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L’assurance de qualité en coprologie fonctionnelle
© Masson, Paris, 2004
Ann Pharm Fr 2004, 62 : 376-381
Séance thématique Physiologie digestive et coprologie fonctionnelle
L’assurance de qualité en coprologie fonctionnelle L. Barbot, N. Kapel, J.-G. Gobert Résumé. Depuis 1994, la qualité dans les laboratoires de biologie médicale est définie par décret dans le Guide de Bonne Exécution des Analyses (GBEA). Les contraintes propres à la coprologie rendent difficiles l’application de certains points du GBEA. En particulier, aucun contrôle de qualité n’est disponible dans ce domaine. Or la matrice fécale est complexe, hétérogène et variable en fonction des pathologies, des interventions chirurgicales, de l’alimentation et des thérapeutiques. Les contrôles de qualité sériques du commerce ne permettent pas de mettre en évidence les interférences analytiques liées à un effet matrice. Ceci nous a conduit à développer notre propre contrôle de qualité à partir d’un mélange de selles de patients lyophilisées pour améliorer l’assurance de qualité de la phase analytique. Les techniques utilisées en coprologie sont manuelles ou semiautomatisées et impliquent une phase pré-analytique qui n’est pas toujours prise en compte par les contrôles de qualité. Une approche semi-quantitative par analyse microscopique des selles est donc couplée au dosage. Cela constitue un témoin interne pour chaque échantillon. La démarche qualité est poursuivie au niveau post-analytique : les analyses sont confrontées entre elles et remises dans le contexte clinique et thérapeutique du patient. La mise en œuvre de l’ensemble des outils décrits précédemment assure la fiabilité des résultats rendus et permet le suivi à long terme d’un patient.
Summary. Quality control in medical laboratories was defi-
Mots-clés : Coprologie, Assurance de qualité, GBEA, Contrôle de qualité, Lipides fécaux.
Quality control in coprology. L. Barbot, N. Kapel, J.-G. Gobert, Ann Pharm Fr 2004, 62: 376-381.
ned in guidelines for good execution of laboratory analyses issued by the French health authorities in 1994. Application of these guidelines is difficult in coprology because the sample is a complex heterogeneous matrix which varies with disease, surgery, food intake, and treatment. In addition, commercial quality control kits are not available for stool biochemical analyses and a national quality control program has not been established. We thus developed our own fecal quality control technique using pooling lyophylized stool samples. Manual or partially automated methods are used in coprology, leading to a long pre-analysis phase which is not always taken into account in quality control. This implies the need for complementary tools to insure the quality of coprology analyses. For example, semi-quantitative microscopic lipid analysis can be used as an internal standard for a given specimen. Quality assurance also involves a post-analytical phase where results obtained for a given specimen are compared with other available data and interpreted in light of the patient's clinical and therapeutic status. This quality assurance strategy enables accurate reliable results useful for long-term patient management.
Key-words: Coprology, Quality control, Quality assurance, Fecal lipids.
Laboratoire de coprologie fonctionnelle, GH Pitié-Salpêtrière, Bâtiment La Force — Division Vincent de Paul, 47-83, boulevard de l’Hôpital, F75652 Paris Cedex 13. Tirés à part : L. Barbot, à l’adresse ci-dessus. E-mail : [email protected]
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Assurance de qualité en coprologie
Introduction : la qualité dans un laboratoire de biologie médicale Si la démarche qualité dans un laboratoire de biologie médicale est ancienne, elle est aujourd’hui définie officiellement dans le Guide de Bonne Exécution des Analyses (GBEA — décret paru en 1994 [1]) qui fait de cette démarche une contrainte réglementaire opposable. Ce texte décrit les moyens matériels et humains dont doit disposer un laboratoire, et les responsabilités de chaque personnel. Il a fait l’objet de révisions en 1999 et en 2003 afin de lever les ambiguïtés d’interprétation et d’apporter des précisions dans des domaines particuliers tels que l’immuno-hématologie. Les laboratoires ont de tout temps rendu des résultats de qualité. Le GBEA apporte l’obligation de le prouver, ce qui nécessite de passer d’une culture traditionnellement orale à une culture écrite afin d’assurer une traçabilité de l’ensemble des actions réalisés sur les prélèvements depuis leur réalisation dans les services cliniques jusqu’au rendu des résultats.
