Induction indirecte du prophage λ par le rayonnement ultraviolet

Mutation Research Elsevier Publishing Company, Amsterdam Printed in The Netherlands

713

I N D U C T I O N I N D I R E C T E DU P R O P H A G E 2 P A R LE R A Y O N N E M E N T ULTRAVIOLET

RAYMOND D E V O R E T E T J A C Q U E L I N E GEORGE Laboratoire des Faibles Radioactivitds, CNRS, 9 I, Gif-sur- Yvette (France) (Re~u le io avril, 1967)

SUMMARY

Indirect induction of prophage 2 by ultraviolet irradiation When Escherichia coli K 12, lysogenic for phage 2, is irradiated with ultraviolet light, prophage 2 immediately enters the vegetative state (direct ultraviolet induction). The induction stimulus produced by ultraviolet irradiation can be transferred b y conjugation from an irradiated F+~- strain to a non-irradiated F-2 + strain (indirect ultraviolet induction, or BOREK-RYAN phenomenon, 1958 ). Some of the properties of indirect and direct ultraviolet induction are compared in this paper. The efficiency of indirect induction is 50% of that obtained by direct induction at optimal ultraviolet doses. Both processes show a two-hit curve at increasing ultraviolet doses. There is a synergistic action of direct and indirect induction when applied to the same recipient strain. These two processes appear to be closely related; they m a y share a common mechanism which leads to prophage induction. Indirect induction is mediated through the transfer of an irradiated sex factor such as factor F. In Hfr × F - conjugation, in which factor F is very seldom transmitted to the recipient strain, no indirect induction occurs. These results eliminate the possibility that chromosomal DNA is responsible for indirect induction. They suggest instead that an extrachromosomal determinant (factor BR) is involved. Factor B R is non-specific; it induces various unrelated inducible episomes. It is unstable, having a half-life of about 8 min at 37 °. Different kinds of data provide indirect evidence in favor of the hypothesis that factor B R is constituted of ultraviolet irradiated DNA. Our experiments suggest that factor BR m a y be an irradiated replicon, such as factor F or factor col I. These two replicons are small enough to be wholly transmitted to the recipient cell. Prophage ~ induction can be triggered in the absence of a direct effect of ultraviolet light upon the prophage or upon the repressor which is synthesized under the control of the prophage.

INTRODUCTION

Chez les baet6ries lysog~nes, lors de la division cellulaire, le DNA du prophage est reproduit par la ce]lule en harmonie avec le DNA bact6rien. Cet 6quilibre peut 6tre Mutation Res., 4 (I967) 713-734

714

R. DEVORET, J. GEORGE

rompu par l'irradiation ultraviolette des bact6ries lorsque le prophage est sensible Faction de ce rayonnement 24. Sous l'effet de l'irradiation, la synth~se du phage v6gdtatif se ddclenche, c'est l'induction du prophage ag. Parmi les nombreux agents physiques ou chimiques capables de produire l'induction lysog6nique aS, le rayonnement ultraviolet (2537 A) est l'un des plus efflcaces, du fait de son absorption s~lective par les acides nucl6iques de la bact6rie 1". Le mdcanisme par lequel s'exerce l'action induetrice du rayonnement ultraviolet est, ~ l'heure actuelle, fort mal connu. Selon JACOB EX MOXOD2~, les agents inducteurs ont pour propridtd commune de ddclencher la formation d'un "inducteur" qui entrerait en competition avec le "r@resseur" dont la synth~se est gouvernde par un g~ne r6gulateur du prophage. L'induction lysogdnique peut 6tre provoqude en l'absence d'exposition "a un quelconque agent inducteur. Dans ce cas, l'induction se produit sans qu'il y ait formation apparente "d'inducteur". C'est le cas de l'induction zygotique qui a dt6 ddcouverte par JACOB EX WOLLMAN28. Celle-ci se produit, par exemple, lorsqu'au cours d'un croisement une bact6rie donatrice Hfr lysog~ne pour le phage it transf~re avec son chromosome le 15rophage 5 une bactdrie rdceptrice non lysog~ne; transnfis A une cellule rdceptrice non immune, le prophage se d6veloppe & l%tat v4g6tatif. En revanche, l'induction ne se produit pas lorsque, r~ciproquement, une bactdrie donatrice Hfr non lysog~ne est crois~e avec une bact~rie r~ceptrice lysog~ne. Ces r~sultats ont 6td les premiers A sugg&er l'hypoth~se de l'existence d'un "r@resseur" cytoplasmique produit par le prophage. Selon cette hypoth6se, le r@resseur assurerait la stabilit~ de l'incorporation du prophage dans le g6nome bactdrien en empdchant la synth~se de protdines prdcoces ndcessaires A la multiplication du phage. L'induction zygotique serait due A l'absence de r@resseur cytoplasmique dans la bactdrie non lysog6ne qui regoit le prophage. De nombreux faits=6, 5~ sont en faveur de l'existence d'un r@resseur cytoplasmique mais, jusqu'A pr6sent, les exp6riences tendant A ddmontrer son transfert d'une cellule A une autre ~ se heurtent A des difficultds d'interprdtation. En revanche, les tentatives faites pour transf6rer au tours de la conjugaison bactdrienne un facteur inducteur produit par les ultraviolets ont donn6 un r4sultat positif. BOREK EX RVANs, ont d6montrd chez Escherichia coli K 12 qu'une bactdrie r6ceptrice F lysog6ne pour le phage it, (F- it+), est induite apr~s conjugaison avec une bactdrie donatrice F+, (F + 2 ), qui a 6t4 pr6alablement exposde au rayonnement ultraviolet. Ce phdnom~ne se produit que la bact6rie donatrice F+ poss~de ou non un prophage. I1 faut souligner que ce processus d'induction par conjugaison ne r~sulte pas du transfert du prophage au cours du croisement; c'est pourquoi, il ne doit pas 6tre confondu avec l'induction zygotique dont il diff6re compl~tement. Afin de contribuer 5. la connaissance du mdcanisme par lequel l'induction du prophage se produit chez E. coli K 12 (it), nous avons entrepris une dtude quantitative du ph~nom~ne d~crit par BOREK ET RVAX~, ~. Des rdsultats pr61iminaires ont ~t~ pr~c~demment rapport6s~, 1.. L'ensemble des donndes obtenues est exposd dans la pr6sente publication. Terminologie Pour la clart6 de l'exposd, nous proposons les ddfinitions suivantes relatives fi l'induction par les ultraviolets. MutaIion Res., 4 (1967) 713-734

715

I N D U C T I O N I N D I R E C T E DU P R O P H A G E ~

Induction directe: survient lorsque le rayonnement a fit6 absorb6 par la bactdrie lysog~ne elle-m6me. Induction indirecte: l'induetion se produit chez une bact6rie r~ceptrice F - lysog~ne ~ la suite du eroisement avec une bact~rie donatrice prdalablement irradide par les ultraviolcts (effct BOREK-RvAN). Facteur BR: ddsigne le facteur, form6 ~ la suite de l'irradiation, dont le transfert au eours de la conjugaison provoque l'induction de la bactdrie lysog~ne rdceptrice. MATI~RIEL ET MI~THODES

Souches bactdriennes el bactdriophages utilisds Les souches bact~riennes sont d6crites dans le Tableau I. Selon les n6cessit6s exp~rimentales, on a introduit dans les souches figurant au Tableau I de nouveaux marqueurs gdn~tiques qui sont explicitement mentionnds dans la suite de l'exposd. TABLEAU

I

SOUCHES BACTI~RIENNES UTILISI~ES Les caract~res des souches sont d6sign~s par des symboles qui signifient : incapacit~ de synth~tiser l a t h r ~ o n i n e t h r - , l a l e u c i n e l e u - , l a t h i a m i n e thi , la c y s t ~ i n e cys , l ' h i s t i d i n e h i s - , l a m 6 t h i o n i n e m e t ; i n c a p a c i t 6 d e f e r m e n t e r le l a c t o s e lac , la g a l a c t o s e g a l - ; s o u c h e n o n l y s o g ~ n e p o u r le p h a g e it, (it) , l y s o g ~ n e p o u r ce p h a g e , (it)+, r ~ s i s t a n t e ~ ce p h a g e , itr, s e n s i b i l i t d a u p h a g e T1, Tls e t r 6 s i s t a n c e , T l r ; slr s e t sir r s i g n i f i e n t r e s p e c t i v e m e n t s e n s i b i l i t 6 ou r ~ s i s t a n c e ~ l a s t r e p t o m y c i n e L e s s o u c h e s e m p l o y e e s d a n s ce t r a v a i l n o u s o n t 6t6 a i m a b l e m e n t d o n n 6 e s p a r les Drs. JACOB ET WOLLMAN 1 e t p a r le Dr. BOREK 2. Ddsignalion

Caract~res gdndliques

Origine

Prove~ance

Hfr H W 1485 II2 W 6 200 P S / F - I a c W 1177 C 600

H f r thi sir s (it)- T1 s F + p r o t o t r o p h e ().) strs F + c y s - his gala (it)- sir s F + m e t B - (it)+ sir s t h i - (.~)- sty s l a c - / F - l a c + F-thr leu-thi-lac (]t)+.~rslr r F t h r - lez~- t h i - lac (it) strs T1 r

HAYES ~s LEDERBERG ET LEDERBERG 37 ~VOLLMAN 52 LEDERBERG ET LEDERBERG 37 JACOB ET ADELBERG 22 I-EDERBERGETLEDERBERG sT APPLEYARD 2

(I)

(2) (I) (2) (I) (2)

(I)

Les phages employ6s pour lysogdniser les souches sensibles sont: 2: provenant de la souche sauvage prototrophe K 12 (2) + (bibl. 36); 2 ind-: non inductible par les ultravioletsS4; 2 857: non inductible par les ultraviolets et induit g la temp6rature de 4 °o (bibl. 51); 434 hy: poss6dant l'immunit6 de 434 (bibl. 3o). Les bact~ries rdsistantes ~ ~ ont ~t~ s61ectionndes ~ l'aide du phage virulent 2 vir (bibl. 27).

Milieux de culture (~) Milieu complet. Liquide: Nutrient Broth Difco: 3 g, Bacto-Tryptone: 5 g, NaCI: 5 g, eau distill6e: IOOO ml. Solide: Peptone: 8 g, Bacto-Tryptone: 5 g, NaCI: 5 g, Bacto-agar: 15 g, eau distill6e: IOOOml. (2) Milieu minimal: Gray et T a t u m modifi647 NH4CI:5 g; N H 4 N Q : I g; Na~SO4: 2 g; MgSO4" 7 H20 : o. I g; CaC12: I mg; K2HPO4 : 3 g ; KH2PO4 : I g; glucose : 5 g; eau distill~e: IOOO ml. Pour la pr@aration d'un milieu minimal solide, on ajoute 15 g d'agar par 1. Pour assurer la croissance de souches auxotrophes, le milieu minimal est additionnd de facteurs de croissance 3~. M u t a t i o n R e s . , 4 (1967) 7 1 3 - 7 3 4

716

R. DEVORET, J. GEORGE

(3) Le milieu minimal sans glucose sert de tampon pour les dilutions des phages et des bact6ries. Pour les 6talements en gdlose molle, la concentration d'agar des milieux solides est 6gale ~ 7.5 g par 1. La streptomycine a 6t6 utilis6e ~ la concentration de IOO/~g/ml. Cultures bactdriennes--Ddnombrement des bactdries et des phages Les bact4ries sont cultivdes dans des bulleurs bien a4r4s dispos4s dans un bainmarie A 37 °. Les milieux sont ensemenc6s au 1/2o de leur volume avec un inoculum provenant d'une culture pouss4e durant la nuit. On suit la croissance des bact6ries par des mesures de densit4 optique effectu6es avec le spectrophotom&tre de Jobin et Yvon (micro-cuve de 0. 4 ml, I cm de trajet optique, longueur d'onde 650 m#). Les techniques utilis~es pour le d4nombrement des bact6ries et des phages sont celles d4crites par ADAMS1.

