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L-Asparaginases d'Escherichia coli
BIOCHIM1E, 1971, 53, 1157-1165.
L-Asparaginases d'Escherichia
coli.
I I - Pluralit6 et origine des formes mol6culaires. Relations avec l'activit6 biologique. P. LABOUREUI:t,(]. LANGLOIS, M. LABROUSSE, M. BOUDON, J. EMERAUD, J. F. SAMAIN (*), M. AGERON, Y. DUMESNIL. Soci~td d'Etudes et d'Applications Bi o ch i m i q u es, 54, rue de Versailles, 78- Joug-en-dosas. (27-9-1971).
Summary. - - Forms I and II of E. coli L-asparaginase present a difference in phi. Among the hypotheses explaining that difference, the most probable is that of a slight conformational variation which may result in a different distribution of charges. Slight differences in the composition of amino-acids, especially amides may also be possible. During either preparation or conservation, the two forms may yield aggregated forms, or more electronegative forms, called evolulion forms. Aggregates of L-asparaginase are whole multiples of the original native form ; about 10 of these forms have been demonstrated. The evolution process especially occurs in an alkaline medium and depends on temperature and ionic strength ; it does not seem due to proteolysis but rather to progressive desamidation of the asparaginase molecule. There is a notable difference in biological activities between native and aggregated forms. In the mouse lymphoma, the biological activity is connected with blood remanence.
INTRODUCTION. I1 est c o n n u que, selon leurs origines, des pr6p a r a t i o n s de L-asparaginase, ayant des propri6t~s b i o c h i m i q u e s c o m p a r a b l e s p e u v e n t a v o i r des propri6t6s b i o l o g i q u e s diff6rentes et 8tre, en particulier, actives ou in a c ti v e s vis-h-vis du l y m p h o n e de la souris [1-2-3-4-5]. Comme nous l ' a v o n s montr6 dans u n e 6tude ant6rieure [6], il existe chez E s c h e r i c h i a coli, l'6tat natif, deux types possibles d ' e n z y m e s . Ils diff6rent p a r l e u r s points isodlectriques, leurs autres propri6t6s s'6tant r6v616es identiques. P o u r p r 6 c i s e r ces donn6es, nous avons c h er ch 6 d 6 t e r m i n e r si des m o d i f ic a t io n s s t r u c t u r a l e s pouvaient 6 v e n t u e l l e m e n t e x p l i q u e r cette diff6rcnce. P ar ailleurs, l ' a n a l y s e 61ectrophor6tique des pr6p a r a t i o n s purifi6es de la L-asparaginase d'Escherichia coli ayant f r 6 q u e m m e n t mis en 6 v i d e n c e la pr6sence de p l u s i e u r s autres formes c o r r e s p o n dant toutes A cette enzyme, mais diff6rant soit p ar leur poids m o l 6 c u l a i r e [7-8], soit p a r leur poids iso61ectrique [E8-9], nous avons c h e r c h 6 ~ pr6ciser la nature des diff6rents 6tats de ]a L-asparaginase, ainsi que les causes p o u v a n t en d 6 t e r m i n e r l ' a p p a r i t i o n . Enfin, nous avons c h e r c h 6 ~ 6tablir
une corr61ation entre les diversit6s structurales et l'activit6 b i o l o g i q u e de ces f o r m e s mol6culaires.
MATERIELS E T METHODES.
PRODUITS. Les diverses asparaginases utilis6es sont produites h p a r t i r des souches 115 (forme I) et 107 (forme II) (*). Les p r o d u i t s 6volu6s sont obtenus p r i n c i p a l e ment p a r i n c u b a t i o n st6rile h 37°C; dans divers milieux tampons. Les formes agr6g6es sont obtenues A p a r t i r d ' a s p a r a g i n a s e s cristallis6es, Inises en solution h la c o n c e n t r a t i o n de 4 h 6 p. cent ; lenr p u r i f i c a t i o n s'effectue p a r s61ection des f r act i o n s obtenues aprbs passage sur S6phadex G 150 6quilibr6 p ar du NaC1 0,02 M.
COMPOSITION EN AfilDES AMINI~S. Les p r o d u i t s sont hydrolys6s h 110°C sous vide, dans HC1 6 N bidistill6, en p r 6 s e n c e d ' a c i d e thioglycolique, p e n d a n t 24, 48 et 72 heures. (*) Certaines parties de ce travail font ]'objet de la th6se de 3~ Cycle de M. SAMAIN. (Biochimie), Facult6 des Sciences, Orsay. (*) Collection S.E.A.B.
P. L a b o u r e u r el coll.
1158
La c h r o m a t o g r a p h i e et l' a n a l y s e sont r6alis6es sur au t o an al y s eu r T e c h n i c o n , d'apr6s la m6thode d'ELLIS et PRESCOTT [101 a v e c gradient de pH 2,9.2 h• 6,1 sur une co]onne de 70 × 0,6 cm. DOSAGE DE LA CYSTEINE-CYSTINE PHANE.
ET 1)U TRYPTO-.
La cyst6ine-cystine est dos6e sous forme d ' a c i d e cyst6ique p ar la m6thode de MOORE I l l ! et sous f o r m e de 5 - c a r b o x y m 6 t h y l c y s t 6 i n e p a r la m 6 t ho d e de CRESTEIELD et coll. [121. Le t r y p t o p h a n e et la t y r o s i n e sont dos6s p a r la m b t h o d e s p e c t r o p h o t o m 6 t r i q u e de BENCZE et SCHMIDT [13~. DOSAGE DE L'AZOTE AMIDE.
I1 est d6termin6 sur les prot6ines hydrolys6es p a r HC1 2 N, p e n d a n t 2 h e n r e s h 100°C. Deux ni6thodes sont utilis6es : a) D6gagement et m e s u r e de NH:~ selon une v a r i a n t e de la nI6thode de CONWAY [14]. b) D6ternIination de la c o n s o m m a t i o n du NADH au cours de la r6action e n z y m a t i q u e suivante : NH~ + a c~to glutarate + NADH -t H ~ L-glutamate + NAD*. ghltamate d6shydrogbnase Cette niesure est effeetu6e p a r s p e e t r o p h o t o m O r i e h 340 nm, selon la m b t h o d c de BUTTEnY et RO~,VSELL [15].
Elle est d6termin6e h p a r t i r de solutions d'aspar a g i n a s c de 0,1 p. cent "h 1 p. cent, dans NaCI 0,02 M pH 7 dans la zone 2 3 0 - 6 0 0 nm, sur un a p p a r e i l Sofica. Le calcul des p o u r c e n t a g c s d'ct h61ices est d6lerrain6 d'apr6s la lot de MOFFIT, SUV c a l c u l a t r i c e WANG. DICHROISME CIRCULAIRE (C.D.).
zone zone ; les cent
8PECTRES DIFFERENTIELS U.V.
Ils sont effectu6s en cuve de 1 cm, avec 6chelle expans6e 0-0,100 sur des soultions de 0,5 h 1,5 p. cent dans NaC1 0,02 M pH 7, au lnoyen du spectrop h o t o m 6 l r e Carry 14.
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n ° 11-
12.
I1 est ell'ecru6 p a r niesure du c h a n g e m e n t d'abs o r p t i o n m o l ai r e "~ 295 nm sur des solutions d'enzyme 'h 0,1 p. cent dans NaC1 0,02 M pH 6. Les op6rations sont effectu6es "h 25°C. Le p H est niesur6 sur titrinibtre Radiometer. Le titrage est effectu6 par a d j o n c t i o n de soude 0,01 N h N ; p o u r le titrage retour, on utilise HC1 N h 0,1 N apr6s un repos de 2 heures. AUTRES MI~THODES. Les d 6 t e r m i n a t i o n s de l'activit6 et du Km de l'enzynie sont effectu6es selon une m 6 t h o d e d6crite pr6c6deuIment [6J. I1 en est de m6me des analyses d'acides amin6s, de la d 6 t e r m i n a t i o n de p o i d s mo16culaire p ar 61ectrophor6se sur p o l y a c r y l a m i d e et des 61ectrophor6ses sur Cellogel. DF.TERMINATION DE LA RI~MANENCE DES DIVERSES FORMES.
La r6nianence est d6termin6e en n i esu r an t l'activit6 enzyniatique s a n g u i n e r6siduelle, sur des pr616vements recueillis sur hdparine. (3 ml chez le lapin-Pool du sang total de 6 a n i m a u x chez la souris). Les i n j e c ' i o n s sont faites p ar vole i.v. h ]a dose de 70-100 u / k g sur : - - souris Swiss de 1 mois ; --- souris B a l b / C de 1 roots, saines ou p o r t eu ses de l y m p h o n i e P 1798 ; --
DISPERSION ROTATOIRE OPTIQUE (O.R.D.).
Lcs mesures de C.D. sont effectu6es d i n s la 250-300 nnI sur un a p p a r e i l Sofica, et dans la 20'0-300 nm sur un a p p a r e i l J ouan CD 185 c o n c e n t r a t i o n s d ' e n z y m e v a r i e n t de 0,3 p. h 1,5 p. cent.
TITEAGE DES TYROSINES.
lapins de 3 kg.
I)ETERMINATION DE L'ACTIVITE BIOLOGIQUE.
Les essais d'activit6 biologique ont 6t6 d6termin6s sur souris B a l b / c de 1 roots, inocul6es avec 1 × 10~ cellules de l y m p h o m e P 1798, 7 ]ours avant l ' i n j e c t i o n d'asparaginase. Les i n j e c t i o n s (1 ml-6 u/nil) sont effectu6es p a r vole i.p. ; les d6terminations de la mortalit6 et du n o m b r e de tunieurs sont effectu6es h divers temps sur une dur6e maxinlmn de 20 jours. EVOLUTION DES AGlqEGATS ill lI[l~O.
Elle cst d6termin6e sur 3 lapins de 3 kg apr6s i n j ect i o n par vole i.v. "h la dose de 500 u / k g . On r e c h e r c h e les formes sur des pr616vements de 5 ml de sang effectu6s au bout de 5 minntes, 10 henres et 14 heures. 3 ml de sang r c c u e i l l i s stir h @ a r i n e sont pass6s sur S6ptaadex G 150, les 61uats sont recueillis, l'activit6 enzynaatiilue d6termin~e dans les fraclions.
Pluralitd
des L-Asparaginases
d'Escherichia
coli.
1159
TABLEAU ].
L - A s p a r a g i n a s e s d ' E s c h e r i c h i a coli. C o m p o s i t i o n en a c i d e s a m i n e s d e s d e u x [ o r m e s n a t i v e s . I Acides amlodS
Lys . . . . . . . .
I
His ........
i
Forme I
Forme II
Valeur calcul6e (t)
Valeur approch6e
21,2 2,6 7,8 47,8 29,4 16,9 19,2 11,1 28,9 31,0 31,7 7,0 12,0 21,8 10,8 8,2 2,0 1.07
21 3 8 48 30 17 19 11 29 31 32 7 12 22 11 8 2
Arg . . . . . . . . Asp . . . . . . . . Thr6 . . . . . . . i Ser . . . . . . . . . Glu . . . . . . . . Pro . . . . . . . . Gly . . . . . . . . Ala . . . . . . . . Val . . . . . . . . M~th . . . . . . . Ileu . . . . . . . . Leu . . . . . . . . Tyr . . . . . . . . Phdn . . . . . . . Try. (2) . . . . . . Cystine ( 3 ) . .
Valeur calcul6e (1)
Valeur approch6e
21,0 2,8 8,3 47,1 29,4 12,4 19,4 12,0 29,0 30,7 33,7 6,9 12,6 22,3 11,7 7,7 2,0 1,06
1
21 3 8 47 29 12 19 12 29 31 34 7 13 22 12 8 2 1
(1) Caleul effeetu~ pour un P.M. de 33 000 (valeur m o y e n n e caleul6e h p a r t i r des donndes exp6rimentales sur l'oligom6re n a t i f et la sous-unitd en milieu dissociant). (2) l)dtermination selon la mdthode de |~ENCZE et SCHM1DT [13]. (3) Valeur moyenne des d b t e r m i n a t i o n s selon la mSthode de MOORE [llJ et de CRESTFIELD et coll. [12].