Les contraintes propres à la coprologie Le GBEA s’applique à l’ensemble des laboratoires de biologie médicale publics et privés. Son application complète à la coprologie fonctionnelle est cependant rendue délicate du fait de contraintes spécifiques à cette discipline. Un dosage en biologie médicale implique l’utilisation d’un étalon et d’un contrôle de qualité. L’étalon correspond à la substance pure à doser et permet le calibrage de la méthode. Le contrôle de qualité est un spécimen qui contient la substance à doser dans un environnement et à une concentration aussi proches que possible de ceux des prélèvements provenant des patients. La première contrainte est liée à l’absence de contrôle de qualité fécal commercialisé et de procédure de contrôle national, pourtant décrits comme obligatoires dans le GBEA. Nous disposons d’étalons (substance azotée pure) et de contrôles commercialisés pour les dosages de sodium et de potassium (sérum). Cependant ces étalons et contrôles ne sont pas
disponibles pour tous les paramètres dosés ou recherchés au laboratoire ; ils ne sont pas dans les gammes de dosages du milieu fécal ; et enfin ils ne permettent pas de mettre en évidence un effet matrice et ne rendent pas compte de tous les événements qui ont lieu dans la lumière digestive, en particulier les phénomènes de digestion. Notre laboratoire a ainsi développé son propre contrôle de qualité fécal [2]. La seconde contrainte est inhérente au prélèvement fécal lui-même. Tout d’abord du point de vue pré-analytique : les analyses de coprologie fonctionnelle nécessitent le recueil de la totalité des selles émises sur 24, 48 ou 72 h Ceci est assez facile à vérifier au cours d’un entretien lorsque le patient se déplace au laboratoire, mais l’est plus difficilement en milieu hospitalier (plusieurs équipes sur 24 h, personnes différentes sur les trois jours…). Ensuite au plan analytique : le prélèvement fécal est par nature complexe, hétérogène et variable d’une personne à l’autre, et pour une même personne malade en fonction des traitements et chirurgies. Ceci ne permet pas l’utilisation des automates classiques de biochimie. Les dosages sont le plus souvent réalisés par des techniques manuelles ou semiautomatisées, dont la reproductibilité est moindre que celle des techniques automatisées (CV < 15 % versus CV < 5 %). Les fourchettes de normalité sont larges en comparaison de celles des paramètres sériques, mais bénéficient d’un consensus international.
Les outils du contrôle de qualité en coprologie La démarche qualité au laboratoire de coprologie nécessite l’utilisation combinée de plusieurs outils. L’association d’étalons ou de contrôles de qualité sériques commercialisés et du contrôle de qualité fécal pour chaque paramètre dosé permet de mettre en évidence un problème analytique liée à la méthodologie employée et/ou un effet matrice lié au prélèvement fécal. Le contrôle de qualité fécal produit au laboratoire, un lot permettant un suivi sur 18 à 24 mois, est réalisé à partir d’un mélange de selles de patients choisies selon des critères définis, lyophilisé, tamisé, aliquoté et conservé à la température
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L. Barbot et Coll. ambiante en flacons sertis sous vide. Ce contrôle est validé en réalisant 20 dosages (un par jour) de chaque paramètre : lipides, azote, sodium, potassium, chlore, alpha 1-antitrypsine. La fourchette de normalité est définie comme la moyenne ± 2 écart-types, et révisée après trois mois d’utilisation si nécessaire. Ces paramètres couvrent l’ensemble des phénomènes pathologiques étudiés : diarrhées de malabsorption ou de maldigestion, diarrhées hydriques et hydro-électrolytiques, exsudation protéique. Le lot actuellement en cours est le n° 29. Le suivi des contrôles et étalons commercialisés et du contrôle fécal implique trois niveaux d’interprétation. Dans un premier temps, le résultat obtenu pour un paramètre donné avec un contrôle/étalon donné est comparé à la fourchette de normalité. Dans un deuxième temps, nous comparons les résultats obtenus pour tous les paramètres dosés à partir d’un contrôle donné, afin de mettre en évidence une erreur de reconstitution du contrôle. Dans un troisième temps, nous comparons les résultats obtenus pour un paramètre donné à partir de plusieurs contrôles et/ou étalons, ce qui permet de détecter un problème dans le processus analytique. Prenons l’exemple du suivi des contrôles et étalons au cours du premier trimestre 2004. Trois paramètres du contrôle de qualité fécal sont abaissés dans la semaine du 9 au 13 février : lipides, sodium et potassium, ce qui fait suspecter une erreur de reconstitution du lyophilisat. En revanche, les résultats pour l’azote sont corrects. Si nous considérons les résultats obtenus dans cette période pour le