- Email: [email protected]
La désoxypyridinoline, marqueur de la résorption osseuse
FATBL B D3
Mod6rateur : J. POLLET (Dourdan)
Avec la collaboration de CHIRON DIAGNOSTICS
I
La d6soxypyridinoline, marqueur de la r6sorption osseuse C. K I N D E R M A N S * C. CORMIER * * D. MARQUE *, C. SACHS et J.-Co S O U B E R B I E L L E *
Introduction L'ost6oporose, maladie diffuse du squelette caract&ris6e par une diminution de la masse osseuse et une augmentation du risque fracturaire, est un probl&me majeur de sant6 publique. Les marqueurs osseux sont des nouveaux outils biologiques permettant d'am61iorer la prise en charge de cette maladie, et leur d6veloppement est tout a fair d'actualit6 (3). En effet, dans des circonstances off les perturbations du remodelage osseux sont mod6r6es, les modifications des param~tres classiques du m6tabolisme phosphocalcique sont trop faibles pour 6tre utiles en pratique clinique. La biopsie osseuse qui donne des informations importantes est un examen invasif et ne peut pas @tre propos6e facilement. La mise au point de dosages de param&tres plus sensibles a permis, en association avec l'@aluation densitom6trique de la masse osseuse, de caract6riser plus pr6cis6ment certaines pathologies m6taboliques. Le tissu osseux est constitu6 d'une matrice inorganique (cristaux d'hydroxyapatite) et d'une matrice organique compos6e surtout de collag~ne de type I e t de prot6ines non collag6niques. Le marqueur osseux doit permettre de quantifier la formation et la d6gradation de la matrice osseuse. II s'agit soit de la mesure d'une activit6 enzymatique plus ou moins sp6cifique des ost6oblastes ou des ost6oclastes, soit de la mesure d'un constituant de la matrice relargu6 dans la circulation Iors de la formation ou de la d6gradation osseuse. Les diff6rents marqueurs osseux (tableau I) ont des sp6cificit6s et des sensibilit6s variables suivant les situations 6tudi6es, lls ont chacun des avantages et des inconv6nients. Certains sont en cours d'6valuation. La d6soxypyridinoline (DPYR), agent de pontage des mol6cules de collag~ne de type I, est un marqueur du remodelage osseux et plus particuli&rement de la r6sorption osseuse.
I, Cellules osseuseset remodelage osseux L'os est compos6 (poids sec) & 70 % de min6ral sous forme de cristaux d'hydroxyapatite (Cal0(P04)6(OH)2). Les 30 % restant correspondent a une matrice organique dont les 9 / 1 0 sont constitu6s de collag~ne de type I e t d'une faible proportion de prot6ines non collag6niques (ost6ocalcine entre autres). Le dernier 1 / 1 0 correspond ~ des cellules sp6cifiques. Le squelette est TABLEAU I Les marqueurs osseux Formation
R6sorption
Non collag6niques Phosphatases alcalines Phosphatase acide tartrate totales (ALP) r6sistante (TRAP) Phosphatase alcaline osseuse (BAL) Ost6ocalcine (OC) Collag6niques Peptide d'extension C terminal Hydroxyproline du procollag~ne I (PICP) Pyridinoline (PYR) D6soxypyridinoline (DPYR) Cross-Laps Peptide d'extension N terminal NTX du procollag~ne I (PINP) Telopeptide C-terminal du collag~ne ! (ICTP)
Pour CHIRON 102
se r e p o r t e r
P. FROTTE
*
constitu6 de 90 % d'os cortical, ou compact, et de 10 % d'os trab6culaire ou spongieux. Dans cet os spongieux, Iocalis6 uniquement dans les m6taphyses des os longs e t ~ la partie centrale des os plats, la matrice osseuse est arrang@ en trav@s microsco~ piques connect@s entre elles et ne repr6sente que 20 % du tissu, le reste 6tant constitu6 par le tissu h6matopoi6tique. L'os est un tissu en continuel renouvellement. II est constitu6 d'unit6s fonctionnelles de remodelage (BMU = "bone modeling units" ou "bone multicellular units") ind6pendantes les unes des autres. A l'6tat "normal", 90 % de la surface osseuse est inactive. Le processus de remodelage est initi6 par des signaux hormonaux et physiques qui permettent le recrutement dans la moelle osseuse de cellules appel6es pr6ost6oclastes et d6riv6es de cellules peu diff6renci6es, les CFU ("colony forming units"). Ces pr6ost6oclastes migrent vers la surface osseuse off elles fusionnent et deviennent des grosses cellules multinuc166es, les ost6oclastes. L'ost6oclaste poss~de l'int6grine, mol6cule ayant la possibilit6 de lier certaines prot6ines incorpor6es dans la matrice osseuse (comme l'ost6opontine). Cette phase d'attachement est n6cessaire. L'ost6oclaste va ensuite cr6er un micro environnement acide et lib6rer des enzymes qui vont d6truire la matrice. C'est la phase de r6sorption. II va en r6sulter une cavit6 dont la profondeur est d'environ 60 lJm. Le taux de calcium dans le milieu p6riost6oclastique sera un signal d'arr~t du processus de destruction osseuse entra~nant la r6traction de l'ost6oclaste. La formation osseuse va ensuite d6buter par la fabrication locale de m6diateurs chimiques qui vont attirer dans la cavit6 des cellules appel@s pr6ost6oblastes. Ce ph6nom~ne est la phase d'ir~/ersion. Ces cellules vont devenir des ost6oblastes matures qui v0nt s6cr6ter une nouvelle matrice de collag&ne afin de remplacer l'os manquant. Cette fabrication est tout d'abord rapide puisqt~e cette nouvelle matrice non min~ralis6e (appel6e ost6o'fde) atteindra une 6paisseur de 20 lam en I mois. A c e point, la min6ralisation commence. Le cycle r6sorption-formation sera termin6 en 3 mois environ (4). Toutefois, si ce processus 6tait totalement efficace, on ne perdrait jamais d'os : chaque BMU remplacerait int6gralement l'os d6truit initialement. Ce n'est pas tout ~ far le cas et un infime d6ficit osseux persiste apr~s chaque cycle, sauf pendant la croissance. Les BMU de l'os trab6culaire subissent plus fr6quemment le processus de remodelage que celles de l'os cortical en raison de la plus grande surface de contact entre les cellules et le tissu h6matopoi6tique dans ce type d'os. On admet que chaque ann6e un adulte renouvelle 25 % de son os trab6culaire et seulement 4 % de son os cortical.
