Inventaire des différentes activités peptidasiques intracellulaires de Streptococcus thermophilus

BIOCHIMIE, 1973, 55, 389-404.

Inventaire des diffdrentes activitds peptidasiques intracellulaires de Streptococcus thermophilus. Purification et propri6t6s d'une dipeptide-hydrolase et d'une arninopeptidase. D a n i e l RAntEn et M i c h e l

J'..DESMAZEAUD.

Laboratoire de Biochimie Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique, Centre National de Recherches Zootechniques, 78350 Jouy-en-Josas-France. (18-12-1972). Summary. - - Besides a proteotytie activity, four peptidases were isolated f r o m S. thermophilus. The purified dipeptidase has a molecular w e i g h t of about 50 000 daltons. It was m a x i m a l l y active a r o u n d pH 7.50 and 50°C, its a p p a r e n t energy of activation was 4 500 cal./mole. The dipeptidase was most stable b e t w e e n pH 7.0 a n d 9.0, and for t e m p e r a tures less t h a n or equal to 50°C. E.D.T.A. or O - p h e n a n t h r o l i n e induced a very significant reduction in enzyme activity, but metal ions such as Co ~÷, Zn ÷÷, Mn +~, Mg÷~ or Ca ++ can reactivate it partially a f t e r the inactivation by a chelating agent such as B.D.T.A. Iodoacetate, p-C.M.B, or D.F.P. induced a slight reduction in enzyme activity. U n s u b s t i t u t e d dipeptides only were h y d r o l y s e d b y the enzyme. The dipeptidase exhibited a specificity t o w a r d dipeptides w i t h a large and h y d r o p h o h i c a m i n o acid residue at the NH2-terminal end ; the second amino acid residue (at the COOH-terminal end) had also an effect on enzymic activity. A homogeneous a m i n o p e p t i d a s e --- with regard to disc electrophoresis - - was obtained. The molecular weight of this enzyme was found to be 62 0O0 daltons. It was m a x i m a l l y active a r o u n d pH 6.40 and 35°C ; its a p p a r e n t energy of activation was 7 300 cal./mole. Aminopeptidase was m o s t stable b e t w e e n pH 5.80 and 9.80 and at a t e m p e r a t u r e less t h a n 40°C. E.D.T.A. or O - p h e n a n t h r o l i n e induced a complete inactivation of the enzyme, but metal ions such as Co*+ and Mn*÷ can reactivate it completely ; metal ions such as Ca +* and Zn ~÷ or Mg ++ partially after the inactivation by a chelating agent such as E.D.T.A. Zn +' 5.10-~ M and alcohols induced a significant reduction in enzyme activity. This enzyme can be precisely defined as a n a - a m i n o - a e y l - p e p t i d e h y d r o l a s e EC.3.4.1. since only NH.2-terminal end amino-acid residues were released f r o m oligopeptides (comprising less t h a n eleven amino-acid residues). Leucine-p-nitroanilide and amino-acid amides (except p h e n y l a l a n i n e amide) were hydrolysed. Lys-Tyr and Leu-Leu were the best dipeptide substrates. Dipeptides w i t h a glyeyl or a h i s t i d y l residue at the NH~-terminal end were not h y d r o l y s e d as also dipeptides w i t h a prolyl or p h e n y l a l a n y l residue.

INTRODUCTION. L a c r o i s s a n c e d e Streptococcus thermophilns d a n s le lait est s t i m u l 6 e p a r l ' a d d i t i o n d e p e p t i d e s dont on connalt actuellement deux classes caract 6 r i s 6 e s p a r la l o n g u e u r d u p e p t i d e El, 2]. P u i s q u e ces p e p t i d e s s e r v e n t c o m m e s o u r c e p r 6 f 6 r e n t i e l l e d ' a c i d e s a m i n e s El, 2~, il se p o s e d o n e le p r o b l a m e d e la n a t u r e d e s p e p t i d a s e s q u i h y d r o l y s e n t ces p e p t i d e s h l ' i n t 6 r i e u r d e la cellule. Or, b i e n q u e la p r 6 s e n c e d ' a c t i v i t ~ s e n z y m a t i q u e s d e c e

Abrdoiations. TRIS = T r i s - ( h y d r o x y m 6 t h y l e ) - a m i n o m 6 t h a n e . D.E.A.E. = Di6thylamino6thyle. E.C.T.E.O.L.A. ---- E p i c h l o r o h y d r i n e - t r i 6 t h a n o l a m i n e . L.N.A. = Leueine-para-nitroanilide. Z = Benzyloxycarbonyle. D.O. = Densit6 optique. E.D.T.A. = Acide ~thyl6ne d i a m i n e t~tra-ac~tique (sel disodique). p-C.M.B. = p a r a - c h l o r o m e r e u r i b e n z o a t e de sodium. D.F.P. ::- Di-iso-propyle fluorophosphate.

t y p e ait 6t6 s i g n a l 6 e c h e z S. thermophilus [3, 4, 5], a u c u n e t e n t a t i v e d ' i s o l e m e n t et d e c a r a c t 6 r i s a t i o n d e s p e p t i d a s e s n ' a 6t6 f a i t e c h e z cet o r g a n i s m e . C'est p o u r q u o i nous avons e n t r e p r i s leur 6rude s y s t 6 m a t i q u e d o n t la p h a s e p r 6 1 i m i n a i r e , l ' i n v e n t a i r e d e s d i f f 6 r e n t e s a c t i v i t 6 s p e p t i d a s i q u e s , est p r 6 s e n t 6 e d a n s le p r 6 s e n t t r a v a i l . D e u x f r a c t i o n s p e p t i d a s i q u e s o n t 6t6 p a r la s u i t e p u r i f i 6 e s et caract6ris6es comme une aminopeptidase [BC 3.4.1] et u n e d i p e p t i d a s e [EC 3.4.3]. L a p u r i f i c a t i o n et les p r o p r i 6 t 6 s d e c e s d e u x e n z y m e s s o n t p r 6 s e n t 6 e s d a n s ce m 6 m o i r e . I1 est i m p o r t a n t d e f a i r e r e m a r q u e r q u e S. thermophilas i n t e r v e n a n t d a n s la f a b r i c a t i o n d e p l u s i e u r s p r o d u i t s a l i m e n t a i r e s (laits f e r m e n t 6 s , f r o m a g e s ) a p p o r t e r a d o n c d a n s c e u x - c i a p r 6 s la l y s e cellulaire un c o m p l e x e de p e p t i d a s e s , potentiellem e n t c a p a b l e d ' e n r i c h i r le p r o d u i t e n a c i d e s a m i n6s l i b r c s e s s e n t i e l s d ' u n p o i n t d e r u e n u t r i t i o n -

390

D a n i e l R a b i e r et M i c h e l J. D e s m a z e a u d .

nel, p u i s q u e nous m o n t r o n s que cette bactdrie possbde en plus d ' u n e dipeptidase et d ' u n e aminopeptidase, des p e p t i d y l e - p e p t i d e - h y d r o l a s e s capables de f o u r n i r h celles-ci les plus courts peptides qui leur seront substrats, MATERIEL E T METHODES. ORGANISME.

S t r e p t o c o c c u s thermophilus : souchc C.NRZ 160 = TJ. Cette bact6rie 6tail i n a i n t e n u e p a r repiquage sur lait 6cr6m6 st6rile et conserv6e p a r cong61ation h - - 30°C.

lion d ' e n v i r o n 215 g de sulfate d ' a i n m o n i u m h 875 1111 de s u r n a g e a n t $3 (soit 40 p. cent de satur a t i o n en (NH4) 2 SO 4) ; aprbs 90 m n h 4°C sans agitation, le pr6cipit6 6tail 61imin6 p a r centrifugation "h l0 000 g p e n d a n t 30 n i n h 4°C ; s e u l l e surnageant $4 contenait u n e activitd peptidasique. Une deuxi&me p r 6 c i p i t a t i o n 6tait effectu6e sur 970 inl de s u r n a g e a n t $4 p a r a d d i t i o n d ' e n v i r o n 280 g de (NrH4)2 SO 4 (soit 80 p. cent de s a t u r a t i o n en sulfate d ' a n i m o n i u I n ) ; aprbs 15 h h 4°C, sans agitation, le prdcipit6 c o n t e n a n t l'activitd peptidasique 6tait recueilli p a r c e n t r i f u g a t i o n h 10 000 g p e n d a n t 30 n m h 4°C et redissous (extrait E l ) dans e n v i r o n 90 ml de t a m p o n phosphate de sodium 0,0~1 M h pH 7,0.

]~XTRAIT CELLULAIRE.

Les 325 g de cellules p r o v e n a i e n t de 75 litres d ' u n e culture sur u n milieu au lair hydrolysd par la papa'ine p r d c 6 d e m m e n t ddcrit [61. Les cellules 6taient lav6es deux fois p a r du t a m p o n phosphate de s o d i u m 0,04 M h pH 7,0. Les cellules remises en s u s p e n s i o n dans 60 ml de ce m6me t a m p o n 6taient soumises h u n t r a i t e m e n t aux ultrasons dans u n a p p a r e i l Siduse U S - 7 7 - 7 ~ u n e fr6quence de 23kHz p e n d a n t 15 m n ; la t e m p d r a t u r e p e n d a n t le t r a i t e m e n t dtait m a i n t e n u e h 4°C. Puts la susp e n s i o n cellulaire 6tait centrifug6e h 34) 000 g p e n d a n t 15 m n h 4°C. Le s u r n a g e a n t [$1~ 6tait conserv6 et u n t r a i t e m e n t s u p p l d m e n t a i r e au ]ysozyme effectu6 sur le culot. P o u r cela le culot dtait remis en s u s p e n s i o n dans du t a m p o n TRI:SHC1 0,05 M h pH 8;0 c o n t e n a n t 0,25 m g / m l de lysozyme. Apr~s i n c u b a t i o n p e n d a n t 6 h h 37°C sous agitation lente les d6bris cellulaires 6taient s6pards p a r c e n t r i f u g a t i o n h 30 004) g p e n d a n t 10 m n h 4°C et le s u r n a g e a n t [$2~ 6tait r 6 u n i au s u r n a g e a n t $1.

3~ ~tape : Chromatographic sur gel de Sepharose 6B.

60 ml d'extrait e n z y m a t i q u e E1 p r d a l a b l e m e n t dialys6s p e n d a n t 3 h ~ 4°C contre du t a m p o n phosphate de s o d i u m 0,01 M h pH 7,1) 6talent chromatographi6s sur u n e colonne de Sepharose 6B (Sephadex). L'61ution 6tait r6alis6e p a r passage du t a m p o n phosphate. Les fractions 6talent recueillies au m o y e n d ' u n collecteur G,M.E. On enregistrait en c o n t i n u la densit6 optique de l'dluat h 280 n m et 264) n m & l'aide d ' u n spectrophotom6tre enregist r e u r Seive. Le < (Vo) de la c o l o n n e 6tait d6termin6 p a r c h r o m a t o g r a p h i c de bluedextran 2000 (Sephadex). On r6unissait les fractions p r d s e n t a n t u n e activit6 p e p t i d a s i q u e el r u n c o n c e n t r a i t douze fois, p a r ultra~iltration h 4°C, les protdines de poids moldculaire sup6rieur 10,000 daltons dans u n e cellule Diaflo (Amicon) sur u n e m e m b r a n e UM 10 Diaflo. On effeetuait ensuite une dialyse p e n d a n t 15 h h 4°C contre du t a m p o n TRIS-HCI 0,005 M h pH 6,50 ( = extrait e n z y m a t i q u e E2).

PROC~DE D'ISOLEMENT ET DE PURIFICATION.

1 ~" ~tape : E l i m i n a t i o n des acides nucl~iqaes.