Croisements Des cultures en milieu complet de bact4ries donatriees et r6ceptrices en voie de eroissance exponentielle sont centrifug4es ~ 4 ° lorsqu'elles atteignent une concentration 6gale ~ 3" lO8 bactdries par ml. Les culots de centrifugation sont remis en suspension dans une solution tampon r4frig4rde. Des 4ehantillons de ees suspensions bact4riennes Sont pr41ev4s pour ~tre irradids par l'ultraviolet. Puis tousles 6chantillons, quel que soit le traitement subi, sont ~ nouveau centrifug4s et les culots resuspendus en milieu complet. Les croisements bact4riens sont alors r4alis4s en m41angeant 2 ml de chaeune des cultures de bact4ries donatrices et r4ceptrices dans des tubes Borrel qui sont ensuite agit~s rdguli~rement au bain-marie ~ 37 °. Lorsque les baetdries donatrices sont lysog&nes (~t)+ ,~s ou bien sensibles (4)-~, on utilise des bact4ries r~ceptrices F streptomyeino-rdsistantes et on ajoute ~ 30 rain de la streptomycine (IOO/~g/ml) qui emp~che la production de phages mflrs provenant des bact4ries m~les mais n'influe pas sur le processus de conjugaison.

Mesure de l'induction (x) Mesure des phages libres. Apr6s 14o min de conjugaison, on centrifuge le contenu des tubes Borrel et on 61imine les baet6ries r6siduelles du surnageant soit par raise en contact avec KCN 0.03 M pendant 30 rain ~ 37 °, technique utilis6e dans nos premi6res expdriences, soit par addition de chloroformeal; c'est ce dernier procdd6 qui a 6t6 le plus souvent utilis6. Les phages ~ sont r6v416s apr6s 25 rain de pr6adsorption & la tempdrature de 37 ° sur les bactdries indicatrices C 600 ou 112 en prdsence de Ca(NOa)2, IO-a M e t de MgSO4, (7 H~O), IO-3 M. (2) Mesure des centres infectieux. La souche r4ceptrice utilis4e dans les croisements est streptomycino-sensible. Les 4chantillons ~ d4nombrer sont pr41ev4s dans les tubes Borrel apr~s 4 ° rain de conjugaison. Les 4talements sont faits en pr4sence de souehe indicatrice streptomycino-r4sistante sur des boites de P4tri bien s~ches et port4es ~ 37 °. Apr~s 4talemcnt, les boltes sont remises rapidement ~ 37 ° et maintenues entr'ouvertes dans l'6tuve pendant Ioo min. Elles sont finement pulv4ris4es avec de la streptomycine, suivant une technique mise au point par LUZZATI(communication personnelle), 14o rain apr~s le d4but de l'exp4rience.

Mutation Res., 4 (1967) 713-734

INDUCTION INDIRECTE DU PROPHAGE ,~

717

Techniques d'irradiation (~) Irradiation ultraviolette. Elle est effectu6e avec une lampe germicide General Electric de I5 W. La dose d'exposition est mesur6e avec un dosim~tre de LATARJET et al. 34 en erg par m m 2 de surface irradi6e. A une distance de 71 cm du tube germicide, la pr6paration revolt IO erg.mm-2.sec 1. L'~paisseur de la suspension bact~rienne irradi6e est 6gale A I ram. On prend les pr6cautions n6cessaires pour 6viter toute photorestauration. (2) Irradiation par rayons X. On utilise sans filtration, sous une tension puls6e de 5 ° kV un tube Machlett OEG 60 A anticathode de tungst~ne qui dans ces conditions donne un rayonnement dont on a mesur6 l'~nergie moyenne 6gale/~ 8 keV. En effet, l'6paisseur de demi-absorption de ce rayonnement dans l'eau est dgale/t 0. 9 mm. Les 6chantillons sont irradi6s A 9-5 cm de la fen~tre avec un d~bit de dose 6gal & 45 ° R/sec. Le volume et l'6paisseur de la suspension irradi6e sont respectivement dgaux 2 m l e t I mm. RESULTATS

Rendement de l'induction indirecte L'induction indirecte a 6t6 d6couverte par BOREK ET RYAN5 qui ont d6montr6 l'existence de ce ph6nom~ne en croisant en milieu synthdtique des bact6ries r6eeptrices lysog6nes avec des bactdries donatrices F+ carenc6es. Cette technique de croisement ne nous a pas donn6 des r6sultats suffisamment reproductibles. I1 nous est apparu que, pour tirer des conclusions valables de l'6tude de l'induction indirecte, il fallait recueillir des donn6es quantitatives aussi bien que qualitatives. C'est pourquoi, d'une part, nous avons employ6 une m6thode de croisement standardis6e, efficace et reproductible (voir MATI~RIELET MI~THODES); d'autre part, nous nous sommes efforc6s de d6terminer avec pr6cision le rendement de l'induction indirecte par rapport ~t l'induction directe. La dose de rayonnement utilis6e pour effectuer cette comparaison 6tait 6gale A 800 ergs/mm~; dans nos conditions exp6rimentales cette dose a une efficacit6 maximal e pour produire l'induction directe. (I) ~,valuation thdorique. Pour ~valuer l'efficacit~ de l'induction indirecte par rapport ~ l'induction directe, on doit comparer les r~sultats de 3 croisements effectu6s simultan6ment. (Les cultures irradi6es pr6alablement aux croisements sont indiqu6es par un ast6risque.) Croisement A: F+ (t)-* x F - (;t)+; Croisement B: F+ ().)- x F - (i)+*; Croisement C: F+ (i)- x F - (;t)+. Ces trois croisements permettent d'6valuer respectivement les taux d'induction indirecte (croisement A), d'induction directe (croisement B) et la production spontan~e de phages (croisement C) clans des conditions exp~rimentales comparables. Si Yon d6signe par a, b, et c les nombres de centres infectieux ou de phages libres produits par les bact6ries r~ceptrices F - (;t)+ au cours des croisements A, B e t C et par p la fr6quence des bact6ries femelles ayant conjugu~, on peut d6finir l'efficacit6 de l'induction indirecte relativement A l'induction directe par le rendement th~orique R suivant la formule (I): a--C

I

Mutation Res., 4 (1967) 713-734

718

R. DEVORET, J. GEORGE

( 2 ) Ddtermination du rendement lhdorique R. On a estim6 le rendemcnt thforique R de l'induction indirecte clans 7 exp6riences inddpendantes (voir Tableau II). Los valeurs a, b et c on 6% ddtermin6es par la mesure des centres infectieux. On a 4valud la fr6quence p des bactdries femellcs qui conjuguent avcc les bactdries rubles en vdrifiant, par des exp6riences de transfert de l'6pisome F-lac, qu'elle correspond assez prdcis6ment, dans nos conditions expfrimentales, ~t la probabilit6 d'appariement que l'on peut ddduire d'une distribution de Poisson off la moyenne repr6sente le rapport des concentrations des bactfries donatrices aux bact6ries rdceptrices. TABLEAU

I1

RENDEMENT

DE L'INDUCTION

[NDIRECTE

EVALUI~ PAR LA MI3SURE D E S C E N T R E S I N F E C T 1 E U X

On a effectual 7 expdriences i n d d p e n d a n t e s ; los c r o i s e m e n t s et le d d n o m b r e m e n t des c e n t r e s infect i e u x o n t e:td r~alisds solon los c o n d i t i o n s exp(~rimentales dScrites d a n s MATERIEL ET M~THODES; on a utilisd c o m m e s o u c h e d o n a t r i c e F + : I I 2 (2) ? r e t c o m m e souchc rdceptricc F : C 6 o o ( ) . ) + ) r slr s, la souche i n d i c a t r i c e e m p l o y d e pour le d d n o m b r e m e n t des c e n t r c s i n f e c t i e u x d t a i t C 6oo ()0 )s slr r. I.,% sig nificatio n des s y m b o l e s R, a, b, c e t p e s t i n d i q u d e clans le t c xt c . La p r o b a b i l i t d p e s t tirde d ' u n e t a b l e n u m d r i q n e de la d i s t r i b u t i o n de Poisson en p r e n a n t p o u r ino\ ennc le r a p p o r t des b a c t d r i e s 1:-/F .

Centre in.fectieux 7, ±oC'/ml Induction indirecte a Induction directe b Production spontande c Rapport F'/F p 1¢ %

l-.vpdriences l II

ll[

1V

02 ioo 4.2 o.59 o.45 Ioo

37 05 o.oi 5.4 0.99 57.4

23 05 o.oi 1.~ 0.67 52.2

3° 14o 3.2 0.70 0.50 38

V

VI

8 39 34 38 o.l 4 o.3 0.o 3.4 0.99 0.96 23"2 l oo valour nmyenne:

VII 20 72 0.53 2.0 0.86 40.6 55.9

Comme le montre le Tableau lI, le rcndcmcnt th6orique R de l'induction indirecto est cn moyenne ~gal & 56o,o. Ce rendement est trhs variable, il ddpend de l%tat physiologique des cultures bact~riennes, de la concentration respective des bact6ries donatrices et r6eeptrices. Fait important, l'induction indirecte d~croit en fonction du temps qui s'~coule entre l'irradiation des bact6ries donatrices et le contact effectif de eelles-ci avec les bact6ries r~ceptrices (voir p. 725). C'est pourquoi le rendement tie l'induction indirecte d@end 6troitement des variables qui eonditionnent la vitesse de l'appariement des bact6ries m~les et Iemelles. (3) Rendemenl thdorique ~et rendement ex]Sdrimental. Etant donn~ que la frdquence p des bac%ries rdceptrices qui s'apparient avee les bac%ries donatrices n'a pas 6t~ mesurde dans la plupart de nos expdriences mais simplement ealcul~e, il est plus simple et aussi justifi6 de d~terminer le rendemcnt de l'induction indirecte sans tonic compte de l'appariement des cellules. On peut cldfinir le rendement exp6rimental R~,,p de l'induction indirecte par la formule (2): a

R~.p

c

t~--c

(2)

D'autre part, la mesure des ~entres infectieux West ni aisde ni toujours applicable. C'est t)our(tuoi nous avons cherch~ /t dvaluer le rendement Re.j, par la mesure des phages lib6rds au (:(mrs des croisements.