2. M6tabolismedu collag6ne de type I Le r6le d'une matrice extracellulaire est de soutenir et relier entre elles des cellules et de donner sa structure ~ un tissu. Chez l'homme, les deux constituants majeurs des matrices extracellulaires sont d'une part de grosses prot6ines fibrillaires, les collag~nes, et d'autre part des agr6gats de prot6ines et d'hydrates de carbone, les prot6oglycans. Nous avons d6j~ vu que le constituant principal, non min6ral, de la matrice osseuse 6tait le colla-
* Laboratoire d'explorations fonctionnelles H6pital Necker-Enfants Malades 149, rue de S~vres - 75743 PARIS CEDEX 15 ** Service de rhumatologie - H6pital Cochin 27, rue du Fg Saint-Jacques - 75679 PARIS CEDEX 14
~ la 2" de c o u v e r t u r e
e t ~ la I r" de g a r d e Revue frangaise des laboratoires, avri11997, N ° 292
g@ne de type I. On donne le nom global de collag@ne ~ une famille de prot@ines ayant en commun une structure particuli@re appel@e triple h@lice polypeptidique et dans laquelle on peut observer une r@p@tition de la s@quence suivante : (GIy-X-Y)n o0 X et Y peuvent ~tre n'importe quel acide amin@ (14). Toutefois, certaines mol@cules de l'organisme ont cette particularit@, sans pr@senter le crit@re fonctionnel de soutien des tissus (fraction C l q du compl@ment ; ac@tylcholinest@rase). Le collag@ne de type Iest la plus abondante des prot@ines chez l'homme (2 & 3 kg) et il est Iocalis@ & plus de 90 % dans l'os. II est constitu@ de deux cha~nes peptidiques identiques (cd) et d'une cha~ne diff@rente mais homoIogue (~ 2). II est fabriqu@ par les ost@oblastes. Le g~ne codant pour les chaines cd est Iocalis@ sur le chromosome 17, celui codant pour la chaine cc 2, sur le chromosome 7. lls sont cependant tr@s @troitement co-r@[email protected] diff@rentes chatnes procollag@niques sont transport@es dans le r@ticulum endoplasmique ot~ elles subissent des transformations sous l'influence d'enzymes sp@cifiques. Au moins 20 % des acides amin@s pr@sents dans le peptide initial sont transform@s par des processus enzymatiques dont le principal est la transformation de la proline en hydroxyproline sans laquelle le collag@ne ne peut pas apparaRre sous la forme d'une triple h@lice. Un autre ph@nom@ne important est l'hydroxylation de certains r@sidus lysine en hydroxylysine n@cessaire & la formation de ponts entre diff@rentes mol@cules de collag@ne. Lorsque la structure en triple h@lice est form@e, la mol@cule de procollag@ne I est excr@t@e dans le liquide extracellulaire ofl elle est rapidement cliv@e d'abord & l'extr@mit@ N terminale puis C terminal par des enzymes sp@cifiques. Les peptides d'extension sont relargu@s dans la circulation dans un rapport stoichom@trique. Une portion du peptide Nest toutefois probablement r@incorpor@e dans la matrice (figure 1). Une lois lib@r@es de leurs peptides d'extension, les mol@cules de collag@ne de type I s'assemblent rapidement en fibres de collag~ne grace ~ diff@rentes r@actions chimiques. La premi@re @tape est enzymatique : la lysyloxydase catalyse l'oxydation des parties N des r@sidus lysine ou hydroxylysine pour former les ald@hydes correspondants. Les ald@hydes ainsi form@s peuvent interr@agir pour former des ponts, encore appel@s "cross-links", entre deux mol@cules de collag@ne. Dans l'os, les plus connus parmi ces agents de pontage sont la pyridinoline et d@soxypyridinoline qui sont caract@ris@es par une structure cyclique et la propri@t@ d'@mettre une fluorescence caract@ristique. Dans le collag&ne I, ces cross-links sont form@s 8 des endroits pr@f@rentiels. Le site principal est la petite pantie non h@lico'fdale situ@e aux deux extr@mit@s d'une mol@cule de collag@ne et aussi appel@e telopeptide. Ces telopeptides sont ainsi connect@s & certaines r@gions de la partie h@lico'fdale d'une mol@cule de collag@ne I voisine pour former les fibres de collag@ne (13). Lors de la r@sorption osseuse, le collag@ne I e s t d@grad@. La quantit@ de collag@ne d@grad@ par an est consid@rable chez tous les individus mais particuli@rement chez les enfants. La d@gradation enzymatique et chimique du collag@ne entra~ne la lib@ration dans la circulation de petits peptides et d'acides amin@s fibres qui sont partiellement @limin@s par les urines. Parmi ces produits de d@gradation, on retrouve la DPYR, soit sous forme fibre, soit sous forme conjugu@e & des peptides de poids mol@culaires variables.
FIGURE 1 Synth~se et d@gradation du collag@ne de type I Triple h@]ice de co]]ag@ne Procollag@ne
: telopeptides
Ost@oblaste pept~'de d'extension N-terminal
~eptide d'extension C-terminal
..... ZL~C\~2~'~2"~^~2/.~J~ ~ < " ~ .
~"~'
o o
Collag~ne de type I immature
Produits de d@gradation ducol]ag~ne d e t y p e l OPYR/PYR libres HYDROXYPROLINE Collag~ne de type I mature
Ga]. Hydroxylysine
=
cz~£~"~~ ' > ' > ~ ~ . i ~
PYR ouDPYR / /
©
r~sorption
,
_~ Telopeptides osseuse Peptldes (contenant ou non Dpyr/Pyr)
FIGURE 2 PYRIDINOLINES PYRIDINOLINE CROSSLINKS COLLAGEN PYRIDINIUM CROSSLINKS
(~H-COOH HO
~H-COOH
CHrCHrCH.COOH
HO
CHrCHyCH.COOH
~m H
H
~H, H
H
I
CHTCH-CH2-CHrCH-COOH NF½
CHr CHrCH I-CH2"CH'COOH NH2
3. D@soxypyridinoline • aspects m@taboliques Pyridinoline=PYR
La pyridinoline (PYR) et la d@soxypyridinoline (DPYR) sont des mol@cules de pontage (crosslinks) qui r@sultent de la condensation de quatre r@sidus lysyl ou hydroxylysyl. Elles stabilisent les fibres de collag@ne de type I au sein de la matrice extra cellulaire. 1. M@tabolisme des pyridinolines
Au stade m@tabolique de la maturation du collag@ne, des liaisons intra puis inter mol@culaires r@alisant des "pontages" intra et/ou inter cha~nes vont assurer l'assemblage des fibres pour former le collag@ne mature. Avec une lysine d'une cha~ne cq il se forme, apr~s transposition d'Amadori, une lysine-5-c@tonorleucine, et avec une hydroxylysine se forme une hydroxylysine5-c@tonorleucine tr@s stables. Deux c@toamines de pontage vont interagir pour former une mol@cule de pontage trivalente de 3hydroxypyridinium reliant ainsi trois cha~nes cc formant l'hydroxylysylpyridinoline (la pyrid~noline) et/ou la lysylpyridino-
P o u r C H I R O N se r e p o r t e r Revue frangaise des laboratoires, avril 1997, N ° 292
De~oxy p y r i d i n
o l i n e = O - P YR
line (la d@soxypyridinoline) (figure 2). Ces mol@cules ont @t@ identifi@es dans les tissus conjonctifs et dans l'os gr&ce & leur fluorescence naturelle. Si PYR a @t@mise en @vidence dans l'os, la dentine, le cartilage et les tendons, DPYR a @t@ retrouv@e essentiellement dans le tissu osseux et la dentine (6). DPYR repr@sente 2 1 % des mol@cules de pontage du collag@ne mature et 0,1 mole par mole de collag@ne dans l'os humain adulte soit de l'ordre de 10 millimoles de DPYR pour 0,17 gramme d'os hydrat@ min@ralis@. Lors de la r@sorption osseuse, le collag@ne est d@grad@, PYR et DPYR sont relargu@es dans la circulation, mol@cules stables et non m@tabolis@es elles sont excr@t@es dans les urines. M@me si DPYR est pr@sente dans l'alimentation, elle ne serait pas absorb@e et il n'y aurait aucune contribution alimentaire dans l'excr@tion urinaire de DPYR m@me apr@s ingestion orale de g@latine.
la 2 ° de c o u v e r t u r e e t
la I re de g a r d e 103
2. Distribution des formes de d6soxypyridinoline dans les urines DPYR est excr~t~e dans les urines, & la fois sous forme libre et conjugu~e & des peptides de masse mol~culaire variable. Le rapport entre ces diff~rentes formes est constant chez l'adulte sain. Formes libres : 38 % Formes peptidiques 550-1000 D : 40 % Formes peptidiques 1000-3500 D : 15 % Formes peptidiques > 3500 D : 7 %
4. Dosages de la d~soxypyridinoline urinaire Les dosages peuvent ~tre effectu~s sur les urines de 24 heures ou sur la deuxi~me miction du matin & jeun. Les formes totales e t / o u fibres de DPYR peuvent @tre mesur~es en effectuant ou non une ~tape d'hydrolyse pr~alable.
1. CLHP Le dosage de DPYR totale est r~alis~ apr~s hydrolyse. Un ml d'urine est hydrolys~ par un volume ~gal de HCI 12N, une nuit 110 °C. Apr~s centrifugation, l'hydrolysat surnageant est purifi~ par chromatographie sur colonne de CF-1 cellulose, rinc~ par un m~lange de l-butanol-acide ac~tique-eau (4:1:1 ; v/v/v). Les pyridinolines sont ~lu~es par 10 ml d'eau, puis lyophilis~es et reprises par 200 I~I de phase mobile : solution aqueuse d'acide hepta fluorobutyrique 0,01 M e t d'ac~tonitrile (87:13 ; v/v). La s~paration chromatographique de PYR et DPYR est r~alis~e sur une colonne en phase inverse C18 (Spherisorb ODS2, 51~m - 25 cm x 4,6 mm). L'~lution par la phase mobile est effectu~e & un d~bit de 1,3 ml/min et la d~tection fluorim~trique (FL 200) A une Iongueur d'excitation de 296 nm et d'~mission de 392 nm. Les concentrations de DPYR sont calcul~es par comparaison & une gamme de standards pr~par~s dans notre laboratoire & partir d'un hydrolysat d'os humain d~min~ralis~ et ~talonn~ par M. BRAZIER (Laboratoire de pharmacie clinique, Amiens (12). L'~tude de la precision de la m~thode comprenant toutes les ~tapes d'hydrolyse, d'extraction et de dosage chromatographique montre des coefficients de variation inter-essais de 8,5 % et intra-essai de 3,5 %. Les pourcentages de r~cup~ration d'une surcharge sont compris entre 91 et 1 0 1 % .