L a e o l o n n e est 6 t a l o n n 6 e a v a n t et a p r 6 s l ' o p 6 r a t i o n au m o y e n d e s f o r m e s o l i g o l n 6 r e s et agr6g6es isol6es.
RI~SULTATS. CARACTI~RISTIQUE;S
STRUCTURALES
DES
FORMES
]
L'O.R.D., le C.D., et les s p e c t r e s d i f f 6 r e n t i e l s o n t 6t6 e f f e c t u 6 s de f a c o n h p o u v o i r c o m p a r e r les r ~ s u l t a t s e n t r e les f o r m e s I e t II, l e s d o n n 6 e s o b t e n u e s p a r ces d i v e r s e s m 6 t h o d e s 6 t a n t e n effet d i f f i c i l e m e n t i n t e r p r 6 t a b l e s i n d i v i d u e l l e m e n t ; les v a l e u r s d e s p a r a m 6 t r e s a o et b o d e l ' 6 q u a t i o n de MOFFIT n e s o n t d o n n 6 e s q u ' h t i t r e c o m p a r a t i f . ( T a b l e a u II).
ET I I .
Les c o m p o s i t i o n s en acides amin6s des deux f o r m e s s o n t t r 6 s v o i s i n e s ; elles s o n t d o n n 6 e s d a n s ]e l a b l e a u I. Aucun groupement sulphydryle libre n'a pu Ore ntis e n 5 v i d e n c e ; le t a u x de c y s t i n e s e r a i t d e 1 m o l e p a r s o u s - u n i t 6 p o u r les d e u x f o r m e s . Celte v a l e u r est s e n s i b l e m e n t la m S m e d a n s les d e u x m 6 t h o d e s u t i l i s 6 e s ( f o r m e I = 2,12 m o l e s s o u s f o r m e d ' a c i d e c y s t ~ i q u e , 2,17 m o l e s s o u s f o r m e d e carboxym6thylcyst6ine).
TABLEAU II.
L - a s p a r a g i n a s e s d ' E s e h e r i c h i a eoli. O.R.D. --- V a l e u r s des p a r a m O t r e s : a o et b o. Formes
Lots
bo
al)
F I
114 116
232 242
160 (*) 80 ('*)
FII
120 120
196 189
170 (') 128 (**)
Le t a u x d e t r y p t o p h a n e est de 2 m o l e s , et c e l u i d e t y r o s i n e d e 12 m o l e s p a r s o u s - u n i t 6 .
(*) Solution dans KC1 0,02 M pH 7. (**) Solution dans tampon P h o s p h a t e 0,05 M pH 7.
Le t a u x d ' a m i d e d e s f o r m e s I e t II e s t v o i s i n d e 35 ___ 3 lnoles d ' a z o t e a m i d 6 p a r s o u s - u n i t 6 (PM 35 000) p o u r les d e u x m 6 t h o d e s u t i l i s 6 e s .
L ' 6 t u d e d e s f o r m e s I e t [I m o n t r e que, d a n s l e u r e n s e m b l e , les e o u r b e s d'O.R.D, et les f i g u r e s de C.D., au n i v e a u d e l ' e f f e t C o t t o n , a l t r i b u 6 au e a r a e -
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t~re de la l i a i s o n p e p t i d i q u e (220 nm) sont trbs s u p e r p o s a b l e s ; p a r c o n t r e , d a n s la z o n e des g r o u p e m e n l s a r o m a t i q u e s (280 nm) nn effet C o t t o n s u p p l 6 m e n t a i r e , v i s i b l e en O.R.D., p e r m e t de les d i f f 6 r e n c i e r . Cet effet, 6tudi6 p a r C.D., m o n t r e q u ' i l est d o u b l e et que les figures o b t e n u e s ne s o n t p a s e x a c t e m e n t i d e n t i q u e s (figure 1). + ORD
CD
-2
-5
t i o n en p r o t 6 i n e , p a r c o n t r e , la d i f f 6 r e n c e e n t r e la f o r m e I seule, c o n t r e e l l e - m 6 m e en p r 6 s e n c e d'ur6e, ne p r d s e n t e p a s les m 6 m e s c a r a c t b r e s , o n y r e t r o u v e en p a r t i c u l i e r la v a r i a t i o n h 287 nm. ETUDE:~
DES
FORMES
AGREGI~ES.
Les diff6rents a g r 6 g a t s de la L - a s p a r a g i n a s e p e u v e n t 6tre c o r r e c t e m e n t s6par6s sur S 6 p h a d e x G 15.0 et G 200, on o b t i e n t a i n s i des f r a c t i o n s trbs p u r e s de l ' o l i g o m ~ r e , et de l ' a g r 6 g a t d i m 6 r i s 6 , et des f r a c t i o n s e n r i c h i e s des autres t y p e s d ' a g r 6 g a t s . On p e u t a i n s i s 6 p a r e r 5 f r a c t i o n s (figure 3).
-4
-6
7~ I
uo
I
I zro
I
z~o
I
I 310
270 ~ao ~90
/2/~
Fro. 1. - - C.D. et O.R.D. des L-asparaginases d'E. coll. .Forme I. ................... Forme II.
Le s p e c t r e de d i f f 6 r e n c e h ce n i v e a u m e t 6galem e n t en 6 v i d e n c e u n e v a r i a t i o n d o n t les m a x i m a se s i t u e n t h 293, 287, 280 n m (figure 2).
--IADO
)o! Ii:
Fro. 3. - - Fractionnement des agr6gats sur S6phadex G 150. (Electrophor6se sur gel de polyacrylamide).
Les v a l e u r s des PM o b t e n u e s p a r p a s s a g e sur S 6 p h a d e x G 150 o n t 6t6 c o n f i r m 6 e s p a r la m 6 t h o d e d'HEDRICK et SMITH.
L ' 6 t u d e des p r o p r i 6 t 6 s c o m p a r a t i v e s de ces div e r s e s f r a c t i o n s est d o n n 6 e darts le t a b l e a u III.
Fm. 2. - - Spectres diff6rentiels U.V. des L-asparaginases d'E. coli. Forme I contre Forme II. --O--O--O-- (Forme I W ur6e contre Form II). (ur6e contre tampon).
N o u s a v o n s v6rifi6 q u e seul le p i c h 280 n m p e u t 6tre attribu6 ~ u n e d i f f 6 r e n e e de c o n c e n t r a -
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Le m a x i m u m d ' a g r 6 g a t i o n n'a p u 6tre d 6 t e r m i n 6 a v e c p r 6 c i s i o n , m a i s , d a n s c e r t a i n s cas, o n a p u c a r a c t 6 r i s e r 10 f o r m e s diff6rentes. Les q u a n t i t 6 s r e s p e c t i v e s de ces d i v e r s e s f o r m e s s o n t d 6 t e r m i n6es s u r gel de p o l y a c r y l a m i d e , elles v a r i e n t e n r a i s o n i n v e r s e de 1 ' i m p o r t a n c e de l e u r p o i d s mol6c u l a i r e . Ces v a l e u r s c h a n g e n t s e l o n l ' o r i g i n e c o m m e r c i a l e des p r o d u i t s ; fi titre i n d i c a t i f , on p e u t d o n n e r i c i d e u x de ces c o m p o s i t i o n s ( T a b l e a u IV). Le t a u x d ' a g r 6 g a t i o n est s u r t o u t sous la d 6 p e n d a n c e de la m 6 t h o d e de p r 6 p a r a t i o n ; le n o m b r e des agr6gats est a u g m e n t 6 p a r la l y o p h i l i s a t i o n et la c r i s t a l l i s a t i o n (figure 4). Les f o r m e s agr6g6es, isol6es, en s o l u t i o n , s o n t stables d a n s l e u r s t r u c t u r e , m a i s elles t e n d e n t
Pluralit~ des L - A s p a r a g i n a s e s d ' E s c h e r i c h i a
colt.
1161
TABLEAU III.
L-asparaginases d ' E s c h e r i c h i a colt. Formes agrJgdes - - Propri~tJs principales.
Etat d'agr~gation
[
P.M. S6phadex G t50
P.M.
Acrylamide
1 x Oligom&re ( 0 ) . . . 100.000 -I- 5 000 2 ~< 0 . . . . . . . . . . . . . . . , 200.000 ~ 5 000 3 X 0(') ............ [ 333.000 ~- 5 000 4 x
o(')
5 x
o(') .............
............
i
110.000 220.000 340.000 450.000
-~~_ + O-
5000 5 000 5 000 5 000
i
Act. Sp6cif. moyenne u/rag 280 230 160 120 60
Km
(1,15 ~
0,1) 10 -:* M
(c
(*) Mdlanges h forte p r o p o r t i o n de ces formes.
r6former l'oligom~re en pr6sence de leur substrat, ou sous l'effet de toute op6ration correspondent h une concentration. TABLEAU IV.
L-asparaginases d ' E s c h e r i c h i a colt. Proportions relatives des diverses formes agrJgdes Formes
1X0.. 2X0.. 3X0.. 4X0.. 5xO.. 6X0.. >6X0..
Produit SEAB 8139 CB 91,7 p, cent 6 , 3 p. cent 1,1 p. cent 0,45 p. cent 0 , 3 p. cent 0,15 p. cent traces
L ' 6 v o l u t i o n est d ' a u t a n t p l u s a c c e n t u ~ e q u e l a f o r m e i o n i q u e est p l u s 61ev6e. E l l e est d i m i n u 6 e d a n s les t a m p o n s b o r a t e (en 1 m o i s h p H 8,5 3 7 ° C : p e r t e d ' a c t i v i t 6 d e 80 p. c e n t e n t a m p o n T r i s et b i c a r b o n a t e et d e 50 p. c e n t e n t a m p o n borate).
Produit BAYER (Crasnitine) 66,2 17,7 8.7 3,5 1,6 1 1,3
p. p. p. p. p. p. p.
cent cent cent cent cent cent cent
FOrtiES ~VOLUTIVES. En plus de ces diverses formes oligom6triques natives ou agr6g6es de la L-asparaginase, on peut rencontrer un processus d'6volution des produits en solution ; cette 6volution obtenue quelle que s o i t la f o r m e n a t i v e o r i g i n e l l e a l i e u d a n s l a z o n e a l c a l i n e d e s p H , et se t r a d u i t p a r l ' o b t e n t i o n d e formes plus 61ectron6gatives. Le processus est sous la d6pendance de la temp 6 r a t u r e et se p r o d u i t d6jh h d e s t e m p 6 r a t u r e s v o i s i n e s d e 4°C. C e t effet est assez l e n t ; o n o b t i e n t les f o r m e s d ' 6 v o l u t i o n e n 1 m o i s h p H 9, et h 37°C. O n a p u m e t t r e e n 6 v i d e n c e e n v i r o n 16 f o r m e s d'6volution successives, dont l'activit6 diminue proportionnetlement h leur 61ectron6gativit6. A u - d e s s o u s d e p H 5, c e t t e 6 v o l u t i o n n ' a p a s lieu, elle se m a n i f e s t e s u r t o u t h p a r t i r d e p H 7, et augm e n t e r 6 g u l i ~ r e m e n t j u s q u ' h p H 11, a u - d e l h d e ce p H i l y a d 6 n a t u r a t i o n (figure 5).