(4) Ddlerminalion du rendemenl expdrimental R,~, par la mesure des phages M u t a t i o n Res., 4 (1967) 713 73,t

719

INDUCTION INDIRECTE DU PROPHAGE ~

libres. La dftermination des taux d'induction a, bet c par la mesure des phages libres n'a de valeur que si l'on connait, dans les conditions oh sont r6alis6s les croisements: (a) le temps de latence de la lyse bact6rienne et le nombre de phages libfrds par bact6rie induite ; (b) la concentration maximale des bact6ries femelles qui n'influe pas sur le rendement de production de phages tout en permettant une grande rapidit6 de l'appariement; (c) le rapport optimum des concentrations des bact6ries males et femelles. Le taux de phages produits par induction directe ou indirecte est maximal au bout de 14o min comme le montre l'6tude de la cindtique d'apparition des particules infectieuses (Fig. 7). Le d6nombrement des particules phagiques a donc 6t6 effectu6 au temps 14o min dans la plupart de nos expfriences. On a utilis6 une concentration de bact6ries femelles 6gale 5~ 3" lO8 bact6ries/ml et, d'autre part, on a choisi un rapport des concentrations des souches donatrices et r6ceptrices 6gal/~ I. Cela est exp6rimentalement justifi6 comme le montre la Fig. i. Lors de l'induction directe, le nombre de phages libdr6s (courbe A) reste constant pour des rapports de concentration bactfries donatrices/bact6ries r6ceptrices inf6rieurs ~ 1. 5 puis d6crolt rapidement pour des valeurs supdrieures. Dans l'induction indirecte, le nombre de phages lib6r6s crolt d'abord en fonction du rapport de la concentration des bact6ries donatrices/bact6ries r6ceptrices; les conditions optimales sont atteintes lorsque ce rapport est compris entre I et 1.5. Une analyse plus d6taill6e de la courbe B montre que l'induction indirecte r6sulte d'un appariement efficace des 100

1010

A

100

Centres BI

Phages 80

A - - - A . . . . . • ....~ , - A

}

'A m o

libres

80

60

60

"o

109

/° ~ °

o eft_

B/O~Oo.

"A

g

~o

4O 2O

20

10 8 0.1

I. 02

Rapport

I. 05

l

l

l

1

2

5

du nombr'e de bacteries F+ F-

0 0 20 40 60 80 100

o

0 20 40 60 80 100

Rendement

Fig. i. I n d u c t i o n i n d i r e c t e en f o n c t i o n de la m u l t i p l i c i t 6 r e l a t i v e des bactEries F + a u x ba c t dri e s F-. D a n s les c o n d i t i o n s e x p E r i m e n t a l e s usuelles, les bactEries rEceptrices E t a n t ~ une c o n c e n t r a t i o n dgale ~t 3" lOS b a c t E r i c s / m l , on a p o r t e en ordonnEe le n o n l b r e de p h a g e s libErEs en 14o inin a u c o u r s d e s 2 c r o i s e m e n t s s u i v a n t s : W 1485 ()l) ~tr* × W 1177 (courbe B) et W I485 (~t)-~tr × W 1177" (courbe A). La dose* Etait dgale ~t 8o0 e r g / m m 2. E n abscisse, e s t reprdsent~e la c o n c e n t r a t i o n relat i v e des bactEries F + p a r r a p p o r t a u x b a c t d r i e s F-. Fig. 2. C o m p a r a i s o n du r e n d e m e n t Rex p de l ' i n d u c t i o n i n d i r e c t e p a r la m e s u r e des p h a g e s l i bre s et des c e n t r e s infectieux. On a r e p r e s e n t 6 le r e n d e m e n t Rexp de l ' i n d u c t i o n i n d i r e c t e dvalu6 p a r la m e s u r e des p h a g e s libres d a n s 21 e x p e r i e n c e s i n d E p e n d a n t e s ( h i s t o g r a m m e A) e t p a r la m e s u r e des c e n t r e s i n f e c t i e u x d a n s 13 e x p e r i e n c e s i n d E p e n d a n t e s ( h i s t o g r a m m e B). Les c r o i s e n l e n t s o n t 6tE rEalis6s a v e c les souches F + : I I 2 ~tr et VvT 1485 ~tr et les souches F :W 1177 e t C 60o (;t) + h r. E n abscisse, on a p o r t 6 les v~leurs du r e n d e m e n t Rexp groupEes p a r classes d ' i n t e r v a l l e s 6 g a u x ~ 20°(,. F n ordonnde, s o n t reprdsentEs les p o u r c e n t a g e s des e x p e r i e n c e s a p p a r t e n a n t ~ une classe donnde, le n o n l b r e a b s o l u des e x p e r i e n c e s effectuEes est i n d i q u d d a n s les cases hachurEes.

Mutation Res., 4 (1967) 713-734

720

R. DEVORI'LT, j. GEORGE

bact6ries conjugantes qui ob6it ~ une loi du hasard du type de la distribution de poisson. Moins rigoureuse que la mesure des centres infectieux, la mesure des phages libres permet d'6valuer plus aisfiment des taux d'induction indirecte tr~s faibles ce qui justifie son emploi. Pour comparer le rendement Reap d6termin6 par la mesure des phages libres 5, cdui ~valu6 par la mesure des centres infectieux, on a effectu6 des exp6riences dent les r~sultats sent r6sum6s sur la Fig. 2. D'apr~s ces donn6es, les moyennes des valeurs de I¢e,p sent respectivement 6gales ~ 44°,,o (phages libres) et 41% (centres infectieux). On constate done que l'une ou l'autre m6thode de d6termination du rendement de l'induction indirecte donne des r6sultats semblables. En outre, on voit que la valeur de R~p 6tablie uniquement d'apr6s les mesures est relativement peu inf6rieure celle du rendement th6orique R oh l'on tient compte de l'appariement des cellules. (5) Iuduclion indirecte et production spontande de phages. Si l'on compare le nombre de phages lib6r6s par induction indirecte a 5, celui des phages produits spontan6ment c, le rapport a/c est en moyenne 6gal 5, 125 d'apr6s les donn6es repr6sent6es sur la Fig. 3. L'effet d'induction indirecte est important, done ais~ment d6tectable.

Relation dose effet daus l'induction indireete (z) Comparaison des courbes d'induction directe et indirecte. Lorsqu'on repr6sente le nombre de centres inf~:etieux produits par l'induction directe en fonction de la dose de rayonnement, la courbe obtenue pent ~tre d6compos6e en 2 parties; la partie ascendante traduit l'induction proprement dite, la partie descendante traduit la capacit6 de la bact6rie 5, former un centre infectieux, c'est-A-dire it donner au inoins un phage mflr 21. La Fig. 4 rapporte une exp6rience off l'on a compar6 la courbe d'induction de bact6ries lysog6nes F , apr6s irradiation ultraviolette directe, et apr6s conjugaison avec des bact6ries donatrices irradi6es. On observe que: (a) pour une dose donn6e, le nombre de centres infectieux produits par induction indirecte est plus faible que celui obtenu par induction directe. Si l'on compare la partie ascendante des 2 courbes d'induction directe et indirecte, tout se passe comme si le processus de conjugaison introduisait un facteur de r6duction de dose. (b) La capacit6 des bact6ries induites ne parait pas atteinte dans l'induction indirecte. La faible diminution du taux d'induction que l'on observe aux fortes doses peut ~tre rattach6e k une inactivation de l'aptitude des bact~ries m~les 5` conjuguer. Ces r6sultats sent conformes 5` ce que l'on pouvait attendre en l'absence d'irradiation directe des bactdries lysog6nes. (2) Forme de la partie ascendante de la courbe d'induction indirecte. Dans le but de pr6ciser la relation qui lie l'induction indirecte ~ la dose d'ultraviolet, on a d6termin6 la forme du segment ascendant de la courbe d'induction en soumettant la bact6rie donatrice F + 5`des doses relativement faibles comprises entre 32 et 4oo ergs/mm ~ (Fig. 5). On obtient en coordonn6es logarithmiques une droite dent la pente est 6gale ~t 1.8. Cette valeur est tr6s proche de celle ~gale 5` 2 trouv6e par MARCOVICH~1 dans le cas de l'induction directe. Ces r6sultats suggfirent que l'effet inducteur est lid ~ la survenue de deux 6vfnements d'6gale probabilit6 (courbe ~ deux coups) dans les deux

Mutation Res., 4 (I967) 713-734

INDUCTION INDIRECTE DU PROPHAGE

2

721 100

J,'v, ',)i6----6- "'~,'

100.

~

8o

~

~o

og 4o~,

/

~o~

.~

~o-~

~

~o-~

~','&

!

',,

•

\

',,\ '\ \

o •

'

""

I~/

u ~

'

\ ~

10 ~

', \ 0

1~'1~

Induction indirecte / / F~roduction sponton~e

,i0~

I

0

I

800

I

I

1600

2400

Dose : eo 9 • m m -2

Fig. 3. Comparaison de l'induction k la p r o d u c t i o n spontan~e de phages. On a repr6sent6 en abscisse le r a p p o r t a/c des p h a g e s lib6r6s en 14 ° rain p a r induction indirecte a sur le n o m b r e de p h a g e s p r o d u i t s s p o n t a n ~ m e n t c au cours de 2i experiences d6jk rapport~es darts la Fig. 2A. Les valeurs de a/c qui s'~chelonnent entre 12 et 474 ont 6t6 g r o u p i e s p a r classes de multiples de IOO..~'n ordonn6e s o n t indiqu6s les pourcentages des experiences a p p a r t e n a n t & une class6 donn~e, le n o m b r e absolu d'exp~riences effectu~es est donn6 dans les cases hachur~es. Fig. 4. Comparaison de l'induction indirecte k l'induction directe en fonction de la dose & u l t r a violet. Au cours d ' u n croisement 112 ~r* × C 600 (~.)+)1.r str 8 (induction indirecte) on a mesur6 la fr6quence des centres infectieux (&) et la survie des bact6ries donatrices (&). P o u r ~valuer l'induction directe, on a effectu6 le croisement 112 ~lr × C 600 (~)+ ~lr st#,* on a mesur6 la fr6quence des centres infectieux o b t e n u s (©) et la survie des bact~ries lysog~nes induites (e).

modes d'induction consid~r6s. Le processus de conjugaison qui intervient dans l'obtention de l'induction indirecte ne modifie pas la forme de la courbe d'induction. Ces donn~es permettent de supposer qu'un m6canisme commun est ~ l'origine de l'induction directe ou indirecte. (3) Action synergique de l'induction indirecte et de l'induction directe. Si l'on effectue le croisement F+ (2)-* × F - (2)+% les bact6ries donatrice et r6ceptrice 6tant toutes deux irradi6es, on observe chez la bact~rie r6ceptrice F - (2) + un taux d'induction tr~s sup~rieur ~ celui qui r6sulterait de l'addition de l'induction directe ~ l'induction indirecte (Tableau III). La valeur th6orique de l'induction survenant & la suite de deux 6v6nements inducteurs ind6pendants est calcul6e selon la formulOS: Pr(A +B) = Pr(A)+Pr(B)--