Les acides nucl6iques 6talent hydrolys6s en ajoutant h 909 ml de s u r n a g e a n t S1 + $2, 0,5 mg de d6soxyribonucl6ase (Sigma), 25 nag de ribonucldase (Sigma) et 1 500 mg de chlorure de magn6sium et l'on i n c u b a i t p e n d a n t 2 h et 30 nan ~9°C avec agitation lente ; on effectuait ensuite u n e p r 6 c i p i t a t i o n p a r 9,64) g de sulfate de manganbse (pr6alablement dissous dans le plus petit volume possible de t a m p o n phosphate de sodium 0,01 M h pH 7,0) ; apr~s 1 h h 4°C le pr6cipit6 6tait 61train6 p a r c e n t r i f u g a t i o n h 10 000 g p e n d a n t 10 m n h 4°C et le s u r n a g e a n t [$3] recueilli. 2e ~tape : Precipitations au sulfate d ' a m m o n i u m . L'opdration 6tait effectude en deux 6tapes. Une p r e m i b r e p r d c i p i t a t i o n 6tail obtenue aprbs addiBIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 4.

If* ~tape : Chromatographic sur D.E.A.E.-cellulose.

45 ml d'extrait e n z y m a t i q u e E2 6talent d6pos6s au sommet d ' u n e colonne de D.E.A.E.-cellulose DE-23 (Whatman) p r 6 c d d e m m e n t 6quilibrde en t a m p o n TRIS-HCI 0,005 M h pH 7,50. Apr6s lavagc de la c o l o n n e p a r e n v i r o n 2,24) ml de t a m p o n TRIS-HC1 0,04)5 M h pH 7,5,0 l'dlution 6tait r6alis6e p a r n t i l i s a t i o n d ' u n g r a d i e n t l i n 6 a i r e de conc e n t r a t i o n en chlorure de sodium, en t a m p o n TRIS-HC1 0,005 M h pH 7,54). Les fractions dtaient recueillies et dosdes coinme ddcrit ci-dessus. Elles dtaient ensuite rdunies en t e n a n t compte des diff6rentes activit6s protdolytiques et p e p t i d a s i q u e s qu'elles r e n f e r m a i e n t (ces extraits dtaient ddsignds : C et P).

P e p t i d a s e s i n t r a c e l l u l a i r e s de S. t h e r m o p h i l u , s .

391

5 ° ~tape : Chromatographie sur E.C.T.E.O.L.A.cellulose.

- - A m i d e s d ' a c i d e amin6 = Sigma ;

La fraction P, apr~s c o n c e n t r a t i o n sur memb r a n e Diatlo UM 10 et dialyse p e n d a n t 36 h /~ 4°C contre le t a m p o n TI~IS-HCI 0,005 M ~ pH 7,5, 6tait d6pos6e au sommet d ' u n e c o l o n n e d'E.C.T. E.O.L.A.-cellulose E9'126 (Sigma) pr6par6e en tampoll TRIS-HC1. Apr6s lavage de la colonne p a r env i r o n 280 ml de t a m p o n TRIS-H,C1 0,005 M pH 7,50, l'61ution 6tait r6alis6e p a r utilisation d ' u n g r a d i e n t lin6aire de c o n c e n t r a t i o n en c h l o r u r e de s o d i u m en t a m p o n TRIS-HC1 0,0,0,5 M ~ pH 7,50. Les fractions 6taient recueillies et dos6es comme d6crit ci-dessus. Elles 6latent ensuite r6unies en t e n a n t compte des diff6rentes activit6s qu'elles r e n f e r m a i e n t (ces extraits 6talent d6sign6s I~P, ~P, Pa et Pb)"

- - Dipeptides n o n substitu6s : Gly-Gly = N.B.C, Gly-Phe = Mann, tous les autres = C y c l o ;

6~ et 7 ° dtapes : Chromatographies sur D.E.A.E.cellulose.

Les extraits enzymatiques c o n t e n a n t les activit6s d i p e p t i d a s i q u e s ou a m i n o p e p t i d a s i q u e s isol6es aprbs c h r o m a t o g r a p h i e sur E.C.T.E.O.L.A.-cellulose 6taient dialys6s p e n d a n t 6 h fi 4°C contre du t a m p o n phosphate de sodium 0,0.1 M ~ pH 7,0 et r6duits ~ 30 ml p a r ultrafiltration sur u n e memb r a n e Diaflo UM 10. Ces extraits 6taient d6pos6s au sommet d ' u n e colonne de D.E.A.E.-cellulose m i c r o g r a n u l a i r e D~E,32 (Whatman), 6quilibr6e en t a m p o n phosphate de s o d i u m 0,01 M ~ pH 7,0. Apr6s lavage de la c o l o n n e p a r e n v i r o n 150 ml de ce t a m p o n l'61ution 6tail r6alis6e p a r utilisation d ' u n g r a d i e n t lin6aire de c o n c e n t r a t i o n en t a m p o n phosphate de sodium ~ pH 7,0. Les fractions 6taient recueillies et dos6es cornme d6crit pr6c6demment. Les fractions c o r r e s p o n dant ~ la partie sym6trique d u p i c d'activit6 dip e p t i d a s i q u e (vis-a-vis de la Leu-Leu) ou aminop e p t i d a s i q u e (vis-a-vis de la L.N.A.) 6latent r6unies puts r e c h r o m a t o g r a p h i 6 e s sur D.E.A.E.-cellulose DE-32 dans les m6mes c o n d i t i o n s que cidessus ~ l ' e x c e p t i o n de la pente du g r a d i e n t lin6aire de c o n c e n t r a t i o n en t a m p o n phosphate de sodium qui 6tait deux fois plus faible. DOSAGE DES PROTEIN,FAS.

La c o n c e n t r a t i o n en prot6ines 6tail d6termin6e selon la m6thode de Lo~vry et al. [4] avec le r6actif de F o l i n et Ciocalteu (.'Merck). La s 6 r u m - a l b u m i n e bovine (Sigma) 6tail employ6e comme prot6ine6talon. DOSAGE DES ACTIVIT]~S PROTI~.OLYTIQUES ET PEPTIDASIQUES,

Origine des substrats : T o u s l e s p r o d u i t s sont de forme L.

BIOCH1MIE, 1 9 7 3 ,

55, n ° 4.

Cyclo ; L.N.A. ---=

- - Dipeptides mono-substitu6s : Z-Gly-Phe- ----F l u k a ; Z-Gly-Ala, Z-Gly-Leu, et Z-Glu-Tyr ---Cyclo ; --

Dipeptides di-substitu6s: Z-Gly-Tyr-NH2, Z-HisPhe-NH2, Z-Thr-Phe-NH2, Z-Ala-Phe-NH2 = Cyclo ; Z-Gly-Leu-NH2 = Mann ;

--Tripeptides: Gly-Tyr-Gly, Gly-Trp-Gly, GlyHis-Gly, Gly-Phe-Gly, Met-Leu-Gly, Leu-GlyGly = C y c l o ; la Lys-Tyr-Leu ainsi que les oligopeptides 6taient isol6s apr6s h y d r o l y s e du glucagon p a r la p a p a i n e ou la t r y p s i n e selon les t e c h n i q u e s d6crites p a r ailleurs [1, 8]. --

<~Peptides de cas6ine >) ~ 0,02 p. cent: cette solution 6tail obtenue aprbs h y d r o l y s e de la cas6ine enti~re p a r la prot6ase neutre de Micrococcus caseolyticus comme d6crit pr6c6d e m m e n t [1].

--- Glucagon: Calbiochem. - - Cas6ine iso61ectrique (qualit6 H a m m e r s t e n ) = N.B.C. Activit~ proldolytique. L'activit6 prot6olytique 6tait dos6e 5 37°C et pH 7,0 en e m p l o y a n t la cas6ine iso61ectrique 2 p. cent comme substrat selon une t e c h n i q u e d6crite p r 6 c 6 d e m m e n t [9], les peptides lib6r6s 6tant estim6s aprbs coloration de 1 ml du filtrat trichlorac6tique p a r 1 ml du r6actif h la n i n h y d r i n e selou Moore et Stein [10]. Apr~s d i l u t i o n p a r 8 ml d'alcool h 50 p. cent on m e s u r a i t la v a r i a t i o n de densit6 optique h 570 nm. Aclivilds amino- ou carboxypeptidasiques. - - Substrat : L e u c i n e - p - n i t r o a n i l i d e LNA [11] ; le m61ange r 6 a c t i o n n e l avail la c o m p o s i t i o n suivante : 0,1 ml de L.N.A. en m6thanol (h 6,4 mg de L.N.A. p o u r 1 ml de m6thanol) ; 2,8 ml de t a m p o n phosphate de s o d i u m 0,01 M h pH 7,0 ; 0,1 ml de solution enzymatique. Apr~s i n c u b a t i o n /~ 37°C p e n d a n t diff6rents intervalles de temps la r6action 6tait arr6t6e p a r a d d i t i o n de 0,5 ml d ' a c i d e ac6tique h 30 p. cent (poids/volume). La v a r i a t i o n de densit6 optique 6tait mesur6e h 410 nm.

--. Substrats : dipeptides n o n substitu6s et peptides de cas6ine -- le m61ange r 6 a c t i o n n e l avail la c o m p o s i t i o n suivante : 0,9 ml de substrat h u n e c o n c e n t r a t i o n de 0,8 ou 1 mM p o u r les dipeptides ou h 0,02 p. cent p o u r les peptides de cas6ine, en t a m p o n phosphate de sodium 0,01 M h p H 7,0;

Daniel Rabier et Michel J. Desmazeaud.

392

0,1 ml de solution enzymatique. Apr6s i n c u b a t i o n h 37°C p e n d a n t diff6rents i n t e r v a l l e s de t e m p s la r6action 6tait arr6t6e en p o r t a n t 15 m n l e m61ange r 6 a c t i o n n e l au b a t h - m a r i e b o u i l l a n t aprbs a d d i t i o n de 1 ml du r6actif h la n i n h y d r i n e . La variatio.n de densit6 o p t i q u e 6tait mesur6e h 570 n m apr6s dilution dans l'alcool h 50 p. cent c o m m e d6crit ci-dessus. Une unit6 d'activit6 e n z y m a t i q u e c o r r e s p o n d h l ' a p p a r i t i o n de 0,01~0 unit6 de densit6 o p t i q u e p a r mn, soit h 570 nm soit a 410 nnL L'activit6 sp6cifique est calcul6e c o m m e le n o m b r e d'unit6s d'activit6 e n z y m a t i q u e p a r mg de prot6ine.

ELECTROPHOBI~.SE EN

GEL DE

POLYACRYLAMIDE EN

TUBE.

L'61ectrophorbse 6tait effectu6e sous une tension de 220 volts en utilisant le bleu de b r o m o p h 6 nol colnme traceur, dans un a p p a r e i l Pleuger c o m p o r t a n t 8 tubes de v e r r e de 7 × 0,5 crn dans lesquels avait 0 6 pr6par6 selon la t e c h n q i u e d6crite p a r Ornstein [12] et Davis !13! un gel de p o l y a c r y l a m i d e h 7 p. cent en t a m p o n TRISborate 0,1 M ~ pH 9,20. Apr6s a c h b v e m e n t de l'61ectrophorbse les prot6ines 6talent r6v616es p a r c o l o r a t i o n au bleu de Coomassie selon la technique d6crite p a r C h r a m b a c h et al. [14]. Le rep6-

TABLEAU I.

lnventaire de dif[drentes activit~s peptidasiques intracellulaires de S t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s 160. t r" 6tape

Substrats

z-x

(.)-v (-) ......

L.N.A . . . . . . . . . . . . . Leu-Leu . . . . . . . . . . . Peptides de eas6ine. Glueagon . . . . . . . . . . Cas6ine . . . . . . . . . . .

