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Intervención de los fibrocitos del ligamento espiral en la regulación metabólica del oído interno José Ramón García Berrocal, Iván Méndez-Benegassi, Cristina Martín y Rafael Ramírez Camacho Servicio de Otorrinolaringología. Hospital Universitario Puerta de Hierro. Universidad Autónoma de Madrid. Madrid. España.

El mantenimiento de un gradiente de K+ entre la endolinfa y la perilinfa es imprescindible para la audición normal y depende inicialmente de la actividad de la estría vascular. La presencia de abundante Na-K-ATPasa en las células marginales de la estría vascular proporciona un mecanismo de bombeo al objeto de preservar la cantidad de K+ en la endolinfa y, consecuentemente, el potencial endococlear. Los fibrocitos de la pared lateral coclear suministran K+ a la estría, vía gap junctions, mediante la recirculación hacia la estría de los iones que fluyen desde la escala media durante la transducción auditiva. La pared lateral de la cóclea contiene cinco tipos de fibrocitos, que se diferencian según su localización, sus características estructurales y su contenido de enzimas que median o facilitan la energía para el transporte iónico. La rotura de las uniones como los puentes celulares por mutaciones de conexinas y otras condiciones patológicas conduce al bloqueo de las vías de recirculación de K+. La expresión de coclina y otorraplina, proteínas que intervienen en funciones estructurales o reguladoras del oído interno, indica una diversidad y una complejidad de los tejidos mesenquimales mayores que lo imaginado previamente. La presencia de otospiralina, una proteína novedosa encontrada en los fibrocitos del limbo espiral, el ligamento espiral y las regiones subepiteliales del vestíbulo, es un hallazgo muy importante, ya que dicha proteína se ha mostrado esencial para la supervivencia de las células ciliadas y las células de sostén del oído interno. Conocer y entender mejor la función de los fibrocitos proporcionará un nuevo y prometedor abordaje etiopatogénico para el tratamiento de las enfermedades del oído interno. +

Palabras clave: Fibrocito. Gap junction. K . Célula ciliada. Sordera. Conexina. Coclina. Otospiralina. Oído interno. DFNA9.

Este trabajo ha sido financiado parcialmente por el proyecto de investigación FIS 050673. Correspondencia: Dr. J.R. García Berrocal. Grupo de Investigación Otológica. Servicio de Otorrinolaringología. Hospital Universitario Puerta de Hierro. San Martín de Porres, 4. 28035 Madrid. España. Correo electrónico: [email protected] Recibido el 8-4-2008. Aceptado para su publicación el 23-4-2008. 494 Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(10):494-9

Intervention of Spiral Ligament Fibrocytes in the Metabolic Regulation of the Inner Ear Maintenance of the K+ gradient between endolymph and perilymph is essential for normal hearing and depends primarily on the activity of the stria vascularis. Abundant Na-K-ATPase in marginal strial cells provides a pumping mechanism for preserving the K+ level of the endolymph and consequently, the endocochlear potential. Fibrocytes in the lateral wall of the cochlea supply K+ to the strial pump, via gap junctions, by recycling back into the stria the ions that efflux from the scala media during auditory transduction. The lateral wall of the cochlea encloses five types of fibrocytes, differentiated by their location, structural features and content of enzymes mediating or energizing ion transport. The disruption of the gap junction bonds by connexin mutations and other pathologies leads to an interruption of K+ recirculation pathways. The expression of cochlin and otoraplin, proteins that participate in structural or regulatory functions in the inner ear, suggests more diversity and complexity of the mesenchymal tissues than envisioned previously. The presence of otospiralin, a novel protein found in fibrocytes of spiral limbus, spiral ligament and subepithelial regions of the vestibule, represent a critical finding since that protein has been shown to be essential for the survival of the hair cells and supporting cells of the inner ear. A more profound knowledge and understanding of the function of inner ear fibrocytes will provide a new and promising aetiopathogenic approach to the treatment of inner ear disorders. Key words: Fibrocyte. Gap junction. K+. Hair cell. Deafness. Connexin. Cochlin. Otospiralin. Inner ear. DFNA9.