Pr(A.B). A repr6sente l'induction directe, B l'induction indirecte; dans les exp6riences

Pr(A.B) est nul. Les donn6es du Tableau I I I indiquent que: Pr(A +B) >~ Pr(A) +Pr(B). Nos r6sultats montrent que lorsque la cellule r6ceptrice est soumise en mSme temps ~. l'induction directe et ~ l'induction indirecte, ces deux processus ne se comportent pas comme deux 6v6nements ind6pendants. I1 y a synergie de leurs effets. Ce fait est en faveur de la similitude des deux modes d'induction directe et indirecte. Mutation~Res.,W4 (1967) 713-734

722

R. D E V O R E T ,

J. GEORGE

"I'ABIA,; A tT i i i ACT2ON SVNERGIQU:,; DE L'IRRAD2ATION DES I3ACTI~RIES DONATRICE;S ET RI'CI~,I'TR2CI'S

l)~ms c e t a b l e a u s o n t r a p p o r t d s les r d s u l t a t s d e 3 expdriences inddpendantes d a n s l e s q u e l l e s les b a c t d r i e s d o n a t r i c e s utilisdes s o n t r e s p e c t i v e m e n t : e x p , 1, W 1 4 8 5 ().) ;tr; e x p . 1 I, W i 4 8 5 (2) As; e x p . I 11, W 1485 (,1. i n d ) + As. l_)ans c h a c u n e d e s expdriences, des dehantillons d'une culture de 1~ s o a c h e rdceptrice W I 177 s o n t i r r a d i d s a u x doses faibles suivantes: o.5o et i o o e r g s / m m a. lls sont ensuite croisds a v e c d e s dchantillons d'une culture d e souche donatrice I:~ e x p o s d e g des doses d g a l e s "k o et 8oo e r g / m m -°. ( ) n mesure les p h a g e s l i b d r d s a p r b s 14o rain d e conjugaison dans les ditIdrents croisements. L'induction mixte (directeq indirecte) est d6terminde e x p d r i mentalement, S a valettr thdorique est calculde en additionnant les valeurs de l'induction directe et indirectc obtenues i n d d p e n d a m m e n t d a n s Ies mames conditions e x p d r i m e n t a l e s . Exp&ie;~ces I .

.

.

.

II

.

.

.

.

Iil

D o s e re('tte pa~" la sozfche

t:- ergs.mm

o

IOO

o

5o

IOO

o

--

88

--

---

09

.50

'2 ,5°

ioo

Phages × Io~/ml

Induction indirecte croisement

Induction directe croisement B :F* ,'< F * Production spontande croisement

93

" -

--

23

76

--

38

52o

-

0.6

--

--

2.2

--

-

I

---

181

553

"

5 lo

2380

93

(93 + ~3) lO6

(93 } 76) 169

(88 + 38) 121i

(88 f 5 2 o ) ()o8

I. 7

3.2

--

-

12

II2

A : F +* ".,"F

. . . .

C : F + X V"

Induction mixte croisement D : F +* >', F * Valeur expdrimentalc

Induction n l i x t e croisements (A ~ B ) .

203

987

(09 I 12) 8i

(69 ; 112) 18i

1.2

5.4

E 88

09

Valeur th4orique T

Rapport E / T

i

i

4

3.4

i

(4) Induction indirecte et recombinaison gdndtique. On a vu prdcddemment que le rendement de l'induction indirecte est proche de 5o°,~ lors de croisements m e t t a n t en jeu des bactdries donatrices de t y p e F +. On sait que le taux de transfert chromosomique observ4 au cours de croisements F + × F - est tr6s faible, a p p r o x i m a t i v e m e n t lO .4 par bactdrie donatrice, Si l'irradiation ultraviolette n'augmente pas consid& rablement la fr6quence du transfert chromosomique lors d'un croisement F+ × F-, on est en droit de consid4rer que l'induction indirecte n'est pas lide au transfert du c h r o m o s o m e de la bact6rie donatrice. La Fig. 6 rapporte les r6sultats d'une expdrience off l'on a mesur6 simultan6rnent en fonction de la dose: (a) le nombre de bact&ies donatrices F+ survivantes l'irradiation; (b) le nombre de phages libdr6s par les bact6ries r6ceptrices F - ; (c) le nombre de recombinants gdn6tiques thr+ lezt + str r formds au cours des eroisements. La courbe d'inaetivation des bactfries donatrices F + est une courbe sigmoide de multiplieitd 3 environ. Le taux de survie atteint i o 2 pour une dose 6gale ~t 135o e r g s . m m -2. Le nombre de phages produits s'61~ve rapidement pour tendre vers un plateau h partir de doses sup4rieures ~ i o o o erg. m m -~. Le nombre de recombinants thr + lezt + str r, 6gal A IO-4 pour la dose o, croit d'un facteur 5 aux faibles doses d'UV c o m m e l'a montrd HAYES 19. Pour des doses plus fortes, le nombre de recombinants dderoit suivant une radiosensibilitd 6gale ~ eelle de la survie des mgdes. Ainsi en fonction de la dose de rayonnement, le taux d'induetion indirecte et le nombre de recombinants form6s varient de fagon diam6tralement opposde. L'induction indirecte semble rdsulter d'un transfert de matdriel eytoplasmique, )/lulation Res., 4 (1967) 713-734

723

INDUCTION INDIRECTE DU PROPHAGE 2

109 , 108

I ~

' ]108

¢/e'",,o"

"'" O ",,

~0~

"o

~.0

10e

a

,'o

t. r~ ;=

•

~

O~

°r 107 o_

10~

106

•

// \\

105

L

\

F~

e/ v/'.

E

O Z

\ N

\ %\

1~0 Dose,

104

~,c

10~

/o /o

1°10

r o. -D

xx\

./i

/o

P

r~

",p

/,

t V / 0 t t' •

6

109

er-g • mm -2

1000

10 3

0

,

2

,

4

,

n

I

103

t

6 8 10 12 14 16

Dose : engs.100.mm -2

Fig. 5. Courbe d ' i n d u c t i o n indirecte ~ faibles doses. On a effectu(~ 4 s~ries i n d @ e n d a n t e s (indiqu6es p a r les s y m b o l e s v , e , ©, &) du c r o i s e m e n t : W 1485 ().) ,t s Mr s* x W 1177. Le n o m b r e de p h a g e s libres est p o r t s en ordonnde, la dose d ' u l t r a v i o l e t regue p a r les bact~ries donatrices est indiqu~e en abscisse. Apr~s 3o m i n de c o n j u g a i s o n on a ajout~ de la s t r e p t o m y c i n e (ioo pg/ml) d a n s le milieu afin d ' e m p ~ c h e r le d 6 v e l o p p e m e n t d a n s la souche W" 1485 de p h a g e s lib~r~s p a r la souche rdceptrice W 1177. Fig. 6. I n d u c t i o n indirecte et f o r m a t i o n des r e c o m b i n a n t s . Au cours du c r o i s e m e n t W I485 (~.)X W I 177, on a mesur~, en fonction de la dose d ' u l t r a v i o l e t regue p a r les bact~ries donatrices, la survie de la s o u c h e d o n a t r i c e F + irradi~e (courbe B), les p h a g e s lib6r~s a u b o u t de 14o m i n de c o n j u g a i s o n (courbe A) et le n o m b r e de r e c o m b i n a n t s t h r + le~q+ s t r r f o r m , s (courbe C). Apr~s 3o nlin de c o n j u g a i s o n on a ajout~ de la s t r e p t o m y c i n e d a n s le milieu (ioo fig/nil) afin d ' e m p ~ c h e r le d d v e l o p p e m e n t d a n s la souche W 1485 de p h a g e s lib~r~s p a r la souche r(ceptrice W 1177.

~8.

ce mot 6tant pris dans le sens de non chromosomique. Ceci est confirm6 par les rdsultats des expdriences(d~crites plus loin)effectu6es en utilisant des bact6ries donatrices Hfr.

Polaritd de l'induction indirecte L'induction indirecte ob6it/~ la loi de polarit6 g6n6tique mise en dvidence par HAYES19 pour le transfert du facteur F. En effet, elle ne se produit que lors du croiscment F + (2)-* × F - (2) + et non lors du croisement F + (2) + × F - (2)-* (Tableau IV). Ces donndes confirment celles obtenues par B O R E K ET R Y A N 6. Ces donn6es ~liminent l'existenee d'un transfert r6eiproque de materiel cytoplasmique au cours de la eonjugaison, elles permettent d'exclure l'intervention d'interm~diaires m6taboliques excrdt6s dans le milieu de culture par les bact6ries irradi&es. Elles sugg~rent que le transfert de mat6riel eytoplasmique responsable de l'induetion indirecte n'a lieu vraisemblablement que lors du passage orient6 de la particule F de la bact6rie donatrice & la baet6rie r6ceptrice. I1 semble alors justifi6 d'utiliser une d6nomination particuli6re pour d6signer le d~terminant cytoplasmique hypoth~tique responsable de l'induction indirecte par l'ultraviolet: c'est pourquoi, nous proposons le terme de facteur BR (bibl. 12). Mutation

Res.,

4 (1967) 713-734

724

R. DEVORET, J. GEORGE

TABLEAU

1V

POLARITE DE L'INDUCTION INDIRECTE

Les souche~ d o n a t r i c e s s o n t ddriv6es de W 1485, les s o u c h e s rdceptrices s o n t d6riv6es de C 600. Les c r o i s e m e n t s s o n t effectuds d a n s les c o n d i t i o n s ddcrites d a n s MAT]~RIEL ET M~THODES. La dose d ' i r r a d i a t i o n regue p a r les c u l t u r e s nlarqu6es d ' u n astdrique est ~gale h 80o e r g s / m m ~. On d d n o m b r e les p h a g e s lib6r6s aprbs 14o m i n de conjugaison. Croisemenl

P h a g e s X z o* / m l

F+(.~) ~ r X F (/~)+)r. F + (a) ~ r * X F (~)+~r F+().)~,~rXF (;t)-~r F ~ ( ~ , ) ~ j , r × F (),) jr*

O.i5 318 7. I ii.5

Cindtique de l'induction indirecte La question se pose de savoir si le transfert du facteur B R responsable de l'induction indirecte est contemporain du passage du facteur F dans la bactdrie r6ceptrice. L'6tude de la cin~tique d'apparition de 1'induction indirecte comparativement ~t l'induction directe dolt indiquer si le transfert du facteur BR est prdcoce ou tardif au cours du croisement. On a mesur6, au cours d'une m~me experience, la cin6tique de la production des phages libdrds par induction directe (croisement F + × F-(2)+*), par induction 10;

i

i

i

~

i

100

A ,~ -x 4t

.,i(o'o -° 10e

10g Oio

I

'

i

'

i

'

i

,

t

'

i

'

/ o

OXo 0

O~O

,rj

107

..~ 10~

0

c/,--.-°

.o_ =

8 t

/

\o.

