cas, initiee et propagke par des cassures simple -brin [14O] et que l’apoptose prCcoce puisse parfois Ctre mieux d&ectke par l’ADN-polym&ase [ 1551. En dehors du choix de l’enzyme, les kits commetciaux proposent Cgalement diffkrents types de marquage : direct (par exemple dUTP fluorescCinC) ou indirect (dUTP conjugut B la biotine, la digoxiginine ou autre et systtme de detection secondaire avec utilisation de fluoresc&ne, peroxydase, phosphatase alcaline...). Dans tout les cas les tissus sont fix& dans de la formaldihyde tampon&e afin d’evirer I’extraction de L’ADN fragment& Cette technique est I’une des seules utilisables sur les coupes tissulaires et ses disavantages sont presque exclusivement lies B des problilmes de spCcificit&. La degradation nCcrotique aleatoire de 1’ADN peut donner des images positives [47, 1191, I’autolyse post mortem de cellules de biopsie ou d’autopsie ma1 conserGes donne igalement un marquage qui peut meme avoir une forme en anneau autour de la membrane nu&aire, source de confusion possible avec une condensation chromatinienne apoptotique [ 501. L’identification des causes potentielles d’artefacts permet d’amtliorer progressivement cette technique [71]. Par exemple la proteinase K, qui permet l’ac&s B la chromatine, doit Ctre utilisee avec parcimonie car elle peut induire des cassures de I’ADN et peut itre remplacte dans de nombreux cas par un passage au four B micro-onde [X0,95]. L’apoptose survient de faGon asynchrone dans un tissu et, contrairement aux foci nicrotiques, le marquage TUNEL ne doit done concerner que des cellules isolees. Un examen histologique classique fait en parallele permet tgalement de s’assurer de l’absence d’une reaction inflammatoire, la phagocytose des cellules apoptotiques survenant avant leur d&g&irescence en debris nCcrotiques. MalgrC cette phagocytose, ii semble que la fen&e de temps pendant laquelle un marquage positif en TUNEL est observable soit un peu plus longue que celle pendant laquelle la condensation de la chromatine est detectke en morphologie, peut-Ctre parce que la digestion de L’ADN en gros fragments peut prWder cette condensation.

L’apoptose est associee dans la plupart des cas B une baisse du potentiel transmembranaire mitochondrial (D\r’) qui peut Ctre r&&e dans les cellules non fixees par une rCduction de l’incorporation de fluorochromes cationiques lipophiles tels que la rhodamine 123, le DiOC6, le JC-1 [70] et analyse en cytometric de flux. Dans la mesure oh la rhodamine 123 manque de sensibiliti et oh le DiOCG est tres sensible i la dCpolarisation de la membrane cytoplasmique qui peut igalement accompagner l’apoptose, le JC-1 est le fluorochrome recommandk par certains auteurs [ 1171. L’externalisation des residus phosphatidylsCrine sur le feuillet externe de la membrane cytoplasmique, autre &Cnement precoce dans l’apoptose, peut Otre facilement dttectke en microscopic g fluorescence ou cytomCtrie en flux apr&s marquage des cellules avec de l’annexine V conjugute a la fluoresceine en prCsence de calcium [ 1381. Le marquage, toujours fait en prPsence d’iodure de propidium, permet d‘identidier les cellules intactes (FITC-PI-), les cellules apoptotiques (FITC+, PI-) et les cellules n&rotiques (n&rose primaire ou secondaire) (FITC+PI+).

Les caspases sont activies par proteolyse et il est possible d’analyser I’activation de caspases individuelles par immunoblot du lysat cellulaire et utilisation d’anticorps spCcifiques. La diminution de la bande native et l’apparition d’une bande de plus faible poids mol&culaire signent cette activation. Cependant, il reste encore tres diffcile de trouver commercialement les anticorps appropri&. I1 en est de mCme pour l’&ude de la protColyse in situ des substrats de ces caspases. Lorsque la dttection de l’activation des caspases est d&irable, il est plus simple de mesurer le clivage de substrats synthetiques, disponibles commercialement, lors de leur incubation avec des lysats de cellules apoptotiques. Ces substrats sont des tt!trapeptides mimant le site de clivage preferentiel d’un groupe de caspases (DEVD, WAD ou autre) conjug& B la 7-amino-4-m&hylcoumarine (AC-DEVD-AMC). Les echantillons analysPs sur un fluoromttre (excitation 360 nm) &mettent une fluorescence verte B 480 nm dont I’intensite est proportionnelle Q la quantite de rPsidus AMC lib&s [137]. Le mkme type de technique peut Ctre utilise avec un substrat chromogenique tel que DEVD-pNA (p-nitroanilide) (disponible egalement commercialement) et lecture sur un spectrophotomktre [ 15 I]. Une nouvelle classe de substrats de type DEVD, fluorog& niques et permtants, a eti tr&s rCcemment d&rite. Peu d’etudes sont encore disponibles mais ce type de reactif devrait permettre l’analyse in situ de l’activation des caspases (par cytometric de flux ou microscopic) sur des cellules individuelles, avec de plus la possibilite de dPtecter simultan&nent d’autre marqueurs qui necessitent des cellules non fixCes (annexine V par exemple). I1 est clair que la silection des techniques optimales doit Ctre faite en fonction de diffkrents facteurs : mod&le &tudie (cel-