2' 6tape

I

~le 6tape

5" 6tape

] Chromatographic sur I D.E.A.E. - cellulose DE-23 Extrait $3 de l'extrait E-2 Extrait E2 apr~s 61imination apr~s B! des acides Sepharose 6 i Extrait Extrait i prot6olypeptidasique nucMiques I tique C P 0 3,5 11,5 11,5

0 13,8 44,5 44,5

0 0 0 8,0

0,9

3,5

4,2

8

49,0 130,0 116,3

Chromatographic sur ECTEOLA-cellulose de l'extrait P Extrait DP

Extrait AP

Extrait Pa

Extralt Pb

0 0 72 14,4 0 0

0 600 300 320 0 0

0 415 230 254 48,5 0

0 50 150 200 96 0

X* ---- Gly ou Glu. Y*" = Phe, Ala, Leu ou Tyr. Les rdsultats sont exprim~s en activit~ sp6ciflque (Unit6s/mg).

- - - S u b s t r a t s : amides, d i p e p t i d e s non substitu6s, d i p e p t i d e s m o n o - ou di-substitu6s, t r i p e p t i d e s , o l i g o p e p t i d e s ---- le m61ange r 6 a c t i o n n e l avait la c o m p o s i t i o n suivante : 0,1 ml de substrat h une c o n c e n t r a t i o n de 0,5 mM (dipeptides mono-substitu6s) ou 2 mM (amides) ou 0,8 h 1 mM (dipeptides non substitu6s et t r i p e p t i d e s ) en t a m p o n p h o s p h a t e de s o d i u m 0,1 M h p H 7,50 ou 6,5.0 p o u r l ' a m i n o p e p t i d a s e ; 0,025 ml de la solution de peptidase. Apr6s i n c u b a t i o n p e n d a n t diff6rents intervalles de temps h 45°C p o u r la d i p e p t i d a s e ou 35°C p o u r l ' a m i n o p e p t i d a s e , les m61anges r6actionnels 6talent d6pos6s en spots sur une feuille de p a p i e r W h a t m a n 3 MM et la d6tection des acides amin6s 6 v e n t u e l l e m e n t lib6r6s p a r h y d r o lyse 6tait effectu6e apr6s c h r o m a t o g r a p h i c descendante ou 61ectrophor~se h haut voltage selon des t e c h n i q u e s d6crites p a r ailleurs [8].

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 4.

rage des activit6s e n z y m a t i q u e s 6tait effectu6 p a r d6coupage m a n u e l des gels en petits disques de 1,5 m m d'6paisseur qui 6talent plac6s dans les m61anges r 6 a e t i o n n e l s a p p r o p r i 6 s pr6par6s en t a m p o n p h o s p h a t e de s o d i u m 0,0,1 M h pH 7,0. Dans le eas oh l ' u t i l i s a t i o n de n i n h y d r i n e i n t e r v e nait, on effectuait une p r 6 & l e e t r o p h o r + s e afin d'61iminer le persulfate d ' a m m o n i u m . ESTIMATION DU POIDS MOL~CULAIIRE. Le poids m o l 6 c u l a i r e des p e p t i d a s e s 6tait estim6 sur une c o l o n n e (85 × 2 cm) de S e p h a d e x G-100 (Pharmacia) selon la t e c h n i q u e d6crite p a r A n d r e w s [15] en utilisant la s @ u m - a l b u m i n e b o v i n e (Sigma), la p e p s i n e ( W o r t h i n g t o n ) , la t r y p sine (N.B.C.) et la ribonucl6ase (Calbiochem) e o m m e prot6ines 6talons.

393

P e p t i d a s e s intracellulaires de S. t h e r m o p h i l u s . BE~ULTATS. l.

--

INVENTAIRE

DES

D1FFERENTES

ACTIVITI~S

PEP-

TIDAS IQUE,q.

Les t r o i s p r e m i 6 r e s 6tapes de p u r i f i c a t i o n ( h y d r o l y s e des a c i d e s n u c l 6 i q u e s , p r 6 c i p i t a t i o n s au s u l f a t e d ' a m m o n i u m , chromatographic sur c o l o n n e de gel de S e p h a r o s e 6,B) a v a i e n t c o m m e o b j e c t i f a v a n t t o u t e t e n t a t i v e de s 6 p a r a t i o n , d'61im i n e r la totalit6 des a c i d e s n u c l 6 i q u e s et la p l u s g r a n d e q u a n t i t 6 p o s s i b l e de p r o t 6 i n e s d 6 p o u r v u e s d ' a c t i v i t 6 p e p t i d a s i q u e (tab. I). Les a c t i v i t 6 s p e p t i d a s i q u e s ont 6t6 d 6 t e r m i n 6 e s au c o u r s du f r a c t i o n n e m e n t v i s - M v i s des s u b s t r a t s s u i v a n t s : u n e p r o t 6 i n e (cas6ine), u n m61ange de p e p t i d e s ( p e p t i d e s de cas6ine), u n p e p t i d e h l o n gue c h a l n e ( g l u c a g o n ) , un d i p e p t i d e ( L e u - L e u ) , la l e u c i n e - p - n i t r o a n i l i d e ( s u b s t r a t des a m i n o p e p t i dases) et des p e p t i d e s de t y p e Z-X-Y ( s u b s t r a t s des c a r b o x y p e p t i d a s e s ) .

s p 6 c i f i q u e de 4,2 s u r la c a s 6 i n e e n t i 6 r e et a u c u n e a c t i v i t 6 ni s u r la L e u - L e u ni s u r la L.N.A. P a r c o n t r e , l ' e x t r a i t P ne p o s s 6 d a i t p l u s a u c u n e activit6 vis-h-vis de la cas6ine, n m i s son a c t i v i t 6 sp6cifique vis-h-vis de la L e u - L e u ou de la L.N.A. 6tait r e s p e c t i v e m e n t de 130,0 ou 58,9. c) Fraclionnement de ractivit~ sur E.C.T.E.O.L.A. cellulose.

peptidasique

On o b t i e n t aprbs c h r o m a t o g r a p h i c E C T E O L A - c e l l u l o s e d e u x c o u r b e s d'61ution

sur dis-

E o DP

AP

I

e

P~

Pb

I-,

I

o '

OJ

o

sb

,~

i

0,5

~'d ..~,

,so

200

.~' des f r o c l ~ s

a) Activit~ carboxgpeptidasique. A u c u n e a c t i v i t 6 de t y p e c a r b o x y p e p t i d a s i q u e n ' a p u 6tre raise en 6 v i d e n c e m 6 m e s u r l ' e x t r a i t n o n p u r i f i 6 $3 (tab. I). 2. c

E

oc

FIG. 2. - - Chromatographie sur E.C.T.E.O.L.A.-cellulose. Isolement de la dipeptidase et de l'aminopeptidase. Colonne : 45 X 2,5 cm. Volume d'extrait P1 apr~s D.E.A.E.-cellulose : 75 ml. D6bit : 40 m l / h . Volume des fractions : 9,7 ml. Tampon TRIS-HC1 0,005 M 7,50. -- densit~ optique h 280 nm. -- pente du gradient de NaC1. e - - o - - e = activit~ sur la Leu-Leu. O--©--Q : activit6 sur les peptides de eas~ine (activit~s mesur6es h 570 rim).

e~ ,o

o

I00

200

500 n °- f r o c t i o n s

Fro. 1. - - Chromatographic sur D.E.A.E.-cellulose DE-:t3. Elimination des activit4s cas6inolytiques. Co lonne : 42,5 X 2,5 cm. D6hit : 40 m l / h . Volume d'extrait E 2 apr6s Sepharose 6 B : 45 mt. T a m p o n : TRIS-HC1 0,005 M pH 7,5. Volume des fractions : 9,7 ml. Elution par gradient lin~aire de concentration en NaC1 en tampon TRIS-HC1. densit6 optique h 280 nm. : densit6 optique h 570 um (activit6 peptidasique sur peptides de cas6ine). : pente du gradient en NaC1. --

e

-

-

e

-

-

e

b) Activitd prot~olytique. L a 4 ~ 6tape d e p u r i f i c a t i o n a p e r m i s de s 6 p a r e r l ' a c t i v i t 6 p r o t 6 o l y t i q u e C ( h y d r o l y s a n t la c a s 6 i n e ) de l ' a c t i v i t 6 p e p t i d a s i q u e P (tab. I, Fig. 1). E n effet, a p r b s c h r o m a t o g r a p h i c s u r D.E.A.E. cellulose D E 23, la f r a c t i o n C p r 6 s e n t a i t u n e a c t i v i t 6

BIOCHIMIE, 197~, 55, n ° 4.

t i n c t e s de l ' a c t i v i t 6 p e p t i d a s i q u e s u i v a n t q u e celleci est d 6 t e r m i n 6 e a v e c c o m m e s u b s t r a t s o i t les p e p t i d e s de cas6ine, soit le d i p e p t i d e L e u - L e u . E n t e n a n t c o m p t e de ces d e u x c o u r b e s l'61uat a 0 6 divis6 en q u a t r e f r a c t i o n s DP, AP, P a e t Pb (Fig. 2) d o n t les a c t i v i t 6 s p e p t i d a s i q u e s o n t 6t6 test6es a v e c d i v e r s s u b s t r a t s p o u r t e n t e r de les c a r a c t 6 r i s e r (tab. I). L ' a b s e n c e d ' a c t i v i t 6 p r o t 6 o l y t i q u e vis-h-vis de la c a s 6 i n e et d ' a c t i v i t 6 e a r b o x y p e p t i d a s i q u e est c o n firm6e p o u r c h a c u n e des q u a t r e f r a c t i o n s . - L a f r a c t i o n D P a les c a r a c t 6 r e s d ' u n e a c t i v i t 6 d i p e p t i d a s i q u e p u i s q u ' e l l e ne p r 6 s e n t e a u c u n e a c t i v i t 6 ni s u r la L.N.A. ni s u r le g l u c a g o n , m a t s p o s s 6 d e u n e f o r t e a c t i v i t 6 v i s - M v i s du d i p e p t i d e Leu-Leu. L a f r a c t i o n AP a les c a r a c t 6 r i s t i q u e s d ' u n e activit6 a m i n o p e p t i d a s i q u e (elle h y d r o l y s e la L.N.A. et la L e u - L e u ) a g i s s a n t p r 6 f 6 r e n t i e l l e m e n t s u r les p e p t i d e s de p o i d s m o l 6 c u l a i r e m o y e n p u i s q u ' e l l e

Daniel Rabier el Michel J. D e s m a z e a u d .

394 est incapable d'hydrolyser r6sidus d'acides amin6s).

le g l u c a g o n ( v i n g t - n e u f

L e s f r a c t i o n s P a et P b c o m m e l a f r a c t i o n A P h y d r o l y s e n t la L.N.A. et l a Lcu~Leu, m a i s e n diffbr e n t p u i s q u ' e l l e s h y d r o l y s e n t a u s s i le g l u c a g o n . C o m p t e t e n u d u fair q u e l a f r a c t i o n P b q u i • s t 61u6e p l u s t a r d i v c n l e n t q u c l a f r a c t i o n P a e t la f r a c t i o n AP, m o n t r e l ' a c t i v i t 6 l a m o i n s f o r t e a v e c l a L.N.A. et l ' a c t i v i t 6 la p l u s f o r t e a v e c le g l u c a g o n (tab. I), o n p e u t s u p p o s e r q u e l e s d e u x f r a c t i o n s Paet P b s o n t c a r a c t 6 r i s 6 e s p a r le fair q u ' c l l e s h y d r o l y s e n t le g l u c a g o n m a i s q u ' e l l c s s o n t c o n t a min6es par l'activit~ aminopeptidasique caract6r i s t i q u e d e la f r a c t i o n AP. 2.