INTRODUCCIÓN La cóclea contiene dos compartimentos principales rellenos de líquidos denominados endolinfa y perilinfa. Los espacios perilinfáticos (escala vestibular y escala timpánica) contienen una solución rica en Na+ y pobre en K+. Por el contrario, la composición iónica de la endolinfa contiene una gran cantidad de iones K+ y escasa concentración de

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iones Na+. Además, la endolinfa tiene un potencial positivo de 80-100 mV. Tradicionalmente se ha postulado que la estría vascular produce la endolinfa y el potencial endococlear, elementos esenciales para la transducción del sonido por las células ciliadas del órgano de Corti. El espacio intercelular localizado en la estría vascular o espacio intraestrial es único porque está aislado de la perilinfa y la endolinfa por dos capas de células, marginales y basales, conectadas por tight junctions. También se ha propuesto que las condiciones iónicas del espacio intraestrial son esenciales para la generación del potencial endococlear1,2. Se han descrito dos tipos de membranas celulares que delimitan el espacio intraestrial, la membrana basolateral de las células marginales y el sincitio, constituido por células intermedias, células basales, fibrocitos del ligamento espiral y células de los capilares, todas unidas por gap junctions2 (fig. 1). La integridad de las uniones intercelulares puede romperse en numerosas condiciones, patológicas o no, lo que interrumpe la recirculación iónica y, consecuentemente, la modificación de la composición de los líquidos endolaberínticos y del potencial endococlear. Esta alteración metabólica conduce a que se altere la homeostasis del oído interno, lo que impide la correcta función de las células sensoriales, la células ciliadas, en la transducción del mensaje sonoro, lo que se traduce en una pérdida de audición, reversible o no en función de la noxa implicada, el tiempo de actuación del agente causal y la intensidad de las alteraciones metabólicas desencadenadas. El objetivo del presente trabajo es revisar el papel de los fibrocitos en los eventos metabólicos implicados en el mantenimiento de la homeostasis del oído interno, así como destacar el protagonismo de estas células en la etiopatogenia de diversas enfermedades del órgano cocleovestibular.

RECIRCULACIÓN DE K+ A TRAVÉS DE SISTEMAS GAP JUNCTION Cuando las células ciliadas son activadas por estímulos mecánicos, los iones K+ del espacio endolinfático entran en el citoplasma de las células ciliadas. Posteriormente, estos iones son expulsados por las regiones basal y lateral, y vuelven a circular hacia la endolinfa. Las uniones intercelulares tipo gap junctions poseen canales que permiten el paso de moléculas inferiores a 1.000 Da entre las células. Estos canales se agrupan íntimamente y se denominan conexones, que son hemicanales que se unen con sus homólogos de la membrana plasmática de las células adyacentes. Cada conexón es un hexámero de una proteína llamada conexina. La localización de diversas conexinas en la cóclea de los mamíferos ha permitido establecer dos sistemas de gap junctions independientes, el sistema epitelial y el sistema conectivo. El sistema epitelial, compuesto por las células interdentales del limbo espiral, las células de soporte del órgano de Corti y las células de las raíces de la región más inferior del ligamento espiral, está involucrado en la recirculación de K+ a través de las cé-

Figura 1. Corte semifino de 0,5 m de microscopio óptico de la pared lateral de la cóclea de cobaya, en el que se muestra la localización de los diferentes tipos de fibrocitos (azul de toluidina, ×10).

lulas ciliadas durante el proceso de transducción mecanosensorial. Sin embargo, el sistema conectivo, compuesto por varios fibrocitos del ligamento espiral (fig. 1) y la región supraestrial, células basales e intermedias de la estría vascular, células mesenquimales que delimitan la escala vestibular, las células oscuras supralímbicas y los fibrocitos del limbo espiral, participaría en el mantenimiento del potencial endolinfático. Se han descrito al menos cuatro tipos de conexinas en la cóclea de los mamíferos: conexina 263, conexina 303 (fig. 2), conexina 314 y conexina 433. La mutación de genes de las conexinas, que causa la sordera hereditaria no sindrómica, podría justificarse por la interrupción de las vías de recirculación iónica de las gap junctions. La presencia de Na-K-ATPasa5 y de un cotransportador Na-K-Cl (NKCC1)6 en la membrana basolateral de las células marginales de la estría vascular y en los fibrocitos tipo II del ligamento espiral y fibrocitos de la región supraestrial respalda la hipótesis de que la producción de la endolinfa, la generación del potencial endococlear y la recirculación de K+ se localiza en estas células de la pared lateral coclear7. El papel de la Na-K-ATPasa consiste en la captación de K+ desde el espacio intraestrial y en mantener baja la concentración intracelular de Na+. El transporte de Na+ desde la perilinfa hacia el espacio intraestrial, vía células marginales de la estría vascular o fibrocitos del ligamento espiral, podría alterarse por la acción de algunos fármacos, que permitirían que este ión se acumule en el espacio intraestrial, lo que desencadena una reducción del potencial endococlear y un mayor flujo de Na+ desde la perilinfa hacia la endolinfa8. Otras enzimas que intervienen en el transporte de iones (anhidrasa carbónica y creatincinasa) también han sido descritas en los fibrocitos de la pared lateral coclear, que Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(10):494-9