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Fro. 4. - - Influence du proc~d~ d ' o b t e n t i o n sur l'agr6gation de la L-asparaginase. De gauche h droite : P r o d u i t en solution - - P r o d u i t lyophi]~is~ - - Produ,it cristallis£
Le p o i d s m o l 6 c u l a i r e d e s f o r m e s les p l u s 6volu6es n ' e s t p a s s i g n i f i c a t i v e m e n t d i f f 6 r e n t d e c e l l e d u p r o d u i t i n i t i a l . I1 e n est d e m S m e d e l e u r c o m position en acides amin6s. C e t t e 6 v o l u t i o n se t r a d u i t p a r d i v e r s effets : --Une faible liberation d'acides amines prop o r t i o n n e l l e a u d e g r 6 d ' 6 v o l u t i o n et 6 q u i v a l e n t e a u m a x i m u m h 0,3 p. c e n t d u p o i d s d e p r o t 6 i n e ; une analyse des aeides amin6s lib6r6s au tours de
P. L a b o u r e u r el coll.
1162
l'6volution m o n t r e u n e grande diversit6 darts la nature de ceux-ci. --Le taux d ' a m i d e des produits 6volu6s est trouv6 f r 6 q u e m m e n t plus faible par les diverses m6thodes utilis6es (27-3.0 r6sidus par S.U.) p o u r les formes les plus 6volu6es.
Fla. 5. - - P r o e e s s u s d ' d v o l u t i o n de la L - a s p a r a g i n a s e d'E. coli ( F o r m e I). C o n s e r v a t i o n p e n d a n t 10 j o u r s h 37°C d a n s divers m i l i e u x t a m p o n s . De g a u c h e h droite : T a m p o n aegtate pH 5 0,02 M. - - T a m p o n p h o s p h a t e pH 0 0,02 M. - - T a m p o n p h o s p h a t e pH 7,5 0,0.2 M. - T a m p o n b i c a r b o n a t e pH 9 0,02 M. - - T a m p o n b i c a r b o n a t e pH 8 0,1 M. - - T a m p o n b o r a t e pH 9 0,02 M.
Cette 6volution ne semble pas due h u n processus enzymatique, l ' a d j o n c t i o n d'extrait bact6r i e n b r u t au nfilieu de conservation, n ' e n t r a i n a n t pas d ' a c c e n t u a t i o n de l'effet. Un processus d'6volution 61ectron6gative peut 6galement avoir lieu sous l'action de prot6ase telle que la c h y m o t r y p sine, mais il s ' a c c o m p a g n e d ' u n e perte d'activit6 brutale, et n o n progressive, ce qui la diff6rencie de l'6volution 61ectron6gative du p r e m i e r type. - - - E n f i n , il n ' y pas de diff6rence dans les courbes de titrages des tyrosines des formes 6volu6es et des formes natives I et II. Le taux de tyrosines masqu6es est 6gal "h e n v i r o n 65 p. cent, clans tous]es cas.
TABLEAU V.
L-asparaginases d ' E s c h e r i c h i a Activitd biologique. Produits(')
2j.
5j.
15 j,
20 j.
a)
20120
15/15
12112
5/5
b)
0
5
7
15
a)
0/12
0/12
5/9
b)
0
o
3
3
0/12
0/12
3/12
3/12
0
0
0
0
2/15
8/15
b)
0
a)
1 ('*~ ] .
.
.
.
T
F 1
a) F 11
coli.
b)
a)
--
15/15
A
E1
1112
b)
0
0
a)
0/12
0/12
--
10 10
1 i
10/10
i
E2
2
2
7/7
10/10
--
t
0 a)
14/14
0
"
0/12
5/9
0/12
0/12
0
0
ii
5
2
10/10
,
7,7
i
5
E3
b)
'
2
(*) T : t ~ m o i n . F I = f o r m e I. F II = f o r m e II. A : a g r ~ g a t s (3 h 5 X 0) f o r m e I. E l , E 2 , E 3 = f o r m e I de degr6 c r o i s s a n t d'6volution. (**) a) N o m b r e d ' a n i m a u x p o r t e u r s de t u m e u r s pal" r a p p o r t a n n o m b r e d ' a n i m a u x v i v a n t s ; b) n o m b r e d ' a n i m a u x m o r t s .
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Pluralitd des L-Asparaginases d ' E s c h e r i c h i a coli. RI~MANENCE DES DIVERSES FORMES.
Les demi-vies des formes natives I e t II et 6volu6es de la L-asparaginase sont voisines : 2 heures 15 - 2 heures 30 chez la souris Swiss, et 5 heures 45 - 6 h e u r e s chez le lapin. La r 6 m a n e n c e des formes agr6g6es est plus imp o r t a n t e chez ces deux esp6ces: 3 h e u r e s 15 chez la souris, 8 h e u r e s 30 chez le lapin. Chez la souris BALB/C, la d e m i - v i e est plus courte que chez la souris Swiss ( f o r m e native : 1 h e u r e ; agr6gat : 1 h e u r e 45). Chez les souris B AEB/C porteuses de lylnpho.me, ces deux temps sont augment6s et en p a r t i c u l i e r la demi-vie de ] ' o l i g o m O r e natif (forme native : 11 heures 30 ; agr6gat : 2 heures 30). ACTIVIT~ BIOLOGIQUE.
Les essais d'activit6 biologique des diverses formes p o r t a n t sur 6 s6ries d'essais, sont r6sum6s dans le tableau V. L'6volution mol6culaire, in vivo, des formes agrbg6es peu actives a ~t6 d6termin6e p a r passage sur S6phadex G 150. L'activit6 r6siduelle, au bout de 14 heures, est r e t r o u v 6 e u n i q u e m e n t sous f or m e agr6g6e, aucune activit6 n ' a y a n t 6t6 d6cel6e dans les fractions c o r r e s p o n d a n t au m o n o m 6 r e , ce qui semble noter qu'il n ' y a pas, in vivo, de p r o c e ssu s de d6sagr6gation en oligom6re actif.
DISCUSSION. L'ensemble de ees r6sultats confirme la grande similitude en t re les formes I e t II de l ' a s p a rag i nase d'E. eoli, dbjh m o n t r 6 e p r 6 e 6 d e m m e n t . Les valeurs des c o m p o s i t i o n s en aeides amin6s des deux formes sont trbs voisines, de m6me que leur taux d ' a m i d e s (35 r6sidus p a r sous-unit6) ; cependant, la p r 6 c i s io n limit6e de ces m6thodes ne p e r m e t pas d ' e x c l u r e l ' i n t e r v e n t i o n de l'un de ces 616ments c o m m e p o u v a n t e x p l i q u e r les diff6rences de p h i ; une diff6rence d'un r6sidu par sons-unit6, p a r exemple, suffit h faire xTarier significativement le pH i. L ' ab s en ce de g r o u p e m e n t s u l p h y d r y l e et le taux de cystine trouv6 p e r m e t t e n t de p e n s e r h la pr6sence d'un pont disulfure dans ]a mol6cule, ce r6sultat est d ' a i l l e u r s confirm6 p a r une 6tude r6cente de OLOSSMAN et BODE [16]. L'O.R.D. et le C.D. ne p e r m e t t e n t pas de m e t t r e en 6vidence une v a r i a t i o n dans l ' e n c h a i n e m e n t p e p t i d i q u e des deux prot6ines, susceptible de prov o q u e r une diff6rence dans la s t r u c t u r e secon-
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daire. Les valeurs de b o de l'6quation de MOFFIT sont semblables p o u r les deux forlnes ; le param o r e ao, auquel il est difficile d ' a t t r i b u e r une signification pr6cise, semble fluctuer, on admet qu'il est peut-6tre la r6sultante d ' i n t e r a c t i o n s structurales, dans ce sens, il p o u r r a i t alors Ore significatif. La p r 6 s e n c e d'un effet Cotton diff6rent fl 280 nm p e r m e t d ' e n v i s a g e r une faible v a r i a t i o n entre les deux structures, au n i v e a u t e r t i a i r e ou quaternaire ; cet effet pcut c o r r e s p o n d r e h une certaine dissymbtrie dans la position ou l ' e n v i r o n n e m e n t des r6sidus arolnatiques. I1 semble que la dissym6trie en elle-m6me (amplitude du C,D.) et l'envir o n n e m e n t des c h r o m o p h o r e s (16ger d6calage vers le rouge du C.D. de la f o r m e I) soient responsables de la diff6rence observ6e. Les spectres diff6rentiels U.V. mettent en 6vidence des m a x i m a 293 n m et h 287 nm, mais il est difficile d ' a t t r i b u e r cette diff6rence au d6masquage de ces r6sidus sur l'une des deux formes ou h u n effet b a t h o c h r o m e ; on peut noter que le m a x i m u m h 287 nm semble se r e t r o u v e r dans le spectre p r o t 6 i n e c o n t r e prot6ine -4- ur6e 6 M. Le m a x i m u m h 293 nm pourrait c o r r e s p o n d r e h u n effet de d6masquage d'un groupe Tyr. Dans leur ensemble, ]es r6sultats apport6s p a r I'U.V. confirment le C.D. et I'O.R.D. Ces r6sultats nlettent en 6 v i d e n c e une diff6rence faible qui t r a d u i t une plus g r a n d e structuration dans la forine II, ce qui p o u r r a i t 6galement contribuer h e x p l i q u e r les propri6t6s de plus grande 61ectron6gativit6 de cette forme, p a r une r6partition diff6rente des charges. Les formes agr6g6es de l ' a s p a r a g i n a s e ont 0 6 raise en 6 v i d e n c e par divers auteurs [7, 81. Le h o m b r e de ces formes est en g6n6ral moins i m p o r tant que celui qui a 6t6 d6termin6 ici. Le taux des formes agr6g6es v ar i e avec le proc6d6 de pr6paration. Ces agr6gats suivent une p r o g r e s s i o n regulibre dans leur P.M. et sont des m u l t i p l es entiers de l'oligombre, ceci est en a c c o r d avec les rbsultats d ' I m o N et VOIC,T qui ont pu mettre en 6vidence, p a r m i c r o s c o p i e 61ectronique, des formes di- et t r i m b r e s I17], mais diffbrent de ceux de Ho et MILIKIN (Progression 1.2.4.) [73. L'agr6gation a une i n f l u en ce p a r t i c u l i b r e sur l'activit6 sp6cifique des p r o d u i t s, celle-ci 6rant i n v e r s e m e n t p r o p o r tionnelle ~ leur P.M. En ce qui c o n c e r n e le p r o cessu s d'6volution de l ' e n z y m e en m i l i e u alcalin, son m 6 c a n i s m e est incertain et ne peut v r a i s e m b l a b l e m e n t pas Ore attribu6 h une prot6olyse ; p a r contre, le faible abaissement du taux d ' a m i d e ntis en 6vidence ici, p o u r r a i t 6tre significatif el e x p l i q u e r cette 6volution 61ectron6gative.