--

PURIFICATION

DE

LA

DIPEPTIDASE

El"

DE

L'AMINOPEPTIDASE.

t r a i t n o n p u r i f i 6 $3. E l l e p r 6 s e n t a i t u n e a c t i v i t 6 s p 6 c i f i q u e d e 200,0 vis-/t-vis d e la L e u - L e u ( t a b . II). A p r 6 s 6 1 e c t r o p h o r b s e e n gel d e p o l y a c r y l a m i d e o n observait, aprbs coloration au bleu de Coomassie, u n e b a n d • d e c o l o r a t i o n i n t e n s e et d e u x b a n d e s d e t r 6 s 16gbre c o l o r a t i o n et d e m o b i l i t 6 61ectro-

/"

®

I00.

"2 > 4-0 0

50

"0

o o Q.

Apr6s deux chromatographies successives sur D E A E . - c e l l u l o s e m i c r o g r a n u l a i r e D E 32 (Fig. 3A), o n o b t e n a i t 845 m i c r o g r a m m e s de dipeptidase p u r i f i 6 e s o i t 0,1804 p. m i l l e d e s p r o t 6 i n e s d e l ' e x -

4

5

~

-~

8

I

l~)pH

®

I00. I

9

0,5

5O ~o

,oo

,~o

~oo n °-

i o

.

.

/"

~o des

fractions

I ~

2 c

/

,o

o o.5

!

5

I

6

|

7

;

;

IOpH

FIG. 4. A = Activit6 de la dipeptidase e n fonction du pH. Activit6 mesur6e sur la Leu-Leu. Les diff6rents pH 6taient o b t e n u s d a n s le t a m p o n TRIS-mal6ate 0,1 M . I n c u b a t i o n 5 m n h 45°C. B : Activit6 de l ' a m i n o p e p t i d a s e en f o n c t i o n du pH. Activit~ mesur~e sur la L.N.A. : • • sur la Leu-Leu : © -© Les diff6rents pH 6taient o b t e n n s dans le t a m p o n TRIS-maldate de sodium 0,1 M. I n c u b a t i o n 20 m n h 35°C p o u r la L.N.A. I n c u b a t i o n 45 m n h 35°C p o u r la Leu-Leu. -

I /;,~/ .,J. ~

io

n -= des fraction, s

Fro. 3. - - A = Deuxi6me c h r o m o t a g r a p h i e sur D.E.A.E.-cellulose m i c r o g r a n u l a i r e DE-32 de l ' e x t r a i t dipeptidasique. Colonne : 33 X 1,2 cm. D~bit : 25 m l / h . Volume des f r a c t i o n s : 3 ml. T a m p o n : p h o s p h a t e de sodium 0,01 M /~ pH 7,0. -6lution des protdincs (D.O. 280 nm). • --•--$ : activitd d i p c p t i d a s i q u e (D.O. 570 n m ; s u b s t r a t : Leu-Lcu). : p e n t • du g r a d i e n t de concentration en t a m p o n p h o s p h a t e M (p). B : Premi6re c h r o m a t o g r a p h i e sur D.E.A.E.-cellulose m i c r o g r a n u l a i r c DE-32 de la f r a c t i o n a m i n o p c p t i dasique AP ( p r o v e n a n t de la c h r o m a t o g r a p h i e sur E.C.T.E.O.L.A.-cellulose). Colounc : 42 X 1,2 cm. Volume d ' c x t r a i t AP conccntr6 : 3l ml. D6bit : 21 m l / h . Volume des f r a c t i o n s : 4,5 ml. T a m p o n : p h o s p h a t e de sodium 0,01 M h pH 7,0. • --$---• = activit6 a m i n o p e p t i d a s i q u e sur la L.N.A. (densit6 optiqne h 410 nm).

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 4.

4

.o -

-

phor6tique inf6rieure; l'activit6 dos6e sur la LeuLeu coincidait avec cette bande d'intense coloration. L'activit6 aminopeptidasiquc apr~s rechromatog r a p h i e s u r D . E . A . E . - c e l l u l o s e (Fig. 3B) r e p r 6 s e n t a i t e n c o r e 51,3 p. c e n t d e l ' a c t i v i t 6 m e s u r 6 e s u r l ' e x t r a i t b r u t $ 3 et n e c o n t e n a i t p l u s q u e 7 m g d e p r o t 6 i n e s o i t 1,49 p. m i l l e d e s p r o t 6 i n e s d e cet e x t r a i t $3 (tab. II). L e t a u x d e p u r i f i c a t i o n o b t e n u 6 t a i t 6gal ~ 343.

395

P e p t i d a s e s i n t r a c e l l u t a i r e s de S. t h e r m o p h i l u , s . 4. --- PROPRIETES DES PEPTIDASES.

Cette enzyme 6tait homog6ne h l'61ectrophorbse en gel de p o l y a c r y l a m i d e p u i s q u ' u n e seule b a n d e de prot6ine 6tait d6tect6e aprbs coloration au bleu de Coomassie. L'activit6 vis-h-vis de la L.N.A. dos6e aprbs d6coupage du gel c o r r e s p o n d a i t h cette b a n d e u n i q u e de prot6ines. 3.

---

Es~rIMATION

DU

POIDS

MOLI~.CULARE

DES

--- Activit~ en [onction du pH. La dipeptidase de S. thermophilus 160 pr6sente u n e activit6 m a x i m u m h pH 7,50 /l 45°C dans le t a m p o n TRIS-mal6ate de sodium 0,1 M vis-h-vis de la Leu-Leu. A pH 5,50 elle n'est plus que 24 p. cent de l'activit6 m a x i m u m (fig. 4A).

PEPTI-

DASES.

L ' a m i n o p e p t i d a s e a son activit6 m a x i m u m pH 6,40 h 35°C vis-fi-vis de la Leu-Leu ou de la L.N.A. A pH 8,60 l'activit6 ne repr6sente plus que 7,5 p. cent de celle obtenue h pH 6,40 ; i~ pH 5,15

Le r a p p o r t du volume d'61ution V~ au volume mort Vo de la c o l o n n e de Sephadex G-100 6tait de 1,5.4 p o u r la dipeptidase et de 1,44 pour l ' a m i n o -

TABLEAU II. Bilan de la purification de la dipeptidase DP (substrat Leu-Leu) et de l'aminopeptidase AP (snbstrat L.N.A.) intracelhdaires de S. t h e r m o p h i l u s 160. Activit6 peptidasiqne Unit6s/ml DP

AP

1re ~tape de purification Extrait $3 (apr~s b r o y a g e de I I , 325 g de eellules et ~liminationI I des aeides nucl6iques) . . . . . . . . 900] 60 18,22 i 2e et 3c ~lape I Extrait E2 (apr~s pr6cipitationsI au sulfate d'ammonium, Sepharose 6 B e t concentration) . . . . 45 1000 i309,11 i 4e ~tape I Extrait peptidasique P (apr~s DEAE-eellulose DE 23). . . . . . . 660 55,4 20,92= 5e ~tape (isolement sur ECTEOLA-eellulose) ___! Extrait dipeptidasique DP . . . . . . laa] i Extrait aminopeptidasique AP... llOl 23 120 6e el 7~ ~tape (apr~s double chromatographic sur [ D E A E - cellulose microgranuI

Unit6s totales

~

Activit6

DP ; AP [ ~"

laire)

AP

DP

AP

I i

i

i

3,5 100

11,5:

54000 1639814680

1OO !

450001 13910 1008

44,5

I

36600 13800 281,6 130

I

35761 !132O0

49,6 22

I

13,8 i 83,21 84,8]

3,9i

67,8

11,3,

3,9

{

I

49

84,3

6,25

6,6

72

171

80,5

600

14

[

26 540

1664

64

15,551

peptidase. Ces valeurs p e r m e t t e n t d'estimer le logarithme d6cimal du poids mal6culaire a p p a r e n t de la dipeptidase h 4;699 et de l ' a m i n o p e p t i d a s e 4,79 eu t e n a n t compte des r a p p o r t Vo/V e o b t c n u s p o u r les quatre prot6incs-6talons utilis6es. Ainsi le poids mol6culaire a p p a r e n t de la dipeptidase de S. thermophilus 160 est d ' e n v i r o n 50 O00 daltons et celui de l ' a m i n o p e p t i d a s e de 62 0,00 daltons. BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 4.

AP I DP

DP

Purification

I

i

Dipeptidase purififie . . . . . . . . . . . . Aminopcptidase homog~ne . . . . . .

Rendement p. cent

sp6eifique Unit6s/mg

=

8400 0,~45 i2000

1200

173,9

3 51,3

343

elle est encore 6gale h la moiti6 de cette activit6 m a x i m u m (Fig. 4B). - - Stabilit~ ~ di[f~reuts pH. La dipeptidase est p a r t i c u l i + r e m e n t stable entre pH 6,0 et pH 8,50 p u i s q u e dans cet intervalle l'activit6 restante est au m o i n s 6gale h 90 p. cent de l'activit6 initia/e.

Daniel Rabier el Michel J. Desmazeaud.

396

A p r ~ s i n c u b a t i o n ~ p H 4,0 o u p H 10,0 il s u b s i s t e e n c o r e 31 p. c e n t de l ' a c t i v i t 6 i n i t i a l e (fig. 5 A). L ' m n i n o p e p t i d a s e est c o m p l b t e m e n t stable d a n s une l a r g e z o n e de p H c o m p r i s e n t r e 5,80 et 9,80. L ' e n z y m e 6tait t o t a l e m e n t i n a c t i v 6 a p r b s i n c u b a t i o n h p H 4,2,5 (fig. 5 B).

g c£100

la d i p e p t i d a s e est u n e e n z y m e r e l a t i v e m e n t t h e r m o s t a b l e . A 2 0 ° C l ' a c t i v i t 6 o b t e n u e ne r e p r 6 s e n t a i t p l u s q u e 23 p. c e n t de l ' a c t i v i t 6 m a x i m u m (Fig. 6A1). La figure 6 A2 ( o b t e n u e ~ p a r t i r des d o n n 6 e s de la f i g u r e 6 A1) cst u n e r e p r 6 s e n t a t i o n d e la lot d ' A r r h e n i u s [16]. La p e n t e d e eette d r o i t e p e r m e t de c a l c u l e r l ' 6 n e r g i e a p p a r e n t e d ' a c t i v a t i o n E~ q u i est 6gale p o u r la d i p e p t i d a s e h 4,500 c a l o r i e s / mole.

E 2,2

z,I

5O °~

,b 2b 3b obt emperature 5'o ~ ?o (°el

0

2,O

~AAA ~110 4 T

> 1,4

4

!

I

I

I

I

5

6

7

8

9

~ L3

I

ioo

I0 pH

O O --- 100.

,; 2b ~b 2o sb

®

¢,.

50.

--

4

I

I

I

I

I

5

6

7

8

9

1~) pH

FIG. 5. A = Stabilit6 de la dipeptidase & diff6rents pH. L'aetivit6 restante 6tait mesur6e aprbs incubation de la dipeptidase pendant 15 mn /l 45°C dans des tampons 0,1 M : ae6tate de sodium (pH 4,0 h 5,4), TRISmal6ate (pH 5,4 h 8,5), carbonate-hiearbonate de sodium (pH 8,5 h 10,0). L'aetivit~ restante 6tait mesur6e pendant 5 m n 45°C sur la Leu-Leu. B ---- Stabilit6 de l'aminopeptidase ~ diff6rents pH. L'activit6 restante 6tait mesur6e apr6s incubation de l'aminopeptidase pendant 20 mn h 35°C dans des t a m pons 0,075 M : ae6tate de sodium (pH 4,0 h 5,60), TRIS-mal6ate de sodium (pH 5,60 h 8,60), borate de sodiurr~-KC1 (pH 8,60 ~t 10,0). L'aetivit6 restante 6tait mesur6e pendant 20 m n ~t 35°C sur la L.N.A. -

--

temf;~raturQ ( ' C }

-

A c t i v i t ~ e n [ o n c t i o n d e la t e m p 6 r a t u r e .