2. ELISA : Pyrilinks®-D Ce coffret permet de mesurer directement DPYR libre. DPYR totale pourra ~tre dos~e apr~s hydrolyse en utilisant le protocole suivant : 200 I~I d'urines sont hydrolysis par un volume ~gal de HCI 12N, de 18 ~ 24 heures & 110 °C puis l'hydrolysat est neutralis~ par de la NaOH 1N en r~alisant une dilution 1,5. Ce test Pyrilinks®-D Elisa, est un dosage immunoenzymatique, d~velopp~ par la soci~t~ Metra Biosystems, utilisant un anticorps monoclonal anti-DPYR fix~ sur la microplaque. DPYR de l'~chantillon urinaire entre en competition avec le conjugu~ marqu~ & la phosphatase alcaline vis-a-vis de l'anticorps. La r~action est mise en ~vidence gr&ce au substrat p-nitroph~nylphosphate, la mesure de la densit~ optique est r~alis~e 405 nm (16). Le coefficient de variation inter-essai a ~t~ ~valu~ 9 %. Apr~s dilutions d'~chantillons de DPYR, le pourcentage de r~cup~ration est de l'ordre de 97 %.
3. Pyrilinks®-D : RIA Ce coffret permet de mesurer directement DPYR libre. DPYR totale pourra @tre dos~e apr~s hydrolyse en utilisant le protocole precedent. Pyrilinks®-D RIA est un dosage radioimmunologique par competition d~velopp~ par la soci~t~ Metra Biosystems, utilisant un anticorps monoclonal anti-DPYR fix~ sur des tubes de polystyrene, le traceur est marqu~ & l'iode 125. Actuellement nous ~valuons ce dosage. Nos r~sultats pr~liminaires montrent des coefficients de variation intra-essai de 3,5 % et les valeurs de DPYR totales urinaires mesur~es par Pyrilinks®-D RIA et par CLHP sont tr~s ~troitement corr~l~es : r = 0,990 p = 0,0001.
sant un anticorps monoclonal anti-DPYR ; la phase solide est constitute de particules paramagn~tiques. Cette technique automatis~e mesure directement DPYR libre, une ~tape manuelle pr~alable adapt~e devrait permettre le dosage de la DPYR totale. QueUes que soient les m~thodes, les r~sultats sont le plus souvent exprim~s par rapport & la cr~atininurie en nmol de DPYR/mmol cr~atinine. Des variations circadiennes ont ~t~ observ~es avec un pic le matin (entre 5 h et 8 h). Les valeurs usuelles en HPLC : femmes 25 - 45 ans (non m~nopaus~es) - - > 3,2 - 8,6 nmol/mmol cr~atinine hommes 25 - 55 ans - - > 2,3 - 6,7 nmol/mmol cr~atinine La quantit~ de DPYR excr~t~e chez l'enfant est de 10 & 15 fois sup~rieure & ce que l'on observe chez l'adulte. La m~thode en CLHP est Iongue et difficilement applicable en routine. Ces m~thodes de dosages immunoenzymatiques~ radioimmunologiques manuelles ou automatis~es, par leur rapidit~, sont une alternative int~ressante pour la mesure de l'excr~tion urinaire de DPYR pour le diagnostic et le suivi th~rapeutique de la r~sorption osseuse.
5. Utilisationde la d(~oxypyridinoline en pratique clinique 1. Comprehension physiopathologique L'utilisation des marqueurs osseux permet de juger de l'importance des ph~nom~nes de r~sorption et de formation dans des situations cliniques vari~es. Ainsi dans l'hyperthyro'fdie, on constate une augmentation de la DPYR bien corr~l~e au taux de T3 (9). De m~me, apr~s parathyro'fdectomie pour hyperparathyro'fdie primaire, les concentrations de DPYR, initialement ~lev~es, se normalisent, t~moignant d'un retour & un remodelage osseux normal (17). On constate ~galement une augmentation en post-m~nopause (de 50 & 100 % pour la DPYR) avec retour & la norme sous traitement cestrog~nique. Cette augmentation du turn over expose & une perte osseuse. II existe, & la m~nopause, une variabilit~ individuelle de la perte osseuse allant.de moins de 1 % & plus de 6 % par an. Les femmes ayar~t une perte rapide (fast losers) auraient un risque accru de fracture par rapport & celles ayant une perte osseuse lente (slow losers). Le d~lai par rapport & la m~nopause est prendre en compte, le maximum de perte osseuse se situant dans les 3 A 5 ans apr~s la m~nopause. Cependant, m~me 10 ans apr~s la m~nopause, les marqueurs de formation (OC, BAL) et de r~sorption (NTX, Cross-Laps) restent tr~s diff~rents des valeurs pr~-m~nopausiques sugg~rant la persistance d'un haut remodelage (8). La comparaison de marqueurs du remodelage d'une population post-m~nopausique sans ost~oporose et d'une population pr~sentant une ost~oporose montre des taux de marqueurs de formation et de r~sorption (DPYR) significativement plus ~lev~s dans la population ost~oporotique sugg~rant qu'un haut turn over expose plus des fractures (5). Les immunodosages de DPYR fibre sont bien corr~l~s avec les mesures p a r HPLC. II existe cependant une correlation n~gative entre le pourcentage de DPYR libre et l'excr~tion de DPYR totale (7). Sous traitement antir~sorptif, la diminution des formes peptidiques de PYR et de DPYR (appr~ci~e par les dosages urinaires de NTX et Cross-Laps) est plus importante que celle des formes fibres entra~nant donc une augmentation du pourcentage DPYR libre/DPYR totale. Ceci permet de mettre l'accent sur la difference entre l'acc~s & la mesure th~oriquement la plus proche de la r~sorption r~elle (DPYR totale) et l'utilisation de marqueurs apparemment plus sensibles mais surestimant peut-~tre, l'intensit~ de l'activit~ de r~sorption (15).
4. Test D P D ACS : 1 8 0
2. Marqueurs osseux pr6dictifs d'une perte osseuse ult6rieure
C'est une technique de dosage en chimiluminescence utilisant une r~action immunologique par competition d~velopp~e par la soci~t~ Chiron Diagnostics sous licence Metra Biosystems, utili-
Nous avons vu, plus haut, que les femmes ne sont pas ~gales devant la perte osseuse post-m~nopausique. A l'~chelon des groupes, l'ost~ocalcine mesur~e chez des femmes r~cemment
Pour CHIRON 104
se reporter
~ la 2 e d e c o u v e r t u r e
e t ~ la I re de g a r d e Revue fran~aise des laboratoires, avri11997, N ° 292
m~nopaus~es refl~te la perte osseuse mesur~e 2 ~ 4 ans plus tard par densitom~trie (1). La combinaison de plusieurs marqueurs (PYR et DPYR, hydroxyprolinurie, ost~ocalcine) permet une meilleure correlation avec la perte osseuse & 10 ans que les marqueurs pris individuellement. La combinaison de quatre marqueurs montre ~galement une valeur predictive sur la perte osseuse 12 ans apr~s la m~nopause (11). La meilleure connaissance des coefficients de variation & long terme des marqueurs (variabilit~ chez un m~me individu des marqueurs mesur~s diff~rents jours dans des conditions identiques) permet d'esp~rer classer le type de turn over (haut, normal ou bas) avec une relative s~curit~ ~ l'~chelon individuel. Les marqueurs sanguins de formation ont un coefficient de variation long terme de 11 & 15 %, les marqueurs urinaires de r6sorption de 25 & 30 %. Une 6tude lyonnaise (OFELY) a permis de v6rifier au temps 0 et 2 ans plus tard, l'existence de changement de classification chez seulement 11 & 2 1 % des patients en fonction des marqueurs retenus et du d61ai de suivi, ce qui laisse esp~rer une utilisation potentielle des marqueurs & l'~chelon individuel.