sodium et le potassium pour le contrôle sérique commercialisé (PathonormTM H, référence 100705, Ingen), nous observons une diminution comparable à celle du contrôle fécal, ce qui suggère un problème analytique. L’association d’une erreur par défaut due au problème de reconstitution du lyophilisat fécal et d’une erreur par défaut due à un problème analytique explique la baisse très forte (hors des trois écarttypes) observée pour le potassium par rapport à celle observée pour les lipides (résultats bas mais restant dans la fourchette de normalité). De même, si nous considérons les résultats du 9 au 13 février pour le dosage de l’azote à partir de l’étalon (2,5-bis(5-ter-butyl-2-benzo-oxazol-2-yl)thiophène ou BBOT, référence 33835210, Thermo-
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Finnigan), nous observons une augmentation par rapport à la fourchette de normalité. Les résultats de l’azote à partir du contrôle fécal sont donc faussement normaux, conséquence de l’association d’une erreur par défaut suite au problème de reconstitution du lyophilisat fécal et d’une erreur par excès due à un problème analytique. Seule la confrontation des différents paramètres et des différents contrôles et étalons nous a permis de comprendre les problèmes rencontrés, de les résoudre et ainsi de rendre, bien qu’avec du retard, des résultats fiables. Le contrôle de qualité fécal a cependant des limites. Les fourchettes de normalité sont larges, à l’image des valeurs usuelles. Par ailleurs il ne rend pas compte de l’ensemble de la phase préanalytique (homogénéisation du prélèvement, pesée d’une prise d’essai, dilution…). Enfin, pour un dosage manuel individuel tel que celui des lipides, une erreur ponctuelle sur un échantillon ne peut être exclue. C’est pourquoi le contrôle de qualité fécal ne peut pas conduire à lui seul à la validation ou au refus de toute une série de dosages sans autre démarche. Nous avons ainsi développé des approches complémentaires dont un exemple sera donné à propos du dosage des lipides fécaux. De plus la cohérence du bilan coprologique est un élément essentiel de la validation biologique d’un dosage : un paramètre fécal n’a de sens que comparé aux autres paramètres, quantitatifs et qualitatifs, et remis dans le contexte clinique — thérapeutique, médical, chirurgical et nutritionnel — du patient.
La démarche qualité en coprologie appliquée au dosage des lipides fécaux Les lipides fécaux sont dosés par la technique de Van de Kamer [3] qui est la plus adaptée aux grandes séries. Ces lipides se trouvent sous des formes très diverses : libres, intracellulaires ou fixés par adsorption sur les celluloses ou d’autres supports inertes. Dans chaque fraction, il existe différents types de lipides dont les méthodes d’extraction et de dosage sont très variables : les triglycérides à chaînes longues et moyennes (graisses neutres alimentaires) et les acides gras
Assurance de qualité en coprologie
A Selles 3 g
KOH + alcool amylique
Chauffage à 300°C à ébullition à reflux
Saponification AG et TG savons
Selle d’aspect gras = Minimum = 2,5 g
Libération des AG
Suivi des moyennes annuelles du contrôle de qualité fécal pour les lipides M M min M max
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 2000
2001
2002
2003
Ether de pétrole + agitation
Extraction des AG
Titrimétrie sur la phase éthérée
prise d ’essai
Selles liquides = lyophilisation préalable Corrélation / microscopie : r = 0,39 - p=0,004 vs r = 0,25 - p=0,07
B
HCl 25%
Résultat aberrant = Interférence analytique ? méthode gravimétrique
Suivi des coefficients de variation annuels du contrôle de qualité fécal pour les lipides CV CV min CV max
40 35 30 25 20 15 10 5 0 2000
2001
2002
2003
Figure 1. A- Dosage des lipides fécaux selon la méthode de Van de Kamer. La meilleure connaissance des étapes a permis de définir des règles afin d’adapter la méthode à l’échantillon selon son aspect plus ou moins gras, sa consistance plus ou moins liquide ou l’existence d’interférences analytiques, et ainsi d’améliorer la reproductibilité du dosage. AG : acides gras ; TG : triglycérides. B- Suivi de l’évolution de la moyenne annuelle du contrôle de qualité fécal pour le dosage des lipides et des coefficients de variations (CV) correspondants. L’application des règles définies ci-dessus s’est traduit par une amélioration des CV de 2000 à 2003. A. de Van de Kamer method for fecal lipid assay. Better knowledge of the steps enabled adaptation of the method to sample aspect (fat content), consistency (liquid or not), and analytical interference, and thus improved reproducibility. AG: fatty acids; TG: triglyceides. B. Mean annual fecal lipid assay quality control and corresponding coefficients of variation (CV). Application of the defined rules led to an improvement in the CV from 2000 to 2003.
