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Intérêt de la polarisation de fluorescence pour la détermination des propriétés opsonisantes de protéines : application à la fibronectine
-
ANALYSES
PROSPECTIVES
- REVUES GENERALES
Int6r( t de la polarisation de fluorescence pour la d( termination des propri6t6s opsonisantes de prot6ines : application la fibronectine S. M u l l e r - V . R 6 g n a u l t
- S. D r o e s c h
- M. Donner
- C . R i v a t - J.-F. Stoltz
INSERM U 284 - 54511 Vand~euvre-Les-Nancy C e d e x
La phagocytose repr~sente un ~l@ment important du syst~me cellulaire de d@fense de I'organisme contre une agression ext@rieure [microbienne, bact~rienne ou autre...]. Ce processus d'internalisation et d'@limination de particules est assur@ par les macrophages et les granulocytes, II existe un contr61e physiologique de I'activit6 phagocytaire par des facteurs plasmatiques : les opsonines [4]. Ces molecules peuvent ~tre des prot~ines telles que la fibronectine, des anticorps sp@cifiques, du compl~ment.,. Elles poss@dent des sites de liaison pour les populations cellulaires phagocytaires et les p a r ticules phagocyt@es, favorisant ainsi leur internalisation. bans des situations pathologiques [septic~mies, brCJlures, traumatismes graves, agressions m@dicales diverses], on note une diminution importante du potentiel de d@fense de I'organisme, due ~ une baisse du taux de certaines opsonines plasmatiques. L'apporf d'opsonines exog@nes purifi@es pourrait par consequent @tre envisag~ afin d'augmenter le potentiel de d@fense de I'organisme. Toutefois, il est indispensable de contr61er I'int~grit~ du pouvoir opsonisant des mol@cules purifi~es.
M6thodes d e d o s a g e d e l'activit6 opsonisante d e facteurs plasmatiques L'activit~ opsonisante de facteurs solubles a ~t6 approch@e jusqu'~ pr@sent par de nombreuses m@thodes qui different essentiellement au niveau de la nature des particules phagocyt6es et du crit@re utilis@ pour quantifier la phagocytose. En effet, les particules cibles peuvent @tredes bact~ries vivantes ou tubes [2], des levures [3, 4], des cellules [globules rouges fix@s)[5] et des particules inertes (billes de latex, d'agarose] [6, 7] trait6es avec une substance permettant la fixation de I'opsonine. La mesure de I'activit~ phagocytaire la plus fr6quemment utilis@eest la quantification par comptage microscopique du nombre de particules ing@r@espar cellule. Les techniques microscopiques sont fastidieuses et les comptages sont effectu~s sur un @chantillon de taille limit~e. L'utilisation de radio-isotopes repr@sente une alternative I'examen microscopique. Ainsi, des m~thodes utilisent
des bact6ries, des cellules ou des Particules marqu6es avec des radio-~16ments [lode 425 [6], Chrome 54 [5], tritium [8]]. II est certain que ces techniques pr6sentent t o u s l e s inconv~nients lids ~ I'utilisation d'isotopes radio-actifs. R6cemment, des m~thodes spectroscopiques ont 6t~ utilis6es : spectrophotom~trie d'absorption dans le cas des levures [9], fluorescence par marquage de bact@ries ou de particules inertes avec un traceur fluorescent [40]. Par ailleurs, la phagocytose est associ~e ~ des ~v6nements cellulaires dont I'intensit~ est reli6e directement I'activit6 phagocytaire. Ainsi, pendant la phagocytose, les macrophages et les polynucl6aires lib~rent de I'eau oxyg~n~e dans le milieu extracellulaire, ce qui a permis le d6veloppement d'une m@thode de d@termination de I'opsonisation faisant appel 6 la chimiluminescence [4]. Par ailleurs, il est @galement possible ~1 I'aide d'une m6thode spectroscopique, la polarisation de fluorescence, de mettre en @vidence une variation de la fluidit@ membranaire Iors de la phagocytose [44, 42]. Cette propri@t@ a @t6 utilis6e pour la mise au point d'une approche des propri@t6s opsonisantes d'une glycoprot@ine plasmatique : la fibronectine.