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Figura 2. Expresión de conexina 30 en el interior de la cóclea de una rata Sprague-Dawley. A: la demostración del ADN nuclear se consiguió con DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol). B: se observa un aumento de inmunotinción de conexina 30 (en rojo) en varias poblaciones celulares del limbo espiral y la pared lateral (×200).

han sido clasificados en varios tipos (I-V) en función de su localización, su orientación y su inmunotinción9. Los iones K+, de localización perilinfática, captados por los fibrocitos tipo II del ligamento espiral, se mueven a través de la estrecha barrera tipo tight junction de las células basales de la estría vascular hacia el espacio intraestrial vía gap junctions que interconectan los fibrocitos tipo II y las células intermedias de la estría vascular. La captación activa de K+ por las células marginales desde el espacio intraestrial puede crear un fuerte gradiente de concentración de los iones K+ entre el espacio intraestrial y el espacio intracelular de los fibrocitos tipo II, que arrastra dichos iones hacia las células intermedias, desde donde son expulsados hacia el espacio intraestrial. Una vez captados activamente por las células marginales, éstas los expelen hacia la endolinfa, donde se encuentran disponibles para las células ciliadas del órgano de Corti.

CARACTERÍSTICAS ULTRAESTRUCTURALES DE LOS FIBROCITOS IMPLICADAS EN EL TRANSPORTE IÓNICO Se han descrito cinco tipos de fibrocitos altamente especializados, en la pared lateral de la cóclea, que se diferencian según la localización, la ultraestructura y el contenido de enzimas que intervienen en el transporte iónico (fig. 3). Se podría resumir diciendo que existen unos fibrocitos con un papel más estructural, los tipos I, III y IV, y unos fibrocitos funcionales, los tipos II y V. Pequeños matices de estructura morfológica y localización han justificado la subdivisión de algunos fibrocitos en diversas subpoblaciones (fig. 1). Así, los fibrocitos tipo III circunferencialmente orientados, que delimitan la cápsula ótica, y los fibrocitos tipo IV, con forma de huso, localizados laterales a la membrana basilar, empaquetan el contenido coclear y contrarrestan las fuerzas mecánicas generadas por los sonidos. Los fibrocitos tipo I, detrás de la estría vascular, están estrechamente empaquetados por fibras colágenas y moldean la forma de curvatura de la pared lateral. Los fibrocitos 496 Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(10):494-9

tipo II, por debajo de la estría vascular, y los fibrocitos tipo V, por encima de la estría vascular, son ricos en mitocondrias y poseen muchas prolongaciones, lo que indica una actividad metabólica muy elevada. Los fibrocitos tipos I, II y V y las células basales e intermedias de la estría vascular están interconectados por uniones tipo gap junctions (fig. 4). La presencia de Na-K-ATPasa en la membrana plasmática de los fibrocitos tipo II facilita el flujo de K+ desde las células del surco externo a los fibrocitos tipo I y posteriormente hacia las células basales y marginales de la estría vascular. Los grandes pliegues de la membrana plasmática de los fibrocitos tipo II aumentan la superficie de contacto con las células del surco externo y con los fibrocitos tipo I incrementan notablemente la disponibilidad de Na-K-ATPasa. Asimismo, los estrechos contactos y las gap junctions entre los fibrocitos y entre estas células y las células marginales de la estría vascular justifican el transporte de K+ desde los fibrocitos hacia esta estructura. Los fibrocitos tipo Ia, que contactan extensamente con las células basales de la estría vascular a través de conexiones tipo gap junctions, poseen un perfil de membrana que parece constituir una red de canalículos, denominada retículo canalicular, que está infiltrada por numerosas mitocondrias. Esta estructura permite el paso de K+ a través de la célula y también el secuestro de iones del citosol, evitando su efecto tóxico, lo que no sucede en las células carentes de este sistema como las de Hensen, Claudius y del surco interno. La presencia de abundantes mitocondrias en proximidad al retículo canalicular podría indicar que éstas proporcionarían el aporte energético suficiente para el transporte iónico. Algunas células poseen un fino aparato de Golgi, constituido por varios cúmulos de 5 cisternas cortas y/o vesículas adyacentes alineadas, que se sitúa próximo al retículo canalicular10. Los fibrocitos tipo Ib se localizan por debajo de los Ia y superiores y profundos respecto a los IIb. Se diferencian de los anteriores en que poseen mayor número de mitocondrias y un citosol perinuclear más abundante, y además contactan con prolongaciones alargadas del polo inferior de los fibrocitos tipo II.