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L. Barbot et Coll. (terme de la digestion) qui sont solubles dans les solvants organiques ; les savons, esters d’acides gras, insolubles dans les solvants organiques. La méthode de Van de Kamer permet le dosage par titrimétrie des lipides totaux après transformation en acides gras (fig. 1). Un échantillon de selles est chauffé à ébullition en présence de potasse alcoolique pour transformer les triglycérides et les acides gras en savons. Les acides gras sont ensuite libérés des savons par l’action de l’acide chlorhydrique puis extraits par l’éther de pétrole. Ils sont alors dosés dans une partie aliquote par la potasse isobutylique en présence de bleu de thymol. Une meilleure connaissance des différentes étapes de ce dosage et la prise en compte de l’hétérogénéité des prélèvements ont permis d’améliorer la reproductibilité de la méthode (fig. 1A). Nous avons remarqué que pour les selles très grasses, la valeur obtenue était toujours sous-estimée, ce qui a fait suspecter une saturation de l’extraction des lipides par la phase éthérée. La diminution de la prise d’essai de selles, normalement de l’ordre de 5 g, lorsque la selle a un aspect gras, permet d’éviter ce phénomène. Il est cependant important de respecter une pesée minimale de 2,5 g. Nous avons également observé que le dosage des lipides étaient souvent mis en défaut pour des selles très liquides. Une étape préalable de lyophilisation de la selle améliore significativement la corrélation du dosage avec l’estimation semiquantitative des lipides au microscope qui sera détaillée ci-dessous. Enfin, le dosage proprement dit des lipides est réalisé par titrimétrie donc sujet à des interférences analytiques (médicaments…). Tout résultat aberrant nous conduit à mettre en œuvre une méthode différente, par exemple celle décrite par Jeejeebhoy et al. [4] basée sur une extraction utilisant des solvants différents de ceux de la technique de Van de Kamer suivie d’un dosage par gravimétrie. La mise en œuvre de ces règles se traduit par l’amélioration de la reproductibilité du dosage des lipides, ce qui est visible sur le suivi des moyennes annuelles du contrôle de qualité fécal et des coefficients de variation (CV) correspondants (fig. 1B). Pour des valeurs moyennes comparables, les CV ont diminué entre 2000 (22 %) et 2003 (16 %) et leur fourchette s’est restreinte (± 5 % en 2003 versus ± 12 % en 2000).
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A B Figure 2. Estimation semi-quantitative des lipides par observation du prélèvement fécal au microscopique optique, à l’objectif 10. A- Selle observée au naturel (selle diluée au 1/3 dans du sérum physiologique). B- Selle diluée volume à volume dans de l’acide chlorhydrique dilué au 1/3 puis incubée 20 mn dans un bain-marie à ébullition afin de transformer l’ensemble des lipides en acides gras. Ceux-ci sont observés en lumière polarisée et leur quantité est estimée de 0 à 15 croix par évaluation de l’intensité de leur brillance par rapport à la matière fécale. 1- corps gras ; 2- fibre musculaire. Semiquantitative estimation of lipid content by observation of the fecal sample under optical microscopy, magnification × 10. A. Untreated sample (1/3 dilution in saline solution). B. volume/ volume dilution with 1/3 diluted hydrochloric acid and incubation for 20 in boiling water bath to release fatty acids from lipids. Observation under polarized light and quantification noted 0 to 15 by evaluation of brilliance compared with fecal matter. 1. Fatty body, 2. Muscle fiber.
Comme évoqué précédemment, les limites du contrôle de qualité fécal et la complexité du milieu fécal ont nécessité le développement d’une approche complémentaire dans le cadre de la démarche qualité. Dans le cas du dosage des lipides fécaux, il s’agit d’une estimation semi-quantitative des lipides au microscope, après traitement acide des selles afin de transformer l’ensemble des lipides en acides gras visibles en lumière polarisée (fig. 2).
Assurance de qualité en coprologie Nous évaluons l’intensité de leur brillance par rapport à la matière fécale selon une gamme allant de 0 à 18 croix. Ceci constitue un étalon interne pour chaque échantillon. Cette estimation est comparée au résultat du dosage des lipides exprimé en grammes de lipides pour 100 g de matière fécale sèche (tableau I). Si l’estimation microscopique et le dosage sont concordants, le dosage est validé techniquement. Dans le cas contraire, nous répétons dans un premier temps l’observation microscopique, puis si celle-ci est confirmée, le dosage. Une étape de validation biologique est dans tous les cas indispensable avant le rendu du résultat. Elle implique la mise en perspective du dosage des lipides avec l’ensemble des paramètres disponibles sur le prélèvement en tenant compte du contexte clinique — médical, chirurgical et thérapeutique — du patient. Ce n’est qu’après toutes ces étapes que le dosage des lipides est validé et peut être rendu.
Conclusion La démarche qualité en coprologie est à l’image du prélèvement : complexe. Elle implique plusieurs étapes et plusieurs outils complémentaires : l’utilisation de contrôles de qualité et d’étalons commercialisés, et du contrôle de qualité fécal développé au laboratoire ; la mise en œuvre de méthodologies variées pour une analyse donnée et leur adaptation aux caractéristiques du prélèvement ; la notion de bilan coprologique c’est-à-dire l’interprétation conjointe de l’ensemble des résultats disponibles pour un prélèvement, leur comparaison aux bilans précédents et la prise en compte du contexte clinique. Cette démarche nous permet de rendre des résultats de qualité, fiables et reproductibles, de répondre aux attentes des cliniciens et ainsi de participer efficacement à la prise en charge et au suivi au long cours des patients.