3. Marqueurs, facteurs pr~dictifs de masse osseuse et de fracture Plusieurs ~tudes confirment l'absence de correlation avec la masse osseuse, confirmant que les marqueurs ne peuvent se substituer ~ la mesure de masse osseuse. Ainsi, une masse osseuse normale ~ ]a m~nopause avec un turn over ~lev~ conduira ~ un seuil critique de masse osseuse avec la m~me rapidit~ qu'une masse osseuse basse avec un turn over bas. En revanche, les marqueurs ont montr~ leur efficacit~ pour pr~dire la fracture du col du f~mur (~tude EPIDOS multicentrique frangaise). Dans cette ~tude prospective, une augmentation de l'excr~tion urinaire de C-t~lopeptide (Cross-Laps) est un facteur de risque de fracture du col du f~mur ind~pendant, au re@me titre que la mesure par ultrasons et que la mesure de la masse osseuse du f~mur. L'association de ces trois param~tres augmente la pr~diction de fracture du col du f~mur. De plus, cette ~tude a permis de d~montrer la persistance d'un haut turn over m~me tr~s distance de la m~nopause (femmes de 81 ans d'Sge moyen), mis en ~vidence par les dosages de t~Iopeptides (NTX, CrossLaps) et de DPYR fibre (p < 0,001 compares aux taux pr~m~nopausiques). L'ost~ocalcine d~carboxyl~e pr~dit ~galement la fracture du col ind~pendamment de la masse osseuse.
4. Int~r~t dans la prise en charge des th~rapeutiques Les marqueurs diminuent rapidement apr~s administration de substances antir~sorptives (pourcentages de changement des marqueurs corr~l~s au changement de la masse osseuse ~ 24 mois) avec, pour les marqueurs de r~sorption, une diminution plus importante des formes peptidiques de cross links (10). Cependant, le taux des marqueurs avant traitement n'est pas pr~dictif de la r~ponse de la masse osseuse ni pour les bisphosphonates, ni pour les oestrog~nes, lls seraient donc utiles, surtout pour juger de la compliance e t / o u de l'efficacit~ des patients. Dans une ~tude portant sur un traitement par calcitonine, il a toutefois ~t~ mis en ~vidence une augmentation plus importante de la masse osseuse quand les marqueurs sont plus ~lev~s avant traitement (2). Compte tenu du coefficient de variation ~ long terme, important surtout pour les marqueurs urinaires, il faut utiliser les marqueurs les plus sensibles dans une situation clinique donn~e (les t~Iopeptides semblent plus sensibles sous bisphosphonates et cestrog~nes) pour s'approcher d'une diminution du double du coefficient de variation ~ long terme. Ainsi, pour les marqueurs urinaires, il est admis qu'une diminution de 50 % peut seule permettre de conclure ~ une diminution du turn over. L'information apport~e par le marqueur sera d'autant plus sensible que le traitement antir~sorptif est efficace. Pour exemple, en post-m~nopause pr~coce, le dosage de t~Iopeptide N-terminal (NTX) entre les valeurs de base et celles & 5 semaines de traitement montre une diminution moyenne d ' 1 % avec du calcium, de 19 % avec de la calcitonine, de 30 % avec les oestrog~nes. La diminution est de 40 % avec ]es oestrog~nes instaur~s dans une ost~oporose averse, et de 60 % avec les bisphosphonates. On voit donc qu'~ l'~chelon individuel, une variation de
P o u r C H I R O N se r e p o r t e r Revue frangaise des laboratoires, avri11997, N ° 292
ce marqueur est moins informative pour les o~strog~nes que pour les bisphosphonates.
Conclusion La DPYR, agent de pontage des mol~cules de collag~nes de type I, est actuellement un des marqueurs de la r~sorption osseuse les plus sensibles. Des dosages simples permettent son utilisation en routine pour la prise en charge des pathologies osseuses. L'association du dosage DPYR et d'un marqueur de la formation osseuse (ost~ocalcine, phosphatase alcaline osseuse) permet une meilleure approche des m~canismes physiopathologiques. Des ~tudes r~centes sugg~rent que la mesure des formes fibres de DPYR est moins sensible que celles de formes totales pour l'appr~ciation des variations du remodelage osseux. BIBLIOGRAPHIE 1. CHRISTIANSEN C., RIIS B.J., ROBRO P. - Prediction of rapid bone loss in postmenopausal women. Lancet, 1987, 1105-1108. 2. CIVITELLI R., GONNELLI S., ZACCHEI F., BIGAZZI S., VATTIMO A., AVIOLI L., GENNARI C. - Bone turnover in postmenopausal osteoporosis. Effect of calcitonin treatment. J. Clin. Invest., 1988, 8 2 : 1268-1274. 3. CORMIER C., SOUBERBIELLE J.C., KINDERMANS C., MENKES C.J., S A C H S C. - Les marqueurs osseux. Immunol. Ann. Biol. Spec., 1993, 8 : 348-354. 4. DE VERNEJOUL M.C., MARIE P. - Cellules osseuses et remodelage osseux. Medecine Sciences, 1993, 9 : 1192-1203. 5. EASTELL R., ROBINS S.P., COLWELL T., ASSIRI A.M.A., RIGGS B.L., RUSSEL R.G.G. -Evaluation of bone turnover in type I of osteoporosis using biochemical markers specific for both bone formation and bone resorption. Osteoporosis Int. 1993, 3 : 255-260. 6. EYRE D.R., PAZ M.A., GALOP P.M. - Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem., 1984, 5 3 : 717-748. 7. GARNERO P., GINEYTS E., A R B A U L T P., CHRISTIANSEN C., DELMAS P . - Differents effects of bisphosphonate and estrogen therapy on peptide-bound bone crosslink excretion. J. Bone Miner. Res. 1995, 1 0 : 641-649. 8. GARNERO P., SORNAY-RENDU E., CHAPUIS M.C., DELMAS P.D. -Increased bone turn over in late post menopausal women is a major determinant bf osteoporosis. J. Bone Miner. Res., 1996, I I : 337-349. 9. GARNERO P , V A S S Y V., BERTHOLIN A., RIOU J.P., DELMAS P. - Markers of bone turnover in hyperthyroidism and the effect of treatment. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1994, 7 8 : 955-959. 10. GARNERO P., WEICHUNG J., SHIH, GINEYTS E., KARPF D.B., DELMAS P. - Comparison of new biochemical markers of bone turnover in late postmenopausal osteoporotic women in response to alendronate treatment. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1994, 7 9 : 1693. 11. H A N S E N M.A., KIRSTEN 0., RIIS B.J., CHRISTIANSEN C. Role of peak bone mass and bone loss in post menopausal osteoporosis : a 12 year study. Brit. Med. J., 1991, 3 0 3 : 961-964. 12. KAMEL S., BRAZIER M., DESMET G., PICARD C., MENNECIER I., SEBERT J.L. - High performance liquid chromatographic determination of 3-hydroxypyridinium derivatives as new markers of bone resorption. J. Chromatogr., 1992, 5 7 4 : 255-260. 13. L A S T J.A., A R M S T R O N G L.G., REISER K.M. - Biosynthesis of collagen crosslinks. Int. J. Biochem., 1990, 2 2 : 559-564. 14. PROCKOP D.J., KIVIRIKKO K.I., TUDERMAN L., GUZMAN N.A. - The biosynthesis of collagen and its disorders. N. Engl. J. Med., 1979, 3 0 1 : 13-23 & 77-85. 15. RANDALL A.G., KENT G.N., GARCIA-WEBB P., B H A G A T C.I., PEARCE D.J., GUTTERIDGE D.H., PRINCE R.L., S T E W A R T G., S T U C K E Y B., WILL R.K., RETALLACK R.W., PRICE R.I., WARD L. - Comparison of biochemical markers of bone turnover in paget disease treated with pamidronate and a proposed model fo the relationships between measurements of the different forms of pyridinoline cross-links. J. Bone Miner. Res., 1996, II1 : 1176-1184. 16. ROBINS S.P., WOITGE H., H E S L E Y R., JU J., SEYEDIN S., SIEBEL M.J. - Direct enzyme-linked immunoassay for urinary deoxypyridinoline as a speficic marker for measuring bone resorption. J. Bone Miner. Res., 1994, 9 : 1643-1649. 17. SEIBEL M., GARTENBERG F., SILVERBERG S., RATCLIFFE A., ROBIN S., BILEZIKIAN J. - Urinary hydroxypyridinium crosslinks in primary hyperparathyroidism. J. Clin. Endocrinol. Metal)., 1992, 7 4 : 481-486.