D6termination d e l'activit6 opsonisante d e la fibronectine par polarisation d e fluorescence La fibronectine est une glypoprot~ine de poids mol@culaire 61ev~ (440 KD] qui poss@de notamment des sites de fixation pour la g@latine et pour des r~cepteurs pr@sents la surface cellulaire. Le test est fond~ sur I'analyse des modifications de la fluidit@ des cellules phagocytaires Iors de la phagocytose de billes en latex en pr6sence ou non de concentrations variables de fibronectine.
D6termiantlon de la fluldlt6 cellulaire par polarlsatlon de fluorescence Lorsque des molecules fiuorescentes sont excit6es en solution par une lumi@re polaris6e, les mouvements browniens des mol@cules provoquent une d~polarisation de la fluorescence ~mise. Tr@ssch@matiquement,
Trait d'Union n ° 8 - p a g e 24
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I'incorporation d e sondes d e nature hydrophobe par exemple, dans les regions Iipidiques membranaires entrafnent une restriction d e leur mouvement d e rotation et diminue p a r consequent le taux d e dCpolarisation d e la fluorescence ~mise. Cette variation est en relation avec la <,fluidit~ ,, d e I'environnement des sondes. On peut obtenir une a p p r o c h e globale d e la fluidit¢ des r~gions lipidiques d e populations cellulaires en d~terminant I'anisotropie statique < r > d e la fluorescence ~mise par les sondes incorpor~es.
D6roulement
du test
/es b/lies d e latex sont g~latinis~es selon la m~thode d e oran et coll., et conserv~es ~ 4°C [6]. Des 6tudes pr@liminaires ant permis d e dOterminer le role des diffOrents param@tres n o t a m m e n t le rapport billes/cellules, le temps d e phagocytose etc. et d e pr@ciser les conditions optimales du test appliqu@ ~ la fibronectine. Le test c o m p r e n d 4 6tapes : Etapes
< r > est d~termin¢ d e la mani~re suivante : I'~chantillon fluorescent est illumin~ par une lumi~re polarisCe verticalement. La fluorescece est analys~e a n g l e droit ~ travers deux polariseurs, I'un parall~le au polariseur d'excitation [intensit¢ d e fluorescence paralIdle : Iii ]. I'autre perpendiculaire au polariseur d'excitat/on : Ii]. Des ~chantillons ,, blancs ,, non fluorescents sont ~g~lement mesur~s pour retrancher les signaux dus la lumiCre diffus~e par la suspension [Ib II et Ib I].
I
MOthodologie
~, prOincubation ~ des b/lies g@latinis@es a v e c la fibronectine p e n d a n t 30 minutes ~ 37°C dans un volume total d e 500 t~l [concentration en fibronectine d e 25 (~ 500/~g/ml]
est inversement corr@l@e a v e c la fiuidit~ cellulaire.
<~incubation ,~ d e 200 t~l du m~lange b/lies g@latinis@es - fibronectine avec les cellules effectrices p e n d a n t I heure ~ 37°C suivie d e deux lavages pour 61/miner les b/lies non incorporOes. Rapport billes/cellules : 6/I pour les polynucl~aires, 20/t pour les P 388 Dt ; concentration celluiaire t2 x 106 granulocytes, 9 x 106 P 388 DI par 6chant/lion
Dans l'@tude entreprise sur les propri@t@s opsonisantes d e prot~ines purifi@es, les mesures ont @t~ effectu@es sur un appareil en excitation continue, automatique et informatis~, dont le principe est un m o n t a g e en T (Fluofluidim~tre SEFAM, Vandoeuvre-Les-Nancy, Licence INSERM CNRS n ° 86522]. ~,
,, incorporation ,~ du TMA-DPH [concentration finale : 2 x I 0 - 6 M ] dans les rOgions lipidiques p e n d a n t t5 minutes ~ 25°C suivi d'un l a v a g e pour @l/miner les sondes fluorescentes non incorporOes.
L'anisotropie < r> ~ g a l e O : (Iii - ibll) -
(Ii-
Ibl~
[Iii - Ibll) + 2 (II -
Ibl_)
Cellules p h a g o c y t a i r e s
..........,~,.