Tableau I. — Concordance entre l’estimation semi-quantitative des lipides par observation microscopique des selles et la concentration lipidique de la matière fécale sèche déterminée par dosage selon la technique de Van de Kamer. Les valeurs en gras correspondent aux valeurs normales. Agreement between semiquantitative estimation of lipids by microscopic observation of stool sample and lipid content of the fecal matter determined by the de Van de Kamer technique. The bold values indicate normal values. Estimation semiquantitative des lipides (0 à 15 croix)
Concentration lipidique attendue (g lipides/100 g matière fécale sèche)
0–2
<5
2–4
5–9
4–6
9 – 14
6–8
14 – 18
8 – 10
18 – 23
10 – 12
23 – 28
12 – 14
28 – 32
14 – 16
32 – 37
16 – 18
37 – 41
Références 1. Arrêté du 2 novembre 1994 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale, publié au Journal Officiel du 4 décembre 1994, 17193-201. 2. Gobert JG, Bernoit MO, Cazalet C, Savel J. Mise au point d’un contrôle de qualité en coprologie fonctionnelle. Ann Biol Clin 1979 ; 37 : 114-5. 3. Van de Kamer JH, Ten Bokkel Huinik H, Weyers HA. Rapid method for determination of fat in feces. J Biol Chem 1949; 177: 347-55. 4. Jeejeebhoy KN, Ahmad S, Kozak G. Determination of fecal fats containing both medium and long chain triglycerides and fatty acids. Clin Biochem 1970; 3: 157-63.
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Ann Pharm Fr 2004, 62 : 376-381
Séance thématique Physiologie digestive et coprologie fonctionnelle
L’assurance de qualité en coprologie fonctionnelle L. Barbot, N. Kapel, J.-G. Gobert Résumé. Depuis 1994, la qualité dans les laboratoires de biologie médicale est définie par décret dans le Guide de Bonne Exécution des Analyses (GBEA). Les contraintes propres à la coprologie rendent difficiles l’application de certains points du GBEA. En particulier, aucun contrôle de qualité n’est disponible dans ce domaine. Or la matrice fécale est complexe, hétérogène et variable en fonction des pathologies, des interventions chirurgicales, de l’alimentation et des thérapeutiques. Les contrôles de qualité sériques du commerce ne permettent pas de mettre en évidence les interférences analytiques liées à un effet matrice. Ceci nous a conduit à développer notre propre contrôle de qualité à partir d’un mélange de selles de patients lyophilisées pour améliorer l’assurance de qualité de la phase analytique. Les techniques utilisées en coprologie sont manuelles ou semiautomatisées et impliquent une phase pré-analytique qui n’est pas toujours prise en compte par les contrôles de qualité. Une approche semi-quantitative par analyse microscopique des selles est donc couplée au dosage. Cela constitue un témoin interne pour chaque échantillon. La démarche qualité est poursuivie au niveau post-analytique : les analyses sont confrontées entre elles et remises dans le contexte clinique et thérapeutique du patient. La mise en œuvre de l’ensemble des outils décrits précédemment assure la fiabilité des résultats rendus et permet le suivi à long terme d’un patient.
Summary. Quality control in medical laboratories was defi-
Mots-clés : Coprologie, Assurance de qualité, GBEA, Contrôle de qualité, Lipides fécaux.
Quality control in coprology. L. Barbot, N. Kapel, J.-G. Gobert, Ann Pharm Fr 2004, 62: 376-381.
ned in guidelines for good execution of laboratory analyses issued by the French health authorities in 1994. Application of these guidelines is difficult in coprology because the sample is a complex heterogeneous matrix which varies with disease, surgery, food intake, and treatment. In addition, commercial quality control kits are not available for stool biochemical analyses and a national quality control program has not been established. We thus developed our own fecal quality control technique using pooling lyophylized stool samples. Manual or partially automated methods are used in coprology, leading to a long pre-analysis phase which is not always taken into account in quality control. This implies the need for complementary tools to insure the quality of coprology analyses. For example, semi-quantitative microscopic lipid analysis can be used as an internal standard for a given specimen. Quality assurance also involves a post-analytical phase where results obtained for a given specimen are compared with other available data and interpreted in light of the patient's clinical and therapeutic status. This quality assurance strategy enables accurate reliable results useful for long-term patient management.
Key-words: Coprology, Quality control, Quality assurance, Fecal lipids.