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P. L a b o u r e u r
L'hypoth6se d ' u n e prot6olyse enzymatique signal6e par divers auteurs p o u r l'acide phosphoglyc6rique inulase [18] et l ' h e x o k i n a s e de levure [19] qui aboutit, pour ces enzymes, h la f o r m a t i o n de p r o d u i t s plus 61ectron6gatifs, n ' a p u 6tre raise en 6vidence avee certitude p o u r l ' a s p a r a g i n a s e d'E. colt, l'existence d'impuret6s prot6olytiques dans les p r 6 p a r a t i o n s n ' a y a n t pu btre d6montr6e. Le traitement, par certaines enzymes prot6olytiques (ehymotrypsine), d o n n e c e p e n d a n t lieu h la f o r m a t i o n de produits plus ~leetron6gatifs mats sans progressivit6 dans l ' a u g m e n t a t i o n de l'61ectron6gativit6. La l i b 6 r a t i o n des acides amin6s qui a c c o m p a g n e l'6volution n ' a p u btre c l a i r e m e n t expliqu6e, le faible taux d'acides amin6s et surtout la diversit6 de leur n a t u r e ne p o u v a n t t r a d u i r e u n p h 6 n o m b n e de prot6olyse m~nag6e en milieu alcalin ; on peut, cependant, sugg~rer la possibilit6 de l i b 6 r a t i o n progressive de r6sidus acides amin6s libres fix6s h des mol6cules d'enzymes, p a r liaisons n o n covalentes. Le processus d'6volution p o u r r a i t trouver u n e explication plus satisfaisante dans u n e d6samidation progressive de la mol6cule. D'apr6s ROBINS!ON et coll. [20], la valeur des tanx d'amides des prot6ines a u n g r a n d r a p p o r t avec leur demi-vie biologique, les prot6ines h fort taux d'amide, c o m m e la ribonucl6ase, 6tant 61imin6es plus r a p i d e m e n t dans les organismes. Le processus de d6samidal i o n jouerait, in vivo, u n rSle i m p o r t a n t en condit i o n n a n t l'6volution de l'activit6 biologique des prot6ines. Un processus analogue d'6volution en milieu alcalin a 6t6 d'ailleurs mis en 6vidence p a r FLATMARK [21] pour le c y t o c h r o m e C. Le p h 6 n o m 6 n e d'6volution ne semble pas avoir d'effet i m p o r t a n t sur la c o n f o r m a t i o n de la mol6cule et ne provoque pas, en particulier, le d6masquage de groupement tyrosine, sur lesquels p o u r rait i n t e r v e n i r l'effet p r o t e c t e u r des ions borates, mats u n e 16g6re m o d i f i c a t i o n c o n f o r m a t i o n n e l l e , analogue h celle des formes I e t II, n'est pas h exclure, a p r i o r i ; des 6tudes sont en cours afin de pr6ciser cette 6ventualit6. E n tout 6tat de cause, ce processus d'6volution explique la possibilit6 des diverses formes obtenues p a r AnENS et coll. [8, 22], mats ne permet pas de leur attribuer le qualificatif d'isoenzymes. La diff6rence entre les Km des diverses asparaginases a parfois 6t6 sugg6r6e comme une explication possible des diversit6s d'activit6s biologiques [23]. Si nous c o n s i d 6 r o n s les divers r6sultats obtenus ici, et en p a r t i c u l i e r la diff6rence d'activit6 entre les formes agr6g6es et monom6riques, on ne peut l'expliquer p a r la diversit6 des Km, puisque ceux-ci sont identiques.
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et coll. Les r 6 m a n e n c e s p a r a i s s e n t plus significatives : BROOOME [24] explique la courte r 6 m a n e n c e de l'asparaginase de levure, p a r 61imination pr6ferentielle des grosses mol6eules, par le syst~me R.E., alors que MASHBURN [9] cherche h 6tablir une relation entre l'61oignement du pH i, de la neutralit6, des diverses p r 6 p a r a t i o n s d'asparaginase, et leur demi-vie. Ainsi, cet auteur a ntis en 6vidence des diff6rences notables de r 6 m a n e n c e entre les asparaginases BAYER (forme A) o u LILLY, que nous assimilons h la forme I, et les asparaginases KYOWA, MERCK OU SQUIBB, que nous assimilons h la forme II. Par contre, nous n ' a v o n s pu mettre en 6vidence aucune diff6rence certaine entre les deux formes dans nos c o n d i t i o n s d'exp6rienee. L ' a u g m e n t a lion d'61ectron6gativit6 provoqu6e p a r l'6volution n ' a pas de r 6 p e r c u s s i o n sur la r 6 m a n e n c e chez les a n i m a u x sains, mats l'agr6gation a u n effet tr6s net et provoque u n e a u g m e n t a t i o n de la dur6e de vie. L'6tat pathologique modifie ees donn~es, les essais effectu6s sur des souris porteuses de lymphome m o n t r e n t u n e a u g m e n t a t i o n du temps de r 6 m a n e n c e plus i m p o r t a n t sur l'oligom~re que sur les agr6gats ; il faut r e m a r q u e r , q u ' a p p a r e m m e n t , les produits agr6g6s gardent leur structure, in vivo, et ne se t r a n s f o r m e n t pas en oligom6re. La pr6senee du LDH-virus d6crit p a r RILEY [25] p o u r r a i t 8tre en r e l a t i o n avec l ' a u g m e n t a t i o n de la r 6 m a n e n c e de l ' a s p a r a g i n a s e oligom6rique et polym6rique, chez l ' a n i m a l p o r t e u r de tumeurs, mats, il se peut aussi qu'elle affeete de fa~on sp6eifique la r6aetion de l ' o r g a n i s m e vis-h-vis des diverses formes. L'aetivit6 biologique sur des souris porteuses de l y m p h o m e c o r r e s p o n d de fa~on logique aux r6manenees sur ees mSmes a n i m a u x , mats elle Inontre, de plus, n n e diff6renciation entre les formes I et II, et les formes 6volu6es et natives, qui n ' a p p a rait pas a v e c l a r 6 m a n e n c e . Une 6volution des formes p o u r r a i t se d6velopper, in vioo, p e n d a n t la dur6e de l'exp6rience, et aboutir dans ]e cas de p r o d u i t s d6jA tr6s modifi6s, h des aetivit6s enzymafiques tr~s faibles, ce qui p e r m e t t r a i t d'expliqner les m o d i f i c a t i o n s d'activil6 biologique. Ces r6snltats m o n t r e n t que la r 6 n m n e n c e , chez les anilnaux sains, est sujette h des v a r i a t i o n s i n d i viduelles, mats q u ' u n e corr61ation assez 6troite s'6tablit entre la r 6 m a n e n c e s a n g u i n e dans u n 6tat pathologique donn6 et l'activit6 b i o l o g i q u e ; cep e n d a n t , elle n ' e x p l i q u e pas toujours les variations de cette activit6 (formes I e t II), et il faut p r o b a b l e m e n t 6tendre la n o t i o n de r 6 m a n e n c e s a n g u i n e "h eelle de r 6 m a n e n c e globale, en repre-
Pluralit(
des L-A sparaginases
n a n t l ' i d d e d e BROOME [23] s u r le c a p t a g e d e l ' a c t i vit6 e n d e h o r s d u c i r c u i t s a n g u i n . Ces d i v e r s e s e x p 6 r i e n c e s m o n t r e n t la n 6 c e s s i t ~ d'observer une grande prudence dans l'extrapolation d'un r6sultat obtenu d'un systbme biologique u n a u t r e , et e n p a r t i c u l i e r de l ' a n i m a l ",i l ' h o m m e , m a i s elles m o n t r e n t 6 g a l e m e n t q u e p o u r u n s y s t b m e b i o l o g i q u e d 6 t e r m i n 6 , il p e u t e x i s t e r d e s formes mol6culaires privil6gi6es d'asparaginase. E n f i n , cet e n s e m b l e d e r 6 s u l t a t s p e r m e t p e u t 6 t r e d ' e x p l i q u e r , p a r l ' o r i g i n e d e s p r o d u i t s , les v a r i a t i o n s de r b s u l t a t s b i o l o g i q u e s ains i o b t e n u e s p a r d i v e r s a u t e u r s : u n f o r t t a u x d ' a g r 6 g a t i o n et une 6volution 61ectron6gative importante pouvant, e n p a r t i c u l i e r , d 6 t e r m i n e r u n e b a i s s e n o t a b l e de l'activit6 biologique.
Remerciements. N o u s r e m e r c i o n s M o n s i e u r le P r o f e s s e u r B. LABOUESSE p o u r l'aide pr6cieuse et le s o u t i e n qu'il n o d s a apportds darts la r d a l i s a t i o n de ce travail. Nods r e m e r c i o n s 6galelnent Mademoiselle le P r o f e s s e u r J. YON et M o n s i e u r SCnECHTER qui nOdS ont perm i s de rdaliser les d d t e r m i n a t i o n s d'O.R.D, et de C.D. Nods r e m e r c i o n s M o n s i e u r le P r o f e s s e u r M. BOIRON, grace h qui n o d s a v o n s pu rdaliser les essa,is d'activii6 biologique. Nods r e m e r c i o n s M e s s i e u r s BRUNEAU et STOLIAHOFF, du Centre de R e c h e r e h e s CLIN-BYLA, p o u r la collaboration prdcieuse q u ' i l s n o d s ont apportde d a n s l'dtude des r d m a n e n c e s . R~SUM~.. Les f o r m e s I e t II de la L - a s p a r a g i n a s e d'E. coli se diff6rencient p a r l e u r pHi. P a r m i les h y p o t h e s e s podr a n t e x p l i q u e r cette diffdrence, on p e n t r e t e n i r u n e faible v a r i a t i o n c o n f o r m a t i o n n e l l e , p o u v a n t a v o i r u n e incidence s u r la r d p a r t i t i o n des charges, s a n s exclurc de faibles diffdrences d a n s la c o m p o s i t i o n en acides a m i n d s , en p a r t i c u l i e r d a n s les t a u x d ' a m i d e s . Les d e u x f o r m e s p c u v e n t d o n n e r n a i s s a n c e , a u cours de l e u r p r 6 p a r a t i o n ou p e n d a n t l e u r c o n s e r v a t i o n , h des f o r m e s agrdg~cs, ou h des f o r m e s p l u s dlectron~gatives, ditcs forines d'6volulion. Les agr6gats de la L - a s p a r a g i n a s e s o n t des m u l t i p l e s a n t l e r s de la f o r m e n a t i v e d'origine, u n e d i z a i n e de ces f o r m e s a y a n t p u ~tre Inise en dvidenee. Le p r o e e s s u s d ' d v o l u t i o n se i n a n i f e s t e s u r t o u t en m i l i e u al'calin, et ddpend de la t e m p 6 r a t u r e et de la force ionique ; il ne s e m b l e p a s du h u n e protdolyse m a i s p l u t 6 t h u n e d 6 s a m i d a t i o n p r o g r e s s i v e de )a mol6cule d ' a s p a r a g i n a s e . Une diffdrence i n a r q u 6 e d a n s les activitds b i o l o g i q u e s s'6tablit entre les forines n a t i v e s et ]cs f o r m e s agrdgdes. D a n s le l y m p h o m e de la souris, l'activit6 biologique est en r e l a t i o n avec l a r ~ m a n e n e e s a n g u i n e . ZUSAMMENFASSUNG. Die F o r m e n I u n d 11 der L - a s p a r a g i n a s e von E. coli u n t e r s c h e i d e n sich d n r e h ihr pHi. U n t e r den Hypo-
BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 1 1 - 12.
d'Escherichia
c()li.
1165
thesen, welche diesen U n t e r s c b i e d erklfiren k6nnen, k a n n m a n diejenige einer s c h w a e h e n k o n f o r m a t i o n e l l e n A n d e r u n g zuriickhalten, welche a u f die V e r t e i l u n g der Ladunffen e i n w i r k e n k6nnte, o h n e s e h w a c h e Untersehiede in der Z u s a m m e n s e t z u n g a n Aminos~iuren, i n s b e s o n d e r e in d a m Gehalt a n A m i d e n a u s z u s e h l i e s s e n . Die b e i d e n F o r m e n k 6 n n e n im L a u f e i h r e r Darst e l l u n g oder i h r e r A u f b e w a h r u n g zu agregierten Form e n oder Inehr e l e k t r o n e g a t i v e n Forinen, welehe als E v o l u t i o n s f o r m e n bezeichnet w a r d e n , fiihren. Die Agregate tier L - A s p a r a g i n a s e sind ganze Vielfache der n a t i v e n U r f o r m u n d etwa z e h n F o r m e n sind naehgewiesen worden. Der E n t w i c k l u n g s p r o z e s s e r s e h e i n t vor a l l e m im a l k a l i s c h e n M e d i u m u n d h/ingt yon der T e m p e r a t u r u n d yon der Ionensfiirke ab ; er s c h e i n t n i c h t dureh eine P r o t e o l y s e s o n d e r n e h e r d u r c h eine allm~ihliche D e s a m i n a t i o n des A s p a r a g i n a s e m o l e k i i l s v e r u r s a e h t zn w a r d e n . Ein b e d e u t e n d e r U n t e r s c h i e d in d e n biologisehen Aktivit~iten z w i s e h e n den n a t i v e n u n d agreg,ierten Form e n w i r d festgestellt. In d a m L y m p h o m der Maus s t e m die biologisehe Aktivitiit i m Z u s a m m e n h a n g m i t d e r B l u t r e m a n e n z .