Les cellules effectrices peuvent ~tre soit des polynucl~aires circulants purifies sur un gradient d e Dextran, soit des cell[Jles macrophagiques maintenues en culture [lign~e P 338 DI]. C o m m e I'indique le Tableau I, la phagocytose d e b/lies d e latex [OSI, 0,81 /~m] se traduit par une augmentation d e la fluidit~ cellulaire refl¢t~e par une diminution d e I'anisotropie d e fluorescence d'une sonde lipophile. Tableau I Variations d e I'anisotropie du TMA-DPH incorpor6 dan.s des granulocytes ; ou des cellules m a c r o p h a g i q u e s [P 388 Dt] Iors d e la phagocytose d e billes d e latex
Pr~traitement
Anisotropie statique < r > du TMA-DPHa incorpor6 dans les polynuclOaires
P 388 Dt
TOm0ins
0,258+ 0,003
0,252+ 0,004
B/liesde latex
0,242±0,003
0,237±0,001
D¢cr0issancede
-6,2%
-
6,0%
4
dOterminations d e polar/sat/on d e fluorescence 25°C.
La valid/tO du test a @tOvOrifiOe avec des prOparations d e fibronectine isolOe ~ partir d'un pool d e plasma frais par c h r o m a t o g r a p h i e d'affinit@ sur s@pharose-g@latine [12]. C o m m e le montre la figure t, la pr@sence d e quantitOs croissantes d e fibronectine [inf@rieures ~ t50 t~g/ml] entrafne une baisse progressive d e I'anisotropie d e fluorescence du TMA-DPH incorpor@ dans des granulocytes qui indique une augmentation d e la phagocytose. Pour des doses plus importantes d e fibronectine, on observe un plateau qui peut traduire un ph@nom@ne d e saturation soit des b/lies gOlatinis@es, soit des r@cepteurs cellulaires.
0.250'
0,230
0.220:
~6o
Test de Student
200
360
~6o
soo '
F;bronectine ( l~g )
I'anis0tr0pieen % 3,57
3,68
p < 0,005
p < 0,005
a) TMA-DPH : trim~thylammoniumdiphOnylhexatri~ne
Figure t Influence de la concentration en fibronectine sur la diminution de I'anisotropie de fluorescence du TMA-DPH Iors de la phagocytose de b/lies de latex g~latinis@es par des polynucl~aires.
Trait d'Union n ° 8 - p a g e 22
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ANALYSES
PROSPECTIVES
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Concentration de ta Fibronectine iors de ia pr¶tion •
0.250-
Courbe A" 390 p g / m l Courbe B ' 5 6 5 0 p g / m l
t
0,2/,0-
@ 0.230 L "1"
i
i
100
200
i
~1_
300 400 Fibronectine en IJg/m[
Figure 2 Influence de la preparation de la fibronectine sur I'anisotropie de fluorescence du TMA-DPH, Le test est tr~s sensible aux cond~itions d e prSparation et conservation d e la fibronectine. Une fibronectine pr~p a r s e sous forme concentr~e [5,65 mg/ml] ne p r o v o q u e a u c u n e variation d e I'anisotropie d e fluorescence p a r r a p p o r t aux 6.chantillons t~moins, la perte du pouvoir opsonisant d e la fibronectine ~tant p r o b a l e m e n t d u e une a u t o - a g r ~ g a t i o n d e la m o l e c u l e [Figure 2].
!0'
, Vortotions d'anlsotmpla en %
Concentration en Fibmnectine
La prSsence d'ions C a l c i u m dans le milieu d e conservation d e la fibronectine semble ~ g a l e m e n t n~cessaire au maintien d e I'activit6 d e la prot~ine qui peut ~tre conservSe sous forme c o n g e l ~ e p e n d a n t plusieurs mats [Figure 3]. Cette a p p r o c h e e x p ~ r i m e n t a l e p e r m e t ~ g a l e m e n t la d~termination d e I ' a c t i v i t 6 0 p s o n i s a n t e d e plasmas.