Laboratoire de coprologie fonctionnelle, GH Pitié-Salpêtrière, Bâtiment La Force — Division Vincent de Paul, 47-83, boulevard de l’Hôpital, F75652 Paris Cedex 13. Tirés à part : L. Barbot, à l’adresse ci-dessus. E-mail : [email protected]
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Assurance de qualité en coprologie
Introduction : la qualité dans un laboratoire de biologie médicale Si la démarche qualité dans un laboratoire de biologie médicale est ancienne, elle est aujourd’hui définie officiellement dans le Guide de Bonne Exécution des Analyses (GBEA — décret paru en 1994 [1]) qui fait de cette démarche une contrainte réglementaire opposable. Ce texte décrit les moyens matériels et humains dont doit disposer un laboratoire, et les responsabilités de chaque personnel. Il a fait l’objet de révisions en 1999 et en 2003 afin de lever les ambiguïtés d’interprétation et d’apporter des précisions dans des domaines particuliers tels que l’immuno-hématologie. Les laboratoires ont de tout temps rendu des résultats de qualité. Le GBEA apporte l’obligation de le prouver, ce qui nécessite de passer d’une culture traditionnellement orale à une culture écrite afin d’assurer une traçabilité de l’ensemble des actions réalisés sur les prélèvements depuis leur réalisation dans les services cliniques jusqu’au rendu des résultats.
Les contraintes propres à la coprologie Le GBEA s’applique à l’ensemble des laboratoires de biologie médicale publics et privés. Son application complète à la coprologie fonctionnelle est cependant rendue délicate du fait de contraintes spécifiques à cette discipline. Un dosage en biologie médicale implique l’utilisation d’un étalon et d’un contrôle de qualité. L’étalon correspond à la substance pure à doser et permet le calibrage de la méthode. Le contrôle de qualité est un spécimen qui contient la substance à doser dans un environnement et à une concentration aussi proches que possible de ceux des prélèvements provenant des patients. La première contrainte est liée à l’absence de contrôle de qualité fécal commercialisé et de procédure de contrôle national, pourtant décrits comme obligatoires dans le GBEA. Nous disposons d’étalons (substance azotée pure) et de contrôles commercialisés pour les dosages de sodium et de potassium (sérum). Cependant ces étalons et contrôles ne sont pas
disponibles pour tous les paramètres dosés ou recherchés au laboratoire ; ils ne sont pas dans les gammes de dosages du milieu fécal ; et enfin ils ne permettent pas de mettre en évidence un effet matrice et ne rendent pas compte de tous les événements qui ont lieu dans la lumière digestive, en particulier les phénomènes de digestion. Notre laboratoire a ainsi développé son propre contrôle de qualité fécal [2]. La seconde contrainte est inhérente au prélèvement fécal lui-même. Tout d’abord du point de vue pré-analytique : les analyses de coprologie fonctionnelle nécessitent le recueil de la totalité des selles émises sur 24, 48 ou 72 h Ceci est assez facile à vérifier au cours d’un entretien lorsque le patient se déplace au laboratoire, mais l’est plus difficilement en milieu hospitalier (plusieurs équipes sur 24 h, personnes différentes sur les trois jours…). Ensuite au plan analytique : le prélèvement fécal est par nature complexe, hétérogène et variable d’une personne à l’autre, et pour une même personne malade en fonction des traitements et chirurgies. Ceci ne permet pas l’utilisation des automates classiques de biochimie. Les dosages sont le plus souvent réalisés par des techniques manuelles ou semiautomatisées, dont la reproductibilité est moindre que celle des techniques automatisées (CV < 15 % versus CV < 5 %). Les fourchettes de normalité sont larges en comparaison de celles des paramètres sériques, mais bénéficient d’un consensus international.
Les outils du contrôle de qualité en coprologie La démarche qualité au laboratoire de coprologie nécessite l’utilisation combinée de plusieurs outils. L’association d’étalons ou de contrôles de qualité sériques commercialisés et du contrôle de qualité fécal pour chaque paramètre dosé permet de mettre en évidence un problème analytique liée à la méthodologie employée et/ou un effet matrice lié au prélèvement fécal. Le contrôle de qualité fécal produit au laboratoire, un lot permettant un suivi sur 18 à 24 mois, est réalisé à partir d’un mélange de selles de patients choisies selon des critères définis, lyophilisé, tamisé, aliquoté et conservé à la température
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L. Barbot et Coll. ambiante en flacons sertis sous vide. Ce contrôle est validé en réalisant 20 dosages (un par jour) de chaque paramètre : lipides, azote, sodium, potassium, chlore, alpha 1-antitrypsine. La fourchette de normalité est définie comme la moyenne ± 2 écart-types, et révisée après trois mois d’utilisation si nécessaire. Ces paramètres couvrent l’ensemble des phénomènes pathologiques étudiés : diarrhées de malabsorption ou de maldigestion, diarrhées hydriques et hydro-électrolytiques, exsudation protéique. Le lot actuellement en cours est le n° 29. Le suivi des contrôles et étalons commercialisés et du contrôle fécal implique trois niveaux d’interprétation. Dans un premier temps, le résultat obtenu pour un paramètre donné avec un contrôle/étalon donné est comparé à la fourchette de normalité. Dans un deuxième temps, nous comparons les résultats obtenus pour tous les paramètres dosés à partir d’un contrôle donné, afin de mettre en évidence une