Isolement d'un nouveau type de diester de trehalose a partir de Mycobacterium fortuitum

Chem. Phys. Lipids 2 (1968) 11-16 © North-Holland Publ. Co., Amsterdam

ISOLEMENT D'UN NOUVEAU TYPE DE DIESTER DE TREHALOSE A PARTIR DE MYCOBACTERIUM

FORTUITUM*

E. V1LKAS, A. ADAM et M. SENN Institut de Chimie des Substances Naturelles, C.N.R.S., 91-Gif-sur-Yvette, France Received 19 July 1967 A new glycolipid has been isolated from M. fortuitum. It is an asymmetric trehalose diester in which two fatty acids esterify the same pyranose cycle (see IV). The structure is established chemically and confirmed by mass spectrometry. Plusieurs diesters de tr6halose ont 6t6 isol6s de M y c o - et Coryn6bact6ries. (1) Le " c o r d f a c t o r " des Mycobact6ries, dans lequel deux mol6cules d ' a c i d e s mycoliques est6rifient le tr6halose en p o s i t i o n 6 et 6' 1, 2). (2) U n glycolipide de Corynebacterium diphtheriae c o n t e n a n t deux acides en C32 est6rifiant aussi les deux hydroxyles primaires du tr6halose3,4). (3) U n d i p a l m i t a t e de tr6halose sym6trique isol6 ~t p a r t i r de M.fortuitum 5). L a spectrom6trie de masse nous a permis de mettre en 6vidence l'existence chez M. fortuitum d ' u n diester de tr6halose asym6trique o0 les deux mol6cules d ' a c i d e s gras est6rifient le m~me cycle p y r a n o s i q u e . A n o t r e connaissance, c'est le p r e m i e r glycolipide de ce type isol6 d ' u n e source naturelle (voir la revue r6cente6)). P a r c h r o m a t o g r a p h i e sur c o l o n n e d ' a c i d e silicique d ' u n m61ange de glycoet p e p t i d o l i p i d e s obtenus fi p a r t i r d ' u n extrait 6th6ro-alcoolique des M y c o bact6ries, nous avons pu isoler un glycolipide d o n t la saponification fournit du tr6halose c o m m e seul sucre et des acides gras de poids mol6culaire m o y e n 270 en p r o p o r t i o n 1:2. Purifi6 par c h r o m a t o g r a p h i e en couche mince et perac6tyl6, ce p r o d u i t a 6t6 soumis fi la s p e c t r o m & r i e de masse. L ' e x a m e n de son spectre (fig. 1) m o n t r e qu'il s'agit p r i n c i p a l e m e n t d ' u n diester asym6trique de structure |. N o u s t r o u v o n s un pic mol6culaire ~t m/e 1150, C02H102019 , c o r r e s p o n d a n t ~t un hexaac6tate de tr6halose est6rifi6 p a r deux acides en C19H3602"*. * Spectrom6trie de masse de glycolipides, IV; pour la IlI" communication, voir N. P. V. Acharya, M. Senn et E. Lederer, C.R. Acad. Sci. 264 (1967) 2173. 1066me communication sur les constituants des Mycobact6ries; 1056me comm., voir C. Nacasch et E. Vilkas, C.R. Acad. Sci. 256 (1967) 413. Ce travail a b6n6fici6 d'une subvention de l'Organisation Mondiale de la Sant6. ** La faible quantit6 dont nous disposions ne nous a pas permis de conclure s'il s'agit d'un acide poss6dant une double liaison, ou un cycle propanique.

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Fig. 1.

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Spectre de masse de l'hexaac6tate du diester de tr6halose asym6trique (I).