et al W

A Biola

lules en culture ou coupes tissulaires), restrictions techniques , , . (equlpement speclalis6, qualit& de conservation des p&wmenus). longueur et coGt d’une methode... Dans tous les cas cependant il est pr&f&able d’utiliser plusieurs techniques SLIT le mPme tchantillon, en in&ant toujours une observation morphologique afin de confirmer les rksultats plus quantita-. tifs obtenus par ailleurs. L’exploitation des connaissances acquises sur la regulation de I’apoptose a permis et permettra encore d’identifier non seulement les acteurs du processus impliquCs dans l’kiologie de certaines maladies, mais aussi de dkfinir des cibles pour l’klaboration de thtkapeutiques innovantes, plus spkcifiques et moins toxiques que celles utilisPes actuellement, notamment dans le domaine du cancer. Les diffkents exemples de pathologies Cvoquks dans cette revue indiquent kgalement que l’analyse des gtnes (Capoptotiques 1)pourrait B l’avenir &tre un prkieux outil de diagnostic et de pronostic.

16

17

18 19

20 21

22

Rbfhrences 1 Agarwal

ML, Taylor WR, Chernov MV, Chernova OB, Stark GR. The p53 network. JBiol Chem 1998 ; 273 : l-4 2 Alnemri ES, Livingston DJ, Nicholson DW, Salvesen G, Thornberry NA, Wong WW, Yuan J. Human ICEICEDprotease nomenclature. C&1996; 87: 171 JC. Programmed cell death and AIDS: from hypothesis to 3 Am&en experiment. Immunol Today 1992 ; 13 : 388-91 4 Anderson G P. Resolution of chronic inflammation by therapeutic induction of apoptosis. TIPS 1996 ; 17 : 438-42 I’, Vyas S, Javoy-Agid F, Herrero MT, Michel PP. Marquez J, 5 Anglade Mouatt-Prigent A, Ruberg M, Hirsch EC, Agid Y. Apoptosis and autophagy in nigral neurons of patients wirh Parkinson’s disease. .%I&

Himpathol1997 6

7

8

9

10 11

12 13 14

15

; 2 : 25-3 I

Beidler DR, Tewari M, Friesen I’D, Poiricr G, Dixit VM. The baculovirus ~35 protein inhibits Fas- and tumor necrosis factorinduced apoptosis. JBioL Chem 1995 ; 270 : 16526-8 Bhalla K, Ibrado AM, Tourkina E, Tang C, Mahoney ME, Huang Y. Tax01 induces internucleosomal DNA fragmentation associated with programmed cell death in human my&id leukemia cells. Leukemia 1993 ; 7 : 563-8 Bonfoco E, Kraine D, Ankarcrona M, Nicotera I’, Lipton SA. Apoptosis and necrosis: two distinct events induced respectively by mild and intense insults with NIMDA or nitric oxide /superoxide in cortical cell culture. Proc Nat1 Acad Sri US.4 1995 ; 92 : 7162-6 Boyd JM, Malstrom S, Subramanian T, Venkatesh LK, Schaeper U, Elangovan B, D’Sa-Eipper C, Chinnadurai G. Adenovirus ElB 19 kDa and Bcl-2 proteins interact with a common ser of cellular proteins. Cell 1994 ; 79 : 341-5 1 Branton PE et Querido E. L’adenovirus humain : une fen&z sut I’apoptose et le cancer. Mpd/Sci 1997 ; 13 : 492-500 Brenner B, Ferlinz K, GrassmC H, Weller M, Koppenhoefer U, Dichgans J, Sandhoff K, Lang F, and Gulbins E. Fas/CD95/Apo-I activates the acidic sphingomyelinases via caspases. CeN death and dt&mziation 1998 ; 5 : 29-37 Chao DT, Korsmeyer SJ, Bcl-2 family: regulators of cell death. Annu RevImmunol1998 ; 16: 395-419 Charriaut-Marlangue C, Pollard H, Ben-Ari Y. Is ischemic cell death of the apoptotic type? Adv Neural 1996 ; 71 : 425-30 Chen G, Branton PE, Yang E, Korsmeyer SJ, Shore GC. Adenovirus ElB I9-kDa death suppressor protein interacts with Bax but not with Bad.jBiolCbem 1996; 271 : 24221-5 Chen J, Nagayama T, Jin K, Sretler RA, Zhu RL, Graham SH, Simon RP. Induction of caspase-3.like protease may mediate delayed

23

24 25 26

27

28

29 30

31

32

33 34

35

neuronal

death

Neurorci

1998 ; 18 : 4914-28

Cheng Hardwick Scrence Cheng Sun Y, affords neonatal 1992-9

in the hippocampus

after

transient

cerebral

ischemia.