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Figura 3. Fotocomposición de microscopio electrónico de transmisión (MET) de pared lateral de cobaya. A: fibrocitos tipo I localizados en la porción media del ligamento espiral; obsérvese la escasez de mitocondrias y de prolongaciones citoplasmáticas (×5.000). B: fibrocitos tipo II; destaca la gran cantidad de mitocondrias y prolongaciones (×6.000), que se muestran en el rectángulo inferior derecho a mayor aumento (×12.000). C: fibrocito tipo III (×6.000). D: fibrocito tipo IV (×4.000). E: fibrocitos tipo V (×2.500).

Los fibrocitos tipo IIb se sitúan en el área de la prominencia espiral. Muestran una polaridad estructural debido a la existencia de prolongaciones y Na-K-ATPasa en el polo superior del cuerpo celular elongado, en íntima proximidad con las células del surco externo, donde captan los iones K+ desde las raíces, y los liberan en el polo inferior hacia los fibrocitos tipo Ib a través de gap junctions. Algunas de las células muestran un perfil con un abundante retículo canalicular y otras presentan numerosas vesículas. Los fibrocitos tipos IV y V facilitan el flujo de electrolitos hacia los fibrocitos tipo I desde las escalas vestibular y timpánica respectivamente, más que desde el órgano de Corti, y también encierran un retículo canalicular extenso. Los haces de las raíces compuestos de las prolongaciones de las células del surco externo se extienden en la región de

Figura 4. Gap junctions entre fibrocitos tipo II (×60.000).

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Tabla I. Elementos expresados en los fibrocitos del oído interno Elemento

Función

Enfermedad

Conexinas 26,30,31,43

Transporte iónico intercelular

Sordera genética DFNA3 y DFNB1

Na-K-ATPasa, cotransportador Na-K-Cl, anhidrasa carbónica

Generación del potencial endococlear, recirculación de K+

Toxicidad por cisplatino, sordera súbita, sordera autoinmunitaria, presbiacusia

Pendrina

Transportador I-Cl

Síndrome de Pendred

Otoraplina

Condrogénesis coclear

Malformación estructural

Coclina

Desconocida

Sordera autosómica dominante DFNA9, sordera autoinmunitaria, ¿presbiacusia?, ¿enfermedad de Ménière?

Otospiralina

Supervivencia de las células ciliadas y células de soporte

Posible sordera genética

la prominencia espiral, poblada por fibrocitos tipo IIb y bandas estromales densas. El contenido de las raíces es muy variable respecto al número de mitocondrias, retículo canalicular y aparato de Golgi.

INMUNOTINCIÓN DE COCLINA EN LOS FIBROCITOS DEL OÍDO INTERNO Los fibrocitos cocleares y vestibulares son células que expresan el gen COCH, encargado de la síntesis de la proteína coclina. Estas células se atrofian mucho en la sordera autosómica dominante DFNA9 y presentan depósitos acelulares homogéneos en las áreas donde se expresa la coclina11. Las mutaciones del gen COCH no sólo se han implicado en el DFNA9, sino que también podrían tener un papel en la presbiacusia y en algunas enfermedades vestibulares. Asimismo, la coclina ha sido considerada uno de los antígenos que causan la sordera autoinmunitaria. Un análisis proteinómico ha identificado a la coclina como una de las proteínas más abundantes del oído interno12. La acumulación de coclina mutada ejerce un efecto tóxico que ocasiona la reducción y la degeneración de fibrocitos y la sustitución de éstos por agregados eosinófilos en el ligamento espiral y el limbo espiral13, a nivel de las vías de recirculación de K+ desde las células epiteliales del órgano de Corti hacia la endolinfa de la escala media, implica una interrupción de la integridad de la red de gap junctions que normalmente existen entre estas células y es esencial en la homeostasis iónica necesaria para el adecuado funcionamiento de las células ciliadas.