"D

n

\ "E

Xo\

10

10~

f ,,..i

t

10 7

oE

104

B i

i

3; 6LO 9'0 120 150 T e m p s : minutes

o.1

0

, ,:,77777:7 20 so 4o so 6o 10

7o

106

Temps : minutes

Fig. 7. Cindtique d ' a p p a r i t i o n des p h a g e s nlflrs p r o d u i t s p a r i n d u c t i o n indirecte. D a n s cette exp4rience, on a croisd la s o u c h e d o n a t r i c e \V i485 (~) )r et la s o u c h e rdceptrice \V i i 7 7 . On a m e s u r 6 g t e m p s v a r i a b l e s p a r la t e c h n i q u e au chloroforme le n o m b r e de p h a g e s mflrs i n t r a b a c t d r i e n s p r o d u i t s lors de l ' i n d u c t i o n directe (croisement F + × F - (2)+*, courbe A), lors de l ' i n d u c t i o n indirecte (croisement F + * × F - ()l) +, courbe B), et s p o n t a n d m e n t (croisement F + × F - ()l) +, courbe C). Fig. 8. Cindtique de disparition de l ' i n d u c t i o n indirecte. U n e culture de la souche V¢ I 4 8 5 (~)- t~r est irradide darts les c o n d i t i o n s h a b i t u e l l e s p a r u n e dose d ' u l t r a v i o l e t 4gale & 8oo e r g / m m 2. L a s u s p e n s i o n b a c t d r i e n n e est remise en milieu n u t r i t i f et conservde k 37 °. Apr~s u n ddlai variable, indiqu6 en abscisse s u r la figure, des 6chantillons de cette c u l t u r e s o n t pr4lev6s et mdlangds avec u n e s u s p e n s i o n de bact6ries femelles W I 177. Apr~s 14 ° rain dc c o n t a c t e n t r e les bactdries d o n a trices et rdceptrices, on m e s u r e le h o m b r e de r e c o m b i n a n t s thr + leu + str r formds et le n o m b r e de p h a g e s p r o d u i t s p a r i n d u c t i o n indirecte. E n ordonnde, s o n t portds le n o m b r e absolu de recomb i n a n t s form6s (courbe B) et le t a u x d ' i n d u c t i o n indirecte r a p p o r t 6 & la v a l e u r o b t e n u e & t e m p s o (courbe A). M u t a t i o n Res., 4 (I967) 713-734

INDUCTION INDIRECTE DU PROPHAGE ~.

725

indirecte (croisement F +* × F - ().)+) et spontan~ment (croisement F + × F-()~)+). Les phages produits par induction indirecte apparaissent 45 min apr~s le d6but du croisement. Au bout de 14o min, le taux de phages lib6r6s est 6gal ~t 5o% de celui obtenu par induction directe. Le temps moyen de la production de phages est de 95 min pour l'induction directe et de IiO min pour l'induction indireete, soit un ~cart de 15 rain. Dans une exp6rience au cours de laquelle le croisement a ~t6 interrompu par agitation m~canique ~ 5 et 15 min, le rendement d'induction indirecte par rapport ~t l'induction directe passe de o ~ 340/0 . Ces diff6rcnts r6sultats indiquent que le facteur BR est transf6r~ pr6cocement au cours des croisements, essentiellement dans les 15 premieres minutes de la conjugaison. Son transfert est donc contemporain de celui du tacteur F et, comme celui-ci, ne se produit pas dans les 5 premieres minutes d'appariement. Le facteur B R 6tant instable en fonction du temps (voir le paragraphe suivant), on comprend que son passage ~t la bactdrie r~ceptrice doit n6cessairement fitre pr6coce pour que l'induction indirecte soit d6tectable. Disparition du facteur B R en fonction du temps Le facteur B R est instable 6. On a mesur6 sa vitesse de disparition au cours d'un croisement F +* × F-(2) + dans lequel on conserve pendant des temps variables 37 °, en milieu nutritif, les bact6ries donatrices qui viennent d'etre irradi6es avant de les croiser avec les bact6ries r6ceptrices (Fig. 8). On constate que le nombre de phages lib6r6s d6crolt de fa~on approximativement exponentielle en fonction du temps alors que le nombre de recombinants crolt 16g~rement ; ce contr61e montre que le traitement subi par les bact6ries donatrices n'a pas affect6 leur capacit6 de conjugaison. De plus, lorsque les bact6ries donatrices sont conserv6es ~ 37 ° pendant i h dans un milieu qui ne permet pas leur croissance, elles conservent avec une efficacit6 int6grale leur aptitude ~ donner l'induction indirecte apr~s remise en milieu nutritif. Par cons6quent, on peut d6finir une p6riode de demi-vie du facteur B R qui, d'apr&s nos mesures, est ~gale ~t environ 8 min ~t 37 ° et 4 ° rain ~t 25 °. Absence d'induction indirecte dans le croisement Hfr × F-(~t) + On sait que, chez les bact6ries donatrices de type Hfr, le facteur sexuel se trouve A l'extr6mit6 terminale du chromosome bact6rien lorsque celui-ci est inject6 la femelle 2~. Au cours de la conjugaison, le facteur sexuel F est, par cons6quent, transmis tardivement et ~t tr~s faible fr6quence. Lorsque le facteur sexuel F se trouve 5. l'6tat autonome, il est, en revanche, transf6r6 rapidement A la majorit6 des cellules r6ceptrices. BOREK ET RYAN 6, ont essay6 d'obtenir l'induction indirecte en croisant des bact6ries donatrices Hfr irradi6es avec des bactdries r6ceptrices lysog&nes; les r6sultats ont 6t6 n6gatifs. En revanche, CALEF et al. 8 ont trouv6 un faible effet d'induction indirecte avec diff6rentes souches de bactdries donatrices Hfr, cet effet se produisant assez tardivement au cours des croisements. Dans le Tableau V sont repr6sent6s les r6sultats obtenus au cours de 4 experiences ind@endantes dans lesquelles on a crois6 la souche Hfr H avec diverses souches r6ceptrices. Mutation Res., 4 (1967) 713-734

R. DEVORET, J. GEORGE

726 TABI.ILAU V ABSENCE D ' I N D U C T I O N I N D I R E C T E DANS LE C R O I S E M E N T H f r

H × F-

l.es souches utilisGes sont les bactdries donatrices: Hfr H et les bactGries rGceptrices: W i i77 (Exps. I e t lI). C 600 (i)+ ;~r slr s (Exp. IIl), C 60o ().)+).r strr {Exp. IV). L'irradiation (800 ergs/ ram'-') et les croisements ont 4td effectu~s selon les techniques habituelles. Les recombinants ont dtd sdlectionn~s ~ i4o rain soit par la streptomycine (ioo/tg/ml) dans les Exps. I, i1 et IV, soit par action du phage T1 (Exp. III). Le pourcentage des reeombinants est dvalud par rapport au nombre des baet6ries rdceptrices k" . Croisement

Bactdries X lO8/Illl Rapport PIfr/1~" Recombinants x IOr'/nll Pourcentage de recombinants F,endement de l'induction indirecte R exp Induction indirecte/production spontan6e

l

II

Hfr

2.8

1:

i. i

UV +UV UV +UV

2. 4 14 Io L3 9

2.6 1.4 1.8 17 io ~2 7

i. i ~

i °o

7.5

4

1II i

0.65 1.4

8 7.2 12 II --

2.5

1V ~.5

2 0.7 15 20 7.5 I0 0.2%

4.6

On volt que le pourcentage des bact6ries femelles qui ont int6gr6 dans leur gdnome des m a r q u e u r s g4n6tiques de la baet6rie donatrice d6croit tr6s peu apr6s l'irradiation de celle-ci. Plus de IO°/o des bact6ries r6ceptriees ont incorpor6 une portion de chromosome m~le irradi6, n 6 a n m o i n s le r e n d e m e n t de l ' i n d u c t i o n indirecte Rexv est inf6rieur ~ I °/ / o • Le t a u x de phages libdr6s dans le croisement Hfr H* × F (2) + est 6gal, en moyenne, ~ 5 fois celui qui est observ6 dans le croisement contr61e pour lequel le m~le n ' a pas 6t6 irradi6. I1 semble q u ' u n effet aussi faible puisse ~tre rattach6 ~ la pr6sence de facteur F l'6tat a u t o n o m e dans certaines bactdries de la souche Hfr. E n effet, dans une expdrience de croisement Hfr H × F , apr6s avoir tu6 les bact6ries donatrices Hfr par de la streptomycine apr6s 14o m i n de contact, on a recherch6 en fonction du temps la propagation du Iacteur F chez les bact6ries rdceptrices, en 6prouvant l ' a p p a r i t i o n de la sensibilit6 au phage anti-male/~2 isol6 par DETTORI et al2. On constate que le pourcentage des bact6ries r6ceptrices qui d e v i e n n e n t sensibles au phage/~2 croit en fonction du temps. Si l'on extrapole les d o n n f e s de la courbe pour le temps o, on volt que le facteur sexuel F se trouve ~ l'4tat a u t o n o m e chez les bactdries donatrices HfrH avec une fr6quence comprise entre Io -a et i o 3 (GEORGE, r6sultats n o n publi6s). De m6me que dans une population de bact6ries F + on peut isoler des bact6ries devenues Hfr, on constate ici que des bact6ries Hfr p e u v e n t revenir ~ l'6tat de bact6ries F +. Dans nos exp6riences, la frdquence d ' a p p a r i t i o n de ces bact6ries F + permet d'expliquer l'effet observ6 dans le cas de croisement Hfr* × F-. Des expfriences ont montr6 que l ' i n d u c t i o n indirecte o b t e n u e est 6galement tr6s faible en utilisant des souches Hfr diff6rentes d ' H f r H (GEORGE, r6sultats non publi6s). Les r6sultats rapport6s ci-dessus a p p u i e n t les donn6es des paragraphes pr6cddents; ils m o n t r e n t que le facteur B R se comporte comme u n facteur extrachromosomique. V a r i a b l e s q u i d d t e r m i n e n t l ' i n d u c t i o n indirecte ( z ) I r r a d i a t i o n X , carence en t h y m i n e et i n d u c t i o n indirecte. Le facteur B R

semble produit dlectivement par l'irradiation ultraviolette. Nous n ' a v o n s pas pu d6clencher l ' i n d u e t i o n indireete par irradiation de la Mutation Res., 4 (1967) 713 734