E, Kirsch DG, Clem RJ, Ravi R, Kastan MB, Bedi A, JM. Conversion of Bcl-2 to a Bax-like effecror by 1997 ; 278 : 1966-8 Y. Deshmukh M, D’Costa A, Demaro JA, Gidday J&l, Jacquin MF, Johnson EM, Holtzman DM. Caspase neuroprotection with delayed administration in a rat hypoxic-ischemic brain injury. J Ch Invest 1998

Clem RJ, baculovirus Clerici M, and cytokine infection:

/

Ueno K, caspases. Shah A, inhibitor model of ; 101 :

Miller LK. Control of programmed cell death by the genes p35 and iap. Mel Cpl’l Bioll994 ; 14 : 5212-22 Sarvin A, Henkart PA, Shearer GM. Apoptotic cell death dysregulation in human immunodeficiency virus pivotal facrors in disease progression. Crll death and differentiation 1997 ; 4 : 699-706 Cohen GM. Caspases : the executioners of apoptosis. Biocbem / 1997 ; 326: l-16 Cohen JJ, Duke RC. Glucocorticoid activation of a calciumdependent endonuclease in thymocyte nuclei leads to cell death. J Immzmol1984 ; 132 : 38-4’ Connors M, Kovacs JA, Krevat S, Banacloche-Gea JC, Sneller MC, Flanigan M, Metcalf JA, Walker RE, Faloon J, Baseler M, Stevens R, Feuierstein I, Masur H, Clifford L. HIV infection induces changes in CD4+ T cell repertoire that are not immediately restored by antiviral or immune based therapies. Nature Medicine 1997 ; 5 : 533-40 Cooper JK, Schilling G, Peters MF, Herring WJ, Sharp AH, Kaminsky 2, LMasone J, Khan FA, Delaney M, Borchelt DR, Dawson VL, Dawson TM, Ross CA. Truncated N-terminal fragments of huntingtin with expanded glutamine repears form nuclear and cytoplasmic aggregates in cell culture. Hum Mel Genet 1998 ; 7 : 783-90 Cotman CW. Apoptosis decision cascades and neuronal degeneration in Alzheimer’s disease. NeurobiolAging 1998 ; 19 : S29-S32 Cotter TG, Martin SJ. Tecbntquer in Apoptozik A werrjgrh& London, Portland Press, 1996 Crumrine RC, Thomas AL, Morgan PF. Attenuation of p53 expression protects against focal ischemic damage in transgenic mice. / Cereb Blood Fh Metab 1994 ; 14 : 887-9 1 De Maria R, Testi R. Fas-FasL interactions: a common parhogenetic mechanism in organ-specific autoimmunity. Immunol Today 1998 ; 19 : 121-5 Debatin KM, Fahrig-Faissner A, Enenkel-Stoodr S, Kreutz W, Benner A, Krammer PH. High expression of Apo-1 (CD95) on T lymphocytes from HIV-infected children. Blood 1994 ; 83 : 3101-3 Debbas M, White E. Wild-type p53 mediates apoprosis by ElA, which is inhibited by El B. Genes Dev 1993 ; 7 : 546-54 Deng G, Podack ER. Suppression of apoptosis in a cytotoxic T-cell line by inrerleukin-2-mediated gene rranscription and deregulated expression of the protooncogene bcl-2. Pror Natf Acnd Scz USA 1993 ; 90 : 2183-73 Dieken ES, Miesfeld RL. Transcriptional transactivation functions localized to the glucocorticoid receptor N terminus are necessary for steroid induction of lymphocyre apoptosis. Mel Cefl Biol 1992 ; 12 : 589-97 Dragunow M, Faull RL, Lawlor P, Beilharz EJ, Singleton K, Walker EB. Mee E. In situ evidence for DNA fragmentation in Huntington’s disease striatum and Alzheimer’s disease temporal lobes. Neuroreport 1995 ; 6 : 1053-7 Duvall E, Wyllie AH. Dearh and the cell. Zmmunol T&y 1986 ; 7 : 115-9 Earl PL, Doms RW, Moss B. Oligomeric wruccure of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. Proc Natl Acad Sri 1990 ; 87 : 648-52 Eguchi Y, Shimizu S, Tsujimoro Y. Intracellular ATP levels determine cell death fate by apoptosis or necrosis. Cancer Res 1997 ; 57 : 1835-40