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ISOLEMENT D~UN DIESTER DE TREHALOSE

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i

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~ H

12-°A J2-OR

o

R': C18H35C-

CH2OAc

,,. 271 ,. 211 -AcOH 1 -AcOH H -CH2CO 229 OAc ;Ac I - t'c°H 169 CH20R

OH O--

OR' OH

OH

0II R ouR'=CIsH55C0 0 Rou R'=C15H31~ouC17H35C-

La perte d'acide ac~tique ~t partir de l'ion mol6culaire donne un pic & m/e 1090. Des pertes ult6rieures de c6t6ne donnent des pics d'intensit6 tr~s faible (voir par exemple, m/e 1048). La fragmentation principale du glycolipide est orient6e par la coupure de la liaison glycosidique et conduit ~t des ions oxonium tr6s stables, comme c'est le cas pour les "cord factors" d'origine naturelle et synth6tique d6crits pr6c6demment 6, v). Ainsi, le pic & m/e 802 est dfi h l'ion oxonium II comportant deux testes acyles, ce qui montre la substitution asym6trique du tr6halose. Ce pic ayant un hombre de masse pair, il faut admettre qu'il y a perte d'un atome d'hydrogbne. L'ion ~ m/e 279 est dfi au radical acyle C18H35C=O e. Le pic tr6s intense ~t m/e 331 correspond & un ion oxonium III provenant de la partie glucopyranosique non substitu6e. D'autres ions mol6culaires sont pr6sents sur le m~me spectre h m/e 1110

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E. V I L K A S ET A L .

et m/e 1138. lls correspondent/~ des glycolipides poss6dant diff6rents restes acyles, h savoir un acide palmitique, on un acide st6arique, et un acide C 1 9 H 3 6 0 2 . Des ions oxonium/~ m/e 762 et m/e 790 proviennent de la fragmentation de ces substances. La saponification de ces glycolipides fournit du tr6halose identifi6 par chromatographie sur papier et un m61ange d'acides gras qui ont pu ~tre identifi6s par la chromatographie en phase gazeuse et la spectrom6trie de masse de leurs esters m6thyliques aux esters des acides palmitique, st6arique, tuberculost6arique e t C 1 9 H 3 6 0 2 . La position de ces acides gras a pu 6tre d6finie par l'oxydation periodique du glycolipide et sa permdthylation. Le glycolipide soumis ~ l'oxydation periodique pendant 36 h r / t pH 5, l'obscurit6, /l la temp6rature ambiante, hydrolys6 et chromatographi6 sur papier, ne contient plus de glucose intact. Ce r6sultat permet d'exclure la substitution en 3. D'autre part, l'hydrolyse du glycolipide perm6thyl6 (ne pr6sentant plus de bande OH dans le spectre IR) suivie 6galement d'une chromatographie sur papier permettent d'identifier un dim6thyl-, un trim6thyl- et un t6tram6thylglucoses. La presence d'un trim6thylglucose indiquerait l'existence d'un diester sym6trique de tr6halose. Son poids mol6culaire serait fividemment identique ~t celui d'un ester asym6trique, seul la pr6sence des ions oxonium monosubstitu6s triac6tyl6s permettrait de conclure. Or, on distingue sur le spectre des pics /t m/e 527 et m/e 567, mais de trop faible intensit6 pour que leur pr6sence soit significative. Le di-O-m6thylglucose a pu ~tre identifi~ au 2,3-di-O-m6thylglucose, d'apr6s son Rg: solvant A:0,65, solvant B:0,58 et le comportement chromatographique caract6ristique au cours de la r6vdlation sp6cifique des sucres m6thyl6s par le trichloroac6tate de N, N-dimdthylaniline (coloration violette) s). Le tri-O-m6thylglucose semble ~tre le 2, 3, 4 tri-O-m6thylglucose, Rg solvant A:0,86; solvant B:0,83; non rdvelable par le trichloroacdtate de dimdthylaniline. D'apr6s ces r6sultats on peut donc attribuer au diester asymdtrique de trdhalose, isol6 de M.fortuitum, la structure (IV) or) R et R' correspondent aux restes acyles palrnitique, st6arique et Ca9H350, et est6rifient le m~me cycle pyranosique en 4 et en 6. Quant au diester symdtrique, il semble appartenir fi la s6rie "classique" dans laquelle le tr6halose est est6rifi6 en position 6 et 6'. Nous remercions vivement Monsieur le Professeur E. Lederer pour l'int6r~t t6moign6/l ce travail.