INDUCTION INDIRECTE DU PROPHAGE ,~

727

souche donatrice F + aux rayons X. On a utilis6 des doses croissantes par fractions de IO kR comprises entre o et 70 kR (voir MATI~RIELET MI~THODES). Aux doses les plus fortes pour lesquelles la survie de la souche donatrice est inf6rieure ~ I°/o le nombre de phages lib6rds n'atteint m~me pas le triple du taux spontan41°; on dolt rappeler que l'induction indirecte par le rayonnement ultraviolet est maximale pour une dose (8oo ergs/mm 2) qui laisse lO% de bact6ries donatrices survivantes. L'absence d'induction indirecte par les rayons X a aussi ~t~ constat~e par RYAN4°. Si on carence en thymine des bactdries donatrices F + exigeant la thymine pour croltre et qu'on 1.?s croise/~ temps variables avec des bactdries r6ceptrices lysog~nes en pr6sence de thymine, on n'obtient pas non plus d'induction indirecte (DEvORET, r6sultats non publi6s; MONK, communication personnelle). L'induction directe est ddclenchde tr~s efficacement par les rayons X (bibl. 33, 4 o) et par la earence en thyminea2,~, 49. L'absence d'induction indirecte ~ la suite de ces traitements n'implique pas une diff6rence fondamentale dans la nature des deux modes d'induction considdr6s; il se peut tout simplement que les 16sions produites par les rayons X ou la carence en thymine ne soient pas transf6rables ~ la cellule r6ceptrice. (2) Constitution gdndtique des bactdries donatrices et rdceptrices. (a) Induction indirecte et facteurs de conjugaison. Nous avons vu que l'induction indirecte se produit ~ la suite de croisements entre bactdries donatrices et bactdries r6ceptrices lorsque le facteur sexuel F qui permet la conjugaison ne se trouve qu'~ l'6tat autonome (voir p. 725 et 726). I1 a fits montr6 par ailleurs que le facteur colicinog~ne col I conf~re ~ des bact~ries comp~tentes la possibilit6 de conjuguer avec des bactdries non colicinog~nes 4~. Si, dans un tel systfime, on irradie par l'ultraviolet la bact6rie donatrice HFC, on obtient chez la bactdrie r6ceptrice col I - (4) + un effet d'induction indirecte du phage ;t avec une efficacit~ le plus souvent sup6rieure ~ celle observde avec le syst~me F +* × F- ().)+ (bibl. 13). L'induction indirecte n'est donc pas sp6cifiquement li~e au transfert du facteur sexuel F mais au transfert d'un facteur de conjugaison existant A l'6tat autonome dans la bactdrie donatrice. Par ailleurs, on salt, d'une part, que le facteur col I n'est jamais int6gr6 au chromosome bact6rien et, d'autre part, qu'au cours de croisements HFC col I+ × col I le transfert de marqueurs g6n~tiques est consid6rablement plus faible que lors de croisements F+ × F-, (biN. 44, 45). Ces faits confirment l'hypoth&se que le facteur BR est un ddterminant extrachromosomique. (b) Induction indirecte et prdsence d'un prophage dans la bactdrie donatriee. Que la bact6rie donatrice soit non lysog~ne, lysog~ne pour le phage ;t ou lysog~ne pour le phage ). ind-, on obtient l'induction indirecte avec une efficacit6 comparable. Ceci est illustr6 notamment par les r6sultats des exp6riences figurant au Tableau III. On volt que la prdsence du prophage ). ind- dans la bact6rie donatrice irradi6e n'emp6che pas la production de l'induction indirecte bien que la bact6rie portant le prophage ne soit pas elle-m6me induite. Le rendement de l'induction indirecte n'apparalt pas diminu6 par la pr6sence du r6presseur du prophage ). ind-; contrairement aux r6sultats obtenus par FISHER 14, le r~presseur synth~tis6 par le phage ~. ind- dans la bact~rie donatrice n'inhibe pas l'induction des bact~ries lysogfines rdceptrices. Le facteur BR porteur de l'information indnctrice ne semble pas inactiv6 par ce r@resseur. Mutation Res., 4 (1967) 713-734

728

R. DEVORET, J. GEORGE

On a recherch6 si le d6veloppement d'un prophage dans une bact6rie donatrice pouvait produire un effet d'induction transf6rable par conjugaison chez une bact6rie r6ceptrice. Pour r6aliser cette exp6rience, on a utilis6 la souche donatrice F + W I485 (2 857) + ;tr sir s, et la souche r6ceptrice F - C 600 (;t)+ ;tr str r. La souche F + (2 857) + est induite lorsqu'elle est port6e ~ la temp6rature de 37 ° (bibl. 5I). Dans nos exp6riences, cette souche est d'abord cultiv6e/~ 32o puis transf6r4e/t la temp6rature de 37 °, elle est ensuite crois6e & temps variables (o, Io et so rain) avec une culture de bact6ries F - (2) +. De la streptomycine (Ioo/~g/ml) est ajout6e & 4 ° rain dans le milieu de croisement pour 6viter la production de phages par la souch~ tonatrice lysog6ne, induite 37 °. Les phages libres sont mesur6s aprbs I4O rain de conjugaison. Les bact6ries r6ceptrices ne sont pas induites lors de ce type de croisement. En revanche, si dans les m6mes conditions on proc6de ~t une irradiation ultraviolette des bact6ries F+ (4 857) + pr6alablement au croisement, on obtient l'induction indirecte. Ces donn6es montrent qu'au cours de l'induction provoqu4e par 616vation thermique, il n ' y a pas de constituants transf6r6s susceptibles d'induire les bact6ries lysog6nes r4ceptrices. (c) Type de l'6pisome inductible port6 par la bact6rie r6ceptrice. La question s'est posfe de savoir si le ph6nombne dfcrit par BOREK ET RYAN dans le cas du prophage 2 6tait sp6cifique de l'induction de ce prophage. Nous avons obtenu le m~me effet d'induction indirecte chez des bact6ries r6ceptrices porteuses d'un prophage pr6sentant l'immunit6 du phage 434- Ii en est de mfime si les bact6ries r6ceptrices poss6dent le facteur colicinog6ne col I (bibl. 43), l'induction se traduit alors par la production de colicine. En revanche, si la bactfrie r6ceptrice est lysoghne pour un phage non inductible comme le phage 2 i~td-, l'induction indirecte ne se produit pas. Les rfsultats que nous venous de rapporter montrent l'absence de sp6cificit6 du facteur BR envers l'6pisome inductible port6 par la bact6rie r6ceptrice. Ceci est conforme ~t ce que l'on observe dans l'induction directe par l'ultraviolet. (d) Autres variables. Sp6cificit6 d'h6te: on sait que dans certains croisements bact6riens, on observe une r6duction importante de la Ir6quence d'acceptation du facteur sexuel darts la souche r6ceptrice (restriction), lorsque le DNA transf6r6 ne porte pas la sp6cificit6 d'h6te (modification), caract6ristique de cette dernihre soucheL L'induction indirecte se produit quelle que soit la sp6cificit6 d'h6te de la souche donatrice ou r4ceptrice utilis6e (E. colf K i2, E. coli B, E. coli C), tant qu'il n ' y a pas de restriction du mat6riel g6n6tique transf6r6 par la souche donatrice irradi6e. En revanche, si le DNA transmis/t la bact6rie r6ceptrice lors de la conjugaison n'est pas accept6 par cette derni6re, il y a 6galement disparition de l'induction indirectelL Capacit4 de r6paration des 16sions ultraviolettes: on sait que certains mutants bact6riens sont incapables de r6parer une grande partie des 16sions provoqu6es par le rayonnement ultraviolet car ils ont perdu la propri4t6 d'exciser les dim4res de thymine form6s darts le DNA (bibl. 7, 48). L'induction indirecte est accrue lorsque la bact6rie donatrice est d6ficiente en enzyme de r6paration ; en revanche, si la souche rfceptrice F - (;t)+ est incapable d'exciser les dim6res de thymine, cela ne modifie pas le rendement de l'induction indirectO 3.

Mutation Res., 4 (I967) 7x3-734

INDUCTION INDIRECTE DU PROPHAGE ~

729

DISCUSSION Les travaux de JACOB el al.25,~8, GOLDTHWAITET JACOBx8 montrent que l'induction du d6veloppement du phage dans une bact6rie lysog+ne est le r6sultat, soit de la disparition du r6pres-~eur cytoplasmique produit par le prophage, soit de l'inactivation de ce rdpresseur par combinaison avec un "inducteur" apparu dans la bactdrie ~ la suite du traitement subi. Quel que soit le m6canisme par lequel le d6veloppement du phage ~ l'6tat v6g6tatif est amorc6, l'6tude de l'induction indirecte semble donner la possibilit~d'analyser la chalne des 6vdnements qui vont de l'absorption de l'dnergie radiante au d6clenchement de l'induction proprement dire. Une telle 6tude n'offre d'int6r~t que si une parent~ 6troite relie l'induction indirecte ~t l'induction directe, de sorte que les r6sultats obtcnus dans la connaissance de l'un de ces ph~nom6nes soient directenl~-nt applicables h l'autre.

(I) Parentd entre l'induction directe et indirecte Les arguments tirds de nos expdriences qui plaident en faveur d'une parent6 6troite entre l'induction directe et l'induction indirecte sont au nombre de trois: (z) Le rendement de l'induction indirecte est en moyenne dgal ~ 5o% par rapport ~ l'induction directe. Compte tenu du fait que le facteur B R est instable et disparalt au cours du temps, l'efficaeit6 de l'induction indirecte est mesur6e le plus souvent par ddfaut, d ' a u t a n t qu'elle ddpend aussi de la rapidit6 avec laquelle l'appariement des cellules et le transfert du facteur F se produisent. On peut, par cons6quent, penser que l'efficacit6 de l'induction indirecte proche de celle de l'induction directe indique l'existence de processus communs aux deux modes d'induction. (2) L'induction indirecte comme l'induction directe se traduit par une courbe (Fig. 5) qui implique que l'induction survient ~ la suite de deux dv~nem~nts d'dgale probabilit6. Cette forme de courbe est sp6cifique de l'induction par l'ultraviolet ~1. MARCOVlCH4° a montr6 que les rayons X produisent l'induction selon une loi de probabilit6 A un seul 6v6nement efficace. On peut souligner que dans l'induction indirecte le processus de conjugaison ne modifie pas la relation dose-effet qui r6git l'induction par l'ultraviolet. (3) Les effets de l'induction directe sont potentialisds par l'induction indirecte et r6ciproquement (Tableau III). Ceci sugg+re que ces deux modes d'induction ne proc~dent pas de m6canismes ind6pendants. On voit que dans l'induction indirecte le d6veloppement du phage A l'6tat v6g6tatif n'est pas cons6cutif ~ une action directe du rayonnement ultraviolet sur le prophage lui-m~me ni sur le r6presseur cytoplasmique produit par celui-ci. Si on admet qu'il existe urie parentd 6troite entre les processus qui aboutissent ~ l'induction indirecte ou ~t l'induction directe, on peut penser que, dans tousles cas, l'induction du prophage peut r6sulter d'une action indirecte du rayonnement. ( I I ) Induction indirecte et processus de con]ugaison L'induction indirecte est li6e au processus de conjugaison. En effet, l'induction indirecte suit la loi de polarit6 du transfert du facteur sexuel (p. 723). Ce fait ~limine l'hypoth~se selon laquelle des produits du m6tabolisme de la bact6rie irradi6e d6clencheraient l'induction par l'interm6diaire du milieu. Mutation Res., 4 (1967) 713-734

73 °

R. DEVORET, J. GEORGE

L'absence d'induction indirecte lors du croisement H f r * × F-(2) + (p. 725) montre, contrairement/~ l'hypoth+se formulde par SILVER et al? °, que l'appariement des cellules, le contact entre les parois cellulaires ne sont pas des conditions suffisantes pour amorcer le d6veloppement du prophage. En effet, on sait que l'appariement des cellules est aussi efficace dans un croisement Hfr × F - qu'au cours d'un croisement F + × F- (bibl. 53). Ces donndes montrent, d'autre part, que le facteur BR n'est pas lid au chromosome irradi6: c'est un d6terminant extrachromosomique. De plus, l'6tude de la cin6tique de l'induction indirecte (p. 724) indique que le transfert de ce dfiterminant est contemporain de celui du facteur F.