n Apoptose

36

37

38 39

40 41

42 43 44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

et pathologies

El-Deity WS, Harper JW, O’Connor PM, Velculescu VE, Canman CE, Jackman J, Pietenpol JA, Burrell M, Hill DE, Wang Y. WAFl/CIPI is induced in p53-mediated Gl arrest and apoptosis. Cancer Rer 1994 ; 54 : 1169-74 Endres IM, Namura S, Shimizu-Sasamata M, Waeher C, Zhang L, Gomez-Isla T, Hyman BT, Moskowitz MA. Attenuation of delayed neuronal death after mild focal ischemia in mice by inhibition of the caspax family. J Cereb Blood Flotu Metab 1998 ; 18 : 23847 Evans-Storms RB, Cidlowski JA. Regulation of apoptosis by steroids hormones. / Stuoid Biochem M&c Bioll995 ; 53 : l-8 Farrow SN, White JHM, Martinou 1, Raven T, Pun K-T, Grinham CJ, Marrinou JC and Brown R. Cloning of a bcl-2 homologue by interaction with adenovirus ElB 19K. Nutwe 1995 ; 374 : 731-733 Fernandez-Sarabia MJ, Bischoff JR. Bcl-2 associates with the rasrelated protein R-ras ~23. Nature 1993 : 366 : 274-275 Fisher GH, Rosenberg FJ, Straw SE, Dale JK, Middelton LA, Lin AY, Strober W, Lenardo MJ, Puck JM. Dominant interfering Fas gene mutations impair apoptosis in a human auto-immune proliferative syndrome. Ce111995 ; 81 : 935-946 Friedlander RM, Brown RH, Gagliardini V, Wang J, Yuan J. Inhibition of ICE slows ALS in mice [letter]. iVa:atwe 1997 ; 388 : 31 Gajewski TF, Thompson CB. Apoptosis meets signal transduction: elimination of a BAD influence. Cell I996 ; 87 : 589-92 Gavrieli Y, Sherman Y. Ben-Sasson SA.Indentification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. / CeilBiol1992 ; 119 : 493-501 Ghadge GD, Lee JP, Bindokas VP, Jordan J, Ma L, Miller RJ, Roos RI’. Mutant superoxide dismutase-l-linked familial amyotrophic lateral sclerosis: molecular mechanisms of neuronal death and protection. JNeurosci 1997 ; 17 : 875646 Giordano C, Stassi G, De Maria R, Todaro M, Richiusa I’, Papoff G, Ruberti G, Bagnasco M, Testi R, Galluzo A. Potential involvement of Fas and its ligand in the pathogen&s of Hashimoto’s thyroiditis. Sctence 1997 ; 275 : 960-3 Gold R, Schmied M, Giegerich G, Breitschopf H, Hartung HP, Toyka KV, Lassman H. Differentiation between cellular apoptosis and necrosis by the combined use of in situ tailing and nick translation techniques. Lab Invert 1994 ; 71 : 219-25 Gold R, Schmied M, Rothe G, Zischler H, Breitschopf H, Wekerle H, Lassman H. Detection of DNA fragmentation in apoptosis: application of in situ nick translation to cell culture systems and tissue sections.jHirtochem Cytochem 1993 ; 41 : 1023-30 Goldberg YP, Nicholson DW, Rasper DM, Kalchman MA, Koide HB, Graham RK, Bromm M, Kazemi-Esfarjani P, Thornberry NA, Vaillancourt JP, Hayden MR. Cleavage of huntingtin by apopain. a proapoptotic cysteine protease, is modulated by the polyglutamine tract [see comments]. Nat Genet 1996 : 13 : 442-9 Grasl-Kraupp 8, Ruttkay-Nedecky B: Koudelka H, Bukowska K, Bursch W, Schulte-Hermann R. In situ detection of fragmented DNA (TUNEL assay) fails to discriminate among apoptosis, necrosis and autolytic death : a cautionary note. Hptology 1995 ; 21 : 1465-68 Han J, Sabbarini I’, White E. Induction of apoptosis by human NbWBik, a BH3-containing protein thar interacts with ElB 19K. Mel Cell Biai 1996 ; 16 : 5857-64 Helmberg A, Auphan N, Carlles C. Karin M. Glucocorticoid-induced apoptosis of human leukemic cells is caused by the repressive function of the glucocorticoid receptor. EMBOj 1995 ; 14 : 452-60 Henderson S, Huen D, Rowe M, Dawson D, Johnson G, Rickinson A. Epstein-Barr virus-coded BHRFl protein, a viral homologue of Bcl2, protects human B cells from programmed cell death. Pror Nutl Acnd Sci USA 1993 ; 90 : 8479-83 Henderson S, Rowe M, Gregory C, Groom-Carter D, Wang F, Longnecker R, Kieff E, and Rickinson A. Induction of Bcl-2 expression by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 protects infected B cells from programmed cell death. Cc/l 1991 ; 65 : 1107-15 Hermine 0, Haioun C, Lepage E, d’Agay MF. Briere J, Lavignac C, Filler G, Salles G, Marolleau JP, Diebold J, Reyas F, Gaulard P. Prognostic significance of Bcl-2 protein expression in aggressive non-

56

Hodgkin’s (GELA). Hickman

Mamasis

lymphoma.

Groupe d’etude ; 87 : 265-72 JA. Apoptosis induced by Rev 1992 ; 11 : 121-39

des lymphomcx

de l’~dult~

Blood 1996

anticancer

drugs.

C,~~ICP;

S7

Hill ME, MacLennan KA, Cunningham DC, Vaughan Hudson B. Burke M, Clarke P, Di St&no F, Anderson L, Vaughan Hudson G. Mason D, Selby P, Linch DC. Pronosric significance of Bcl-2 expression and bci-2 major breakpoint rearrangement in diffuse large cell non-Hodgkin’s lymphoma: a british national investigation study. Blood 1996 ; 88 : 1046-5 1

58

Holtzman neurodegenerarive

59

Huang DC, Adams JM, Cow S. The conserved N-terminal BH4 domain of B&2 homologues ‘is essential for inhibition of apoptosis and interaction with CED-4. EMBOJ 1998 ; 17 : 1029-39

60

Humke EW, Ni J, Dixit VM. ERiCE, a novel FLICE-activatable caspase. / Biol Chem 1998 ; 273 : 15702-7 Inohara N, Ding L, Chen S, Nuiiez G. harakirz, a novel regulator of cell death, encodes a protein that activates apoptosis and interacts selectively with survival-promoting proteins Bcl-2 and B&XL. EMBO 11937 ; 16 : 1686-94

61

62

63

DM,

Deshmukh. Caspases: a disease? Nat Med 1997 ; 3 : 954-5

treatment

for

Itoh G, Tamura J, Suzuki M, Suzuki Y, Ikeda H. Koike M, Nomura hl, Jie T, Ito K. DNA fragmentation of huma infarcted myocardial cells demonstrated by the nick end labeling method and agarose gel electrophoresis. Am J Path1 1995 ; 146 : 1325-3 1 James TN. Normal and abnormal consequences of apoptosis in the human heart. Anna Rev Physioll998 ; 60 : 303-25