S u r le s u b s t r a t Leu=Leu l ' h y d r o l y s e m a x i m u m 6tait o b t e n u e /l 5,0L°C p o u r la d i p e p t i d a s e . L ' a c t i vit6 m e s u r 6 e ~ 70°C r e p r 6 s e n t a i t e n c o r e 75 p. c e n t de l ' a c t i v i t 6 m a x i m u m ee q u i s e m b l e i n d i q u e r q u e BIOCHIMIE, 1973, 55, n o 4.

32

A

A T

0

FIG. 6. - - A~ : Aetivit6 de Ia dipeptidase en fonction de la temI~rature. Substrat = Leu-Leu. Dur6e d'ineubation : 5 ran. pH du milieu r6aetionnel : 7,50 en tampon phosphate de sodium 0,1 M. A~ = Repr6sentation graphique de la lot d'Arrhenius (h partir des donn~es de la figure 6 A~). log V, = logarithme d6eimal de la vitesse initiale. B1 = Aetivit6 de l'aminopeptidase en fonetion de la temp6ratnre. Substrat = L.N.A. Dur6e d'incubation : 20 ran. pH du m i l i e u r6actionnel : 6,60 en tampon TRIS-mal6ate de sodium 0,1 M. B~ = Repr6sentation graphique de la lot d'Arrhenius (h partir des donn6es de la figure 6 B~).

L a v i t e s s e d ' h y d r o l y s e de la L.N.A. p a r l ' a m i n o p e p t i d a s e 6tait m a x i m u m h 35°C. L ' a c t i v i t 6 m e s u r6e h 5 0 ° C r e p r 6 s e n t a i t e n c o r e 57 p. c e n t de l ' a c t i vit6 m e s u r 6 e $ 35°C ce q u i s e m b l e i n d i q u e r q u e l ' a m i n o p e p t i d a s e est r e l a t i v e m e n t t h e r m o l a b i l e . A 20oC l ' a c t i v i t 6 o b t e n u e r e p r 6 s e n t a i t e n c o r e 52 p. c e n t de l ' a c t i v i t 6 m a x i m u m (fig. 6 B1). L a p e n t e d e la d r o i t e , d a n s la r e p r 6 s e n t a t i o n g r a p h i q u e de la lot d ' A r r h e n i u s (fig. 6 B2) p e r m e t d ' e s t i m e r ~ 7 300 c a l o r i e s / m o l e l ' 6 n e r g i e a p p a r e n t e d ' a c t i v a t i o n de l ' a m i n o p e p t i d a s e . --

Stabilit6 ~ di[Hrentes

temperatures.

L a d i p e p t i d a s e est stable aux t e m p 6 r a t u r e s inf6r i e u r e s ou 6gales h 50°C.

P e p t i d a s e s intracellulaires de S. t h e r m o p h i l u s . Aprbs i n c u b a t i o n & 6O°C p e n d a n t 15 min, 50 p. cent d'activit6 6talent d6truits et 80 p. cent apr6s une i n c u b a t i o n de 10 rain h 6,5°C. La lin6arit6 des cin6tiques d ' i n a c t i v a t i o n obtenues h cha-

® 6` I00

2 ~o.

600C 1,5

i_

8

"e 6 5 ° C

"7. 20. °_

,4

0 0

I

I

5 duroc

'0

I

I

I0

15

~

50.

--

d'incubation ( m i n u t e s )

®

o o ~oo &

2

tC} O~

40°C

"2

50°C

4"-¢.J

55°C

1,5

o o 6,

60°C

I0

--

!

!

I

O

I0 20 30 dur~e d'incubotion (minutes)

Fro. 7. - - A ---- Stabilit6 de la dipeptidase h diff~rentes temperatures. Inactivation h pH 7,5 en tampon phosphate de sodium 0,1 M. Substrat ---- Leu-Leu. Incubation pendant 5 mn a 45°C, h pH 7,5 dans le m~me tampon. B ---- Stabilit6 de l'amlnopeptidase h diff~rentes temperatures. Inactivation ~t pH 6,50 en tampon TRIS-mal6ate de sodium 0,1 M. Dosage de l'activit6 restante = substrat L.N.A. Incubation 20 mn h 35°C, h pH 6,50 dans le tampon ci-dessus.

que t e m p 6 r a t u r e dans la r e p r 6 s e n t a t i o n logar i t h n f i q u e i n d i q u e que la f r a c t i o n d i p e p t i d a s i q u e 6tudi6e ne c o n t i e n t bien q u ' u n seul type d'activit6 (fig. 7A) [17]. P a r contre, l ' a m i n o p e p t i d a s e est p e u t h e r m o stable puisqu'& p H 6,5 une nette i n a c t i v a t i o n 6tait

BIOCHIMIE, 1973, 5 5 ,

observ6e d6s 40°C. A 60°C la d e s t r u c t i o n t h e r m i que de l ' a m i n o p e p t i d a s e 6tait p a r t i c u l i b r e m e n t r a p i d e (fig. 7 B).

- - I n f l u e n c e de certains inhibiteurs. R~activation par les cations. La d i p e p t i d a s e de S. thermophilus 160 a les caract~res d ' u n e m 6 t a l l o e n z y m e p u i s q u ' u n e inhibition p r e s q u e totale 6tait obtenue apr~s incubation par l'O-ph6nanthroline ou I'E.D.T.A. (tab. IIIA).

o _(2

I0

397

n °

4.

L ' a d d i t i o n des ions Co ++, Zn ++, Mn ++, Mg*+ et Ca ++ e n t r a i n a i t u n e r 6 a c t i v a t i o n p a r t i e l l e de la dipeptidase inhib6e p a r I'E.D.T.A., l ' i o n Co *+ 6rant le plus efficace, l ' i o n Ca ++ le m o i n s efficace (tab. IV A). P a r contre, une i n h i b i t i o n p a r t i e l l e 6tait obtenue avec le p - c h l o r o m e r c u r i b e n z o a t e et l'iodoac6tare de s o d i u m d ' u n e p a r t et avec le d i i s o p r o p y l f l u o r o p h o s p h a t e d ' a u t r e p a r t ; ces r6sultats h i s sent s u p p o s e r que des r6sidus d ' a c i d e amin6 soufr6 et des r6sidus s6ryles a u r a i e n t un rSle dans l'activit6 de la d i p e p t i d a s e (tab. I I I A ) . L ' a m i n o p e p t i d a s e a aussi les c a r a c t 6 r i s t i q u e s d ' u n e m 6 t a l l o e n z y m e p u i s q u ' u n e i n h i b i t i o n tota]e 6tait obtenue apr6s i n c u b a t i o n en p r 6 s e n c e d'E.D.T.A. 10 -5 M ou d ' O - p h 6 n a n t h r o l i n e 10 -3 M (tab. I I I B). L ' a d d i t i o n de cations divalents p e r m e t de ret r o u v e r l'activit6 soit t o t a l e m e n t avec les ions Co ++ et Mn +÷, soit p a r t i e l l e m e n t avec les ions Ca ++, Z n " et Mg +÷ (Tab. IV B). U n e a n o m a l i e a 6t6 constat6e avec l ' i o n Zn ++ dont l'effet de r 6 a c t i v a t i o n d i m i n u e q u a n d sa c o n c e n t r a t i o n augmente. On a v6rifi6 que ce p h 6 n o m 6 n e 6tait dfi h u n effet i n h i b i t e u r de l ' i o n Zn ++ en lui-mSme, en i n c u b a n t l ' a m i n o p e p t i d a s e en p r 6 s e n c e d ' i o n s Zn ÷÷ seulement, h des c o n c e n t r a t i o n s v a r i a n t de 5.10 -5 M h 5.10 -a M. L ' i o n Zn ++ e x e r c a i t en effet un p o u v o i r i n h i b i t e u r sur l ' e n z y m e (tab. V). D ' a u t r e part, l'iodoac6tate de s o d i u m n ' e x e r c a i t pas d'effet i n h i b i t e u r h une c o n c e n t r a t i o n de 10 -3 M. Comme le p-C.M.B, n'influen~ait lui aussi que tr6s p e u l'activit6 a m i n o p e p t i d a s i q u e , les g r o u p e m e n t s SH ne d o i v e n t pas p a r t i c i p e r h la s t r u c t u r e du site actif de l ' e n z y m e (tab. III B). P a r contre, le D.F.P. semblait p r 6 s e n t e r un p o u v o i r i n h i b i t e u r , m~me h la c o n c e n t r a t i o n de 10 -5 M. Ce compos6 6rant pr6par6 en i s o p r o p a n o l , l'effet inhib i t e u r de ce solvant a 6t6 test& E n effet, (tab. VI), l ' i s o p r o p a n o l e x e r c e bien un effet i n h i b i t e u r vish-vis de F a m i n o p e p t i d a s e ainsi que les alcools h c h a i n e droite. It est i m p o r t a n t de r e m a r q u e r que cet effet i n h i b i t e u r est f o n c t i o n du n o m b r e de c a r b o n e s de l'alcool consid6r6 et de sa c o n c e n 26

Daniel Rabier et Michel J. D e s m a z e a u d .

398

TABLEAU I I I . Pattie A

Effet des inhibiteurs sur l'activit6 dipeptidasique

t

Concentration molaire [ de l'inhibiteor I 5.10-3M . . . . . . . . . . . . , 2,5.10-~M.. i ........ ' i 5.10-~M . . . . . . . . . ... 5.10-"M............ 5.10-6M . . . . . . . . . . . . Partie B

]

E.D.T.A.

i O-phdnanthroline

D.F.P

p-CMB

lodoacdtate de sodium

68 79

82 100

82 4 4 79

!8 34 95

88

Effet des inhibiteurs sur l'activit6 aminopeptidasique

10-~M . . . . . . . . . . . . . . . . 10 -:~M . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10-4M. 10-'~'M. . . . . . . . . . . . . . . .

i 1

0 0 0 0

O 0 2,5 80

2,5 45 77,5 77,5

80 100 100 100

92,5 97,5 97,5

A : L a d i p e p t i d a s e d t a i t i n c u b 6 e e n p r d s e n c e de l ' i n h i b i t e u r & p H 7,5 d a n s d u t a m p o n p h o s p h a t e de s o d i u m 0,1 M h 45°C p e n d a n t l0 ran. L ' a c t i v i t d r e s t a n t e 6 t a i t dos6e s u r la I , e u - L e u e n t a m p o n p h o s p h a t e de s o d i u m 0,1 M h p H 7,50. Les r d s u l t a t s s o n t e x p r i m d s e n p. c e n t de l ' a c t i v i t 6 i n i t i a l e . B : Les r d s u l t a t s s o n t e x p r i m d s e n p. c e n t de l ' a c t i v i t d i n i t i a l e a p r 6 s u n e i n c u b a t i o n p e n d a n t 20 m u ~t 35°C e n p r d s e n c e d e s d i f f 6 r e n t s i n h i b i t e u r s p r 6 p a r d s d a u s le t a m p o n T R I S - m a l d a t e de s o d i u m 0,2 M h p H 6,50. L ' a c t i v i t d r e s t a n t e d t a i t m e s u r d e s u r la L.N.A. e n i n c u b a n t le m d l a n g e r d a c t i o n n e l p e n d a n t 20 m n h 35°C d a n s le t a m p o n c i - d e s s u s h p H 6,50.

incubation d a n s le n - b u t a n o I h 1 p . c e n t ( v / v ) . D'autre part, apr~s une incubation dans l'isoprop a n o l h 0,1 p . c e n t , 12,5 p. c e n t d e l ' a c t i v i t 6 6 i n t e n t

tration. Ainsi, d'une part, apr6s une incubation d a n s le m 6 t h a n o l h 1 p . c e n t ( v / v ) , 8,5 p . c e n t d e l ' a c t i v i t 6 d t a i e n t d d t r u i t s e t 63 p. c e n t a p r ~ s u n e

TAnLEAU IV. Partie A

[

R~activation de l'activitd dipeptidasique apr~s inhibition par I'E.D.T.A.