Anisotrople 0,255 ¢r)
Concentration en Fibronectine pendant to pr~incubotiop 200 palm t
pendant I.a pr&lncubation w
300 pg / ml. 0.2,',5
0.235
0
,
13
,
23
0.225
, 26 '
~'9
35 D&tal opr~s de to
9B jours [=cout& In preparation fibronectine
Figure 3 Stabilit6 de la fibronectine conserv~e congel~e dans un tampon contenant des ions Ca ++ [4 mM].
Sons plasma
PiosrnQ total[
Piosrno d&pourvu de Rbronectlnl ( ptosma I:1")
I-I.
Pl[osmoFireconstitui
ovi= R purifi&e
Figure 4 Effet de la d~plStion et de la reconstitution d'un plasma en fibronectine sur I'anisotropie de fluorescence du TMA-DPH.
Trait d'Union n ° 8 - p a g e 23
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C o m m e le montre la figure 4, cette activit@ est d u e en partie ~ la fibronectine puisqu'elle est restor@e pratiquement compl@tement Iorsque I'on rajoute d e la fibronectine purifi@e ~ un p l a s m a d@pourvu d e fibronectine.
Conclusion La t e c h n i q u e d6crite ici p e r m e t des mesures rapides, r e p r o d u c t i b l e s et sensibles d e I'activit~ opsonisante d ' u n e prot6ine purifi@e : la fibronectine. Elle p e u t @tre utilis6e dans les m@mes conditions pour des plasmas. Elle ne pr@sente p a s les inconv@nients des techniques fond@es sur I'utilisation d'isotopes radioactifs. Etant donn~e la taille relativement i m p o r t a n t e d e 1'6chantillon dans cet essai, une estimation plus e x a c t e d e I'activit@ des prot6ines p e u t 6tre o b t e n u q u ' a v e c les m 6 t h o d e s m i c r o s o o p i q u e s d 6 p e n d a n t d'~chantillons d e petites tallies. Ce travail a 6t@ r@alis~ a v e c I'aide d'un Contrat EtatR@gion Lorraine GBM - A p p e l d'offres 1986.
R6sum~ La p h a g o c y t o s e d e particules inertes p a r des polynucl6aires d u sang p 6 r i p h 6 r i q u e ou des cellules m a c r o - , p h a g i q u e s se traduit p a r une a u g m e n t a t i o n d e la fluidit@ membranaire. Les variations d e fluidlt@ peuvent ~tre mises en 6 v i d e n c e p a r polarisation d e fluorescence en suivant les modifications d e I'anisotropie d e ~a,~luere~-~ c e n c e 6mise p a r des sondes incorpor@es d a n s les r6gions lipidiques cellulaires. Cette propri~t6 a 6t@ mise profit pour mettre au point un test p e r m e t t a n t d e v@rifier I'activit@ opsonisante d ' u n e prot@ine p l a s m a t i q u e purifi6e : la fibronectine. Le test p e u t ~tre 6tendu ~ la d@termination d e I'activit@ opsonisante d e olasmas et s6rums.
Bibliographie t. BROWN E,J. - The role of extracellular matrix proteins in the control of phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 1986, 39, 579-591. 2, SILVENNOINEN-KASSINENS., KOSKELAM. - Optimal conditions for the opsonophagocytosis test with streptococcus pneumoniae serotypes 3, 6A, 7F and 19F and human granulocytes. Act. path, microbial, immunol, scand. 1986, C, 94, 105-1tt. 3. SHAALAA.Y., DHALIWAL H.S., BISHOPS., LING N,R. - Ingestion of dyed - opsonised yeasts as a simple way of detecting phagocytes in lymphocyte preparations. Cytophilic binding of immunogiobulins by ingesting cells. J, of Immunological methods, 1979, 27, 175-187, 4, TURNERN.W,, GRANTC., SEYMOURN,D., HARVEYB., LEVINSKY R,J. - Evaluation of C3b/C3bi opsonization and chemiluminescence with selected yeasts and bacteria using sera of different opsonic potential, Immunology, t986, 58, I 'I I-I 15. 