64

Kajstura J, Chen W, Reiss K, Clark WA, Sonnenblick EH, Krajewski S. Reed JC, Olivetti G, Anversa I’. Apoptotic and necrotic myocyre cell deaths are independant contributing variables of infarct size in rats. Lab Invest 1996 ; 74 : 86107

65

Kerr JFR, Wyllie AH, Currie phenomenon with wide ranging Cancer 1972 : 26 : 239-57

66

Kharbanda S, Pandey P, Schtield L, Israeis S, Roncinske R, Yoshida K, Bharti A, Yum Z-M, Saxena S, Weichselbaum R, Naiin C, Kufe D. Role for Bcl-XL as an inhibitor of cytosolic cytochrome c accumulation in DNA damage induced apoptosis. Proc Natl Acad Sci

67

Kluck m4, Bossy-Wetzel E, Green of cytochrome c from mitochondria regulation of apoptosis. Science 1997

68

Kostic V, Jackson-Lewis V, de Bilbao F, Dubois-Dauphin M, Przedborski S. B&2 : prolonging life in a transgenic mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Science 1997 ; 277 : 559-62 Kroemer G, Zamzami N, Susin SA. Mirochondrial control of apoptosis. Immune/ Today 1997 ; 18 : 44-51

AR. Apoptosis implications

: a basic biological in tissue kinetics. Br j

USA 1997 ; 94 : 6939-42

69

DR,

Newmeyer : a primary ; 275 : 1132-6

70

Kroemer G. Mitochondrial implication endosymbionr hypothesis of apoptosis DiffPrentintion 1997 ; 4 : 433-56

71

Labat-Moleur F, Guillermet C, Lorimier I’, Robert C, Lantuejoul S, Brambilla E, Negoescu .4. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections : critical evaluation and improvement / Histocbem Cytochem 1998 ; 46 : l-8 Leist M, Single B, Castoldi AE, Kuhnle S, Nicotera I’. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration : a switch in the decision between apoptosis and necrosis.]& Med 1997 ; 185 : 14814

72

73 74

75

in apoptosis. evolution.

DD. The release site for Bcl-2

Towards an Cell Death

Levine AJ. ~53. the cellular gatekeeper for growth and division. Cell 1997 ; 88 : 323-31 Li I’, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad h4, Alnemri ES, Wang X. Cytochrome C and dATP-dependent formation of Apaflicaspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Celi 1997 ; 91 : 479-89 Liu W, Zou H, Slaughter C, Wang X. DFF, a heterodimeric protein that functions downstream of caspase-3 to trigger DNA fragmentation during apoptosis. Cell 1997 ; 89 : 175-84

A Biola

‘6

‘7

78 79

I o&shin RA, Williams CM. Programmed cell death: endocrine potcntiarion of the breakdown of the intersegmental muscles of silkmoths. /insect Pbysioll964 ; 10 : 643-649 Lockshin RA. Programmed cell death: activation of lysis by mechanism involving the synthesis of protein. J lplsecr Ply&l 1969 ; 15 : 1505-16 Loo DT. Rillema JR. Measurement of cell death. M&ads Cell Bioi 1998 ; 57 : 25 1-64 Lowe SW, Ruley HE. Stabilizarion of the p53 turnor suppressor is induced by adenovirus ElA in mouse rhymocytes. Genei De11 1993 ;