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L-Asparaginases d'Escherichia
coli.
I I - Pluralit6 et origine des formes mol6culaires. Relations avec l'activit6 biologique. P. LABOUREUI:t,(]. LANGLOIS, M. LABROUSSE, M. BOUDON, J. EMERAUD, J. F. SAMAIN (*), M. AGERON, Y. DUMESNIL. Soci~td d'Etudes et d'Applications Bi o ch i m i q u es, 54, rue de Versailles, 78- Joug-en-dosas. (27-9-1971).
Summary. - - Forms I and II of E. coli L-asparaginase present a difference in phi. Among the hypotheses explaining that difference, the most probable is that of a slight conformational variation which may result in a different distribution of charges. Slight differences in the composition of amino-acids, especially amides may also be possible. During either preparation or conservation, the two forms may yield aggregated forms, or more electronegative forms, called evolulion forms. Aggregates of L-asparaginase are whole multiples of the original native form ; about 10 of these forms have been demonstrated. The evolution process especially occurs in an alkaline medium and depends on temperature and ionic strength ; it does not seem due to proteolysis but rather to progressive desamidation of the asparaginase molecule. There is a notable difference in biological activities between native and aggregated forms. In the mouse lymphoma, the biological activity is connected with blood remanence.
INTRODUCTION. I1 est c o n n u que, selon leurs origines, des pr6p a r a t i o n s de L-asparaginase, ayant des propri6t~s b i o c h i m i q u e s c o m p a r a b l e s p e u v e n t a v o i r des propri6t6s b i o l o g i q u e s diff6rentes et 8tre, en particulier, actives ou in a c ti v e s vis-h-vis du l y m p h o n e de la souris [1-2-3-4-5]. Comme nous l ' a v o n s montr6 dans u n e 6tude ant6rieure [6], il existe chez E s c h e r i c h i a coli, l'6tat natif, deux types possibles d ' e n z y m e s . Ils diff6rent p a r l e u r s points isodlectriques, leurs autres propri6t6s s'6tant r6v616es identiques. P o u r p r 6 c i s e r ces donn6es, nous avons c h er ch 6 d 6 t e r m i n e r si des m o d i f ic a t io n s s t r u c t u r a l e s pouvaient 6 v e n t u e l l e m e n t e x p l i q u e r cette diff6rcnce. P ar ailleurs, l ' a n a l y s e 61ectrophor6tique des pr6p a r a t i o n s purifi6es de la L-asparaginase d'Escherichia coli ayant f r 6 q u e m m e n t mis en 6 v i d e n c e la pr6sence de p l u s i e u r s autres formes c o r r e s p o n dant toutes A cette enzyme, mais diff6rant soit p ar leur poids m o l 6 c u l a i r e [7-8], soit p a r leur poids iso61ectrique [E8-9], nous avons c h e r c h 6 ~ pr6ciser la nature des diff6rents 6tats de ]a L-asparaginase, ainsi que les causes p o u v a n t en d 6 t e r m i n e r l ' a p p a r i t i o n . Enfin, nous avons c h e r c h 6 ~ 6tablir
une corr61ation entre les diversit6s structurales et l'activit6 b i o l o g i q u e de ces f o r m e s mol6culaires.
MATERIELS E T METHODES.
PRODUITS. Les diverses asparaginases utilis6es sont produites h p a r t i r des souches 115 (forme I) et 107 (forme II) (*). Les p r o d u i t s 6volu6s sont obtenus p r i n c i p a l e ment p a r i n c u b a t i o n st6rile h 37°C; dans divers milieux tampons. Les formes agr6g6es sont obtenues A p a r t i r d ' a s p a r a g i n a s e s cristallis6es, Inises en solution h la c o n c e n t r a t i o n de 4 h 6 p. cent ; lenr p u r i f i c a t i o n s'effectue p a r s61ection des f r act i o n s obtenues aprbs passage sur S6phadex G 150 6quilibr6 p ar du NaC1 0,02 M.
COMPOSITION EN AfilDES AMINI~S. Les p r o d u i t s sont hydrolys6s h 110°C sous vide, dans HC1 6 N bidistill6, en p r 6 s e n c e d ' a c i d e thioglycolique, p e n d a n t 24, 48 et 72 heures. (*) Certaines parties de ce travail font ]'objet de la th6se de 3~ Cycle de M. SAMAIN. (Biochimie), Facult6 des Sciences, Orsay. (*) Collection S.E.A.B.
P. L a b o u r e u r el coll.
1158
La c h r o m a t o g r a p h i e et l' a n a l y s e sont r6alis6es sur au t o an al y s eu r T e c h n i c o n , d'apr6s la m6thode d'ELLIS et PRESCOTT [101 a v e c gradient de pH 2,9.2 h• 6,1 sur une co]onne de 70 × 0,6 cm. DOSAGE DE LA CYSTEINE-CYSTINE PHANE.
ET 1)U TRYPTO-.
La cyst6ine-cystine est dos6e sous forme d ' a c i d e cyst6ique p ar la m6thode de MOORE I l l ! et sous f o r m e de 5 - c a r b o x y m 6 t h y l c y s t 6 i n e p a r la m 6 t ho d e de CRESTEIELD et coll. [121. Le t r y p t o p h a n e et la t y r o s i n e sont dos6s p a r la m b t h o d e s p e c t r o p h o t o m 6 t r i q u e de BENCZE et SCHMIDT [13~. DOSAGE DE L'AZOTE AMIDE.
I1 est d6termin6 sur les prot6ines hydrolys6es p a r HC1 2 N, p e n d a n t 2 h e n r e s h 100°C. Deux ni6thodes sont utilis6es : a) D6gagement et m e s u r e de NH:~ selon une v a r i a n t e de la nI6thode de CONWAY [14]. b) D6ternIination de la c o n s o m m a t i o n du NADH au cours de la r6action e n z y m a t i q u e suivante : NH~ + a c~to glutarate + NADH -t H ~ L-glutamate + NAD*. ghltamate d6shydrogbnase Cette niesure est effeetu6e p a r s p e e t r o p h o t o m O r i e h 340 nm, selon la m b t h o d c de BUTTEnY et RO~,VSELL [15].
Elle est d6termin6e h p a r t i r de solutions d'aspar a g i n a s c de 0,1 p. cent "h 1 p. cent, dans NaCI 0,02 M pH 7 dans la zone 2 3 0 - 6 0 0 nm, sur un a p p a r e i l Sofica. Le calcul des p o u r c e n t a g c s d'ct h61ices est d6lerrain6 d'apr6s la lot de MOFFIT, SUV c a l c u l a t r i c e WANG. DICHROISME CIRCULAIRE (C.D.).
zone zone ; les cent
8PECTRES DIFFERENTIELS U.V.
Ils sont effectu6s en cuve de 1 cm, avec 6chelle expans6e 0-0,100 sur des soultions de 0,5 h 1,5 p. cent dans NaC1 0,02 M pH 7, au lnoyen du spectrop h o t o m 6 l r e Carry 14.
BIOCHIMIE,
1971,
53,
n ° 11-
12.
I1 est ell'ecru6 p a r niesure du c h a n g e m e n t d'abs o r p t i o n m o l ai r e "~ 295 nm sur des solutions d'enzyme 'h 0,1 p. cent dans NaC1 0,02 M pH 6. Les op6rations sont effectu6es "h 25°C. Le p H est niesur6 sur titrinibtre Radiometer. Le titrage est effectu6 par a d j o n c t i o n de soude 0,01 N h N ; p o u r le titrage retour, on utilise HC1 N h 0,1 N apr6s un repos de 2 heures. AUTRES MI~THODES. Les d 6 t e r m i n a t i o n s de l'activit6 et du Km de l'enzynie sont effectu6es selon une m 6 t h o d e d6crite pr6c6deuIment [6J. I1 en est de m6me des analyses d'acides amin6s, de la d 6 t e r m i n a t i o n de p o i d s mo16culaire p ar 61ectrophor6se sur p o l y a c r y l a m i d e et des 61ectrophor6ses sur Cellogel. DF.TERMINATION DE LA RI~MANENCE DES DIVERSES FORMES.
La r6nianence est d6termin6e en n i esu r an t l'activit6 enzyniatique s a n g u i n e r6siduelle, sur des pr616vements recueillis sur hdparine. (3 ml chez le lapin-Pool du sang total de 6 a n i m a u x chez la souris). Les i n j e c ' i o n s sont faites p ar vole i.v. h ]a dose de 70-100 u / k g sur : - - souris Swiss de 1 mois ; --- souris B a l b / C de 1 roots, saines ou p o r t eu ses de l y m p h o n i e P 1798 ; --
DISPERSION ROTATOIRE OPTIQUE (O.R.D.).
Lcs mesures de C.D. sont effectu6es d i n s la 250-300 nnI sur un a p p a r e i l Sofica, et dans la 20'0-300 nm sur un a p p a r e i l J ouan CD 185 c o n c e n t r a t i o n s d ' e n z y m e v a r i e n t de 0,3 p. h 1,5 p. cent.
TITEAGE DES TYROSINES.
lapins de 3 kg.
I)ETERMINATION DE L'ACTIVITE BIOLOGIQUE.
Les essais d'activit6 biologique ont 6t6 d6termin6s sur souris B a l b / c de 1 roots, inocul6es avec 1 × 10~ cellules de l y m p h o m e P 1798, 7 ]ours avant l ' i n j e c t i o n d'asparaginase. Les i n j e c t i o n s (1 ml-6 u/nil) sont effectu6es p a r vole i.p. ; les d6terminations de la mortalit6 et du n o m b r e de tunieurs sont effectu6es h divers temps sur une dur6e maxinlmn de 20 jours. EVOLUTION DES AGlqEGATS ill lI[l~O.
Elle cst d6termin6e sur 3 lapins de 3 kg apr6s i n j ect i o n par vole i.v. "h la dose de 500 u / k g . On r e c h e r c h e les formes sur des pr616vements de 5 ml de sang effectu6s au bout de 5 minntes, 10 henres et 14 heures. 3 ml de sang r c c u e i l l i s stir h @ a r i n e sont pass6s sur S6ptaadex G 150, les 61uats sont recueillis, l'activit6 enzynaatiilue d6termin~e dans les fraclions.
Pluralitd
des L-Asparaginases
d'Escherichia
coli.
1159
TABLEAU ].
L - A s p a r a g i n a s e s d ' E s c h e r i c h i a coli. C o m p o s i t i o n en a c i d e s a m i n e s d e s d e u x [ o r m e s n a t i v e s . I Acides amlodS
Lys . . . . . . . .
I
His ........
i
Forme I
Forme II
Valeur calcul6e (t)
Valeur approch6e
21,2 2,6 7,8 47,8 29,4 16,9 19,2 11,1 28,9 31,0 31,7 7,0 12,0 21,8 10,8 8,2 2,0 1.07
21 3 8 48 30 17 19 11 29 31 32 7 12 22 11 8 2
Arg . . . . . . . . Asp . . . . . . . . Thr6 . . . . . . . i Ser . . . . . . . . . Glu . . . . . . . . Pro . . . . . . . . Gly . . . . . . . . Ala . . . . . . . . Val . . . . . . . . M~th . . . . . . . Ileu . . . . . . . . Leu . . . . . . . . Tyr . . . . . . . . Phdn . . . . . . . Try. (2) . . . . . . Cystine ( 3 ) . .
Valeur calcul6e (1)
Valeur approch6e
21,0 2,8 8,3 47,1 29,4 12,4 19,4 12,0 29,0 30,7 33,7 6,9 12,6 22,3 11,7 7,7 2,0 1,06
1
21 3 8 47 29 12 19 12 29 31 34 7 13 22 12 8 2 1
(1) Caleul effeetu~ pour un P.M. de 33 000 (valeur m o y e n n e caleul6e h p a r t i r des donndes exp6rimentales sur l'oligom6re n a t i f et la sous-unitd en milieu dissociant). (2) l)dtermination selon la mdthode de |~ENCZE et SCHM1DT [13]. (3) Valeur moyenne des d b t e r m i n a t i o n s selon la mSthode de MOORE [llJ et de CRESTFIELD et coll. [12].