LA OTOESPIRALINA PRODUCIDA POR LOS FIBROCITOS DEL OÍDO INTERNO ES ESENCIAL PARA LA SUPERVIVENCIA DE LAS CÉLULAS CILIADAS En la presente revisión ha quedado suficientemente demostrado que el adecuado funcionamiento de las células ciliadas depende de la composición iónica de los líquidos endolaberínticos, endolinfa y perilinfa. Así, las estructuras 498 Acta Otorrinolaringol Esp. 2008;59(10):494-9

que participan en el balance iónico, la estría vascular en la cóclea y las células oscuras en el vestíbulo, que producen endolinfa, rica en K, requieren de regiones mesenquimales, no sensoriales, el limbo espiral y el ligamento espiral en la cóclea y la estroma inferior al epitelio sensorial en el vestíbulo para mantener la homeostasis del oído interno. Esta afirmación se apoya en la expresión en los fibrocitos de Na-K-ATPasa, anhidrasas carbónicas II y III14,15, varios canales y transportadores16,17, proteínas de la matriz extracelular18,19 y moléculas reguladoras20. El hallazgo de que algunos fibrocitos también expresan conexinas 26, 30 y 313,4 y el transportador I-Cl pendrina21 es una indicación más de su importancia en el movimiento de líquidos y el flujo de iones en el oído interno (tabla 1). Otras proteínas como la otoraplina, que podría inducir la condrogénesis en la cóclea durante el desarrollo22, y la coclina11 pueden participar en funciones reguladoras o estructurales en el interno, lo que indicaría más diversidad y complejidad de los tejidos mesenquimales. Sin embargo, el hallazgo de una proteína desconocida hasta el momento, de 6,4 kDa, denominada otospiralina, secretada por los fibrocitos del limbo espiral, el ligamento espiral y las regiones subepiteliales del vestíbulo (mácula y canales semicirculares), aporta una valiosa contribución al conocimiento de la homeostasis de las células ciliadas. Así, el bloqueo transitorio de la síntesis de otospiralina en el cobaya produce disfunción vestibular y sordera irreversible, justificada por la degeneración de las células ciliadas23. Esta degeneración sigue un patrón según el cual se produce una mayor afección de las células ciliadas externas y células de sostén que de las células ciliadas internas. La ausencia de otospiralina podría alterar los fibrocitos, inducir la aparición de vacuolas y modificar factores importantes para las células ciliadas y/o la homeostasis iónica. El desarrollo de un modelo animal que presenta una deleción del gen Otos, que codifica la otospiralina, produce una sordera moderada y una degeneración de los fibrocitos II y IV, por lo que se ha señalado que esta disfunción moderada podría preceder a la aparición de una presbiacusia24. En conclusión, la implicación de estructuras mesenquimales, no sensoriales, en la homeostasis del oído interno representa un avance importante en el conocimiento de la

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fisiología coclear, ya que tradicionalmente se atribuía a estos elementos celulares un mero papel mecánico, de soporte estructural. Entender la importancia de los flujos iónicos encargados del buen funcionamiento de las células sensoriales podría permitir el desarrollo de terapias específicamente destinadas a dichas alteraciones metabólicas. La aplicación precoz de estos tratamientos, que puede tener un ejemplo en la sordera súbita o en la sordera autoinmunitaria25, se ha mostrado muy eficaz y quizá tiene como dianas terapéuticas los fibrocitos de la pared lateral y del limbo espiral. Asimismo, estas células son el objetivo inicial de fármacos ototóxicos como el cisplatino26. Otras causas de disfunción cocleovestibular como el DFNA9, algunas variantes de la enfermedad de Ménière y de la presbiacusia, pueden obedecer a la agresión sufrida por los fibrocitos del oído interno.

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