7 : 53545 80

81

82 83

84

85

86

87

88

89

90

91 92 93

94

95

96

Lucassen PJ, Chung WCJ, Vermeulen JP, van Lookeren Campagne M, Hein van Dierendonck J, Swaab D. Microwave-enhanced in situ end-labeling of fragmented DNA: parametric srtudies in relation to postmortem delay and fixation of rat and human brain. J Him&wm Cyrochem 1995 ; 43 : 1163-71 MacManus JP, Linnik MD. Gene expression induced by cerebral ischemia : an apoptotic perspective. / Cereb Bbood Flow Metab 1997 ; 17 : 515-32 Manfredi JJ, Parness J, Horwitz SB. Taxol binds to cellular microtubules. / Cell Bioll982 ; 34 : 688-96 Marrinou JC, Dubois-Dauphin M. Staple JK, Rodriguez I. Frankowski H, Missorten M, Albertini P, Talabot D, Catsicas S. Pietra C. Overexpression of BCL-2 in transgenic mice protects neurons from naturally occurring cell death and experimental ischemia. Arewon 1994 ; 13 : 1017-30 Maze1 S, Burtrum D, Petrie HT. Regulation of cell division cvcle progression by bcl-2 expression: a potential mechanism for inhibiion of programmed cell death. J Exp Med 1996 ; 183 : 22 19-26 McKenna SL. Cotter TG. Functional aspects of apoptosis in hematopoiesis and consequences of failure. Adv Cancer Res 1997 ; 71 : 121-64 Migheli A, Piva R, Atzori C, Troost D, Schiffet D. c-Jun, JNK/SAPK kinases and transcription factor NF-kappa B are selectively activated in astrocytes, but not motor neurons, in amyotrophic lareral sclerosis. ] Neuropathol Exp Neural 1997 ; 56 : 13 1422 Miyashita T, Reed JC. Tumor suppressor p53 is a direcr transcriptional activator of the human bax gene. Cell 1995 ; 80 : 293-9 h4iyashira T, Krajewski S, Krajewska IM, Wang HG, Lin HK, Hoffman B, Lieberman D, Reed JC. Tumor suppressor p53 is a regulator of bcl-2 and bax in gene expression in vitro and in viva. Onrogene 1994 ; 9 : 1799-805 Mochizuki H, Nakamura N, Nishi K, Mizuno Y. Apoptosis is induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+) in ventral mesencephahc-striatal co-culture in rat. Neurosci Lett 1994 ; 170 : 1914 Momand J, Zambetti GP, Olson DT, George D, Levine AJ. The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivarion. Celf 1992 ; 69 : 123745 Mundle SD, Gregory SA, Preisler HD, Ra~a A. Enzymatic programming of apoptotic cell death. Patitobiobgy 1996 ; 64 :161-70 Nagata S. Apoptosis by death factor. Cell 1997 ; 88 : 355-65 Namura S, Zhu J, Fink K, Endres M, Srinivasan A, Tomaselli KJ. Yuan J, Moskowitz MA. activation and cleavage of caspase-3 in apoptosis induced by experimental cerebral &hernia. / Nenrorci 1998 ; 18 : 365968 Nazareth LV, Harbour DV, Thompson EB. IMapping the human glucocorticoid receptor for leukemic cell death. / Biol Gem 1991 ; 266 : 12976-80 Negoescu A, Lorimer P, Labar-Moleur F, Drouet C, Robert C, Guillermet C, Brambilla C, Brambilla E. In situ apoptotic cell labeling by the TU!iEL method : improvement and evaluation on cell preparations. J Histocbem Cytochem 1996 ; 44 : 959-68 Nicholson D, Thornberry N. Caspases : killer proteases. 7X% 1997 ;

22 : 299-306 97

Iiicoletti I, Migliorari G, Pagliaci MC, rapid and simple method for measuring

Grignani F, Riccardi thymocyte apoptosis

C. A by

et al

n

propidium iodide staining and flow cytometry. / Immunol Methods 1991 ; 139 : 271-79 98 Nicorera P, Leist M. Energy supply and the shape of death in neurons and lymphoid cells. Cell Death Differ 1997 ; 4 : 43542 99 Nielsen LL. Lipari P, Dell J, Gurnani M, Hajian G. Adenovirusmediated p53 gene therapy and pa&axe1 have synergisric efficacy in models of human head and neck, ovarian, prostate, and breast cancer. C&z Cancer Res 1998 ; 4 : 83546 100 Nirto MA, Lopez-Rivas A. IL-2 protects T lymphocytes from glucocorticoid-induced DNA fragmentation and cell death. / Immunoi 1989 : 143 : 4166-70 101 h‘ishimoto 1, Okamoto T, Giambarella U, Iwatsubo T. Apoptosis in neurodegenerative diseases. 4dv Phamacol1997 ; 41 : 337-68 102 h‘unez G, Clarke MF. The Bcl-2 f am, I y 0 f proteins: regulators of cell death and survival. Trends Cell Biof 1994 ; 4 : 399-403 103 O’Connor L, Strasser A, O’Reilly LA, Haussman G, Adams JM, Coly S, Huang DCS. Bim: a novel member of the Bcl-2 family that promotes apoptosis. ElclBO J 1998 ; 17 : 384-95 104 Oliner JD, Kin&r KW, Meltzer PS, George DL, \~ogelstein B. Amplification of a gene encoding a p53 associated protein in human

sarcomas. Nmure

1992 ; 358 : 80-3

105 Oltvai ZN, .Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in viva with a conserved horn&g, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell 1993 ; 74 : 609-19 106 Owen-Schaub LB, Zhang W. Cusack JC, Angelo LS. Santee SIM, Fujiwara I-, Roth JA, Deisseroth AB, Zhang WW, Kruzel E, et al. Wild-type human p53 and a temperature sensitive mutant induce FasiAPO-1 expression. Mel CeN Biol1995 ; 15 : 303240 107 Portera-Cailliau C, Hedreen JC, Price DL. Koliatsos VE Evidence for apoprotic cell death in Huntington disease and excitotoxic animal models. /Newok 1995 ; 15 : 3775-87 108 Preudhomme C, Fenaux I’. The clinical significance of mutations of the ~53 tumour suppressor gene in haematological malignancies. Br J Hmmatoll997 ; 98 : 502-l 1 103 Rabizadeh S, Gralla EB, Borchelt DR, Gwinn R. Valentine JS, Sisodia S, Wong P, Lee M, Hahn H, Bredesen DE. Mutations associated wirh amyotrophic lateral sclerosis convert superoxide dismutase from an antiapoprotic gene to a proapoptotic gene: studies in yeast and neural cells. Proc NatlAud Sri USA 1995 ; 92 : 3024-8 110 Rae L. Debbas M, Sabbatini P, Hockenbery D, Korsmeyer S, White E. The adenovirus El.4 proteins induce apoptosis, which is inhibited by the El B 19KDa and Bcl-2 proteins. Proc Narf Acad Sci USA 1992 ;