( I I I ) Nature du facteur BR (i) Le facteur BR semble ~tre constitud par du DNA irradi6 comme le sugg~rent les faits rapportds ci-dessous: (a) Le tacteur BR est produit lors de l'irradiation ultraviolette de longueur d'onde 2537 A qui, on le sait, frappe 61ectivement les acides nucl~iques de la cellule. (b) L'exposition des bact~ries donatrices /~ la lumi~re visible provoque la r~version de l'induction indirecte par photo-restauration 6. On sait que ce processus de r@aration agit en scindant les dim+res de thymine produits dans le DNA par l'irradiation. D'autre part, l'induction indirecte est inhibde par l'illumination prdalable de la bact6rie lysog+ne r~eeptriceL ce qui indique aussi que le facteur BR transf~r~ est vraisemblablement constitu6 par du DNA. (c) Des exp~riences d'induction indirecte ont dt6 effectu6es dans lesquelles les bactfiries donatrices utilisdes ~taient des mutants bact~riens ayant perdu la capacitd d'exciser les dimbres de thymine form,s dans le DNA h la suite de l'irradiation. On a obtenu dans ces expdriences un taux d'induction indirecte dgal ~ celui observd avec des bact6ries donatrices irradides de type sauvage, en ddlivrant aux batteries de type mutant une dose trois lois moindre de rayonnement ultraviolet la. (d) Enfin, on a vu pr~cddemment qu'on ne peut obtenir l'induction indirecte au cours d'un croisement dans lequel le DNA transf~rd par la bact~rie donatrice ne porte pas la sp~eificitd d'h6te de la souche rdceptrice et se trouve soumis au processus de restriction, c'est-h-dire vraisemblablement d~grad~ dans la baetdrie h6te. Ce rdsultat renforce l'hypoth~se selon laquelle le facteur BR serait constitud par du DNA (bibl. 17). I1 sugg~re, d'autre part, que le facteur BR agit apr+s avoir ~td transmis ~ la bact6rie r6ceptrice. I1 permet de rejeter l'hypoth+se de SILVERet at. 5° selon laquelle l'induction indirecte ne rdsulterait pas d'un transfert de substance mais seulement d'une "conduction" de l'information lors de l'appariement des cellules. (2) L'introduction dans la baet6rie rdceptrice de DNA irradid ou de produits de d6gradation de ee DNA irradi5 n'est pas une condition suffisante pour provoquer l'induction indireete. En effet, l'induction indirecte ne se produit pas: (a) lorsqu'un segment de DNA chromosomique irradid est transmis ~ la bactdrie rdeeptrice (croisemerit Hfr* × I; ); (b) quand le DNA irradid transfdrd est soumis au processus de restriction qui lib+re vraisemblablement des produits de ddgradation du DNA; (c) si on infecte une bactdrie lysog+ne par un phage homologue ou hdtdrologue irradid ((/EOR(;JC, r6sultats non publi6s). (3) L'induction indireete se produit seulement lorsqu'un facteur sexuel h l'dtat autonome, facteur 1; ou faeteur col I, un r6plicon ~ de petite taille est transf6r~ en M u t a t i o n lees., 4 (1967) 713-734

731

INDUCTION INDIRECTE DU PROPHAGE ~

totalitd 5, une cellule lysog~ne rfceptrice 13. L'ensemble des observations qui viennent d'etre discut~es amine 5, formuler les hypotheses suivantes: (a) le facteur B R est constitu6 par un Iacteur sexuel irradi6; (b) le facteur B R est un facteur cytoplasmique inconnu qui passerait d'une cellule 5, une autre grace au facteur sexuel. Si on admet l'hypoth~se b, il faut penser qu'il existerait dans la cellule en dehors du chromosome et du facteur sexuel une structure cytoplasmique suppl~mentaire constitude par du DNA. Selon SILVER et al. 5°, lors du croisement F + × F-, la quantit6 du DNA transf6r6e correspondrait 5, la taille du facteur F transmis. S'il existait une structure cytoplasmique contenant du DNA, il faudrait que sa taille soit beaucoup plus petite que celle du facteur sexuel pour ne pas ~tre d6cel6e. On devrait, d'autre part, admettre que cette structure soit tr~s li6e au facteur sexuel pour ~tre translfir6e avec une efficacit6 tr&s proche de celle du transfert du facteur sexuel lui-m~me. Ces arguments sont fortement en faveur de l'hypoth&se selon laquelle le facteur BR serait constitu6 par le facteur sexuel F ou col I irradi6.

( I V ) Transfert d'un facteur sexuel irradid et induction indirecte Nous venons de discuter les arguments selon lesquels le facteur sexuel irradi6 serait le facteur BR, porteur du signal inducteur. Si on adopte cette hypoth~se, on peut se demander comment le transfert 5, une bact6rie lysog~ne rdceptrice d'une unit6 de r@lication autonome partiellement altdr~e pourrait d6clencher le d6veloppement du phage 5, l'6tat v6g6tatif; comment une telle hypoth~se est-elle compatible avec les modules connus concernant l'induction ? L'atteinte du DNA du prophage n'est pas requise pour que celui-ci soit induit 21. En revanche, on salt que tous les agents inducteurs connus ont pour effet commun de provoquer l'arr~t de la r@lication du DNA bactdrien; cependant, tout arr~t de la r@lication du DNA bact~rien n'engendre pas n6cessairement le d6veloppement du prophage 5, l'dtat v6g6tatif. Ce fait est ais6ment constat6 lorsque les bact~ries lysog~nes sont soumises 5, une carence en acide amin64 ou bien lorsqu'elles sont priv6es d'une source de carbone ~°. En outre, les bact6ries lysog~nes ainsi traitdes perdent leur aptitude 5, ~tre induites 38. On est en droit de penser que ce n'est pas simplement l'arr~t de la synth~se du DNA bact6rien qui provoque l'induction mais bien plut6t une perturbation du processus de r6gulation de cette synth~se. Selon GOLDTHWAITET JACOBis, un arr~t de la synth~se du DNA chromosomique pourrait favoriser l'accumulation de nucl6otides normalement utilis6s dans la synth~se du DNA. Selon ces auteurs, une telle accumulation pourrait avoir pour cons6quence 1'inactivation du r6presseur d~clenchant ainsi l'induction du prophage. On pourrait concevoir, dans le cas de l'induction indirecte, que l'introduction dans une bactdrie r6ceptrice d'un facteur sexuel alt6r6 rendu incapable de se r@liquer ult6rieurement puisse causer dans cette bact6rie une perturbation analogue /~ celle envisag6e par GOLDTHWAIT ET JACOB 18. Actuellement, aucun fait pr6cis ne vient 5, l'appui d'une telle interpr6tation du m6canisme de l'induction indirecte. Des exp6riences sont entreprises pour @rouver l'ensemble des hypotheses formul6es concernant notamment la nature du facteur BR.

Mutation Res., 4 (I967) 713-734

73 2

R. DEVORET, J. GEORGE

R~SUMI~ Chez les bactdries lysog~nes Escherichia coli K 12 (it)+ l'exposition au rayonnement ultraviolet d6clenche le ddveloppement v6gdtatif du prophage (induction directe par l'ultraviolet). L'effet inducteur du rayonnement ultraviolet peut ~tre transf6r6 lors de la conjugaison d'une bactdrie donatrice irradi6e F+(,t) et d'une bactdrie r6ceptrice non-irradi6e F (it)+ (induction indirecte par l'ultraviolet ou effet BOREKRYAN). Dans ce cas, l'induction du prophage est d6clenchde en absence de toute irradiation directe du prophage ou du r~presseur synth6tis6 sous le contr61e du prophage. Les caract6ristiques de l'induction indirecte sont analys6es dans la prdsente publication. Pour une dose optimale de rayonnement ultraviolet l'induction indirecte a une efficacitd dgale it environ 5o°/'0 de celle de l'induction directe. Lorsque dans une bactdrie r6ceptrice F (it)+, on ddclenche simultan6ment les deux processus d'induction directe et indirecte, ceux-ci se comportent comme deux ~v6nements synergiques et non pas ind6pendants. Induction directe et induction indirecte selnblent dtroitement apparent6es, un ou plusieurs des mdcanismes conduisant au d6veloppement du prophage pourrait leur ~tre comnmn. L'induction indirecte est produite lorsque le facteur sexuel F est/~ l'6tat autonome dans la bact6rie donatrice et est transmis ~ haute fr~quence ~ la bact6rie r6ceptrice. Lors de la conjugaison Hfr × F au cours de laquelle le transfert de DNA chromosomique est dlevd et celui du facteur F extr~mement bas, l'induction indirecte ne se produit pas. Ce r6sultat 61imine l'dventualit6 selon laquelle du DNA chromosornique provoquerait l'induction indirecte et sugg~re au contraire qu'un ddterminant extrachromosomique (facteur BR) est responsable de se type d'induction. Le facteur BR n'est pas spdcifique : il induit diffdrents dpisomcs inductibles non apparent6s. I1 est instable, sa p6riode de demi-vie est d'environ 8 rain 5 37 °. De nombreuses preuves indirectes sugg~rent que le facteur BR est constitu6 par du DNA irradi~. On propose l'hypoth~se que le facteur BR serait un rdplicon endommag~ par 1'irradiation. Le facteur F, unitd de r6plication de petite taille transf6rde int~gralement au cours de la conjugaison, pourrait, apr~s irradiation ultraviolette, constituer le facteur BR. REMERCIEMENTS

Nous adressons nos vifs remerciements au Dr. JACOB et au Dr. WOLLMANqui nous ont fourni de nombreuses souches et qui par leurs conseils ont grandement stimul6 notre travail. Nous sommes tr~s reconnaissants au Dr. G. N. COHENpour son soutien constant. Nous devons 5 l'amabilit6 du Dr. E. BOREK un certain nombre de souches. Ce travail a b6n6fici6 de l'excellente aide technique de Melle YOLANDEMATHIEN.