L a e o l o n n e est 6 t a l o n n 6 e a v a n t et a p r 6 s l ' o p 6 r a t i o n au m o y e n d e s f o r m e s o l i g o l n 6 r e s et agr6g6es isol6es.
RI~SULTATS. CARACTI~RISTIQUE;S
STRUCTURALES
DES
FORMES
]
L'O.R.D., le C.D., et les s p e c t r e s d i f f 6 r e n t i e l s o n t 6t6 e f f e c t u 6 s de f a c o n h p o u v o i r c o m p a r e r les r ~ s u l t a t s e n t r e les f o r m e s I e t II, l e s d o n n 6 e s o b t e n u e s p a r ces d i v e r s e s m 6 t h o d e s 6 t a n t e n effet d i f f i c i l e m e n t i n t e r p r 6 t a b l e s i n d i v i d u e l l e m e n t ; les v a l e u r s d e s p a r a m 6 t r e s a o et b o d e l ' 6 q u a t i o n de MOFFIT n e s o n t d o n n 6 e s q u ' h t i t r e c o m p a r a t i f . ( T a b l e a u II).
ET I I .
Les c o m p o s i t i o n s en acides amin6s des deux f o r m e s s o n t t r 6 s v o i s i n e s ; elles s o n t d o n n 6 e s d a n s ]e l a b l e a u I. Aucun groupement sulphydryle libre n'a pu Ore ntis e n 5 v i d e n c e ; le t a u x de c y s t i n e s e r a i t d e 1 m o l e p a r s o u s - u n i t 6 p o u r les d e u x f o r m e s . Celte v a l e u r est s e n s i b l e m e n t la m S m e d a n s les d e u x m 6 t h o d e s u t i l i s 6 e s ( f o r m e I = 2,12 m o l e s s o u s f o r m e d ' a c i d e c y s t ~ i q u e , 2,17 m o l e s s o u s f o r m e d e carboxym6thylcyst6ine).
TABLEAU II.
L - a s p a r a g i n a s e s d ' E s e h e r i c h i a eoli. O.R.D. --- V a l e u r s des p a r a m O t r e s : a o et b o. Formes
Lots
bo
al)
F I
114 116
232 242
160 (*) 80 ('*)
FII
120 120
196 189
170 (') 128 (**)
Le t a u x d e t r y p t o p h a n e est de 2 m o l e s , et c e l u i d e t y r o s i n e d e 12 m o l e s p a r s o u s - u n i t 6 .
(*) Solution dans KC1 0,02 M pH 7. (**) Solution dans tampon P h o s p h a t e 0,05 M pH 7.
Le t a u x d ' a m i d e d e s f o r m e s I e t II e s t v o i s i n d e 35 ___ 3 lnoles d ' a z o t e a m i d 6 p a r s o u s - u n i t 6 (PM 35 000) p o u r les d e u x m 6 t h o d e s u t i l i s 6 e s .
L ' 6 t u d e d e s f o r m e s I e t [I m o n t r e que, d a n s l e u r e n s e m b l e , les e o u r b e s d'O.R.D, et les f i g u r e s de C.D., au n i v e a u d e l ' e f f e t C o t t o n , a l t r i b u 6 au e a r a e -
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t~re de la l i a i s o n p e p t i d i q u e (220 nm) sont trbs s u p e r p o s a b l e s ; p a r c o n t r e , d a n s la z o n e des g r o u p e m e n l s a r o m a t i q u e s (280 nm) nn effet C o t t o n s u p p l 6 m e n t a i r e , v i s i b l e en O.R.D., p e r m e t de les d i f f 6 r e n c i e r . Cet effet, 6tudi6 p a r C.D., m o n t r e q u ' i l est d o u b l e et que les figures o b t e n u e s ne s o n t p a s e x a c t e m e n t i d e n t i q u e s (figure 1). + ORD
CD
-2
-5
t i o n en p r o t 6 i n e , p a r c o n t r e , la d i f f 6 r e n c e e n t r e la f o r m e I seule, c o n t r e e l l e - m 6 m e en p r 6 s e n c e d'ur6e, ne p r d s e n t e p a s les m 6 m e s c a r a c t b r e s , o n y r e t r o u v e en p a r t i c u l i e r la v a r i a t i o n h 287 nm. ETUDE:~
DES
FORMES
AGREGI~ES.
Les diff6rents a g r 6 g a t s de la L - a s p a r a g i n a s e p e u v e n t 6tre c o r r e c t e m e n t s6par6s sur S 6 p h a d e x G 15.0 et G 200, on o b t i e n t a i n s i des f r a c t i o n s trbs p u r e s de l ' o l i g o m ~ r e , et de l ' a g r 6 g a t d i m 6 r i s 6 , et des f r a c t i o n s e n r i c h i e s des autres t y p e s d ' a g r 6 g a t s . On p e u t a i n s i s 6 p a r e r 5 f r a c t i o n s (figure 3).
-4
-6
7~ I
uo
I
I zro
I
z~o
I
I 310
270 ~ao ~90
/2/~
Fro. 1. - - C.D. et O.R.D. des L-asparaginases d'E. coll. .Forme I. ................... Forme II.
Le s p e c t r e de d i f f 6 r e n c e h ce n i v e a u m e t 6galem e n t en 6 v i d e n c e u n e v a r i a t i o n d o n t les m a x i m a se s i t u e n t h 293, 287, 280 n m (figure 2).
--IADO
)o! Ii:
Fro. 3. - - Fractionnement des agr6gats sur S6phadex G 150. (Electrophor6se sur gel de polyacrylamide).
Les v a l e u r s des PM o b t e n u e s p a r p a s s a g e sur S 6 p h a d e x G 150 o n t 6t6 c o n f i r m 6 e s p a r la m 6 t h o d e d'HEDRICK et SMITH.
L ' 6 t u d e des p r o p r i 6 t 6 s c o m p a r a t i v e s de ces div e r s e s f r a c t i o n s est d o n n 6 e darts le t a b l e a u III.
Fm. 2. - - Spectres diff6rentiels U.V. des L-asparaginases d'E. coli. Forme I contre Forme II. --O--O--O-- (Forme I W ur6e contre Form II). (ur6e contre tampon).
N o u s a v o n s v6rifi6 q u e seul le p i c h 280 n m p e u t 6tre attribu6 ~ u n e d i f f 6 r e n e e de c o n c e n t r a -
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Le m a x i m u m d ' a g r 6 g a t i o n n'a p u 6tre d 6 t e r m i n 6 a v e c p r 6 c i s i o n , m a i s , d a n s c e r t a i n s cas, o n a p u c a r a c t 6 r i s e r 10 f o r m e s diff6rentes. Les q u a n t i t 6 s r e s p e c t i v e s de ces d i v e r s e s f o r m e s s o n t d 6 t e r m i n6es s u r gel de p o l y a c r y l a m i d e , elles v a r i e n t e n r a i s o n i n v e r s e de 1 ' i m p o r t a n c e de l e u r p o i d s mol6c u l a i r e . Ces v a l e u r s c h a n g e n t s e l o n l ' o r i g i n e c o m m e r c i a l e des p r o d u i t s ; fi titre i n d i c a t i f , on p e u t d o n n e r i c i d e u x de ces c o m p o s i t i o n s ( T a b l e a u IV). Le t a u x d ' a g r 6 g a t i o n est s u r t o u t sous la d 6 p e n d a n c e de la m 6 t h o d e de p r 6 p a r a t i o n ; le n o m b r e des agr6gats est a u g m e n t 6 p a r la l y o p h i l i s a t i o n et la c r i s t a l l i s a t i o n (figure 4). Les f o r m e s agr6g6es, isol6es, en s o l u t i o n , s o n t stables d a n s l e u r s t r u c t u r e , m a i s elles t e n d e n t
Pluralit~ des L - A s p a r a g i n a s e s d ' E s c h e r i c h i a
colt.
1161
TABLEAU III.
L-asparaginases d ' E s c h e r i c h i a colt. Formes agrJgdes - - Propri~tJs principales.
Etat d'agr~gation
[
P.M. S6phadex G t50
P.M.
Acrylamide
1 x Oligom&re ( 0 ) . . . 100.000 -I- 5 000 2 ~< 0 . . . . . . . . . . . . . . . , 200.000 ~ 5 000 3 X 0(') ............ [ 333.000 ~- 5 000 4 x
o(')
5 x
o(') .............
............
i
110.000 220.000 340.000 450.000
-~~_ + O-
5000 5 000 5 000 5 000
i
Act. Sp6cif. moyenne u/rag 280 230 160 120 60
Km
(1,15 ~
0,1) 10 -:* M
(c
(*) Mdlanges h forte p r o p o r t i o n de ces formes.
r6former l'oligom~re en pr6sence de leur substrat, ou sous l'effet de toute op6ration correspondent h une concentration. TABLEAU IV.
L-asparaginases d ' E s c h e r i c h i a colt. Proportions relatives des diverses formes agrJgdes Formes
1X0.. 2X0.. 3X0.. 4X0.. 5xO.. 6X0.. >6X0..
Produit SEAB 8139 CB 91,7 p, cent 6 , 3 p. cent 1,1 p. cent 0,45 p. cent 0 , 3 p. cent 0,15 p. cent traces
L ' 6 v o l u t i o n est d ' a u t a n t p l u s a c c e n t u ~ e q u e l a f o r m e i o n i q u e est p l u s 61ev6e. E l l e est d i m i n u 6 e d a n s les t a m p o n s b o r a t e (en 1 m o i s h p H 8,5 3 7 ° C : p e r t e d ' a c t i v i t 6 d e 80 p. c e n t e n t a m p o n T r i s et b i c a r b o n a t e et d e 50 p. c e n t e n t a m p o n borate).
Produit BAYER (Crasnitine) 66,2 17,7 8.7 3,5 1,6 1 1,3
p. p. p. p. p. p. p.
cent cent cent cent cent cent cent
FOrtiES ~VOLUTIVES. En plus de ces diverses formes oligom6triques natives ou agr6g6es de la L-asparaginase, on peut rencontrer un processus d'6volution des produits en solution ; cette 6volution obtenue quelle que s o i t la f o r m e n a t i v e o r i g i n e l l e a l i e u d a n s l a z o n e a l c a l i n e d e s p H , et se t r a d u i t p a r l ' o b t e n t i o n d e formes plus 61ectron6gatives. Le processus est sous la d6pendance de la temp 6 r a t u r e et se p r o d u i t d6jh h d e s t e m p 6 r a t u r e s v o i s i n e s d e 4°C. C e t effet est assez l e n t ; o n o b t i e n t les f o r m e s d ' 6 v o l u t i o n e n 1 m o i s h p H 9, et h 37°C. O n a p u m e t t r e e n 6 v i d e n c e e n v i r o n 16 f o r m e s d'6volution successives, dont l'activit6 diminue proportionnetlement h leur 61ectron6gativit6. A u - d e s s o u s d e p H 5, c e t t e 6 v o l u t i o n n ' a p a s lieu, elle se m a n i f e s t e s u r t o u t h p a r t i r d e p H 7, et augm e n t e r 6 g u l i ~ r e m e n t j u s q u ' h p H 11, a u - d e l h d e ce p H i l y a d 6 n a t u r a t i o n (figure 5).