89 : 7742-6 111 Ray CA, Black RA, Kronheim SR, Greenstreet TA, Sleath PR, Salvesen GS, Pickup DJ. Viral inhibition of inflammation : cowpox virus encodes an inhibitor of the interleukin-1 (beta) converting enzyme. Cell 1992 ; 69 : 597-604 112 Reed JC. Bcl-2 and chemoresistance in cancer. In: K&n JA, eds. Afterwtwe mechanisms of multidrug resistance in CR~CEI. Birkhaiiser, 1995 : 191-214 113 Robertson KM, Zangrilli J. Fernandes-Alnemri T, Friesen PD, Lirwdck G, Alnemri ES : Baculovirus P35 inhibits the glucocorticoidmediated parhway of cell death. Cancer Rei 1997 ; 57 : 4347 114 Roger R. Issaad C. Pallardy M et al. BCR-ABL does not prevent apoptotic death induced by human natural killer or lymphokineactivated killer cells. Blood 1996 ; 87 : 1113-22 115 Rosenberg YJ, Anderson AO, Pabst R. HIV-induced decline in blood CD4iCD8 ratios : viral killing or altered lymphocyte trafficking. hnmunol Today 1998 ; 19 : 10-7 116 Roy N, Deveraux QL, Takahashi R, Salvesen GS, Reed JC. The cIAP-I and c-IAP-2 proteins are direct inhibitors of specific caspases. EMBO J1997 ; 16 : 6914-25 117 Salvioli S, Ardizzoni A, Franceschi C, Cossarirza A. JC-1, but not DiOC6 or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells : implications for studies of mirochondrial functionality during apoprosis. FEBS Lert 1797 ;

411 :77-82

n Apoptose

et pathologies

118 Sander CA, Yano T, Clark HM, Harris C, Longo DL, Jaffe ES. Raff..ld M. p53 mutation is associated with progression in follicular lymphomas. Blood 1993 ; 82 : 1994-2004 119 Sasano H. In situ end labeling and its applications to the study of endocrine disease: how can we study programmed cell death in surgical pathology material? Endocr Pathol1995 ; 2 :87-9 120 Sato T, Hanada M, Bodrug S, Irie S, Iwama N, Boise LH, Thompson CB, Golemis E, Fong L, Wang HG. Reed JC. Interactions among members of the B&2 protein family analyzed with a yeast two-hybrid system. ProcNatlAcadSci USA 1994 ; 91 : 9238-42 121 Savill J, Fadok V, Henson I’, Haslett C. Phagocyte recognition of cells undergoing apoptosis. Immunol Today 1?93 ; 14 : 131-6 122 Schielke GP, Yang GY, Shivers BD, Betz AL. Reduced ischemic brain injury in inrerleukin-1 beta converting enzyme-deficient mice. / Cereb BioodFlowMerab 1998 ; 18 : 180-5 123 Schwartz LM, Osborne BA, eds. Cell Death. Methods in Cell Biology, ~0146. Academic Press, New York. 1995. 124 Shibasaki F, Kondo E, Akagi T, McKeon F. Suppression of signalling through transcription factor NF-AT by interactions between calcineurin and B&2. Nature1997 ; 386 : 728-31 125 Shimizu S, Eguchi Y, Kamike W, Itoh Y, Hasegawa J, Yamada K, Orsudi Y, Matsuda H, Tsujimoto Y. Induction of apoptosis as well as necrosis by hypoxia and predominant prevention of apoprosis by B&2 and Bcl-XL. Cancer Rer 1996 ; 56 :2161-66 126 Silverstein FS. Can inhibition of apoptosis rescue ischemic brain? / C/m Invest 1998 ; 101 : 1809-10 127 Stefanis L, Burke RE. Greene LA. Apoptosis in neurodegenerarive disorders. Curr Open ~Veuroll997 ; 10 : 299-305 128 Sukharev S, Pleshakova 0, Sadovnikov V. Role of proteases in activation of apoptosis. Cell Death Doffer 1997 ; 4 : 457-62 129 Susin SA, Zamzami N, Castedo M, Hirsch T, Marchetti P, IMacho A, Daugas E, Geuskens M, Kroemer G. Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease. /Exp Med 1996 ; 184 : 1331-1341 130 Takahashi T. Generalized lymphoproliferative disease in mice, caused by a poinr mutation in Fas ligand. Ceil 1994 ; 76 : 969-76 131 Tatron NA, Kish SJ. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of l-methyl-4.phenyl-1,2,3,6tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining. Neuroscience 1997 ; 77 : 1037-48 132 Thomas LB, Gates DJ, Richfield EK, O’Brien TF. Scweizer JB, Swindler DA. DNA end labelling (TUNEL) in Huntington’s disease and other neuropathological conditions. Exp Neural 1995 ; 133 : 265-72 133 Thompson CB. Apoprosis in the pathogenesis and treatment of desease. Science 1995 ; 267 : 1456-62 I34 Thulasi R, Harbour DV, Thompson EB. Suppression of c-myc is a crirical step in glucocorticoid-induced human leukemic cell Iysis. / Biol Chem1993;268:18306-12 135 Tsujimoro Y. Apoptosis and necrosis: intracellular ATI’ level as a determinant for cell death modes. CellL&& Dzjj% 1997 ; 4 : 429-34 136 Tsujimoto Y, Croce CM. Analysis of the structure, transcripts, and protein products of t&l-Z, the gene involved in human follicular lymphoma. ProcNatlAcadSci USA 1986 : 83 : 5214-8 137 Vaux DL, Wilheim S, Hacker G. Requirements for proteolpsis during apoprosis. Izfol Cell Bioll997 ; 17 : 6502-7 138 Vermes I, Haanen C, Steffens-N&ken H, Reutelingsperger C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using Huorescein labelled Annexin V. JImmunolMethods 1995 ; 184 : 39-51 I39 Villa I’, Kaufman” SH, Earnshaw WC. Caspases and caspases inhibitors. TIBS 1997 ; 22 : 388-393 140 Walker PR, LeBlanc J, Sikorska LM. Evidence that DNiA fragmentation in apoptosis is initiated and propagated by single-strand breaks. Cell Death Dzfftr 1997 ; 4 : 506-15