5. WEINBERGD.A., WESTONL.K., KAPLANSJ,E. - Influence of prostalglandin 12on fibronectin mediated phagocytosis in viva and in vitro. Journal of Leukocyte Biology, 1985, 37, 151-t59. 6, DORAN J.E., MANSBERGERA.R., REESEA,C, - Cold insoluble globulin - enhanced phagocytosis of gelatinized targets by macrophage monolayers, A model system. J. of the ReticuIoendothelial Society, t980, 27, 471-483. 7, JOHNSON E,, GAUPERAAT., ESKELANDT. - Fibronectin binds to complement coated agarose beads and increases their association to mouse macrophages, Scand, J, Immunol, t985, 22, 315-320. 8, SPANGENBERGP., CRAWFORD N, - A sensitive procedure for quantifying the phagocytic competence of blood granuIocytes. Bioscience reports, 1986, 6, 7t5-720. 9, KAMINSKIN,E., ROBERTSJ.F., GUTHRIEF,E. - A rapid spectraphotometric method for assessing macrophage phagocytic activity. Immunology letters, 1985, 10, 329-331. t 0. ODA T., MAEDA H, - A new simple fluorometric assay for phagocytosis. J. of Immunological Methods. 1986, 88, t75-183. t I, BERLINR.D., FERAJ.P. - Changes in membrane microviscosity associated with phagocytosis: effect of colchicine. Proc, Nat. Acad. Sci, 1977, 74, 1072-1076. 1 2, MULLERS,, REGNAULTV,, DONNER M,, RiVAT C,, STOLTZJ.F. - Etude par polarisation de fluorescence de populations leycocytaires du sang p~riph~rique, Interaction avec des mol@cules d'int~r@t biologique. Innov. Tech. Biol. Med, 1987, sous presse.
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Int6r( t de la polarisation de fluorescence pour la d( termination des propri6t6s opsonisantes de prot6ines : application la fibronectine S. M u l l e r - V . R 6 g n a u l t
- S. D r o e s c h
- M. Donner
- C . R i v a t - J.-F. Stoltz
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La phagocytose repr~sente un ~l@ment important du syst~me cellulaire de d@fense de I'organisme contre une agression ext@rieure [microbienne, bact~rienne ou autre...]. Ce processus d'internalisation et d'@limination de particules est assur@ par les macrophages et les granulocytes, II existe un contr61e physiologique de I'activit6 phagocytaire par des facteurs plasmatiques : les opsonines [4]. Ces molecules peuvent ~tre des prot~ines telles que la fibronectine, des anticorps sp@cifiques, du compl~ment.,. Elles poss@dent des sites de liaison pour les populations cellulaires phagocytaires et les p a r ticules phagocyt@es, favorisant ainsi leur internalisation. bans des situations pathologiques [septic~mies, brCJlures, traumatismes graves, agressions m@dicales diverses], on note une diminution importante du potentiel de d@fense de I'organisme, due ~ une baisse du taux de certaines opsonines plasmatiques. L'apporf d'opsonines exog@nes purifi@es pourrait par consequent @tre envisag~ afin d'augmenter le potentiel de d@fense de I'organisme. Toutefois, il est indispensable de contr61er I'int~grit~ du pouvoir opsonisant des mol@cules purifi~es.