la 2 e de c o u v e r t u r e e t
la I re de g a r d e 105
Mod6rateur : J. POLLET (Dourdan)
Avec la collaboration de CHIRON DIAGNOSTICS
I
La d6soxypyridinoline, marqueur de la r6sorption osseuse C. K I N D E R M A N S * C. CORMIER * * D. MARQUE *, C. SACHS et J.-Co S O U B E R B I E L L E *
Introduction L'ost6oporose, maladie diffuse du squelette caract&ris6e par une diminution de la masse osseuse et une augmentation du risque fracturaire, est un probl&me majeur de sant6 publique. Les marqueurs osseux sont des nouveaux outils biologiques permettant d'am61iorer la prise en charge de cette maladie, et leur d6veloppement est tout a fair d'actualit6 (3). En effet, dans des circonstances off les perturbations du remodelage osseux sont mod6r6es, les modifications des param~tres classiques du m6tabolisme phosphocalcique sont trop faibles pour 6tre utiles en pratique clinique. La biopsie osseuse qui donne des informations importantes est un examen invasif et ne peut pas @tre propos6e facilement. La mise au point de dosages de param&tres plus sensibles a permis, en association avec l'@aluation densitom6trique de la masse osseuse, de caract6riser plus pr6cis6ment certaines pathologies m6taboliques. Le tissu osseux est constitu6 d'une matrice inorganique (cristaux d'hydroxyapatite) et d'une matrice organique compos6e surtout de collag~ne de type I e t de prot6ines non collag6niques. Le marqueur osseux doit permettre de quantifier la formation et la d6gradation de la matrice osseuse. II s'agit soit de la mesure d'une activit6 enzymatique plus ou moins sp6cifique des ost6oblastes ou des ost6oclastes, soit de la mesure d'un constituant de la matrice relargu6 dans la circulation Iors de la formation ou de la d6gradation osseuse. Les diff6rents marqueurs osseux (tableau I) ont des sp6cificit6s et des sensibilit6s variables suivant les situations 6tudi6es, lls ont chacun des avantages et des inconv6nients. Certains sont en cours d'6valuation. La d6soxypyridinoline (DPYR), agent de pontage des mol6cules de collag~ne de type I, est un marqueur du remodelage osseux et plus particuli&rement de la r6sorption osseuse.
I, Cellules osseuseset remodelage osseux L'os est compos6 (poids sec) & 70 % de min6ral sous forme de cristaux d'hydroxyapatite (Cal0(P04)6(OH)2). Les 30 % restant correspondent a une matrice organique dont les 9 / 1 0 sont constitu6s de collag~ne de type I e t d'une faible proportion de prot6ines non collag6niques (ost6ocalcine entre autres). Le dernier 1 / 1 0 correspond ~ des cellules sp6cifiques. Le squelette est TABLEAU I Les marqueurs osseux Formation
R6sorption
Non collag6niques Phosphatases alcalines Phosphatase acide tartrate totales (ALP) r6sistante (TRAP) Phosphatase alcaline osseuse (BAL) Ost6ocalcine (OC) Collag6niques Peptide d'extension C terminal Hydroxyproline du procollag~ne I (PICP) Pyridinoline (PYR) D6soxypyridinoline (DPYR) Cross-Laps Peptide d'extension N terminal NTX du procollag~ne I (PINP) Telopeptide C-terminal du collag~ne ! (ICTP)
Pour CHIRON 102
se r e p o r t e r
P. FROTTE
*
constitu6 de 90 % d'os cortical, ou compact, et de 10 % d'os trab6culaire ou spongieux. Dans cet os spongieux, Iocalis6 uniquement dans les m6taphyses des os longs e t ~ la partie centrale des os plats, la matrice osseuse est arrang@ en trav@s microsco~ piques connect@s entre elles et ne repr6sente que 20 % du tissu, le reste 6tant constitu6 par le tissu h6matopoi6tique. L'os est un tissu en continuel renouvellement. II est constitu6 d'unit6s fonctionnelles de remodelage (BMU = "bone modeling units" ou "bone multicellular units") ind6pendantes les unes des autres. A l'6tat "normal", 90 % de la surface osseuse est inactive. Le processus de remodelage est initi6 par des signaux hormonaux et physiques qui permettent le recrutement dans la moelle osseuse de cellules appel6es pr6ost6oclastes et d6riv6es de cellules peu diff6renci6es, les CFU ("colony forming units"). Ces pr6ost6oclastes migrent vers la surface osseuse off elles fusionnent et deviennent des grosses cellules multinuc166es, les ost6oclastes. L'ost6oclaste poss~de l'int6grine, mol6cule ayant la possibilit6 de lier certaines prot6ines incorpor6es dans la matrice osseuse (comme l'ost6opontine). Cette phase d'attachement est n6cessaire. L'ost6oclaste va ensuite cr6er un micro environnement acide et lib6rer des enzymes qui vont d6truire la matrice. C'est la phase de r6sorption. II va en r6sulter une cavit6 dont la profondeur est d'environ 60 lJm. Le taux de calcium dans le milieu p6riost6oclastique sera un signal d'arr~t du processus de destruction osseuse entra~nant la r6traction de l'ost6oclaste. La formation osseuse va ensuite d6buter par la fabrication locale de m6diateurs chimiques qui vont attirer dans la cavit6 des cellules appel@s pr6ost6oblastes. Ce ph6nom~ne est la phase d'ir~/ersion. Ces cellules vont devenir des ost6oblastes matures qui v0nt s6cr6ter une nouvelle matrice de collag&ne afin de remplacer l'os manquant. Cette fabrication est tout d'abord rapide puisqt~e cette nouvelle matrice non min~ralis6e (appel6e ost6o'fde) atteindra une 6paisseur de 20 lam en I mois. A c e point, la min6ralisation commence. Le cycle r6sorption-formation sera termin6 en 3 mois environ (4). Toutefois, si ce processus 6tait totalement efficace, on ne perdrait jamais d'os : chaque BMU remplacerait int6gralement l'os d6truit initialement. Ce n'est pas tout ~ far le cas et un infime d6ficit osseux persiste apr~s chaque cycle, sauf pendant la croissance. Les BMU de l'os trab6culaire subissent plus fr6quemment le processus de remodelage que celles de l'os cortical en raison de la plus grande surface de contact entre les cellules et le tissu h6matopoi6tique dans ce type d'os. On admet que chaque ann6e un adulte renouvelle 25 % de son os trab6culaire et seulement 4 % de son os cortical.