Mulation Res., 4 (1967) 713-734

INDUCTION INDIRECTE DU PROPHAGE

2

733

REFERENCES I ADAMS, M. H., Bacteriophages, Interscience, New York, 1959. 2 APPLEYARD, R. I~., Segregation of new lysogenic types during growth of a doubly lysogenic strain derived fronl E. cell }(12, Genetics, 39 (1954) 440-452. 3 ARBER, W., ET 3/1. L. 3/1ORSE, Host specificity of DNA produced by Escherichia coil, V h Effects on bacterial conjugation, Genetics, 51 (1965) 137-148 • 4 BOREK, E., Factors controlling aptitude and phage development in a lysogenic Eseheriehia cell KI2, Bioehim. Biophys. Acta, 8 (I952) 211-215. 5 BOREK, E., ETA. RYAN, The transfer of irradiation-elicited induction in a lysogenic organism, Prec. Natl. Acad. Sci. (U.S.), 44 (1958) 374-3776 BOREK, }~., ETA. RYAN, The transfer of a biologically active irradiation product from cell to cell; Biochim. Biophys. Aeta, .ii (I96O) 67 73. 7 BO,'CE, R. P., ET P. HOWARD-FLANDERS, Release of ultraviolet light-induced thymine dimers from I)NA in E. coil KI2, Prec. Natl. dead. Sci. (U.S.), 51 (1964) 293-3oo. 8 CALEF, E., G, GIARDINA ETG. ~IODIANO, Esperimenti genetici sull'effetto Borek-Ryan, Atti A.G.[., 5 (196o) 247-253. 9 R. DETTORI, G. MACCACAROETG. PICCININ, Sex-specific bacteriophages of Escheriehia cell K12, Giorn. Mierobiol., 9 (1961) I41-15o. IO DEVORET, R., Transfert par conjugaison de Faction inductrice des rayonnements UV et X chez E. cell KI2 ().), Intern. J. Radiation Biol., 6 (1963) 385 . i I DEVORET, R., ET J. GEORGE, Sur l'induction ultraviolette par conjugaison du prophage ). chez E. cell KI2, Compt. Rend., 258 (I964) 2227 223 O. 12 DEVORBT, R., ET J. GEORGE, Sur un facteur extrachromosomique responsable de l'induction ultraviolette par conjugaison, Compt. Rend., 258 (1964) 5287-529o. 13 DEVORET, R., 3/[. MONK ET J. GEORGE, Indirect ultraviolet induction of prophage ;t and colicin I factor, Z. Bakteriol., 196 (1965) 193-2o7. 14 FISHER, K. W., Conjugal transfer of immunity to phage ,~. multiplication in Eseherichia cell KI2, J. Gen. Mierobiol., 28 (1962) 711 719. 15 FORTET, F., ~ldments de Calcul des Probabilitds, C.N.R.S., Paris, 1956. 16 FRANKLIN, R,, The action spectrum for the ultraviolet induction of lysis in Escheriehia cell KI2, Bioehim. Biophys. Acta, 13 (1954) 137 138. 17 GEORGE, J., Corr61ation entre la disparition de l'induction indirecte du prophage ,;tet la restriction du DNA transmis k la bact~rie r~ceptrice inductible dans un croisement F + × F - h6t6rosp~cifique, Compt. Rend., 262 (1966) 18o5-18o8. 18 GOLDTHWAIT, D., ET F. JACOB, Sur le m~canisme de l'induction du d6veloppement du prophage chez les bact6ries lysog6nes, Compt. Rend., 259 (1964) 661-664. 19 HAYES, W . , The mechanism ot genetic recombination in E. cell, Cold Spring Harbor Syrnp. Quant. Biol., 18 (1953) 75-93. 20 JACOB, F., Influence du r6ginle carbon6 sur le d6veloppement des bacteriophages chez un Pseudomonas pyoeyanea, Ann. Inst. Pasteur, 82 (1952) 578-602. 21 JACOB, F., Les Baetdries Lysog~nes etla Notion de Provirus, Masson, Paris, 1954. 22 JACOB, F., E'r E. A. ADELBERG, Transfert de caract6res g6n~tiques par incorporation au facteur sexuel d'Eseherichia cell, Compt. Rend., 249 (1959) 189-191. 23 JACOB, F., S. BRENNER ET F. COZlN, On the regulation of DNA replication in bacteria, Cold Spring Harbor Syrup. Quant. Biol., 28 (1963) 329-348. 24 JACOB, F., ETA. CAMPBELL, Sur le syst6me de r6pression assurant l'immunit6 chez les bact4ries lysoghnes, Cornpt. Rend., 248 (1959) 3219-3221. 25 JACOB, F., ET J. MONOD, Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins, J. Mol. Biol., 3 (1961) 318-356. 26 JACOB, F., R. SUSSMAN ET J. 3/tONeD, Sur la nature du r4presseur assurant l'immunit6 des bact~ries lysog6nes, Compt. Rend., 254 (1962) 4214-4216. 27 JACOB, F., ET E. L. WOLLMAN, Induction spontan4c du d4veloppement du bacteriophage ;t au tours de la recombinaison g4n4tique chez E. cell KI2, Compt. Rend., 239 (1954) 455-456. 28 JACOB, F., ET E. L. WOLLMAN, l~tude g6n~tique d'un bact4riophage temp6r4 d'Escherichia cell, I. Le syst6me g4n6tique du bacteriophage ;t, Ann. Inst. Pasteur, 87 (1954) 653-673. 29 JACOB, F., ET E. L. WOLLMAN, Genetic and physical determinations of chromosomal segments in E. cell, Biological replication of macromolecules, Symp. Soc. Exptl. Biol. Med., 12 (1958) 75-92. 3° KAISER, A. D., ET F. JACOB, Recombination between related temperate bacteriophages and the genetic control of immunity and prophage localization, Virology, 4 (1957) 5o9-521. 31 KELLENBERGER, E., ET J. SI~CHAUD, Electron microscopical studies of phage multiplication, II. Production of phage-related structures during multiplication of phages T2 and T 4, Virology, 4 (1957) 256-z74.

Mutation Res., 4 (1967) 713-734

734

R. DEVORET, J. GEORGE

32 I(ORN, D., ET A. WEISSBACH, T h y n l i n e l e s s i n d u c t i o n in Escherichia cell 1(i2 (~.), Biochim. Bioph.vs. Acta, 6I (1962) 775 79o. 33 I,ATARJET, 14., I n d u c t i o n , p a r les r a y o n s X, de la p r o d u c t i o n d ' u n b a c t d r i o p h a g e chcz H. megalkeriton lysog~ne, A n n . lnsl. Pasteur, 81 (195I) 389-393 . 34 I.ATARJET, R., P. MORENNE ET R. BERGER, I~Tn appareil simple p o u r le dosage des r a v o n n e m e n t s ultraviolets dmis p a r les l a m p e s germicides, A n n . Inst. Pasteur, 85 11953) I 7 4 - I 8 4 . .3.5 I~EDERBERG, J., i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n of biochemical m u t a n t s of bacteria, Methods in Medical Research, Year Book Publishers, Chicago, 3 (195 o) 5 22. 30 [A,:DERBERC,, H. M., L y s o g e n i c i t y in E. cell I(I2, Ge~zelics, 36 (195 I) 560. 37 LEDERBERG, E. M., E'r J. LEDER~ERG, Genetic s t u d i e s of lysogenicity in E. coli, (;enetics, 38 (I953) 51-64 • 38 LwovF, A., l,ysogeny, Bacteriol. Rev., 17 (1953) 269 337. 39 I.WOFF, A., L. SIMINOVITC}{ e'r N. KJELDGAARD, I n d u c t i o n de l a p r o d u c t i o n de b a c t d r i o p h a g e s chez une bact~rie lysog6ne, A n n . Inst. Pasteur, 79 1105o) 815-858. 4 ° MARCOWCH, H., I~tude radiobiologique du s y s t 6 m e lysog6ne d' Escherichia coli K 12, l. R a y o n X, Amz. Inst. Pasteur, 9o (r956) 3o3 319. 41 MARCOVlCH, H., Etu(te de l'action des r a y o n s ultraviolets s u r le s v s t b m e lysogbne Escherichia coil IgI2 (~.), Iq~2S, A, A n n . Inst. Pasteur, 9I (1956) 5 I I - 5 2 2 . 42 MJ,:LI.:CHF.N, N., Ex P. D. SI{AAR, T h e p r o v o c a t i o n of an early step of i n d u c t i o n by t h y m i n e d e p r i v a t i o n , l'irology, I6 (I902) 21 29. 43 MoxK, ?,I., ~CT R. DEVOnF.T, I n d u c t i o n u l t r a v i o l e t t e par c o n j u g a i s o n du p r o p h a g e ). par I'interm d d i a i r e d u f a c t e u r c o l l , A n n . Inst. Pasteur, Io 7 Suppl. 5 (1964) I()3-173. 44 Moxl¢, M., F.T R. C. CLOWn-S, T r a n s f e r of t h e colicin 1 factor in E. coli t(i2 a n d its i n t e r a c t i o n with t h e [; fertility factor, J. (;en. Mierobiol., 36 (1964) 365-384. 45 MoxK, M., r:x F.. C. CLOWES, T h e regulation of colicin s y n t h e s i s a n d colicin factor t r a n s f e r in Escherichia coli I(ie, ./. (;en. Microbiol., 36 (I964) 385-392. 46 I{YAN, A., A u n i q u e mode of action of ultraviolet irradiation in p r o p h a g e induction, Biochim. Biophys. Acta, 6o (1962) 455 457. 47 R v a x , F., v.z L. SCHNF.mER, T h e c o n s e q u e n c e s of m u t a t i o n (luring t h e g r o w t h of hiochenlical m u t a n t s of Escherickia coli, I. T h e p a t t e r n of a d a p t a t i o n of histidineless cultures, J. [4acleriol., 50 (~948) 699-7o8. 48 S r z L o w , I',. B., ET \V. L. CARRIER, The d i s a p p e a r a n c e of t h y m i n e d i m e r s from 1)NA: an error correcting m e c h a n i s m , Proc. Natl. Acad. Sci. ( U . S . ) , 51 11964) 226 23I. 49 SICARD, N., ET I{. DEVORET, Effets de la carence en t h y m i n e sur des s o u c h e s d'Esckerichia coli lysog6ne K12 T - et colicinog~ne ~5 T , Compt. Rcndl, 255 1t962) r 4 f 7 - I 4 I g . 5 ° SrLW.;R,S., F.. E. MooDYET 1{. C. CLOWES, l.imits on material t r a n s f e r d u r i n g lrt >: F m a t i n g s in E. coli 1112, J. ]14ol. Biol., r2 1t965) 283 286. 5 E S u s s ~ i a x , R., Er F. J a c o u , Sur un s y s t 6 m e dc r6pression t h e r m o s e n s i b l e chez le bactdriop h a g e ~. d'Escherichia eoli, Compl. Rend., 254 (I962) I517-r519. 52 \VOLLMAN, E. I.., Sur le d d t e r m i n i s m e gdndtique de lx lysogdnie, A ~ n . [nst. Pasteur, 84 (~953) 281-294. 53 \VoI.L.~:\N, E. L., ET F. JAcob, Sur les p r o c e s s u s de e o n j u g a i s o n et de r e c o m b i n a i s o n ehez E. coli, I I. La localisation c h r o m o s o m i q u e du p r o p h a g e ?. et les consdqucnces gdndtiques de l ' i n d u c t i o n z y g o t i q u e , A n n . Inst. Pasleur, O.3(~957) 323 330. 31u/ation Res., 4 (1967) 713-734