Isolierung und Charakterisierung einer L-Leucin-aminopeptidase (LAP) und einer L-Alaninaminopeptidase (AAP) aus Euglena gracilis

Biochem. Physiol. Pflanzen (BPP), Bd. 164, S. 72-79 (1973)

Martin-Luther-Universitat Halle-Wittenberg Sektion Biowissenschaften, Fachbereich Biochemie

Isolierung und Charakterisierung einer L-Leucin-aminopeptidase (LAP) und einer L-Alaninaminopeptidase (AAP) aus Euglena gracilis Von K.

SENKPIEL,

1.

RICHTER

und A.

BARTH

Mit 7 Abbildungen (Eingegangen am 7. August 1972)

Isolation and Characterization of L-Leucineaminopeptidase (LAP) and L-Alanineaminopeptidase (AAP) from Euglena gracilis Summary Two aminopeptidasel! (LAP and AAP) have been isolated from cytoplasm a of Euglena gracilis Klebs (1224-5/25 strain Z). The aminopeptidases were purified from the cytoplasmatic fraction by precipitation with ammonium sulphate (40-80% saturation), by dialysis against 0.01 m Tris/HCl buffer pH 7.0 and by filtration on Sephadex G-200 and OM-Sephadex 0-25. The pH optimum for AAP is 8.0 and for LAP is 7.2. By means of AAP and LAP the investigation of the hydrolysis of a series of amino acid-4-(phenylazo)-phenylamides with varying amino acid residue showed that L-alanine- and L-Ieucine-4-(phenylazo)-phenylamide are the best substrates. No enzymatic hydrolysis of the amino acid-4-(phenylazo)-phenylamides like D-alanine-, D-Ieucine-, D-valine-, L-cystine-, L-isoleucine-, D-phenylalanine-, y-amino butyric acid- and sarcosine-4-(phenylazo)-phenylamide could be detected. The equation of the initial rate for the liberation of the first hydrolysis product (4-phenylazo-phenylamine) can be represented in both cases by the Michaelis-Menten law, modified by Briggs and Haldane.

1. Einleitung

In den letzten Jahren mehren sich die Arbeiten iiber die Isolierung und Charakterisierung von Aminopeptidasen (Arylamidasen)). So gelang es z. B. Exopeptidasen aus menschlichen oder tierischen Organen bzw. Organteilen zu beschreiben, die bevorzugt jeweils Amidsubstrate des L-Leuzins, L-Alanins, L-Phenylalanins, L-Methionins, L-Valins, L-Cystins, L-Prolins, L-Hydroxyprolins, L-Arginins, L-Lysins, der Asparaginsaure und Glutaminsaure hydrolysieren. In den meisten Fallen konnte das Katalyseverhalten dieser Enzyme durch Ermittlung molekularer Parameter

Isolierung und Oharakterisierung einer L-Leucin-aminopeptidase (LAP) usw.