2. M6tabolismedu collag6ne de type I Le r6le d'une matrice extracellulaire est de soutenir et relier entre elles des cellules et de donner sa structure ~ un tissu. Chez l'homme, les deux constituants majeurs des matrices extracellulaires sont d'une part de grosses prot6ines fibrillaires, les collag~nes, et d'autre part des agr6gats de prot6ines et d'hydrates de carbone, les prot6oglycans. Nous avons d6j~ vu que le constituant principal, non min6ral, de la matrice osseuse 6tait le colla-
* Laboratoire d'explorations fonctionnelles H6pital Necker-Enfants Malades 149, rue de S~vres - 75743 PARIS CEDEX 15 ** Service de rhumatologie - H6pital Cochin 27, rue du Fg Saint-Jacques - 75679 PARIS CEDEX 14
~ la 2" de c o u v e r t u r e
e t ~ la I r" de g a r d e Revue frangaise des laboratoires, avri11997, N ° 292
g@ne de type I. On donne le nom global de collag@ne ~ une famille de prot@ines ayant en commun une structure particuli@re appel@e triple h@lice polypeptidique et dans laquelle on peut observer une r@p@tition de la s@quence suivante : (GIy-X-Y)n o0 X et Y peuvent ~tre n'importe quel acide amin@ (14). Toutefois, certaines mol@cules de l'organisme ont cette particularit@, sans pr@senter le crit@re fonctionnel de soutien des tissus (fraction C l q du compl@ment ; ac@tylcholinest@rase). Le collag@ne de type Iest la plus abondante des prot@ines chez l'homme (2 & 3 kg) et il est Iocalis@ & plus de 90 % dans l'os. II est constitu@ de deux cha~nes peptidiques identiques (cd) et d'une cha~ne diff@rente mais homoIogue (~ 2). II est fabriqu@ par les ost@oblastes. Le g~ne codant pour les chaines cd est Iocalis@ sur le chromosome 17, celui codant pour la chaine cc 2, sur le chromosome 7. lls sont cependant tr@s @troitement co-r@[email protected] diff@rentes chatnes procollag@niques sont transport@es dans le r@ticulum endoplasmique ot~ elles subissent des transformations sous l'influence d'enzymes sp@cifiques. Au moins 20 % des acides amin@s pr@sents dans le peptide initial sont transform@s par des processus enzymatiques dont le principal est la transformation de la proline en hydroxyproline sans laquelle le collag@ne ne peut pas apparaRre sous la forme d'une triple h@lice. Un autre ph@nom@ne important est l'hydroxylation de certains r@sidus lysine en hydroxylysine n@cessaire & la formation de ponts entre diff@rentes mol@cules de collag@ne. Lorsque la structure en triple h@lice est form@e, la mol@cule de procollag@ne I est excr@t@e dans le liquide extracellulaire ofl elle est rapidement cliv@e d'abord & l'extr@mit@ N terminale puis C terminal par des enzymes sp@cifiques. Les peptides d'extension sont relargu@s dans la circulation dans un rapport stoichom@trique. Une portion du peptide Nest toutefois probablement r@incorpor@e dans la matrice (figure 1). Une lois lib@r@es de leurs peptides d'extension, les mol@cules de collag@ne de type I s'assemblent rapidement en fibres de collag~ne grace ~ diff@rentes r@actions chimiques. La premi@re @tape est enzymatique : la lysyloxydase catalyse l'oxydation des parties N des r@sidus lysine ou hydroxylysine pour former les ald@hydes correspondants. Les ald@hydes ainsi form@s peuvent interr@agir pour former des ponts, encore appel@s "cross-links", entre deux mol@cules de collag@ne. Dans l'os, les plus connus parmi ces agents de pontage sont la pyridinoline et d@soxypyridinoline qui sont caract@ris@es par une structure cyclique et la propri@t@ d'@mettre une fluorescence caract@ristique. Dans le collag&ne I, ces cross-links sont form@s 8 des endroits pr@f@rentiels. Le site principal est la petite pantie non h@lico'fdale situ@e aux deux extr@mit@s d'une mol@cule de collag@ne et aussi appel@e telopeptide. Ces telopeptides sont ainsi connect@s & certaines r@gions de la partie h@lico'fdale d'une mol@cule de collag@ne I voisine pour former les fibres de collag@ne (13). Lors de la r@sorption osseuse, le collag@ne I e s t d@grad@. La quantit@ de collag@ne d@grad@ par an est consid@rable chez tous les individus mais particuli@rement chez les enfants. La d@gradation enzymatique et chimique du collag@ne entra~ne la lib@ration dans la circulation de petits peptides et d'acides amin@s fibres qui sont partiellement @limin@s par les urines. Parmi ces produits de d@gradation, on retrouve la DPYR, soit sous forme fibre, soit sous forme conjugu@e & des peptides de poids mol@culaires variables.
FIGURE 1 Synth~se et d@gradation du collag@ne de type I Triple h@]ice de co]]ag@ne Procollag@ne
: telopeptides
Ost@oblaste pept~'de d'extension N-terminal
~eptide d'extension C-terminal
..... ZL~C\~2~'~2"~^~2/.~J~ ~ < " ~ .
~"~'
o o
Collag~ne de type I immature
Produits de d@gradation ducol]ag~ne d e t y p e l OPYR/PYR libres HYDROXYPROLINE Collag~ne de type I mature
Ga]. Hydroxylysine
=
cz~£~"~~ ' > ' > ~ ~ . i ~
PYR ouDPYR / /
©
r~sorption
,
_~ Telopeptides osseuse Peptldes (contenant ou non Dpyr/Pyr)
FIGURE 2 PYRIDINOLINES PYRIDINOLINE CROSSLINKS COLLAGEN PYRIDINIUM CROSSLINKS
(~H-COOH HO
~H-COOH
CHrCHrCH.COOH
HO
CHrCHyCH.COOH
~m H
H
~H, H
H
I
CHTCH-CH2-CHrCH-COOH NF½
CHr CHrCH I-CH2"CH'COOH NH2
3. D@soxypyridinoline • aspects m@taboliques Pyridinoline=PYR
La pyridinoline (PYR) et la d@soxypyridinoline (DPYR) sont des mol@cules de pontage (crosslinks) qui r@sultent de la condensation de quatre r@sidus lysyl ou hydroxylysyl. Elles stabilisent les fibres de collag@ne de type I au sein de la matrice extra cellulaire. 1. M@tabolisme des pyridinolines
Au stade m@tabolique de la maturation du collag@ne, des liaisons intra puis inter mol@culaires r@alisant des "pontages" intra et/ou inter cha~nes vont assurer l'assemblage des fibres pour former le collag@ne mature. Avec une lysine d'une cha~ne cq il se forme, apr~s transposition d'Amadori, une lysine-5-c@tonorleucine, et avec une hydroxylysine se forme une hydroxylysine5-c@tonorleucine tr@s stables. Deux c@toamines de pontage vont interagir pour former une mol@cule de pontage trivalente de 3hydroxypyridinium reliant ainsi trois cha~nes cc formant l'hydroxylysylpyridinoline (la pyrid~noline) et/ou la lysylpyridino-
P o u r C H I R O N se r e p o r t e r Revue frangaise des laboratoires, avril 1997, N ° 292
De~oxy p y r i d i n
o l i n e = O - P YR
line (la d@soxypyridinoline) (figure 2). Ces mol@cules ont @t@ identifi@es dans les tissus conjonctifs et dans l'os gr&ce & leur fluorescence naturelle. Si PYR a @t@mise en @vidence dans l'os, la dentine, le cartilage et les tendons, DPYR a @t@ retrouv@e essentiellement dans le tissu osseux et la dentine (6). DPYR repr@sente 2 1 % des mol@cules de pontage du collag@ne mature et 0,1 mole par mole de collag@ne dans l'os humain adulte soit de l'ordre de 10 millimoles de DPYR pour 0,17 gramme d'os hydrat@ min@ralis@. Lors de la r@sorption osseuse, le collag@ne est d@grad@, PYR et DPYR sont relargu@es dans la circulation, mol@cules stables et non m@tabolis@es elles sont excr@t@es dans les urines. M@me si DPYR est pr@sente dans l'alimentation, elle ne serait pas absorb@e et il n'y aurait aucune contribution alimentaire dans l'excr@tion urinaire de DPYR m@me apr@s ingestion orale de g@latine.
la 2 ° de c o u v e r t u r e e t
la I re de g a r d e 103
2. Distribution des formes de d6soxypyridinoline dans les urines DPYR est excr~t~e dans les urines, & la fois sous forme libre et conjugu~e & des peptides de masse mol~culaire variable. Le rapport entre ces diff~rentes formes est constant chez l'adulte sain. Formes libres : 38 % Formes peptidiques 550-1000 D : 40 % Formes peptidiques 1000-3500 D : 15 % Formes peptidiques > 3500 D : 7 %
4. Dosages de la d~soxypyridinoline urinaire Les dosages peuvent ~tre effectu~s sur les urines de 24 heures ou sur la deuxi~me miction du matin & jeun. Les formes totales e t / o u fibres de DPYR peuvent @tre mesur~es en effectuant ou non une ~tape d'hydrolyse pr~alable.
1. CLHP Le dosage de DPYR totale est r~alis~ apr~s hydrolyse. Un ml d'urine est hydrolys~ par un volume ~gal de HCI 12N, une nuit 110 °C. Apr~s centrifugation, l'hydrolysat surnageant est purifi~ par chromatographie sur colonne de CF-1 cellulose, rinc~ par un m~lange de l-butanol-acide ac~tique-eau (4:1:1 ; v/v/v). Les pyridinolines sont ~lu~es par 10 ml d'eau, puis lyophilis~es et reprises par 200 I~I de phase mobile : solution aqueuse d'acide hepta fluorobutyrique 0,01 M e t d'ac~tonitrile (87:13 ; v/v). La s~paration chromatographique de PYR et DPYR est r~alis~e sur une colonne en phase inverse C18 (Spherisorb ODS2, 51~m - 25 cm x 4,6 mm). L'~lution par la phase mobile est effectu~e & un d~bit de 1,3 ml/min et la d~tection fluorim~trique (FL 200) A une Iongueur d'excitation de 296 nm et d'~mission de 392 nm. Les concentrations de DPYR sont calcul~es par comparaison & une gamme de standards pr~par~s dans notre laboratoire & partir d'un hydrolysat d'os humain d~min~ralis~ et ~talonn~ par M. BRAZIER (Laboratoire de pharmacie clinique, Amiens (12). L'~tude de la precision de la m~thode comprenant toutes les ~tapes d'hydrolyse, d'extraction et de dosage chromatographique montre des coefficients de variation inter-essais de 8,5 % et intra-essai de 3,5 %. Les pourcentages de r~cup~ration d'une surcharge sont compris entre 91 et 1 0 1 % .