Concentration molaire des cations 5.10-~M . . . . . . . . . . . . . . Partie B

]

10-'~M . . . . . . . . . . . . . . 5.10-~M . . . . . . . . . . . . . . 10-4M . . . . . . . . . . . . . . 5.10-4M . . . . . . . . . . . . . . 10-3M . . . . . . . . . . . . . . 5. I0-'~ M . . . . . . . . . . . . . .

~

Co++

Mn++

Mg++

Zn++

~

Ca+~

89

52

50

87

i

35

R6activation de l'aminopeptidase, apr~s inhibition par I'E.D.T.A. I00 100 [ l i [

12

71

12

58

42

23

85

I00 100 I00 100

25

A : A p r 6 s i n c u b a t i o n e n p r d s e n c e d'E.D.T.A. 5.10-4 M e o m m e d d c r i t c i - d e s s u s a u t a b l e a u III, ]e c h l o r u r e m 6 t a l l i q u e 5.10-8 M d t a i t a j o u t d et a p r ~ s 10 m n ~ 45°C l ' a e t i v i t 6 d t a i t dosde s u r la L e u - L e u e n t a m p o n T R I S - m a l d a t e 0,1 M h p H 7,50. L e s r d s u l t a t s s o n t e x p r i m d s e n p. c e n t de l ' a c t i v i t d i n i t i a l e a v a n t i n c u b a t i o n e n prds e n c e d'E.D.T.A. B : L ' a c t i v i t d a m i n o p e p t i d a s i q u e d t a i t i n h i l ~ e p a r I'E.D.T.A. 5.10-5 M c o m m e d6crit c i - d e s s u s a u t a b l e a u III. L a r 6 a c t i v a t i o n d t a i t o b t e n u e p a r le c h l o r u r e m d t a l l i q u e p e n d a n t q0 m , h 35°C p u t s l ' a c t i v i t d d t a i t dosde s u r la L.N.A. e n t a m p o n T R I S - m a l d a t e de s o d i u m 0,2 M h p H 6,40 e n i n c u b a n t 20 m n h 35°C. L e s r 6 s u l t a t s s o n t e x p r i m d s e n p. c e n t de l ' a e t i v i t d i n i t i a l e a v a n t l ' i n a c t i v a t i o n .

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 4.

399

P e p l i d a s e s i n l r a c e l l u l a i r e s de S . t h e r m o p h i l u ~ s .

le Z-Gly-Leu ni sur le Z-Gly-Phe. Donc l ' e n z y m e 6tudi6e doit 6tre consid6rde c o m m e une d i p e p t i dase stricte.

d6truits et 85 p. cent apr6s une i n c u b a t i o n dans ce m6me solvant /i nne c o n c e n t r a t i o n de 5 p. cent (tab. VI).

TABLEAU V. Action inhibitrice de l'ion Zn +÷vis-d-vis de l'aminopeptidase. Concentration molaire de l'ioa Zn ~+

0

!

5.1~5M

5.t0-4M

]

90,3

77,4

I

5.t0-ZM

i p. cent d'activitd . . . . . . . . . . . . . . . . . .

100

36,5

L'aetion inhibitrice de l'ion Zn ++ dtait mise en 6videnee en incubant l'enzvme et la L.N.A. en prdsenee de celui-ci pendant 20 mn /t 35°C dans le tampon TRIS-~raldate de ~odium 0,2 M /~ pH 6,40.

- - Sp~ci[icit~ de substral. Pour la d i p e p t i d a s e on n ' o b s e r v a i t a u c u n e h y d r o l y s e ni de la cas6ine enti6re, ni du glueagon, ni du p e n t a p c p t i d e Hisr...Thr~, ni d ' a u c u n t r i p e p t i d e . De m6me, parrot les d i p e p t i d e s dont l'extr6mit6 NH2-terminale 6tait bloqu6e p a r le g r o u p e m e n t b e n z y l o x y c a r b o n y l e aucun n'6tait hydrolys6. Enfin, aucune h y d r o l y s e n'6tait non plus observ6e sur les substrats ne c o m p o r t a n t pas

Sur les 19 p e p t i d e s essay6s un seul, Gly-Pro, n'6tait pas h y d r o l y s 6 (tab. VII). La d i p e p l i d a s e de S. thermophilus 160 pr6sente une sp6cificit6 d ' a c t i o n envers les d i p e p t i d e s poss6dant un rdsidu d ' a c i d e amin6 apolaire et volulnineux en p o s i t i o n N.He-terminale p u i s q u e les dip e p t i d e s Met~Leu, Leu-Gly, Leu-Ala, Tyr-Leu, PheGly 6talent tr6s r a p i d e m e n t h y d r o l y s 6 s alors que les d i p e p t i d e s poss6dant soft un r6sidu Gly (sauf

TABLEAU YI.

Inhibition de l'aminopeptidase par di[[~rents alcools. Concentration en alcool p. cent v/v

Mdthanol

Ethanol

10 5

74

9,6

1

91,5 100

71,5 90,5

O,1

n-Propanol

5,3 49 81

Isopropanol

14,9 59,5 87,5

n-Butanol

0

37 74

Les rdSultats sont exprim6s en p. cent de l'activitd initiale apr6s une incubation pendant 20 mn h 35°C en prdsence des diffdrents alcools diluds dans le tampon TRISmal6ate de sodium 0,2 M h pH 6,50. L'activitd restante dtait mesurde sur la L.N.A. en incubant le mdlange rdactionnel pendant 20 mn h 35°C dans le tampon ci-dessus h pH 6,50.

de liaison p e p t i d i q u e v r a i e c'est-/i-dire sur les substruts de type acide amin6 arnide ou leucine-p-nit r o a n i l i d e . L ' e x i g e n c e de la p e p t i d a s e d ' u n substrat ne c o m p o r t a n t que deux r6sidus d ' a c i d e s amin6s aux extr6mit6s NH 2- ou COOH-terminale libres 6tait confirrn6e p a r le fair que les d i p e p t i d e s Tyr-Leu, Lys-Tyr, Gty-Tyr, His-Ser et Gly-Trp 6taient h y d r o l y s 6 s (tab. VIII) alors que les t r i p e p tides ou le p c p t i d e His-Ser-Gln-Gly-Thr ou le glucagon les r e n f e r m a n t ne l'6taient pas. De m6me, les p e p t i d e s Gly-Leu et Gly-Phe 6taient h y d r o l y s 6 s alors q u ' a u c u n e h y d r o l y s e n'6tait observ6e ni sur

BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 4.

le d i p e p t i d e Gly-Phe) ou Ala d ' u n e part, ou un r6sidu p o l a i r e His ou Lys d ' a u t r e part, en position NH2-terminale, n'6taient que l e n t e m e n t h y d r o l y s6s. Le r6sidu COOH-terminal a une influence sur la vitesse d ' h y d r o l y s e p u i s q u e dans la s6rie des substrats de type Leu-X tr6s f o r t e m e n t hydrolys6s, cette vitesse d ' h y d r o l y s e augmente avec la diminution du p o i d s m o l d c u l a i r e du rdsidu X (st X = Gly, Ala ou Leu on obtenait Gly > Ala > Leu). De m6rne les substrats de la s6rie Gly-Y 6taient hydrolysds fi des vitesses trbs diffdrentes selon la nature du r6sidu Y (st Y = Phe, Ala, Tvr~ Gly,

Daniel Rabier et Michel J. D e s m a z e a u d .

400:

Trp ou Pro, on o b t e n a i t Phe > Ala > Gly > Trp > Pro) (tab. VII).

Tyr >

L ' a n l i n o p e p t i d a s e n ' h y d r o l y s e pas la cas6ine entibre, ni le glucagon, ni les deux oligopeptides c o n t e n a n t douze, ou plus, r6sidus d'acide amin6 issus du glucagon (Hisl---Lys12 et Tyrlz---Thr29) ;

Arg17 et Leu26...Thr29 les deux p r e m i e r s r6sidus NH2-terminaux 6taient aussi lib6r6s avec u n bon r e n d e m e n t . Enfin sur les peptides Sers...Lys~2, AsP15...Gln24, Aspls...Gln20, Argls...Gln24, Asp21... Gin24 , Trp25...Thr29 on obtenait u n e h y d r o l y s e rapide du r6sidu NH2-terininal mais u n e h y d r o l y s e plus faible du deuxi6ine r6sidu N H e - t e r m i n a l ;

TABLEAU VII.

Etude comparative de l'activitd de la dipeptidase et de l'aminopeptidase de S. t h e r m o p h i l u s 160 envers di[[~rents dipeptides. Substrat dipeptidique hydrolys6 Met-Leu . . . . . . . . . . . . .

Leu-Gly . . . . . . . . . . . . . Leu-Ala . . . . . . . . . . . . . Tyr-Leu . . . . . . . . . . . . . Phe-Gly . . . . . . . . . . . . . Gly-Phe . . . . . . . . . . . . . Leu-Leu . . . . . . . . . . . . . Ala-Ala . . . . . . . . . . . . . . Ala-Gly . . . . . . . . . . . . . . Gly-Ala. . . . . . . . . . . . . . Gly-Tyr. . . . . . . . . . . . . . His-Ser . . . . . . . . . . . . . . . Gly-Gly . . . . . . . . . . . . . . His-His . . . . . . . . . . . . . . His-Leu . . . . . . . . . . . . . . Lys-Tyr . . . . . . . . . . . . . . Gly-Trp... . . . . . . . . . . . Pro-Gly . . . . . . . . . . . . . . Gly-Pro . . . . . . . . . . . . . .

Dipeptidase de S. thermophilus 160. Aminopeptidase de S. thermophilus t60. En p. cent de I'aetivitt~ En p. cent de l'activit6 sp6eifique sp6cifiqne obtenue sur |a Lys-Tyr obtenue sur ia Met-Len 10o 82,8 58

56,1 47,3 32,5 31,9 13 11,2 7,1 6,5 1,6 1,5 1,3 1,3 1,2 tr~s faiblement hydrolys~! tr~s faiblement hydrolys6 0

les dipeptides disubstitu6s et les dipeptides monosubstitu6s au n i v e a u de leur g r o u p e m e n t NH2-term i n a l ne sont pas n o n plus substrats. La leucinep a r a - n i t r o a n i l i d e et les amides d ' a c i d e amin6, substrats caract6ristiques des aminopeptidases, sont hydrolys6es tr6s fortement p a r la peptidase, l'exception c e p e n d a n t de la t y r o s i n e amidc qui n'est que p a r t i e l l e m e n t hydrolys6e et de la ph6n y l a l a n i n e amide qui ne l'est pas (Tab. VIII). La c o n f i r m a t i o n de la sp6cificit6 stricte de type a-amino-aeyle p e p t i d e h y d r o l a s e [I5C.3.4.1] pr6sent6e p a r la peptidase est apport6e p a r l'6tude de la l i b 6 r a t i o n des acides ainin6s, obtenue apr6s h y d r o l y s e des oligopeptides issus du glucagon (Tab. VIII). E n effet, les r6sidus d'acide alnin6 en p o s i t i o n NH2-terininale sont syst6innatiqueinent lib6r6s. Ainsi, h p a r t i r des peptides H i s r . . P h %, Hisr..Thr~, Sers...Leu14, Leul~...Asp21 la peptidase lib6rait seuleinent, respectiveinent, l ' h i s t i d i n e , la s6rine et la leucine, acides amin6s NH2-terminaux de ees peptides; de plus, sur les peptides Tyrj;~...