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eindeutig determiniert werden. 1m Gegensatz zu der verhaltnismaBig groBen Anzahl der bisher vorliegenden Untersuchungsergebnisse im tierischen Bereich, sind die experimentellen Informationen tiber analoge Aminopeptidasen pflanzlicher Herkunft auffallend gering. Wahrend in den letzten Jahren einige Arbeiten tiber diese Enzyme, isoliert aus hoheren Pflanzen, bekannt wurden (1-8), sind entsprechende Untersuchungen an niederen autotrophen Pflanzen, wie z. B. den einzelligen Grtinalgen, Ul1seres Wissens so gut wie nicht durchgeftihrt worden (9). Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, zu versuchen, Aminopeptidasen in Euglena gracilis nachzuweisen, aus diesem Objekt zu isolieren und zu charakterisieren. 2. Material und Methoden a) Die Anzucht der Alge Euglena gracilis, Stamm Z (Nr. 1224-5/25) erfolgte in mixotropher Kultur bei 28 °0, Dauerlicht (Leuchtstoffrohren, ca. 2000 Lux) unter Verwendung von Glueose als 0- und Glutaminsaure als N-Quelle im Nahrmedium. b) Vorversuche ergaben, daB in Euglena gracilis die Aminopeptidaseaktivitat im Oytoplasma lokalisiert ist. Eine Isolierung dieser Enzyme ist ohne ZellaufschluB moglich, wenn wie folgt verfahren wird: 60 g der angezogenen und bei 1100 g abgeschleuderten Algen werden durch 3maliges Waschen mit tridest. Wasser von der anhaftenden Nahrlosung schnell befreit. Danach wird unter Zusatz von tridest. Wasser eine etwa 40%ige Algensuspension hergestellt und 48 Stunden bei 0 ° -4 °0 stehengelassen. Wahrend dieser Zeit diffun.diert ein groBer Teil der im Oytoplasma enthaltenen Proteine, zu denen die cytoplasmatischen Aminopeptidasen gehoren, in das waBrige Medium. Die Euglenen kugeln sich dabei ab, ohne zu zerplatzen. Ein mehrmaliges schnelles Einfrieren(3 x) derfrisch gewaschenen Algensuspension(002/Methanol) und anschlieBendes langsames Auftauen ist giinstig, da auf diese Weise die Zellpermeabilitat erhOht und die Diffusion der Proteine beschleunigt wird. Nach beendeter "Zelldialyse" werden die Algen abzentrifugiert (30 Min., 1500 g). Das Sediment wird verworfen. Aus dem klaren, proteinreichen (ca. 6 mg Protein pro ml), schwach gelblichen Uberstand werden die Aminopeptidasen isoliert. Dazu werden diese Enzyme durch eine fraktionierte Ammoniumsulfatfallung bei 40-50%iger (NH4hS04Sattigung angereichert, gegen 0,01 m Tris/HOI-Puffer, pH 7,0, dialysiert und mittels Kollodiummembranfilter (Typ SM 16311, Durchlassigkeitsgrenze: MG 30000) konzentriert. Es schlieBt sich eine Kationenaustauscherchromatographie mit OM-Sephadex 0-25 und eine mehrfache Gelfiltration (Trennung iiber Sephadex G-200) an. Die Kationenaustauscherchromatographie stellt einen weiteren Anreicherungsschritt dar. Der erste Gipfel (Abb. 1) des Spektrums enthalt das gesamte Aminopeptidase-aktive Protein. Diese Fraktion wird anschlieBend mit Sephadex G-200 weiter aufgetrennt (Abb. 2). Der 1. Peak im Proteinspektrum (Abb.2A) enthalt eine Aminopeptidase, welche das chromogene Substrat L-Leucin-4-(phenylazo)-phenylamid am schnellsten hydrolysiert (im folgendem als "LAP" bezeichnet). Der 2. Gipfel ist ebenfalls Exopeptidase-aktiv, besitzt jedoch im Vergleich zu 1 eine andere Substratspezifitat. Hier wird L-Alanin-4-(phenylazo)-phenylamid am raschesten gespalten (AAP). Inaktiv gegeniiber chromogenen Amidsubstraten ist der 3. Gipfel des Proteinspektrums. In dieser Fraktion sind besonders alkalische Phosphatase, anorganische Pyrophosphatase (aPPase) und Glutamat-Oxalat-Transaminase (GOT) nachzuweisen. Da die Alaninaminopeptidase (AAP) relativ stabil ist, konnte die Sephadex-G-200-Trennung noch zweimal wiederholt werden (Abb. 2B und 20). Es gelang auf diese Weise ein hochgereinigtes Enzym zu erhalten.

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K. SENKPIEL. 1. RICHTER und A. BARTH

1m Gegensatz zu der relativ stabilen AAP tritt bei der LAP leicht eine Denaturierung ein· wenn verdunnte Enzymlosungen einige Stunden bei Temperaturen um bzw. oberhalb 4°C stehengelassen werden. Aus diesem Grunde ist zur Isolierung der LAP ein Alcoa-AufschluB der EuglenaZellen zu empfehlen (9) und eine sofortige Trennung des Homogenats uber Sephadex G-200 bei o°C bis maximal 4°C. Das resultierende Proteinspektrum ist in der Abb.3 dargestellt. Hier enthalt der 3. Gipfel Fremdproteine, der 1. die LAP (der 2. Peak die AAP). Eine wiederholte Gelfiltration der LAP-Enzymfraktion fuhrt zu einem Protein mit hoher LAP-Aktivitat. Fur die folgenden Untersuchungen zur Enzymcharakterisierung wurde jeweils frisch bereitete LAP verwendet. c) Die Aktivitatsbestimmung der Aminopeptidasen wurde unter Verwendung von Aminosaure-4-(phenylazo)-phenylamiden als chromogene Substrate nach einer der beschriebenen Methoden (im kontinuierlichen oder im diskontinuierlichen Verfahren) durchgefuhrt (10).

3. Ergebnisse und Diskussion Wie aus der Abb. 4 hervorgeht, wurde unter den angegebenen Bedingungen flir die AAP aus Euglena gracilis ein pH-Optimum von 8,0 und flir die LAP, aus dem gleichen Objekt isoliert, ein so!ches von 7,2 gefunden.

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Abb. 1. Proteinspektrum der CM-Sephadex-C-25-Trennung bei 280 nm, 0,02 m Phosphatpuffer, pH 6,8. Abb.2. Proteinspektrum der Sephadex-G-200-Trennung bei 280 nm. A = 1., B = 2., C = 3. Sephadex-G-200-Trennung.