M6thodes d e d o s a g e d e l'activit6 opsonisante d e facteurs plasmatiques L'activit~ opsonisante de facteurs solubles a ~t6 approch@e jusqu'~ pr@sent par de nombreuses m@thodes qui different essentiellement au niveau de la nature des particules phagocyt6es et du crit@re utilis@ pour quantifier la phagocytose. En effet, les particules cibles peuvent @tredes bact~ries vivantes ou tubes [2], des levures [3, 4], des cellules [globules rouges fix@s)[5] et des particules inertes (billes de latex, d'agarose] [6, 7] trait6es avec une substance permettant la fixation de I'opsonine. La mesure de I'activit~ phagocytaire la plus fr6quemment utilis@eest la quantification par comptage microscopique du nombre de particules ing@r@espar cellule. Les techniques microscopiques sont fastidieuses et les comptages sont effectu~s sur un @chantillon de taille limit~e. L'utilisation de radio-isotopes repr@sente une alternative I'examen microscopique. Ainsi, des m~thodes utilisent
des bact6ries, des cellules ou des Particules marqu6es avec des radio-~16ments [lode 425 [6], Chrome 54 [5], tritium [8]]. II est certain que ces techniques pr6sentent t o u s l e s inconv~nients lids ~ I'utilisation d'isotopes radio-actifs. R6cemment, des m~thodes spectroscopiques ont 6t~ utilis6es : spectrophotom~trie d'absorption dans le cas des levures [9], fluorescence par marquage de bact@ries ou de particules inertes avec un traceur fluorescent [40]. Par ailleurs, la phagocytose est associ~e ~ des ~v6nements cellulaires dont I'intensit~ est reli6e directement I'activit6 phagocytaire. Ainsi, pendant la phagocytose, les macrophages et les polynucl6aires lib~rent de I'eau oxyg~n~e dans le milieu extracellulaire, ce qui a permis le d6veloppement d'une m@thode de d@termination de I'opsonisation faisant appel 6 la chimiluminescence [4]. Par ailleurs, il est @galement possible ~1 I'aide d'une m6thode spectroscopique, la polarisation de fluorescence, de mettre en @vidence une variation de la fluidit@ membranaire Iors de la phagocytose [44, 42]. Cette propri@t@ a @t6 utilis6e pour la mise au point d'une approche des propri@t6s opsonisantes d'une glycoprot@ine plasmatique : la fibronectine.
D6termination d e l'activit6 opsonisante d e la fibronectine par polarisation d e fluorescence La fibronectine est une glypoprot~ine de poids mol@culaire 61ev~ (440 KD] qui poss@de notamment des sites de fixation pour la g@latine et pour des r~cepteurs pr@sents la surface cellulaire. Le test est fond~ sur I'analyse des modifications de la fluidit@ des cellules phagocytaires Iors de la phagocytose de billes en latex en pr6sence ou non de concentrations variables de fibronectine.
D6termiantlon de la fluldlt6 cellulaire par polarlsatlon de fluorescence Lorsque des molecules fiuorescentes sont excit6es en solution par une lumi@re polaris6e, les mouvements browniens des mol@cules provoquent une d~polarisation de la fluorescence ~mise. Tr@ssch@matiquement,
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ANALYSES PROSPECTIVES - REVUES GENERALES
I'incorporation d e sondes d e nature hydrophobe par exemple, dans les regions Iipidiques membranaires entrafnent une restriction d e leur mouvement d e rotation et diminue p a r consequent le taux d e dCpolarisation d e la fluorescence ~mise. Cette variation est en relation avec la <,fluidit~ ,, d e I'environnement des sondes. On peut obtenir une a p p r o c h e globale d e la fluidit¢ des r~gions lipidiques d e populations cellulaires en d~terminant I'anisotropie statique < r > d e la fluorescence ~mise par les sondes incorpor~es.
D6roulement
du test
/es b/lies d e latex sont g~latinis~es selon la m~thode d e oran et coll., et conserv~es ~ 4°C [6]. Des 6tudes pr@liminaires ant permis d e dOterminer le role des diffOrents param@tres n o t a m m e n t le rapport billes/cellules, le temps d e phagocytose etc. et d e pr@ciser les conditions optimales du test appliqu@ ~ la fibronectine. Le test c o m p r e n d 4 6tapes : Etapes
< r > est d~termin¢ d e la mani~re suivante : I'~chantillon fluorescent est illumin~ par une lumi~re polarisCe verticalement. La fluorescece est analys~e a n g l e droit ~ travers deux polariseurs, I'un parall~le au polariseur d'excitation [intensit¢ d e fluorescence paralIdle : Iii ]. I'autre perpendiculaire au polariseur d'excitat/on : Ii]. Des ~chantillons ,, blancs ,, non fluorescents sont ~g~lement mesur~s pour retrancher les signaux dus la lumiCre diffus~e par la suspension [Ib II et Ib I].
I
MOthodologie
~, prOincubation ~ des b/lies g@latinis@es a v e c la fibronectine p e n d a n t 30 minutes ~ 37°C dans un volume total d e 500 t~l [concentration en fibronectine d e 25 (~ 500/~g/ml]
est inversement corr@l@e a v e c la fiuidit~ cellulaire.