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18 3 12 10 0 0 37 6 0 0 0 0 0 0 5 100 tr6s faiblement hydrolys6 0 0

p o u r certains peptides le troisi~me r6sidu NHet e r m i n a l 6tait aussi v r a i s e i n b l a b l e m e n t lib6r6, mais l ' i n t e r p r 6 t a t i o n des spots p o u r ces acides amin6s aprbs c h r o m a t o g r a p h i e ou 61ectrophorbse 6tait peu nette en p a r t i c u l i e r pour la m 6 t h i o n i n e lib6r6e du peptide Thr25...Thr2a. Une seule difficult6 d ' i n t e r p r 6 t a t i o n subsiste p o u r le r6sidu glut a m i n y l e du peptide Alala...Gln24, c e p e n d a n t la glutamine lib6r6e dolt c o r r e s p o n d r e h u n e action de type a i n i n o p e p t i d a s i q u e (lib6rant Gln2o) et n o n du type c a r b o x y p e p t i d a s i q u e (qui lib6rerait Gln24) p u i s q u e cette d e r n i b r e n ' a jamais 6t6 observ6e, m~ine en p a r t i c u l i e r , sur les peptides de structure COOH-terininale analogue (Argls...Gln24 ou Asp21... Glne4). P a r i n i les dipeptides, la L y s - T y r et la Leu-Leu (tab. VII) sont les meilleurs substrats p o u r l'aminopeptidase de S. thermophilus 160; de noinb r e u x dipeptides n'6taient pas hydrolys6s en part i c u l i e r la p l u p a r t de ceux poss6dant u n r6sidu

401

P e p t i d a s e s i n t r a c e l l u l a i r e s de S. t h e r m o p h i l u s . glycyle ou h i s t i d y l e en position NH~-terminale, ou c o n t e n a n t un r6sidu p r o l y l e ou ph6nylalanyle. Cependant, il semble d o n c que cette a m i n o p e p t i dase possbde une sp6cificit6 assez large puts-

tr6 que les extraits cellulaires de cette bact6rie a p p a r a i s s e n t plus p a r t i c u l i ~ r e m e n t aptes h d6grader les p r o d u i t s i n t e r m 6 d i a i r e s de l ' h y d r o l y s e de la cas6ine plut6t que la cas6ine elle-m6me. D ' a u t r e

TABLEAU VIII.

Action de l'aminopeptidase sur des d~rivJs d'acides aminds, des tripeptides et des oligopeptides du glucagon. Acides amin6s lib6res Substrats

Coloration intense --)~

Leueine-p-nit roanilide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Leucine amide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Isoleucine amide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Alanine amide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Valine amide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tyrosine amide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Leu

Lys-Tyr-Leu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . GIy-Tyr-Gly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gly-Trp-Gly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gly-His-Gly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Lys Gly Gly

Coloration moyenne --9

!a!b

Leu Ileu Ala Val Tyr Tyr, Leu Tyr Trp

Gly

Hisl--Ser-Gln-Gly-Thr-Ph% --9 His~-Ser-Gln-Gly-Thr~ --9 Sers-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr- Leu l

His His

Ser

Sers-Asp-Tyr-Ser-Lys I_~

Ser

Tyr la-Leu-Asp-Ser -Arg~ 7 - - 9 --9 Leut4-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Glu-Asp2t _~Aspt~-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln~4 . . . . . . .

Tyr, Leu

Asp

Set

Arg ?

Asp I.~-Ser-Arg-Arg-Ala-Glnuo --9 --9 ~" ArgIs-Ala-Gln-Asp- Phe-¥ a|-Glnw, -~- - - 9 Alato-Gln-Asp-Phe-Val-Gln~ -9 --9 Asp~i-Phe-Val-GIn~4 --9 - - 9 Trp.2~-Leu-Met-Asn-Thr2~ --9 - - 9 -~Leu~a-Met-Asn-Thr-2.q -~- - - 9

Asp

Ser

Arg ?

Arg

Ala

Ala

Gln

Asp

Phe

Trp

Leu

qu'elle est capable de lib6rer aussi bien des r6sidus apolaires que des r6sidus p o l a i r e s (tab1. VII et VIII). DISCUSSION. Aucune 6tude syst6matique des p e p t i d e s h y d r o lases [EC.3.4] de S. thermophilus n ' a v a i t 6t6 e n c o r e e n t r e p r i s e bien que la p r 6 s e n c e d ' e n z y m e s de ce type air 6t6 d6j/i signal6e p a r p l u s i e u r s auteurs. En effet P o z n a n s k i et al. [3] o a t d6mon-

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Asp

Leu

Met ?

Leu, Met

p a r t Bottazi [4] a d6montr6 que des s u s p e n s i o n s cellulaires de S. thermophilus 6taient capables d ' h y d r o l y s e r de n o m b r e u x p e p t i d e s de synth6se en lib6rant p r 6 f 6 r e n t i e l l e m e u t la leucine, la glyc i n e ou l ' a l a n i n e . Enfin, C a r i n i et R e s m i n i [5], ont mis en 6 v i d e n c e une h y d r o l y s e de la cas6ine, avec l i b 6 r a t i o n de n o m b r e u x compos6s de bas p o i d s mol6culaire, p a r des broyats cellulaires de S. thermophilus. Nos r6sultats c o n f i r m e n t ces p r e m i e r e s 6tudes et mettent en 6 v i d e u c e la r i c h e s s e en peptidases i n t r a c e l l u l a i r e s de S. thermophilus.

Daniel Rabier et Michel J. D e s m a z e a u d .

402

La d i p e p t i d a s e de S. thermophilus 160 a y a n t un p H o p t i m u m de 7,50 se r a p p r o c h e de la d i p e p t i dase de N. catarrhalis I1:81 au p H o p t i m u m de 7,60, de la d i p e p t i d a s e d'E. colt [19] de p H optim u m plus 6tendu (pH 7,4 h p H 8,0), ainsi que de la d i p e p t i d a s e de S. cerevisiae var. ellipsoideus [20] de p H o p t i m u m 7,5 h 8,0. Comme p o u r la d i p e p t i d a s e de M. phlei [21! celle de S. thermophilns 160 est b e a u c o u p plus active 'h 50°C qu'h 37')C p e n d a n t un t e m p s court. La d i p e p t i d a s e de S. thermophilus 160, c o m m e les d i p e p t i d a s e s p r 6 c 6 d e m m e n t 6tudi6es, se c o m p o r t e c o m m e une m 6 t a l l o e n z y m e p u i s q u e PE.D.T.A. et l ' O - p h 6 n a n t h r o l i n e sont de p u i s s a n t s i n h i b i t e u r s et que cette i n h i b i t i o n peut 6tre plus ou m o i n s s u p p r i m 6 e p a r diff6rents cations. Son i n h i b i t i o n p a r t i e l l e p a r le p - c h l o r o m e r c u r i b e n zoate la r a p p r o c h e de la d i p e p t i d a s e de S. cerevisiae var. ellipsoideus [2.0] et de celle de N. catarrhalts [18] qui subissent une forte i n h i b i t i o n p a r le p - c h l o r o m e r c u r i b e n z o a t e ou l ' a c i d e p - m e r c u r i benzoique. D ' a u t r e p a r t la d i p e p i i d a s e de S. thermopbiius se r a p p r o c h e de la d i p e p t i d a s e de M. phlei E21] ou de la d i p e p t i d a s e r6nale [22] p u i s q u ' e l l e s h y d r o l y s e n t r a p i d e m e n t les substrats Leu-Gly, Lcu-Ala ou Gly-Phe ; c o m m e la d i p e p t i d a s e de M. phlei [21] celle de S. thermophilus n ' h y d r o l y s e que trbs faiblement, ou pas, r e s p e c t i v e m e n t !a GiyGly ou la Gly-Pro ce qui i n d i q u e que ces p r 6 p a r a tions ne sont pas contamin6es p a r une ilnidodipeptidase (amino-acyle L-proline hydrolase EC 3.4.3.7). De plus, elles sont c a p a b l e s d ' h y d r o lyser p a r t i e l ! e m e n t le d i p e p t i d e Pro-Gly. Enfin, le p o i d s m o l 6 c u l a i r e de la d i p e p t i d a s e de

S. thermophilus 1~0 6tant d ' e n v i r o n 50 000 daltons, la r a p p r o c h e de la d i p e p t i d a s e de M. phlei ou de la d i p e p t i d a s e r6nale qui a u n p o i d s mol6culaire c o m p a r a b l e , r e s p e c t i v e m e n t 45 000 daltons [21] ou 47 200 daltons [22]. C e p e n d a n t la d i p e p t i d a s e de S. thermophilus 160 pr6sente c e r t a i n e s p r o p r i 6 t 6 s diff6rentes de celles des d i p e p t i d a s e s p r 6 c 6 d e m m e n t 6tudi4es. Ainsi e l l e s'61oigne de celle de M. phlei [21] d o n t l'activit6 est m a x i m u m h p H 9,50. Elle pr6sente aussi une plus g r a n d e stabilit6 vis-h-vis du p H que la d i p e p t i d a s e d'E. colt [19] ou de la d i p e p t i d a s e de S. cerevisiae var. ellipsoideus [20] et sa zone de stabilit6 au p H (de p H 6,0 h 8,50) est diff6r e n t e de celle de la d i p e p t i d a s e de M. phlei [21] situ6e vers les p t I alcalins (de p H 7,0 h p H 10,0). D ' a u t r e p a r t elle s'en diff6rencie aussi p u i s q u e des substrats de t y p e Ala-Gly, Gly-Ala, Gly-Gly ou Gly-Trp h y d r o l y s 6 s r a p i d e m e n t p a r la d i p e p t i BIOCHIMIE, 1 9 7 3 ,

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dase r6nale [22] ou celle de M. phlei [21] ne le sont que f a i b l e m e n t p a r elle-m6me. Cependant,