2. ELISA : Pyrilinks®-D Ce coffret permet de mesurer directement DPYR libre. DPYR totale pourra ~tre dos~e apr~s hydrolyse en utilisant le protocole suivant : 200 I~I d'urines sont hydrolysis par un volume ~gal de HCI 12N, de 18 ~ 24 heures & 110 °C puis l'hydrolysat est neutralis~ par de la NaOH 1N en r~alisant une dilution 1,5. Ce test Pyrilinks®-D Elisa, est un dosage immunoenzymatique, d~velopp~ par la soci~t~ Metra Biosystems, utilisant un anticorps monoclonal anti-DPYR fix~ sur la microplaque. DPYR de l'~chantillon urinaire entre en competition avec le conjugu~ marqu~ & la phosphatase alcaline vis-a-vis de l'anticorps. La r~action est mise en ~vidence gr&ce au substrat p-nitroph~nylphosphate, la mesure de la densit~ optique est r~alis~e 405 nm (16). Le coefficient de variation inter-essai a ~t~ ~valu~ 9 %. Apr~s dilutions d'~chantillons de DPYR, le pourcentage de r~cup~ration est de l'ordre de 97 %.
3. Pyrilinks®-D : RIA Ce coffret permet de mesurer directement DPYR libre. DPYR totale pourra @tre dos~e apr~s hydrolyse en utilisant le protocole precedent. Pyrilinks®-D RIA est un dosage radioimmunologique par competition d~velopp~ par la soci~t~ Metra Biosystems, utilisant un anticorps monoclonal anti-DPYR fix~ sur des tubes de polystyrene, le traceur est marqu~ & l'iode 125. Actuellement nous ~valuons ce dosage. Nos r~sultats pr~liminaires montrent des coefficients de variation intra-essai de 3,5 % et les valeurs de DPYR totales urinaires mesur~es par Pyrilinks®-D RIA et par CLHP sont tr~s ~troitement corr~l~es : r = 0,990 p = 0,0001.
sant un anticorps monoclonal anti-DPYR ; la phase solide est constitute de particules paramagn~tiques. Cette technique automatis~e mesure directement DPYR libre, une ~tape manuelle pr~alable adapt~e devrait permettre le dosage de la DPYR totale. QueUes que soient les m~thodes, les r~sultats sont le plus souvent exprim~s par rapport & la cr~atininurie en nmol de DPYR/mmol cr~atinine. Des variations circadiennes ont ~t~ observ~es avec un pic le matin (entre 5 h et 8 h). Les valeurs usuelles en HPLC : femmes 25 - 45 ans (non m~nopaus~es) - - > 3,2 - 8,6 nmol/mmol cr~atinine hommes 25 - 55 ans - - > 2,3 - 6,7 nmol/mmol cr~atinine La quantit~ de DPYR excr~t~e chez l'enfant est de 10 & 15 fois sup~rieure & ce que l'on observe chez l'adulte. La m~thode en CLHP est Iongue et difficilement applicable en routine. Ces m~thodes de dosages immunoenzymatiques~ radioimmunologiques manuelles ou automatis~es, par leur rapidit~, sont une alternative int~ressante pour la mesure de l'excr~tion urinaire de DPYR pour le diagnostic et le suivi th~rapeutique de la r~sorption osseuse.
5. Utilisationde la d(~oxypyridinoline en pratique clinique 1. Comprehension physiopathologique L'utilisation des marqueurs osseux permet de juger de l'importance des ph~nom~nes de r~sorption et de formation dans des situations cliniques vari~es. Ainsi dans l'hyperthyro'fdie, on constate une augmentation de la DPYR bien corr~l~e au taux de T3 (9). De m~me, apr~s parathyro'fdectomie pour hyperparathyro'fdie primaire, les concentrations de DPYR, initialement ~lev~es, se normalisent, t~moignant d'un retour & un remodelage osseux normal (17). On constate ~galement une augmentation en post-m~nopause (de 50 & 100 % pour la DPYR) avec retour & la norme sous traitement cestrog~nique. Cette augmentation du turn over expose & une perte osseuse. II existe, & la m~nopause, une variabilit~ individuelle de la perte osseuse allant.de moins de 1 % & plus de 6 % par an. Les femmes ayar~t une perte rapide (fast losers) auraient un risque accru de fracture par rapport & celles ayant une perte osseuse lente (slow losers). Le d~lai par rapport & la m~nopause est prendre en compte, le maximum de perte osseuse se situant dans les 3 A 5 ans apr~s la m~nopause. Cependant, m~me 10 ans apr~s la m~nopause, les marqueurs de formation (OC, BAL) et de r~sorption (NTX, Cross-Laps) restent tr~s diff~rents des valeurs pr~-m~nopausiques sugg~rant la persistance d'un haut remodelage (8). La comparaison de marqueurs du remodelage d'une population post-m~nopausique sans ost~oporose et d'une population pr~sentant une ost~oporose montre des taux de marqueurs de formation et de r~sorption (DPYR) significativement plus ~lev~s dans la population ost~oporotique sugg~rant qu'un haut turn over expose plus des fractures (5). Les immunodosages de DPYR fibre sont bien corr~l~s avec les mesures p a r HPLC. II existe cependant une correlation n~gative entre le pourcentage de DPYR libre et l'excr~tion de DPYR totale (7). Sous traitement antir~sorptif, la diminution des formes peptidiques de PYR et de DPYR (appr~ci~e par les dosages urinaires de NTX et Cross-Laps) est plus importante que celle des formes fibres entra~nant donc une augmentation du pourcentage DPYR libre/DPYR totale. Ceci permet de mettre l'accent sur la difference entre l'acc~s & la mesure th~oriquement la plus proche de la r~sorption r~elle (DPYR totale) et l'utilisation de marqueurs apparemment plus sensibles mais surestimant peut-~tre, l'intensit~ de l'activit~ de r~sorption (15).
4. Test D P D ACS : 1 8 0
2. Marqueurs osseux pr6dictifs d'une perte osseuse ult6rieure
C'est une technique de dosage en chimiluminescence utilisant une r~action immunologique par competition d~velopp~e par la soci~t~ Chiron Diagnostics sous licence Metra Biosystems, utili-
Nous avons vu, plus haut, que les femmes ne sont pas ~gales devant la perte osseuse post-m~nopausique. A l'~chelon des groupes, l'ost~ocalcine mesur~e chez des femmes r~cemment
Pour CHIRON 104
se reporter
~ la 2 e d e c o u v e r t u r e
e t ~ la I re de g a r d e Revue fran~aise des laboratoires, avri11997, N ° 292
m~nopaus~es refl~te la perte osseuse mesur~e 2 ~ 4 ans plus tard par densitom~trie (1). La combinaison de plusieurs marqueurs (PYR et DPYR, hydroxyprolinurie, ost~ocalcine) permet une meilleure correlation avec la perte osseuse & 10 ans que les marqueurs pris individuellement. La combinaison de quatre marqueurs montre ~galement une valeur predictive sur la perte osseuse 12 ans apr~s la m~nopause (11). La meilleure connaissance des coefficients de variation & long terme des marqueurs (variabilit~ chez un m~me individu des marqueurs mesur~s diff~rents jours dans des conditions identiques) permet d'esp~rer classer le type de turn over (haut, normal ou bas) avec une relative s~curit~ ~ l'~chelon individuel. Les marqueurs sanguins de formation ont un coefficient de variation long terme de 11 & 15 %, les marqueurs urinaires de r6sorption de 25 & 30 %. Une 6tude lyonnaise (OFELY) a permis de v6rifier au temps 0 et 2 ans plus tard, l'existence de changement de classification chez seulement 11 & 2 1 % des patients en fonction des marqueurs retenus et du d61ai de suivi, ce qui laisse esp~rer une utilisation potentielle des marqueurs & l'~chelon individuel.