ISOLEMENT D'UN DIESTER DE TREHALOSE

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Partie exp&imentale Mycobacterium fortuitum est cultiv6 15 jours sur le milieu de Sauton. Aprbs filtration du milieu de culture, les bact6ries sont extraites plusieurs lois par le m61ange alcool-6ther (1 : 1). L'extrait 6th6ro-alcoolique repris par l'eau et l'6ther fournit une fraction insoluble dans ces deux solvants, soluble ais6ment dans le chloroforme. Cette fraction est chromatographi6e sur colonne d'acide silicique-c61ite (2: 1) (quantit6 d'adsorbant : 50 fois la quantit6 de produit) en utilisant comme 61uants: le chloroforme, puis le chloroforme contenant des quantit6s croissantes de m6thanol. Les glycolipides d6crits dans ce travail sont 61u6s par CHCI 3 contenant 10% de m6thanol. Les chromatographies analytiques et pr6paratives en couche mince sont effectu6es sur gel de silice G (Merck) dans le chloroformem6thanol 95:5. Les glycolipides sont saponifi6s par chauffage h reflux pendant 2 heures avec la potasse m6thanolique h 5%. Les sucres sont dos6s par la m6thode ~t l'anthrone 9). Les acides gras m6thyl6s par le diazom~thane sont chromatographi6s en phase gazeuse sur un appareil "Chromagaz C G I " Profit, muni d'un d6tecteur ~t ionisation de flamme; gaz vecteur: azote, d6bit: 60 ml/mn, temp6rature: 200 °. Deux diff6rentes colonnes de 2 m de long ont 6t6 utilis6es: (1) SE 30 h 10%; (2) Api6zon L ~t 20%. L'ac6tylation des glycolipides est effectu6e par l'anhydride ac6tique dans la pyridine ~, la temp6rature ambiante pendant 18 ~ 20 hr. Le glycolipide intact est oxyd6 par le periodate de Na dans le m61ange dioxane-eau ~t la temp6rature ambiante, ~, l'obscurit6 pendant 36 hr. La m6thylation dans la D M F par l'iodure de m6thyle en pr6sence d'oxyde d'argent pendant 80 hr est effectu6e selon la technique de Kuhn et coi1.1°). Les produits d'hydrolyse sont chromatographi6s dans: (a) 6thanolbutanol-eau-ammoniaque (10: 40: 49: 1) technique ascendante; (b) 6thanolbutanol-eau (1:4: 5) technique descendante. Spectrom~trie de masse: les spectres de masse ont 6t6 mesur6s avec un appareil MS9 (A.E.I.). Les 6chantillons sont introduits directement dans la source d'ions ~t l'extr6mit6 en c6ramique du syst6me d'introduction directe et la source d'ions chauff6e ~t 200 o pour les esters m6thyliques d'acides gras et ~t 280 ° pour le glycolipide intact. Note ajout(e ?t la correction des ~preuves La comparaison de comportement chromatographique en couche mince d'un 6chantillon de mycoside F de M.fortuitum (G. B. Fregnan, D. W. Smith and H. M. Randall, J. Bacteriol. 82 (1961) 517) qui nous a 6t6 aimablement

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E. VILKAS ET AL.

envoy6 par le Professeur D. W. Smith, et du diester de tr6halose asym6trique d6crit dans le pr6sent m6moire, semble i n d i q u e r qu'il s'agit de la m~me substance.

Bibliographie 1) H. Bloch, J. Exptl. Med. 91 (1950) 197 2) H. Noll, H. Bloch, J. Asselineau and E. Lederer, Biochim. Biophys. Acta 20 (1956) 299 3) T. loneda, M. Lenz and J. Pudles, Biochem. Biophys. Res. Comm. 13 (1963) 110 4) M. Senn, T. loneda, J. Pudles and E. Lederer. European J. Biochem. 1 (1967) 353 5) E. Vilkas and A. Rojas, Bull. Soc. Chim. Biol. 46 (1964) 689 6) E. Lederer, Chem. Phys. Lipids 1 (1967) 294 7) E. Vilkas, A. Adam, M. Senn and E. Lederer, European J. Biochem., in press 8) E. L. Hirst, L. Hough and J. K. N. Jones, J. Chem. Soc. 928 (1949) 9) R. Johanson, Anal. Chem. 26 (1954) 1331 10) R. Kuhn, H. Trischmann and I. L6w, Angew. Chem. 67 (1955) 32