en conclusion, la d i p e p t i d a s e de

S. thermophilus 160 semble p l u s p r o c h e de celle de M. phlei [21] que des autres d i p e p t i d a s e s mic r o b i e n n e s p r 6 c 6 d e m m e n t 6tudi6es. P l u s i e n r s enzymes du t y p e a m i n o p e p t i d a s i q u e ont 6t6 d6jh purifi6es et caract6ris6es aussi b i e n h p a r t i r de tissus a n i m a u x [29] qu'~ p a r t i r de cellnles de diff6rentes esp6ces b a c t 4 r i e n n e s en p a r t i culler Escherichia colt [24, 25, 26], Pseudomonas [27], Aeromonas proteolytica [28], Bacillus stearolhermophilus [11! ou B. subtilis var. amylosacchariticus [29]. L ' a m i n o p e p t i d a s e de S. thermophiIns 160 est int6ressante p a r sa stabilit6 h des valeurs 61ev6cs de pH. Ce fait p e u t i n d i q u e r , si on le r a p p r o c h e de la difficult6 d ' e x t r a c t i o n de Penzyme, une l o c a l i s a t i o n p a r t i c u l a i r e de celle-ci. Cette p r o p r i 6 t 6 la r a p p r o c h e de l ' a m i n o p e p t i d a s e d'E. colt F25] qui reste t o t a l e m e n t active h p H 10,50. De m6me p a r son p H o p t i m u m de 6,50 vis-a-vis de la l e u c i n e - p - n i t r o - a n i l i d e , elle est comp a r a b l e h l ' a m i n o p e p t i d a s e de B. stearothermophihis [11~ qui poss6de sur cc substrat un p H optim u m de 7,50. Comme de n o m b r e u s e s a m i n o p e p t i d a s e s , que ce soit la l e u c i n e - a m i n o p e p t i d a s e du r e i n de p o r c EC.3.4.1.!. [23i, ou celles d ' o r i g i n e b a c t 6 r i e n n e [27, 30, 31], celle de S. thermophilus 160 est vrais e m b l a b l e m e n t une m 6 t a l l o e n z y m e p u i s q u ' e l l e est sensible ~ I'E.D.T.A. et h diff6rents cations. En p a r t i c u l i e r , c o m m e l ' a m i n o p e p t i d a s e d'E. colt [251 ou la l e u c i n e - a m i n o p e p t i d a s e [23], celle de S. thermophilus 160 p e u t 6tre inhib6e p a r l ' i o n Zn ÷+. Comme la l e u c i n e a m i n o p e p t i d a s e [23] et l ' a m i n o p e p t i d a s e de B. stearothermophilus [11], celle de S. thermophilus 160 est inactiv6e p a r les alcools et cette i n h i b i t i o n est f o n c t i o n de la c o n c e n t r a t i o n et du n o m b r e de c a r b o n e s de l'alcool consid6r6. Do.nc le site actif de cette p e p t i d a s e d e v r a i t se c o m b i n e r f a c i l e m e n t avec les r6sidus a l i p h a t i q u e s v o l u m i n e u x p u i s q u e les alcools qui r 6 p o n d e n t h cette c a r a c t 6 r i s t i q u e sont de p u i s s a n t s i n h i b i t e u r s [23]. C e p e n d a n t cette h y p o t h 6 s e n'est p a s confirrode p a r l'6tude de la sp6cificit6 d ' a c t i o n de l'amin o p e p t i d a s e de S. thermophilus 160 - - c o n t r a i r e m e n t h la l e u c i n e a m i n o p e p t i d a s e [23] et h l ' a m i n o p e p t i d a s e I d'E. colt [253 --- qui ne m o n t r e pas une p r 6 f 6 r e n c e stricte p o u r l ' h y d r o l y s e de substrats p e p t i d i q u e s p o s s 6 d a n t un r6sidu a p o l a i r e et v o l u m i n e u x en p o s i t i o n NH2-terminale. E n effet, p o u r ]es d i p e p t i d e s , la L y s - T y r est f o r t e m e n t h y d r o l y s 6 e ; /~ p a r t i r des o l i g o p e p t i d e s on a obtenu aussi bien la l i b 6 r a t i o n d ' a c i d e s amin6s p o l a i r e s (s6rine, a c i d e a s p a r t i q u e , a r g i n i n e ) que

Peptidases

intracellulaires

celle d ' a e i d e s amin6s apolaires (leueine, alanine, m 6 t h i o n i n e ) . Ces c a r a c t 6 r i s t i q u e s r a p p r o c h e n t l ' a m i n o p e p t i d a s e d e S. t h e r m o p h i l u s 160 d e c e l l e li6e a u x r i b o s o m e s c h e z E. c o l i [30~, l a q u e l l e h y d r o l y s e des d i p e p t i d e s p r 6 s e n t a n t des r6sidus p o l a i r c s ( t h r 6 o n y l e ou l y s y l e ) en p o s i t i o n N H 2t e r m i n a l e , fi d e s t a u x c o m p a r a b l e s i~ c e u x o b t e n u s p o u r des substrats p r 6 s e n t a n t des r6sidus apol a i r e s ( m 6 t h i o n y l e o u l e u c y l e ) e n p o s i t i o n N H 2terminale. U n e c a r a e t 6 r i s t i q u e de l ' a m i n o p e p t i d a s e de S. t h e r m o p h i l u s 16,0 e s t e n ce q u i c o n c e r n e les d i p e p t i d e s - - son activit6 faible vis-a-vis de ceux p o s s 6 d a n t u n r d s i d u g l y c y l e ou h i s t i d y l e , o u n u l l e v i s - h - v i s d e c e u x r e n f e r m a n t u n r 6 s i d u p r o l y l e ou p h 6 n y l a l a n y l e : c e t t e p r o p r i 6 t 6 la d i f f 6 r e n c i e d o n c tr6s n e t t e m e n t de la d i p e p t i d a s e . P a r p l u s i e u r s a u t r e s d e ses p r o p r i 6 t 6 s l ' a m i n o p e p t i d a s e d e S. t h e r m o p h i l u s 160 se d i f f 6 r e n c i e a u s s i d e s a m i n o p e p t i d a s e s p r 6 c 6 d e m m e n t 6tudi6es. A i n s i s o n p H a p t i m u m est v o i s i n d e 6,50 alors que celui des autres a m i n o p e p t i d a s e s est c o m p r i s e n t r e 8,0 et 9,5 [23, 25, 27, 11]. L e p o i d s m o l 6 c u l a i r e d e l ' a m i n o p e p t i d a s e d e S. t h e r m o p h i lus 16.0 est r e l a t i v e m e n t f a i b l e ( e n v i r o n 62 000 d a l t o n s ) et il d o i t 6tre r a p p r o c h 6 d e c e u x d ' A e r o m o h a s p r o t e o t y t i c a (P.M. 2 9 0 0 0 d a l t o n s ) [281 et d e P s e u d o m o n a s (P.M. 51 000 dalto,ns) [ 2 7 ] ; il est tr6s i n f 6 r i e n r h c e l u i g 6 n 6 r a l e m e n t m e s u r 6 p o u r ce t y p e d ' e n z y m e s . E n e f f e t les a u t r e s a m i n o p e p t i d a s e s o n t u n p o i d s m o l 6 c u l a i r e 6gal ou s u p 6 r i e u r 300 000 d a l t o n s [23, 25, 31]. I1 f a u t r e m a r q u e r q u c c e s p o i d s m o l 6 c u l a i r e s 61ev6s t r a d u i s e n t p o u r les a m i n o p e p t i d a s e s d e s f o r m e s p o l y m 6 r e s d o n t les m o n o m 6 r e s o n t , p a r c o n t r e , u n p o i d s m o l 6 c u l a i r e c o m p a r a b l e .h c e l u i d e l ' a m i n o p e p t i d a s e d e S. l h e r m o p h i I u s 160.

Remerciements. Nous remercions Monsieur J. H e r m i e r pour ses suggestions et ses critiques au cours de la rdalisation de ce travail et de la r~daction dn manuscrit, ainsi que Monsieur C. Bouillanue qui a eu l'obligeance de nous f o u r n i r les suspensions coneentrdes congeldes de cellules bact6riennes et Mademoiselle J e a n n e F o u r n a u d qui a mls h notre disposition l'appareil de t r a i t e m e n t aux ultrasons. P~suM~. En plus d'une aetivit6 cas6inolytique, quatre activitds peptidasiques dtaient mises en 6vidence ehez S. t h e r m o p h i l u s 1~0. La dipeptidase purifi6e a un poids moldeulaire de 50 000 daltons. Son activit5 est m a x i m u m ~ pH 7,50 et h 50°C ; l'dnergie apparente &activation E est dgale h 4 500 cal./mole. La dipeptidase est stable de pH 6,0 h pH 9,0 et aux temp6ratures 6gales ou infdrieures h 50°C. Elle est f o r t e m e n t inhibde par l ' o - p h 6 n a n t h r o l i n e et I'E.D.T.A. mais elle peut ~tre

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d e S. t h e r m o p h i l , u s .

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rdactivde p a r t i e l l e m e n t par les ions Co÷+, Zn~% Mn ÷+, Mg +÷ ou Ca ++ ; elle est f a i b l e m e n t inhibOe par le p-C.M.B., l'iodoac~tate de s o d i u m ou le D.F.P. L'enzymc n ' h y d r o l y s e que des dipeptides non substitu6s. Elle prdsente une sp~cificit6 d'action envers les dipeptides possddant un rdsidu d'acide amin6 apolaire et volum ' n e u x en position NH~-terminale ; l'influence du rdsidu CDOH-terminal est aussi d~montrde. Une a m i n o p e p t i d a s e dtait obtenue sous forme h o m o g~ne h l'dlectrophor6se. Son poids mol6culaire dtait estim6 h 62 000 daltons. Son aetivit6 dtait m a x i m u m h pH 6,40 et & 35°C. L'6nergie apparente d'activation de l ' a m i n o p e p t i d a s e dtait de 7 300 cal./mole. L'aminopeptidase dtait stable /~ 35°C pour les valeurs de pH comprises entre pH 5,80 et 9,80 et "~ pH 6,50 pour les temp6ratures infdrieures h 40°C. L'E.D.T.A. 10-5 M ou l ' O - p h d n a n t h r o l i n e 10-,3 M i n h i b a i t t o t a l e m e n t Fenzyme ; les ions Co~+ et Mn+~ la rdactivaient eompl6tem e n t et les ions Ca ++, Zn +÷ et Mg++ partiellement. D'autre p a r t les ions Zn ++ 5.10-3 M pouvaient i n h i b e r forteraent l ' a m i n o p e p t i d a s e ainsi que les alcools. L'enzyme ~tait une a - a m i n o - acyl - peptide hydrolase EC.3.4.1. stricte p uisqu'elle ne libdrait que les acides amines ell position NHe-terminale d'oligopeptides (dix r~sidus d'acides amin6s au plus). Elle h y d r o l y s a i t aussi la leucine-p-nitroanilide et des acides aminds amides (a l'exception de la ph~nylalanine amide). P a r m i les dipeptides la Lys-Tyr et la Leu-Leu dtaient les meilleurs substrats. De n o m b r e u x dipeptides n'~taient pas hydrolysds en particulier ceux p r d s e n t a n t un r6sidu glyeyle ou histidyle en position NH:,-terminale ou cont e n a n t un rdsidu prolyle ou ph6nylalanyle. BIBLIOGRAPHIE. 1. Deslnazeaud, M. J. & Hermier, J. H. (1972) Enr. J. Biochem., 28, 190-198. 2. Desmazeaud, M. J. & Hermier, J. H. (1973) Bioehimie, 55, n ° 6/7. 3. Poznanski, S., Lenoir, J. & Moequot, G. (1965) Le Lair, 45, 3-26. 4. Bottazi, V. (1965) Ann. Mierobiol. Enzimol., lfi, 197-201. 5. Carini, S. & Resmini, P. (1968) Ann. Microbiol. Enzimol., 18, 57-65. 6. Valles, E. & Moequot, G. (1968) Le Lait, 48, 631-643. 7. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. & Randall, R. J. (1951) J. Biol. Chem., 193, 265-275. 8. Desmazeaud, M. J. (1972) Bioehimie, 54, 1109-1114. 9. Desmazeaud, M. J. & Hermier, J. H. (1968) Ann. Biol. anita. Bioch. Biophgs., 8, 419-429. 10. Moore, S. ~ Stein, W. H. (1954) J. Biol. Chem., 211, 907-913. 11. Roneari, G. & Zuber, H. (1969) Int. J. Protein Res., ~1, 45-61. 12. Ornstein, L. (1964) Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 321349. 13. Davis, B. J. (1964) Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 404427. 14. Chrambaeh, A., Reisfeld, R. A., Wyckoff, M. & Zaccari, J. (1967) Anal. Biochem., 20, 150-154. 15. Andrews, P. (1964) Biochem. J., 91, 222-233. 16. Moelwyn-Hughes, E. A. (1950) in The e n z y m e s (Sumner, J. B. et Myrbheh, K. Ed.), Vol. I, pp. 28-78, Academic Press, New-York. 17. Kruh, J. (1971) in Biochimie, pp. 165-166, Collection Hermann, Paris. 18. l]ehal, F. J. & Folds, J. D. (1967) Biochem. Biophys. Res. Comman., 27, 344-349. 19. Haley, E. E. (1968) J. Biol. Chem., 243, 5748-5752. 20. Cordonnier, R. (1966) Ann. Technol. Agr., 15, H.S. 1, 1-114.

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