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Fro. 4. - - Influence du proc~d~ d ' o b t e n t i o n sur l'agr6gation de la L-asparaginase. De gauche h droite : P r o d u i t en solution - - P r o d u i t lyophi]~is~ - - Produ,it cristallis£
Le p o i d s m o l 6 c u l a i r e d e s f o r m e s les p l u s 6volu6es n ' e s t p a s s i g n i f i c a t i v e m e n t d i f f 6 r e n t d e c e l l e d u p r o d u i t i n i t i a l . I1 e n est d e m S m e d e l e u r c o m position en acides amin6s. C e t t e 6 v o l u t i o n se t r a d u i t p a r d i v e r s effets : --Une faible liberation d'acides amines prop o r t i o n n e l l e a u d e g r 6 d ' 6 v o l u t i o n et 6 q u i v a l e n t e a u m a x i m u m h 0,3 p. c e n t d u p o i d s d e p r o t 6 i n e ; une analyse des aeides amin6s lib6r6s au tours de
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1162
l'6volution m o n t r e u n e grande diversit6 darts la nature de ceux-ci. --Le taux d ' a m i d e des produits 6volu6s est trouv6 f r 6 q u e m m e n t plus faible par les diverses m6thodes utilis6es (27-3.0 r6sidus par S.U.) p o u r les formes les plus 6volu6es.
Fla. 5. - - P r o e e s s u s d ' d v o l u t i o n de la L - a s p a r a g i n a s e d'E. coli ( F o r m e I). C o n s e r v a t i o n p e n d a n t 10 j o u r s h 37°C d a n s divers m i l i e u x t a m p o n s . De g a u c h e h droite : T a m p o n aegtate pH 5 0,02 M. - - T a m p o n p h o s p h a t e pH 0 0,02 M. - - T a m p o n p h o s p h a t e pH 7,5 0,0.2 M. - T a m p o n b i c a r b o n a t e pH 9 0,02 M. - - T a m p o n b i c a r b o n a t e pH 8 0,1 M. - - T a m p o n b o r a t e pH 9 0,02 M.
Cette 6volution ne semble pas due h u n processus enzymatique, l ' a d j o n c t i o n d'extrait bact6r i e n b r u t au nfilieu de conservation, n ' e n t r a i n a n t pas d ' a c c e n t u a t i o n de l'effet. Un processus d'6volution 61ectron6gative peut 6galement avoir lieu sous l'action de prot6ase telle que la c h y m o t r y p sine, mais il s ' a c c o m p a g n e d ' u n e perte d'activit6 brutale, et n o n progressive, ce qui la diff6rencie de l'6volution 61ectron6gative du p r e m i e r type. - - - E n f i n , il n ' y pas de diff6rence dans les courbes de titrages des tyrosines des formes 6volu6es et des formes natives I et II. Le taux de tyrosines masqu6es est 6gal "h e n v i r o n 65 p. cent, clans tous]es cas.
TABLEAU V.
L-asparaginases d ' E s c h e r i c h i a Activitd biologique. Produits(')
2j.
5j.
15 j,
20 j.
a)
20120
15/15
12112
5/5
b)
0
5
7
15
a)
0/12
0/12
5/9
b)
0
o
3
3
0/12
0/12
3/12
3/12
0
0
0
0
2/15
8/15
b)
0
a)
1 ('*~ ] .
.
.
.
T
F 1
a) F 11
coli.
b)
a)
--
15/15
A
E1
1112
b)
0
0
a)
0/12
0/12
--
10 10
1 i
10/10
i
E2
2
2
7/7
10/10
--
t
0 a)
14/14
0
"
0/12
5/9
0/12
0/12
0
0
ii
5
2
10/10
,
7,7
i
5
E3
b)
'
2
(*) T : t ~ m o i n . F I = f o r m e I. F II = f o r m e II. A : a g r ~ g a t s (3 h 5 X 0) f o r m e I. E l , E 2 , E 3 = f o r m e I de degr6 c r o i s s a n t d'6volution. (**) a) N o m b r e d ' a n i m a u x p o r t e u r s de t u m e u r s pal" r a p p o r t a n n o m b r e d ' a n i m a u x v i v a n t s ; b) n o m b r e d ' a n i m a u x m o r t s .
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Pluralitd des L-Asparaginases d ' E s c h e r i c h i a coli. RI~MANENCE DES DIVERSES FORMES.
Les demi-vies des formes natives I e t II et 6volu6es de la L-asparaginase sont voisines : 2 heures 15 - 2 heures 30 chez la souris Swiss, et 5 heures 45 - 6 h e u r e s chez le lapin. La r 6 m a n e n c e des formes agr6g6es est plus imp o r t a n t e chez ces deux esp6ces: 3 h e u r e s 15 chez la souris, 8 h e u r e s 30 chez le lapin. Chez la souris BALB/C, la d e m i - v i e est plus courte que chez la souris Swiss ( f o r m e native : 1 h e u r e ; agr6gat : 1 h e u r e 45). Chez les souris B AEB/C porteuses de lylnpho.me, ces deux temps sont augment6s et en p a r t i c u l i e r la demi-vie de ] ' o l i g o m O r e natif (forme native : 11 heures 30 ; agr6gat : 2 heures 30). ACTIVIT~ BIOLOGIQUE.
Les essais d'activit6 biologique des diverses formes p o r t a n t sur 6 s6ries d'essais, sont r6sum6s dans le tableau V. L'6volution mol6culaire, in vivo, des formes agrbg6es peu actives a ~t6 d6termin6e p a r passage sur S6phadex G 150. L'activit6 r6siduelle, au bout de 14 heures, est r e t r o u v 6 e u n i q u e m e n t sous f or m e agr6g6e, aucune activit6 n ' a y a n t 6t6 d6cel6e dans les fractions c o r r e s p o n d a n t au m o n o m 6 r e , ce qui semble noter qu'il n ' y a pas, in vivo, de p r o c e ssu s de d6sagr6gation en oligom6re actif.
DISCUSSION. L'ensemble de ees r6sultats confirme la grande similitude en t re les formes I e t II de l ' a s p a rag i nase d'E. eoli, dbjh m o n t r 6 e p r 6 e 6 d e m m e n t . Les valeurs des c o m p o s i t i o n s en aeides amin6s des deux formes sont trbs voisines, de m6me que leur taux d ' a m i d e s (35 r6sidus p a r sous-unit6) ; cependant, la p r 6 c i s io n limit6e de ces m6thodes ne p e r m e t pas d ' e x c l u r e l ' i n t e r v e n t i o n de l'un de ces 616ments c o m m e p o u v a n t e x p l i q u e r les diff6rences de p h i ; une diff6rence d'un r6sidu par sons-unit6, p a r exemple, suffit h faire xTarier significativement le pH i. L ' ab s en ce de g r o u p e m e n t s u l p h y d r y l e et le taux de cystine trouv6 p e r m e t t e n t de p e n s e r h la pr6sence d'un pont disulfure dans ]a mol6cule, ce r6sultat est d ' a i l l e u r s confirm6 p a r une 6tude r6cente de OLOSSMAN et BODE [16]. L'O.R.D. et le C.D. ne p e r m e t t e n t pas de m e t t r e en 6vidence une v a r i a t i o n dans l ' e n c h a i n e m e n t p e p t i d i q u e des deux prot6ines, susceptible de prov o q u e r une diff6rence dans la s t r u c t u r e secon-
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daire. Les valeurs de b o de l'6quation de MOFFIT sont semblables p o u r les deux forlnes ; le param o r e ao, auquel il est difficile d ' a t t r i b u e r une signification pr6cise, semble fluctuer, on admet qu'il est peut-6tre la r6sultante d ' i n t e r a c t i o n s structurales, dans ce sens, il p o u r r a i t alors Ore significatif. La p r 6 s e n c e d'un effet Cotton diff6rent fl 280 nm p e r m e t d ' e n v i s a g e r une faible v a r i a t i o n entre les deux structures, au n i v e a u t e r t i a i r e ou quaternaire ; cet effet pcut c o r r e s p o n d r e h une certaine dissymbtrie dans la position ou l ' e n v i r o n n e m e n t des r6sidus arolnatiques. I1 semble que la dissym6trie en elle-m6me (amplitude du C,D.) et l'envir o n n e m e n t des c h r o m o p h o r e s (16ger d6calage vers le rouge du C.D. de la f o r m e I) soient responsables de la diff6rence observ6e. Les spectres diff6rentiels U.V. mettent en 6vidence des m a x i m a 293 n m et h 287 nm, mais il est difficile d ' a t t r i b u e r cette diff6rence au d6masquage de ces r6sidus sur l'une des deux formes ou h u n effet b a t h o c h r o m e ; on peut noter que le m a x i m u m h 287 nm semble se r e t r o u v e r dans le spectre p r o t 6 i n e c o n t r e prot6ine -4- ur6e 6 M. Le m a x i m u m h 293 nm pourrait c o r r e s p o n d r e h u n effet de d6masquage d'un groupe Tyr. Dans leur ensemble, ]es r6sultats apport6s p a r I'U.V. confirment le C.D. et I'O.R.D. Ces r6sultats nlettent en 6 v i d e n c e une diff6rence faible qui t r a d u i t une plus g r a n d e structuration dans la forine II, ce qui p o u r r a i t 6galement contribuer h e x p l i q u e r les propri6t6s de plus grande 61ectron6gativit6 de cette forme, p a r une r6partition diff6rente des charges. Les formes agr6g6es de l ' a s p a r a g i n a s e ont 0 6 raise en 6 v i d e n c e par divers auteurs [7, 81. Le h o m b r e de ces formes est en g6n6ral moins i m p o r tant que celui qui a 6t6 d6termin6 ici. Le taux des formes agr6g6es v ar i e avec le proc6d6 de pr6paration. Ces agr6gats suivent une p r o g r e s s i o n regulibre dans leur P.M. et sont des m u l t i p l es entiers de l'oligombre, ceci est en a c c o r d avec les rbsultats d ' I m o N et VOIC,T qui ont pu mettre en 6vidence, p a r m i c r o s c o p i e 61ectronique, des formes di- et t r i m b r e s I17], mais diffbrent de ceux de Ho et MILIKIN (Progression 1.2.4.) [73. L'agr6gation a une i n f l u en ce p a r t i c u l i b r e sur l'activit6 sp6cifique des p r o d u i t s, celle-ci 6rant i n v e r s e m e n t p r o p o r tionnelle ~ leur P.M. En ce qui c o n c e r n e le p r o cessu s d'6volution de l ' e n z y m e en m i l i e u alcalin, son m 6 c a n i s m e est incertain et ne peut v r a i s e m b l a b l e m e n t pas Ore attribu6 h une prot6olyse ; p a r contre, le faible abaissement du taux d ' a m i d e ntis en 6vidence ici, p o u r r a i t 6tre significatif el e x p l i q u e r cette 6volution 61ectron6gative.