Isolierung und Oharakterisierung einer L-Leucin-aminopeptidase (LAP) usw.

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Abb.4. Ermittlung des pH-Optimums. Auftragung von Vo in Mol/! min gegen den pH. Substratkonzentration: 1 x 10-4 Moli!. Temperatur: 30 °0, 0,1 m Teorell-Stenhagen-Puffer; Enzymkonzentration (bezogen auf Protein): 2,82 x 10-3 mg/m! (AAP) und 1,80 x 10-2 mg/m! (LAP). 1 = Spaltung von L-Alanin-4-(phenylazo)-phenylamid durch AAP. 2 = Spaltung von L-Leuzin-4-(phenylazo)-phenylamid durch LAP.

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K. SENKPIEL, 1. RICHTER und A. BARTH

Die Temperaturoptima (Abb. 5) liegen fur die AAP bei 35°C (Substrat: L-Alanin4-(phenylazo)-phenylamid) und fUr die LAP bei 40 °C(Substrat: L-Leuzin-4-(phenylazo )-phenylamid). In der Tabelle 1 sind die Substratspezifitaten fur die AAP und LAP aus Euglena gracilis aufgefUhrt. Als Vergleich sind die entsprechenden Werte fUr die enzymatische Hydrolyse der Aminosaure- und Oligopeptid-4-(phenylazo)-phenylamide durch AAP aus Schweinenierenrinde angegeben (10). Ein Vergleich der aus Euglena gracilis isolierten AAP mit der Schweinenieren-AP zeigt folgende Ubereinstimmung im katalytischen Verhalten: 1. In beiden Fallen ist die Michaelis-Menten-Funktion, entsprechend v = f([S]) gultig (Abb. 6, A, B, C). 2. Die enzymatische Hydrolyse der Oligopeptidarylamide: Alanyl-Alanin-, Alanyl-Alanyl-Alanin- und Alanyl-Alanyl-Alanyl-Alanin-4-(phenylazo )-phenylamid durch Euglena-AAP (Abb. 7) erfolgt analog der Oligopeptid-4-(phenylazo)-phenylamid-Spaltung durch Schweinenieren-AAP (11) und deutet auf einen gleichartigen step-by-step-Mechanismus hin.

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Abb. 5. Bestimmung des Temperaturoptimums. Auftragung von Vo in Moll! x min. gegen die Temperatur in °C. Enzymkonzentration (bezogen auf Protein): 1,4 X 10-2 mg/m! (LAP) und 1,9 x 10-2 mg/m! (AAP). 1 = Spaltung von L-Alanin-4-(phenylazo)-phenylamid durch AAP, SUbstratkonzentration: 2,0 x 10-4 Moll!; 0,1 m Teorell-Stenhagen-Puffer, pH 8,4. 2 = Spaltung von L-Leuzin-4-(phenylazo)-phenylamid durch LAP, Substratkonzentration: 2,0 x 10-4 Moll!; 0,1 m Teorell-Stenhagen-Puffer, pH 7,2.

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Isolierung und Oharakterisierung einer L-Leucin-aminopeptidase (LAP) usw.

3. Die 4-(Phenylazo)-phenylamide der Aminosauren: D-Alanin, D-Leuzin, LCystin, L-Isoleuzin, D-Phenylalanin, y-Aminobuttersaure und Sarkosin werden in beiden Fallen unter den angegebenen Bedingungen (Tabelle 1) nicht hydrolysiert. Interessant ist jedoch, da.13 folgende Dnterschiede zwischen der Euglena-AAP und der Schweinenieren-AAP vorhanden sind: 1. Die Substratspezifitat ist differenziert (Tabelle 1). Auffallend ist die relativ hohe Spaltungsrate des Substrates Glycin-4-(phenylazo)-phenylamid und demgegentiber die relativ niedrige des L-Methionin-4-(phenylazo)-phenylamids durch AAP aus Euglena gracilis im Vergleich zur Schweinenieren-AAP (hier sind die Verhaltnisse umgekehrt). 2. Das Temperaturoptimum der Euglena-AAP (35°C) liegt signifikant niedriger als dasjenige der Schweinenieren-AAP (54 DC). In beiden Fallen wurde als Substrat ~

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Abb.6. Auftragung von Vo in Mol/l x min. gegen die Substratkonzentration. A = Spaltung von L-Leuzin-4-(phenylazo)-phenylamid durch LAP. B = Spaltung von L-Alanin-4-(phenylazo)-phenylamid durch AAP. o = Auftragung von 19 (Vmax/vo - 1) gegen - Ig(S) (Hillplot). Temperatur: 30 °0; Enzymkonzentration (bezogen auf Protein): 1,4 x 10-2 mg/ml (LAP) und 2,8 x 10-2 mg/ml (AAP); Teorell-Stenhagen-Puffer, pH 8,4.