3. Marqueurs, facteurs pr~dictifs de masse osseuse et de fracture Plusieurs ~tudes confirment l'absence de correlation avec la masse osseuse, confirmant que les marqueurs ne peuvent se substituer ~ la mesure de masse osseuse. Ainsi, une masse osseuse normale ~ ]a m~nopause avec un turn over ~lev~ conduira ~ un seuil critique de masse osseuse avec la m~me rapidit~ qu'une masse osseuse basse avec un turn over bas. En revanche, les marqueurs ont montr~ leur efficacit~ pour pr~dire la fracture du col du f~mur (~tude EPIDOS multicentrique frangaise). Dans cette ~tude prospective, une augmentation de l'excr~tion urinaire de C-t~lopeptide (Cross-Laps) est un facteur de risque de fracture du col du f~mur ind~pendant, au re@me titre que la mesure par ultrasons et que la mesure de la masse osseuse du f~mur. L'association de ces trois param~tres augmente la pr~diction de fracture du col du f~mur. De plus, cette ~tude a permis de d~montrer la persistance d'un haut turn over m~me tr~s distance de la m~nopause (femmes de 81 ans d'Sge moyen), mis en ~vidence par les dosages de t~Iopeptides (NTX, CrossLaps) et de DPYR fibre (p < 0,001 compares aux taux pr~m~nopausiques). L'ost~ocalcine d~carboxyl~e pr~dit ~galement la fracture du col ind~pendamment de la masse osseuse.
4. Int~r~t dans la prise en charge des th~rapeutiques Les marqueurs diminuent rapidement apr~s administration de substances antir~sorptives (pourcentages de changement des marqueurs corr~l~s au changement de la masse osseuse ~ 24 mois) avec, pour les marqueurs de r~sorption, une diminution plus importante des formes peptidiques de cross links (10). Cependant, le taux des marqueurs avant traitement n'est pas pr~dictif de la r~ponse de la masse osseuse ni pour les bisphosphonates, ni pour les oestrog~nes, lls seraient donc utiles, surtout pour juger de la compliance e t / o u de l'efficacit~ des patients. Dans une ~tude portant sur un traitement par calcitonine, il a toutefois ~t~ mis en ~vidence une augmentation plus importante de la masse osseuse quand les marqueurs sont plus ~lev~s avant traitement (2). Compte tenu du coefficient de variation ~ long terme, important surtout pour les marqueurs urinaires, il faut utiliser les marqueurs les plus sensibles dans une situation clinique donn~e (les t~Iopeptides semblent plus sensibles sous bisphosphonates et cestrog~nes) pour s'approcher d'une diminution du double du coefficient de variation ~ long terme. Ainsi, pour les marqueurs urinaires, il est admis qu'une diminution de 50 % peut seule permettre de conclure ~ une diminution du turn over. L'information apport~e par le marqueur sera d'autant plus sensible que le traitement antir~sorptif est efficace. Pour exemple, en post-m~nopause pr~coce, le dosage de t~Iopeptide N-terminal (NTX) entre les valeurs de base et celles & 5 semaines de traitement montre une diminution moyenne d ' 1 % avec du calcium, de 19 % avec de la calcitonine, de 30 % avec les oestrog~nes. La diminution est de 40 % avec ]es oestrog~nes instaur~s dans une ost~oporose averse, et de 60 % avec les bisphosphonates. On voit donc qu'~ l'~chelon individuel, une variation de
P o u r C H I R O N se r e p o r t e r Revue frangaise des laboratoires, avri11997, N ° 292
ce marqueur est moins informative pour les o~strog~nes que pour les bisphosphonates.
Conclusion La DPYR, agent de pontage des mol~cules de collag~nes de type I, est actuellement un des marqueurs de la r~sorption osseuse les plus sensibles. Des dosages simples permettent son utilisation en routine pour la prise en charge des pathologies osseuses. L'association du dosage DPYR et d'un marqueur de la formation osseuse (ost~ocalcine, phosphatase alcaline osseuse) permet une meilleure approche des m~canismes physiopathologiques. Des ~tudes r~centes sugg~rent que la mesure des formes fibres de DPYR est moins sensible que celles de formes totales pour l'appr~ciation des variations du remodelage osseux. BIBLIOGRAPHIE 1. CHRISTIANSEN C., RIIS B.J., ROBRO P. - Prediction of rapid bone loss in postmenopausal women. Lancet, 1987, 1105-1108. 2. CIVITELLI R., GONNELLI S., ZACCHEI F., BIGAZZI S., VATTIMO A., AVIOLI L., GENNARI C. - Bone turnover in postmenopausal osteoporosis. Effect of calcitonin treatment. J. Clin. Invest., 1988, 8 2 : 1268-1274. 3. CORMIER C., SOUBERBIELLE J.C., KINDERMANS C., MENKES C.J., S A C H S C. - Les marqueurs osseux. Immunol. Ann. Biol. Spec., 1993, 8 : 348-354. 4. DE VERNEJOUL M.C., MARIE P. - Cellules osseuses et remodelage osseux. Medecine Sciences, 1993, 9 : 1192-1203. 5. EASTELL R., ROBINS S.P., COLWELL T., ASSIRI A.M.A., RIGGS B.L., RUSSEL R.G.G. -Evaluation of bone turnover in type I of osteoporosis using biochemical markers specific for both bone formation and bone resorption. Osteoporosis Int. 1993, 3 : 255-260. 6. EYRE D.R., PAZ M.A., GALOP P.M. - Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem., 1984, 5 3 : 717-748. 7. GARNERO P., GINEYTS E., A R B A U L T P., CHRISTIANSEN C., DELMAS P . - Differents effects of bisphosphonate and estrogen therapy on peptide-bound bone crosslink excretion. J. Bone Miner. Res. 1995, 1 0 : 641-649. 8. GARNERO P., SORNAY-RENDU E., CHAPUIS M.C., DELMAS P.D. -Increased bone turn over in late post menopausal women is a major determinant bf osteoporosis. J. Bone Miner. Res., 1996, I I : 337-349. 9. GARNERO P , V A S S Y V., BERTHOLIN A., RIOU J.P., DELMAS P. - Markers of bone turnover in hyperthyroidism and the effect of treatment. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1994, 7 8 : 955-959. 10. GARNERO P., WEICHUNG J., SHIH, GINEYTS E., KARPF D.B., DELMAS P. - Comparison of new biochemical markers of bone turnover in late postmenopausal osteoporotic women in response to alendronate treatment. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1994, 7 9 : 1693. 11. H A N S E N M.A., KIRSTEN 0., RIIS B.J., CHRISTIANSEN C. Role of peak bone mass and bone loss in post menopausal osteoporosis : a 12 year study. Brit. Med. J., 1991, 3 0 3 : 961-964. 12. KAMEL S., BRAZIER M., DESMET G., PICARD C., MENNECIER I., SEBERT J.L. - High performance liquid chromatographic determination of 3-hydroxypyridinium derivatives as new markers of bone resorption. J. Chromatogr., 1992, 5 7 4 : 255-260. 13. L A S T J.A., A R M S T R O N G L.G., REISER K.M. - Biosynthesis of collagen crosslinks. Int. J. Biochem., 1990, 2 2 : 559-564. 14. PROCKOP D.J., KIVIRIKKO K.I., TUDERMAN L., GUZMAN N.A. - The biosynthesis of collagen and its disorders. N. Engl. J. Med., 1979, 3 0 1 : 13-23 & 77-85. 15. RANDALL A.G., KENT G.N., GARCIA-WEBB P., B H A G A T C.I., PEARCE D.J., GUTTERIDGE D.H., PRINCE R.L., S T E W A R T G., S T U C K E Y B., WILL R.K., RETALLACK R.W., PRICE R.I., WARD L. - Comparison of biochemical markers of bone turnover in paget disease treated with pamidronate and a proposed model fo the relationships between measurements of the different forms of pyridinoline cross-links. J. Bone Miner. Res., 1996, II1 : 1176-1184. 16. ROBINS S.P., WOITGE H., H E S L E Y R., JU J., SEYEDIN S., SIEBEL M.J. - Direct enzyme-linked immunoassay for urinary deoxypyridinoline as a speficic marker for measuring bone resorption. J. Bone Miner. Res., 1994, 9 : 1643-1649. 17. SEIBEL M., GARTENBERG F., SILVERBERG S., RATCLIFFE A., ROBIN S., BILEZIKIAN J. - Urinary hydroxypyridinium crosslinks in primary hyperparathyroidism. J. Clin. Endocrinol. Metal)., 1992, 7 4 : 481-486.
la 2 e de c o u v e r t u r e e t
la I re de g a r d e 105