erreur de reconstitution du contrôle. Dans un troisième temps, nous comparons les résultats obtenus pour un paramètre donné à partir de plusieurs contrôles et/ou étalons, ce qui permet de détecter un problème dans le processus analytique. Prenons l’exemple du suivi des contrôles et étalons au cours du premier trimestre 2004. Trois paramètres du contrôle de qualité fécal sont abaissés dans la semaine du 9 au 13 février : lipides, sodium et potassium, ce qui fait suspecter une erreur de reconstitution du lyophilisat. En revanche, les résultats pour l’azote sont corrects. Si nous considérons les résultats obtenus dans cette période pour le sodium et le potassium pour le contrôle sérique commercialisé (PathonormTM H, référence 100705, Ingen), nous observons une diminution comparable à celle du contrôle fécal, ce qui suggère un problème analytique. L’association d’une erreur par défaut due au problème de reconstitution du lyophilisat fécal et d’une erreur par défaut due à un problème analytique explique la baisse très forte (hors des trois écarttypes) observée pour le potassium par rapport à celle observée pour les lipides (résultats bas mais restant dans la fourchette de normalité). De même, si nous considérons les résultats du 9 au 13 février pour le dosage de l’azote à partir de l’étalon (2,5-bis(5-ter-butyl-2-benzo-oxazol-2-yl)thiophène ou BBOT, référence 33835210, Thermo-
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Finnigan), nous observons une augmentation par rapport à la fourchette de normalité. Les résultats de l’azote à partir du contrôle fécal sont donc faussement normaux, conséquence de l’association d’une erreur par défaut suite au problème de reconstitution du lyophilisat fécal et d’une erreur par excès due à un problème analytique. Seule la confrontation des différents paramètres et des différents contrôles et étalons nous a permis de comprendre les problèmes rencontrés, de les résoudre et ainsi de rendre, bien qu’avec du retard, des résultats fiables. Le contrôle de qualité fécal a cependant des limites. Les fourchettes de normalité sont larges, à l’image des valeurs usuelles. Par ailleurs il ne rend pas compte de l’ensemble de la phase préanalytique (homogénéisation du prélèvement, pesée d’une prise d’essai, dilution…). Enfin, pour un dosage manuel individuel tel que celui des lipides, une erreur ponctuelle sur un échantillon ne peut être exclue. C’est pourquoi le contrôle de qualité fécal ne peut pas conduire à lui seul à la validation ou au refus de toute une série de dosages sans autre démarche. Nous avons ainsi développé des approches complémentaires dont un exemple sera donné à propos du dosage des lipides fécaux. De plus la cohérence du bilan coprologique est un élément essentiel de la validation biologique d’un dosage : un paramètre fécal n’a de sens que comparé aux autres paramètres, quantitatifs et qualitatifs, et remis dans le contexte clinique — thérapeutique, médical, chirurgical et nutritionnel — du patient.
La démarche qualité en coprologie appliquée au dosage des lipides fécaux Les lipides fécaux sont dosés par la technique de Van de Kamer [3] qui est la plus adaptée aux grandes séries. Ces lipides se trouvent sous des formes très diverses : libres, intracellulaires ou fixés par adsorption sur les celluloses ou d’autres supports inertes. Dans chaque fraction, il existe différents types de lipides dont les méthodes d’extraction et de dosage sont très variables : les triglycérides à chaînes longues et moyennes (graisses neutres alimentaires) et les acides gras
Assurance de qualité en coprologie
A Selles 3 g
KOH + alcool amylique
Chauffage à 300°C à ébullition à reflux
Saponification AG et TG savons
Selle d’aspect gras = Minimum = 2,5 g
Libération des AG
Suivi des moyennes annuelles du contrôle de qualité fécal pour les lipides M M min M max
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 2000
2001
2002
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Ether de pétrole + agitation
Extraction des AG
Titrimétrie sur la phase éthérée
prise d ’essai
Selles liquides = lyophilisation préalable Corrélation / microscopie : r = 0,39 - p=0,004 vs r = 0,25 - p=0,07
B
HCl 25%
Résultat aberrant = Interférence analytique ? méthode gravimétrique
Suivi des coefficients de variation annuels du contrôle de qualité fécal pour les lipides CV CV min CV max
40 35 30 25 20 15 10 5 0 2000
2001
2002
2003
Figure 1. A- Dosage des lipides fécaux selon la méthode de Van de Kamer. La meilleure connaissance des étapes a permis de définir des règles afin d’adapter la méthode à l’échantillon selon son aspect plus ou moins gras, sa consistance plus ou moins liquide ou l’existence d’interférences analytiques, et ainsi d’améliorer la reproductibilité du dosage. AG : acides gras ; TG : triglycérides. B- Suivi de l’évolution de la moyenne annuelle du contrôle de qualité fécal pour le dosage des lipides et des coefficients de variations (CV) correspondants. L’application des règles définies ci-dessus s’est traduit par une amélioration des CV de 2000 à 2003. A. de Van de Kamer method for fecal lipid assay. Better knowledge of the steps enabled adaptation of the method to sample aspect (fat content), consistency (liquid or not), and analytical interference, and thus improved reproducibility. AG: fatty acids; TG: triglyceides. B. Mean annual fecal lipid assay quality control and corresponding coefficients of variation (CV). Application of the defined rules led to an improvement in the CV from 2000 to 2003.