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P. L a b o u r e u r
L'hypoth6se d ' u n e prot6olyse enzymatique signal6e par divers auteurs p o u r l'acide phosphoglyc6rique inulase [18] et l ' h e x o k i n a s e de levure [19] qui aboutit, pour ces enzymes, h la f o r m a t i o n de p r o d u i t s plus 61ectron6gatifs, n ' a p u 6tre raise en 6vidence avee certitude p o u r l ' a s p a r a g i n a s e d'E. colt, l'existence d'impuret6s prot6olytiques dans les p r 6 p a r a t i o n s n ' a y a n t pu btre d6montr6e. Le traitement, par certaines enzymes prot6olytiques (ehymotrypsine), d o n n e c e p e n d a n t lieu h la f o r m a t i o n de produits plus ~leetron6gatifs mats sans progressivit6 dans l ' a u g m e n t a t i o n de l'61ectron6gativit6. La l i b 6 r a t i o n des acides amin6s qui a c c o m p a g n e l'6volution n ' a p u btre c l a i r e m e n t expliqu6e, le faible taux d'acides amin6s et surtout la diversit6 de leur n a t u r e ne p o u v a n t t r a d u i r e u n p h 6 n o m b n e de prot6olyse m~nag6e en milieu alcalin ; on peut, cependant, sugg~rer la possibilit6 de l i b 6 r a t i o n progressive de r6sidus acides amin6s libres fix6s h des mol6cules d'enzymes, p a r liaisons n o n covalentes. Le processus d'6volution p o u r r a i t trouver u n e explication plus satisfaisante dans u n e d6samidation progressive de la mol6cule. D'apr6s ROBINS!ON et coll. [20], la valeur des tanx d'amides des prot6ines a u n g r a n d r a p p o r t avec leur demi-vie biologique, les prot6ines h fort taux d'amide, c o m m e la ribonucl6ase, 6tant 61imin6es plus r a p i d e m e n t dans les organismes. Le processus de d6samidal i o n jouerait, in vivo, u n rSle i m p o r t a n t en condit i o n n a n t l'6volution de l'activit6 biologique des prot6ines. Un processus analogue d'6volution en milieu alcalin a 6t6 d'ailleurs mis en 6vidence p a r FLATMARK [21] pour le c y t o c h r o m e C. Le p h 6 n o m 6 n e d'6volution ne semble pas avoir d'effet i m p o r t a n t sur la c o n f o r m a t i o n de la mol6cule et ne provoque pas, en particulier, le d6masquage de groupement tyrosine, sur lesquels p o u r rait i n t e r v e n i r l'effet p r o t e c t e u r des ions borates, mats u n e 16g6re m o d i f i c a t i o n c o n f o r m a t i o n n e l l e , analogue h celle des formes I e t II, n'est pas h exclure, a p r i o r i ; des 6tudes sont en cours afin de pr6ciser cette 6ventualit6. E n tout 6tat de cause, ce processus d'6volution explique la possibilit6 des diverses formes obtenues p a r AnENS et coll. [8, 22], mats ne permet pas de leur attribuer le qualificatif d'isoenzymes. La diff6rence entre les Km des diverses asparaginases a parfois 6t6 sugg6r6e comme une explication possible des diversit6s d'activit6s biologiques [23]. Si nous c o n s i d 6 r o n s les divers r6sultats obtenus ici, et en p a r t i c u l i e r la diff6rence d'activit6 entre les formes agr6g6es et monom6riques, on ne peut l'expliquer p a r la diversit6 des Km, puisque ceux-ci sont identiques.
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et coll. Les r 6 m a n e n c e s p a r a i s s e n t plus significatives : BROOOME [24] explique la courte r 6 m a n e n c e de l'asparaginase de levure, p a r 61imination pr6ferentielle des grosses mol6eules, par le syst~me R.E., alors que MASHBURN [9] cherche h 6tablir une relation entre l'61oignement du pH i, de la neutralit6, des diverses p r 6 p a r a t i o n s d'asparaginase, et leur demi-vie. Ainsi, cet auteur a ntis en 6vidence des diff6rences notables de r 6 m a n e n c e entre les asparaginases BAYER (forme A) o u LILLY, que nous assimilons h la forme I, et les asparaginases KYOWA, MERCK OU SQUIBB, que nous assimilons h la forme II. Par contre, nous n ' a v o n s pu mettre en 6vidence aucune diff6rence certaine entre les deux formes dans nos c o n d i t i o n s d'exp6rienee. L ' a u g m e n t a lion d'61ectron6gativit6 provoqu6e p a r l'6volution n ' a pas de r 6 p e r c u s s i o n sur la r 6 m a n e n c e chez les a n i m a u x sains, mats l'agr6gation a u n effet tr6s net et provoque u n e a u g m e n t a t i o n de la dur6e de vie. L'6tat pathologique modifie ees donn~es, les essais effectu6s sur des souris porteuses de lymphome m o n t r e n t u n e a u g m e n t a t i o n du temps de r 6 m a n e n c e plus i m p o r t a n t sur l'oligom~re que sur les agr6gats ; il faut r e m a r q u e r , q u ' a p p a r e m m e n t , les produits agr6g6s gardent leur structure, in vivo, et ne se t r a n s f o r m e n t pas en oligom6re. La pr6senee du LDH-virus d6crit p a r RILEY [25] p o u r r a i t 8tre en r e l a t i o n avec l ' a u g m e n t a t i o n de la r 6 m a n e n c e de l ' a s p a r a g i n a s e oligom6rique et polym6rique, chez l ' a n i m a l p o r t e u r de tumeurs, mats, il se peut aussi qu'elle affeete de fa~on sp6eifique la r6aetion de l ' o r g a n i s m e vis-h-vis des diverses formes. L'aetivit6 biologique sur des souris porteuses de l y m p h o m e c o r r e s p o n d de fa~on logique aux r6manenees sur ees mSmes a n i m a u x , mats elle Inontre, de plus, n n e diff6renciation entre les formes I et II, et les formes 6volu6es et natives, qui n ' a p p a rait pas a v e c l a r 6 m a n e n c e . Une 6volution des formes p o u r r a i t se d6velopper, in vioo, p e n d a n t la dur6e de l'exp6rience, et aboutir dans ]e cas de p r o d u i t s d6jA tr6s modifi6s, h des aetivit6s enzymafiques tr~s faibles, ce qui p e r m e t t r a i t d'expliqner les m o d i f i c a t i o n s d'activil6 biologique. Ces r6snltats m o n t r e n t que la r 6 n m n e n c e , chez les anilnaux sains, est sujette h des v a r i a t i o n s i n d i viduelles, mats q u ' u n e corr61ation assez 6troite s'6tablit entre la r 6 m a n e n c e s a n g u i n e dans u n 6tat pathologique donn6 et l'activit6 b i o l o g i q u e ; cep e n d a n t , elle n ' e x p l i q u e pas toujours les variations de cette activit6 (formes I e t II), et il faut p r o b a b l e m e n t 6tendre la n o t i o n de r 6 m a n e n c e s a n g u i n e "h eelle de r 6 m a n e n c e globale, en repre-
Pluralit(
des L-A sparaginases
n a n t l ' i d d e d e BROOME [23] s u r le c a p t a g e d e l ' a c t i vit6 e n d e h o r s d u c i r c u i t s a n g u i n . Ces d i v e r s e s e x p 6 r i e n c e s m o n t r e n t la n 6 c e s s i t ~ d'observer une grande prudence dans l'extrapolation d'un r6sultat obtenu d'un systbme biologique u n a u t r e , et e n p a r t i c u l i e r de l ' a n i m a l ",i l ' h o m m e , m a i s elles m o n t r e n t 6 g a l e m e n t q u e p o u r u n s y s t b m e b i o l o g i q u e d 6 t e r m i n 6 , il p e u t e x i s t e r d e s formes mol6culaires privil6gi6es d'asparaginase. E n f i n , cet e n s e m b l e d e r 6 s u l t a t s p e r m e t p e u t 6 t r e d ' e x p l i q u e r , p a r l ' o r i g i n e d e s p r o d u i t s , les v a r i a t i o n s de r b s u l t a t s b i o l o g i q u e s ains i o b t e n u e s p a r d i v e r s a u t e u r s : u n f o r t t a u x d ' a g r 6 g a t i o n et une 6volution 61ectron6gative importante pouvant, e n p a r t i c u l i e r , d 6 t e r m i n e r u n e b a i s s e n o t a b l e de l'activit6 biologique.
Remerciements. N o u s r e m e r c i o n s M o n s i e u r le P r o f e s s e u r B. LABOUESSE p o u r l'aide pr6cieuse et le s o u t i e n qu'il n o d s a apportds darts la r d a l i s a t i o n de ce travail. Nods r e m e r c i o n s 6galelnent Mademoiselle le P r o f e s s e u r J. YON et M o n s i e u r SCnECHTER qui nOdS ont perm i s de rdaliser les d d t e r m i n a t i o n s d'O.R.D, et de C.D. Nods r e m e r c i o n s M o n s i e u r le P r o f e s s e u r M. BOIRON, grace h qui n o d s a v o n s pu rdaliser les essa,is d'activii6 biologique. Nods r e m e r c i o n s M e s s i e u r s BRUNEAU et STOLIAHOFF, du Centre de R e c h e r e h e s CLIN-BYLA, p o u r la collaboration prdcieuse q u ' i l s n o d s ont apportde d a n s l'dtude des r d m a n e n c e s . R~SUM~.. Les f o r m e s I e t II de la L - a s p a r a g i n a s e d'E. coli se diff6rencient p a r l e u r pHi. P a r m i les h y p o t h e s e s podr a n t e x p l i q u e r cette diffdrence, on p e n t r e t e n i r u n e faible v a r i a t i o n c o n f o r m a t i o n n e l l e , p o u v a n t a v o i r u n e incidence s u r la r d p a r t i t i o n des charges, s a n s exclurc de faibles diffdrences d a n s la c o m p o s i t i o n en acides a m i n d s , en p a r t i c u l i e r d a n s les t a u x d ' a m i d e s . Les d e u x f o r m e s p c u v e n t d o n n e r n a i s s a n c e , a u cours de l e u r p r 6 p a r a t i o n ou p e n d a n t l e u r c o n s e r v a t i o n , h des f o r m e s agrdg~cs, ou h des f o r m e s p l u s dlectron~gatives, ditcs forines d'6volulion. Les agr6gats de la L - a s p a r a g i n a s e s o n t des m u l t i p l e s a n t l e r s de la f o r m e n a t i v e d'origine, u n e d i z a i n e de ces f o r m e s a y a n t p u ~tre Inise en dvidenee. Le p r o e e s s u s d ' d v o l u t i o n se i n a n i f e s t e s u r t o u t en m i l i e u al'calin, et ddpend de la t e m p 6 r a t u r e et de la force ionique ; il ne s e m b l e p a s du h u n e protdolyse m a i s p l u t 6 t h u n e d 6 s a m i d a t i o n p r o g r e s s i v e de )a mol6cule d ' a s p a r a g i n a s e . Une diffdrence i n a r q u 6 e d a n s les activitds b i o l o g i q u e s s'6tablit entre les forines n a t i v e s et ]cs f o r m e s agrdgdes. D a n s le l y m p h o m e de la souris, l'activit6 biologique est en r e l a t i o n avec l a r ~ m a n e n e e s a n g u i n e . ZUSAMMENFASSUNG. Die F o r m e n I u n d 11 der L - a s p a r a g i n a s e von E. coli u n t e r s c h e i d e n sich d n r e h ihr pHi. U n t e r den Hypo-
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d'Escherichia
c()li.
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thesen, welche diesen U n t e r s c b i e d erklfiren k6nnen, k a n n m a n diejenige einer s c h w a e h e n k o n f o r m a t i o n e l l e n A n d e r u n g zuriickhalten, welche a u f die V e r t e i l u n g der Ladunffen e i n w i r k e n k6nnte, o h n e s e h w a c h e Untersehiede in der Z u s a m m e n s e t z u n g a n Aminos~iuren, i n s b e s o n d e r e in d a m Gehalt a n A m i d e n a u s z u s e h l i e s s e n . Die b e i d e n F o r m e n k 6 n n e n im L a u f e i h r e r Darst e l l u n g oder i h r e r A u f b e w a h r u n g zu agregierten Form e n oder Inehr e l e k t r o n e g a t i v e n Forinen, welehe als E v o l u t i o n s f o r m e n bezeichnet w a r d e n , fiihren. Die Agregate tier L - A s p a r a g i n a s e sind ganze Vielfache der n a t i v e n U r f o r m u n d etwa z e h n F o r m e n sind naehgewiesen worden. Der E n t w i c k l u n g s p r o z e s s e r s e h e i n t vor a l l e m im a l k a l i s c h e n M e d i u m u n d h/ingt yon der T e m p e r a t u r u n d yon der Ionensfiirke ab ; er s c h e i n t n i c h t dureh eine P r o t e o l y s e s o n d e r n e h e r d u r c h eine allm~ihliche D e s a m i n a t i o n des A s p a r a g i n a s e m o l e k i i l s v e r u r s a e h t zn w a r d e n . Ein b e d e u t e n d e r U n t e r s c h i e d in d e n biologisehen Aktivit~iten z w i s e h e n den n a t i v e n u n d agreg,ierten Form e n w i r d festgestellt. In d a m L y m p h o m der Maus s t e m die biologisehe Aktivitiit i m Z u s a m m e n h a n g m i t d e r B l u t r e m a n e n z .
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