<~incubation ,~ d e 200 t~l du m~lange b/lies g@latinis@es - fibronectine avec les cellules effectrices p e n d a n t I heure ~ 37°C suivie d e deux lavages pour 61/miner les b/lies non incorporOes. Rapport billes/cellules : 6/I pour les polynucl~aires, 20/t pour les P 388 Dt ; concentration celluiaire t2 x 106 granulocytes, 9 x 106 P 388 DI par 6chant/lion
Dans l'@tude entreprise sur les propri@t@s opsonisantes d e prot~ines purifi@es, les mesures ont @t~ effectu@es sur un appareil en excitation continue, automatique et informatis~, dont le principe est un m o n t a g e en T (Fluofluidim~tre SEFAM, Vandoeuvre-Les-Nancy, Licence INSERM CNRS n ° 86522]. ~,
,, incorporation ,~ du TMA-DPH [concentration finale : 2 x I 0 - 6 M ] dans les rOgions lipidiques p e n d a n t t5 minutes ~ 25°C suivi d'un l a v a g e pour @l/miner les sondes fluorescentes non incorporOes.
L'anisotropie < r> ~ g a l e O : (Iii - ibll) -
(Ii-
Ibl~
[Iii - Ibll) + 2 (II -
Ibl_)
Cellules p h a g o c y t a i r e s
..........,~,.
Les cellules effectrices peuvent ~tre soit des polynucl~aires circulants purifies sur un gradient d e Dextran, soit des cell[Jles macrophagiques maintenues en culture [lign~e P 338 DI]. C o m m e I'indique le Tableau I, la phagocytose d e b/lies d e latex [OSI, 0,81 /~m] se traduit par une augmentation d e la fluidit~ cellulaire refl¢t~e par une diminution d e I'anisotropie d e fluorescence d'une sonde lipophile. Tableau I Variations d e I'anisotropie du TMA-DPH incorpor6 dan.s des granulocytes ; ou des cellules m a c r o p h a g i q u e s [P 388 Dt] Iors d e la phagocytose d e billes d e latex
Pr~traitement
Anisotropie statique < r > du TMA-DPHa incorpor6 dans les polynuclOaires
P 388 Dt
TOm0ins
0,258+ 0,003
0,252+ 0,004
B/liesde latex
0,242±0,003
0,237±0,001
D¢cr0issancede
-6,2%
-
6,0%
4
dOterminations d e polar/sat/on d e fluorescence 25°C.
La valid/tO du test a @tOvOrifiOe avec des prOparations d e fibronectine isolOe ~ partir d'un pool d e plasma frais par c h r o m a t o g r a p h i e d'affinit@ sur s@pharose-g@latine [12]. C o m m e le montre la figure t, la pr@sence d e quantitOs croissantes d e fibronectine [inf@rieures ~ t50 t~g/ml] entrafne une baisse progressive d e I'anisotropie d e fluorescence du TMA-DPH incorpor@ dans des granulocytes qui indique une augmentation d e la phagocytose. Pour des doses plus importantes d e fibronectine, on observe un plateau qui peut traduire un ph@nom@ne d e saturation soit des b/lies gOlatinis@es, soit des r@cepteurs cellulaires.
0.250'
0,230
0.220:
~6o
Test de Student
200
360
~6o
soo '
F;bronectine ( l~g )
I'anis0tr0pieen % 3,57
3,68
p < 0,005
p < 0,005
a) TMA-DPH : trim~thylammoniumdiphOnylhexatri~ne
Figure t Influence de la concentration en fibronectine sur la diminution de I'anisotropie de fluorescence du TMA-DPH Iors de la phagocytose de b/lies de latex g~latinis@es par des polynucl~aires.
Trait d'Union n ° 8 - p a g e 22
-
ANALYSES
PROSPECTIVES
- REVUES GENERALES
Concentration de ta Fibronectine iors de ia pr¶tion •
0.250-
Courbe A" 390 p g / m l Courbe B ' 5 6 5 0 p g / m l
t
0,2/,0-
@ 0.230 L "1"
i
i
100
200
i
~1_
300 400 Fibronectine en IJg/m[
Figure 2 Influence de la preparation de la fibronectine sur I'anisotropie de fluorescence du TMA-DPH, Le test est tr~s sensible aux cond~itions d e prSparation et conservation d e la fibronectine. Une fibronectine pr~p a r s e sous forme concentr~e [5,65 mg/ml] ne p r o v o q u e a u c u n e variation d e I'anisotropie d e fluorescence p a r r a p p o r t aux 6.chantillons t~moins, la perte du pouvoir opsonisant d e la fibronectine ~tant p r o b a l e m e n t d u e une a u t o - a g r ~ g a t i o n d e la m o l e c u l e [Figure 2].