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78 Tabelle 1

K. SENKPIEL, I. RICHTER und A. BARTH

Ermittlung der Substratspezifitiit der AAP aus Euglena gracilis im Vergleich zur S ch weinenieren -AAP Bedingungen: Substratkonzentration (L-Alanin-4-(phenylazo )-phenylamid): 1 x 10-4 Mol/l Temperatur: 30°C; Teorell-Stenhagen Puffer, pH 8,4 Hydrolyseraten in %, bezogen auf die spezif. Aktivitiit Enzymherkunft

Substrate: (4-(Phenylazo )-phenylamide der Aminosiiuren)

Euglena gracilis

Schweinenieren

L-Alanin Glycin L-Leuzin L-Ornithin L-Methionin

100,0 65,9 12,4 12,2 9,6

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Substrate: (4-(Phenylazo )-phenylamide der Oligopeptide)

Hydrolyseraten in % (Spaltung von L-Ala-PAP-amid = 100 % gesetzt), bezogen auf die spezifische Aktivitiit Euglena gracilis Schweinenieren

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t (min) Abb. 7. Auftragung von 6. E gegen die Zeit in min.; Substratkonzentration: 1 x 10-4 Mol/l, 0,1 m TeorelI-Stenhagen-Puffer,pH 8,0, Temperatur: 30°C, Enzymkonzentration (AAP): 1,4 x 10-2 mg/ml (bezogen auf Protein). 1 = L-Ala-PAP-amid, 2 = L-Ala-L-Ala-PAP-amid, 3 = L-AlaL-Ala-L-Ala-PAP-amid, 4 = L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-PAP-amid (PAP = 4-PhenylazophenylRest).

Isolierung und Charakterisierung einer L-Leucin-aminopeptidase (LAP) usw.

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L-Alanin-4-(phenylazo)-phenylamid verwendet, die Messungen erfolgten bei den optimalen pH-Werten. 3. Wahrend die Schweinenieren-AAP in der Mikrosomenfraktion partikelgebun den vorliegt, ist das analoge Enzym der Euglena gracilis im Cytoplasm a lokalisiert bzw. aus der Cytoplasmafraktion ohne vorherige Eingriffe zur ProteinablOsung isolierbar. Dieses differenzierte Verhalten der AAP aus Euglena gracilis und der AAP aus Schweinenieren beruht sicherlich auf Unterschieden in der Struktur und/oder der Konformation der Enzymproteine. In dieser Richtung sind weitere vertiefende Untersuchungen durchzufiihren. 4. Zusammenfassung 2 Aminopeptidasen (AAP und LAP) konnten aus dem Cytoplasm a von Euglena gracilis Klebs (1224-5/25 Stamm Z) isoliert werden. Diese Exopeptidasen wurden durch eine Ammoniumsulfat-Fallung (40-80%ige Sattigung) angereichert, gegen 0,01 m Tris/HCl Puffer, pH 7,0, dialysiert und durch Kationenaustauscherchromatographie (CM Sephadex C-25) sowie wiederholte Gelchromatographie (Sephadex G-200) gereinigt. Das pH-Optimum liegt fiir die LAP bei 7,2 und fiir die AAP bei 8,0. Die Hydrolyseuntersuchung einer Reihe von Aminosaure-4-(phenylazo)-phenylamiden mit variiertem Aminosaurerest zeigt, daB die AAP das Substrat L-Alanin-4(phenylazo )-phenylamid und die LAP das Substrat L-Leuzin-4-(phenylazo )-phenylamid am besten spaltet. Es konnte keine enzymatische Hydrolyse der 4-(Phenylazo )-phenylamide folgender Aminosauren beobachtet werden: D-Alanin, D-Leuzin, D-Valin, L-Cystin, L-Isoleuzin, D-Phenylalanin, y-Aminobuttersaure und Sarkosin. Die initiale Geschwindigkeitsgleichung fiir die Freisetzung des ersten Spaltproduktes (4-(Phenylazo )-phenylamin) entspricht dem von BRIGGS und HALDANE modifizierten Michaelis-Menten Grenzgesetz.

5. Literatur 1. ASHTON, F. M., und DAHMEN, J., Phytochemistry 7,189-197 (1968).

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Anschrift der Verfasser: Dr. KLAUS SENKPIEL, Sektion Biowissenschaften, Fachbereich Biochemie, 40 Halle/S., Domplatz 1; Dipl.-Biol. IRMGARD RICHTER, Kinderklinik der MartinLuther-Universitat, 402 Halle/S., Leninallee 18, und Prof. Dr. ALFRED BARTH, Sektion Biowissenschaften, Fachbereich Biochemie, 40 Halle/S., Domplatz 1.