141 Walker PR, Kokilwa L, LeBlanc J, Sikorska hl. Detection ot tht, Initial stages of DNA fragmentation in apoptosis. Biotechnique: 1’19.3 : 15 : 1032-9 142 Wang H-G, Takayama S, Rapp UR, Reed JC. Bcl-2 intel.icting protein, BAG-l, binds to and activates the kinase Raf-1. PY~I, Nuri Acad Sri 1996a ; 93 : 7063-8 143 Wang H-G, Rapp UR, Reed JC. Bcl-2 targets the protein kinasr Raf-1 to mitochondria. C&f 1996b ; 87 : 629-38 144 Wang S, Miura M, Jung YK, Zhu H, Li E, Yuan J. Murinc caspase11, an ICE-interacring protease, is essential for the activarion of ICE. Cell 1998 ; 92 : 501-9 145 Watanabe-Fukunaga R, Brannan CI, Copeland KG, Jenkins NA, xagata G. Lymphoproliferation disorder in mice explained by a defect in Fas anrigen that mediate apoptosis. Narure 1992 ; 356 : 314-Y' 146 Webb A, Cunningham D, Cotter F, Clarke PA, di Stefano F, Ross P, Corbo M, Dziewanowska Z. Bcl-2 antisense therapy in patienrs with non-Hodgkin lymphoma. Lancet 1997 ; 349 : 1137-41 147 Wijsman JH. Jonker RR, Keijzer R, van de Velde CJH, Cornelisae CJ, van Dierendonck JH. A new method to detect apoptosis in paraffin sections : in situ end-labeling of fragmented DN.4. J Histochem Cjmchem 1993;41 : 7-12 148 Wils KN, Maneval DC, h,Ienzel P, Harris MP, Surjipro S, Vaillancourt M, Hung W-M, Johnson DE, Anderson SC, Wen SF, Bookstein R. Shepard HM, Gregory RJ. Developpement and characterization of recombinant adenoviruses encoding human p53 for gene therapy. Human Gene Therapy 1994 ; 5 :1079-88 149 Wiseman LR, Spencer CM. Pacliraxel. An update of its use in the treatment of mrtasratic breast cancer and ovarian and other gynaecological cancers. Drugs Aging 1998 ; 12 : 305-34 150 Wolthers KC, Schuitemaker H, Miedema F. Rapid CD4+ ‘I‘-cell turnover in HI\‘-1 infecrion: a paradigm revisited. Immunoi T0da.y 1998;19:44-8 151 Wright SC, Schellenberger U, Wang H, Kinder DH, Talhouk JW, Larrick JW. Activation of CPP32-like proteases is not sufficient ro trigger apoptosis: inhibition of apoptosis bv agents that suppress activation of AP24, but not CPP32-like ac&ity. / Exp Med 1997 ; 186: 1107-15 152 Wyllie AH, Kerr JFR, Curie AR. Cell death: the significance of apoptosis. Int Rev Cytol1980a ; 68 : 25 l-306 I53

Wyllie AH. Glucocorticoid-induced with rndogenous endonuclease

&cation.

thymocyte apoptosis Nature 1980b

is associated : 284 : 5554

154 Xue D. Howirz HR. Inhibition of the Caenorhabditis elegans celldeath protease CED-3 by a CED-3 cleavage site in baculovirus p35 protein. Nature 1995 ; 377 : 248-51 I55 Yamadori I, Yoshino T, Kondo E, Cao L, Akagi T. Matsuo Y, Minowada J. Comparison of two methods of staining of apoprotic cells of leukemia cell lines: terminal deoxynucleotidyl transferax and DNA polymerase I reactions. / Hisrochem Cytorbem 1998 ; 46 : 85-95 156 Yang J. Liu X, Bhalla K, Naekyung Kim C, Ibrado AM, Cai J, Peng TI, Jones DP, Wang W. Prevenrion of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome c from mirochondria blocked. Science 1997 ; 275 : 1129-32 I57 Yuan J. Transducing signals of life and death. Curr Open CeN Biol 1937 ; 9 : 247-51 158 Zamzami N, Susin SA, March& I’, Hirsch T, Gomez-Monterrey I. Casredo M, Kroemer G. Mitochondrial control of nuclear apoptosls. / ExpMed1996; 183: 1533-44 159 Zeitlin S, Liu JP, Chapman DL, Papaioannou VE. Efstratiadis A. Increased apoptosis and early embryonic lethality in mice nullizygous for the Huntington’s disease gene homologue. Nat Genet 1995 ; 11 : 155-63 160 Zou H. Henzel WJ, Liu X, Lutschg A, Wang X. Apaf-1, a human prorein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell 1997 ; 90 : 405-13