!0'
, Vortotions d'anlsotmpla en %
Concentration en Fibmnectine
La prSsence d'ions C a l c i u m dans le milieu d e conservation d e la fibronectine semble ~ g a l e m e n t n~cessaire au maintien d e I'activit6 d e la prot~ine qui peut ~tre conservSe sous forme c o n g e l ~ e p e n d a n t plusieurs mats [Figure 3]. Cette a p p r o c h e e x p ~ r i m e n t a l e p e r m e t ~ g a l e m e n t la d~termination d e I ' a c t i v i t 6 0 p s o n i s a n t e d e plasmas.
Anisotrople 0,255 ¢r)
Concentration en Fibronectine pendant to pr~incubotiop 200 palm t
pendant I.a pr&lncubation w
300 pg / ml. 0.2,',5
0.235
0
,
13
,
23
0.225
, 26 '
~'9
35 D&tal opr~s de to
9B jours [=cout& In preparation fibronectine
Figure 3 Stabilit6 de la fibronectine conserv~e congel~e dans un tampon contenant des ions Ca ++ [4 mM].
Sons plasma
PiosrnQ total[
Piosrno d&pourvu de Rbronectlnl ( ptosma I:1")
I-I.
Pl[osmoFireconstitui
ovi= R purifi&e
Figure 4 Effet de la d~plStion et de la reconstitution d'un plasma en fibronectine sur I'anisotropie de fluorescence du TMA-DPH.
Trait d'Union n ° 8 - p a g e 23
ANALYSES PROSPECTIVES - REVUES GENERALES
C o m m e le montre la figure 4, cette activit@ est d u e en partie ~ la fibronectine puisqu'elle est restor@e pratiquement compl@tement Iorsque I'on rajoute d e la fibronectine purifi@e ~ un p l a s m a d@pourvu d e fibronectine.
Conclusion La t e c h n i q u e d6crite ici p e r m e t des mesures rapides, r e p r o d u c t i b l e s et sensibles d e I'activit~ opsonisante d ' u n e prot6ine purifi@e : la fibronectine. Elle p e u t @tre utilis6e dans les m@mes conditions pour des plasmas. Elle ne pr@sente p a s les inconv@nients des techniques fond@es sur I'utilisation d'isotopes radioactifs. Etant donn~e la taille relativement i m p o r t a n t e d e 1'6chantillon dans cet essai, une estimation plus e x a c t e d e I'activit@ des prot6ines p e u t 6tre o b t e n u q u ' a v e c les m 6 t h o d e s m i c r o s o o p i q u e s d 6 p e n d a n t d'~chantillons d e petites tallies. Ce travail a 6t@ r@alis~ a v e c I'aide d'un Contrat EtatR@gion Lorraine GBM - A p p e l d'offres 1986.
R6sum~ La p h a g o c y t o s e d e particules inertes p a r des polynucl6aires d u sang p 6 r i p h 6 r i q u e ou des cellules m a c r o - , p h a g i q u e s se traduit p a r une a u g m e n t a t i o n d e la fluidit@ membranaire. Les variations d e fluidlt@ peuvent ~tre mises en 6 v i d e n c e p a r polarisation d e fluorescence en suivant les modifications d e I'anisotropie d e ~a,~luere~-~ c e n c e 6mise p a r des sondes incorpor@es d a n s les r6gions lipidiques cellulaires. Cette propri~t6 a 6t@ mise profit pour mettre au point un test p e r m e t t a n t d e v@rifier I'activit@ opsonisante d ' u n e prot@ine p l a s m a t i q u e purifi6e : la fibronectine. Le test p e u t ~tre 6tendu ~ la d@termination d e I'activit@ opsonisante d e olasmas et s6rums.
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