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L. Barbot et Coll. (terme de la digestion) qui sont solubles dans les solvants organiques ; les savons, esters d’acides gras, insolubles dans les solvants organiques. La méthode de Van de Kamer permet le dosage par titrimétrie des lipides totaux après transformation en acides gras (fig. 1). Un échantillon de selles est chauffé à ébullition en présence de potasse alcoolique pour transformer les triglycérides et les acides gras en savons. Les acides gras sont ensuite libérés des savons par l’action de l’acide chlorhydrique puis extraits par l’éther de pétrole. Ils sont alors dosés dans une partie aliquote par la potasse isobutylique en présence de bleu de thymol. Une meilleure connaissance des différentes étapes de ce dosage et la prise en compte de l’hétérogénéité des prélèvements ont permis d’améliorer la reproductibilité de la méthode (fig. 1A). Nous avons remarqué que pour les selles très grasses, la valeur obtenue était toujours sous-estimée, ce qui a fait suspecter une saturation de l’extraction des lipides par la phase éthérée. La diminution de la prise d’essai de selles, normalement de l’ordre de 5 g, lorsque la selle a un aspect gras, permet d’éviter ce phénomène. Il est cependant important de respecter une pesée minimale de 2,5 g. Nous avons également observé que le dosage des lipides étaient souvent mis en défaut pour des selles très liquides. Une étape préalable de lyophilisation de la selle améliore significativement la corrélation du dosage avec l’estimation semiquantitative des lipides au microscope qui sera détaillée ci-dessous. Enfin, le dosage proprement dit des lipides est réalisé par titrimétrie donc sujet à des interférences analytiques (médicaments…). Tout résultat aberrant nous conduit à mettre en œuvre une méthode différente, par exemple celle décrite par Jeejeebhoy et al. [4] basée sur une extraction utilisant des solvants différents de ceux de la technique de Van de Kamer suivie d’un dosage par gravimétrie. La mise en œuvre de ces règles se traduit par l’amélioration de la reproductibilité du dosage des lipides, ce qui est visible sur le suivi des moyennes annuelles du contrôle de qualité fécal et des coefficients de variation (CV) correspondants (fig. 1B). Pour des valeurs moyennes comparables, les CV ont diminué entre 2000 (22 %) et 2003 (16 %) et leur fourchette s’est restreinte (± 5 % en 2003 versus ± 12 % en 2000).
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A B Figure 2. Estimation semi-quantitative des lipides par observation du prélèvement fécal au microscopique optique, à l’objectif 10. A- Selle observée au naturel (selle diluée au 1/3 dans du sérum physiologique). B- Selle diluée volume à volume dans de l’acide chlorhydrique dilué au 1/3 puis incubée 20 mn dans un bain-marie à ébullition afin de transformer l’ensemble des lipides en acides gras. Ceux-ci sont observés en lumière polarisée et leur quantité est estimée de 0 à 15 croix par évaluation de l’intensité de leur brillance par rapport à la matière fécale. 1- corps gras ; 2- fibre musculaire. Semiquantitative estimation of lipid content by observation of the fecal sample under optical microscopy, magnification × 10. A. Untreated sample (1/3 dilution in saline solution). B. volume/ volume dilution with 1/3 diluted hydrochloric acid and incubation for 20 in boiling water bath to release fatty acids from lipids. Observation under polarized light and quantification noted 0 to 15 by evaluation of brilliance compared with fecal matter. 1. Fatty body, 2. Muscle fiber.
Comme évoqué précédemment, les limites du contrôle de qualité fécal et la complexité du milieu fécal ont nécessité le développement d’une approche complémentaire dans le cadre de la démarche qualité. Dans le cas du dosage des lipides fécaux, il s’agit d’une estimation semi-quantitative des lipides au microscope, après traitement acide des selles afin de transformer l’ensemble des lipides en acides gras visibles en lumière polarisée (fig. 2).
Assurance de qualité en coprologie Nous évaluons l’intensité de leur brillance par rapport à la matière fécale selon une gamme allant de 0 à 18 croix. Ceci constitue un étalon interne pour chaque échantillon. Cette estimation est comparée au résultat du dosage des lipides exprimé en grammes de lipides pour 100 g de matière fécale sèche (tableau I). Si l’estimation microscopique et le dosage sont concordants, le dosage est validé techniquement. Dans le cas contraire, nous répétons dans un premier temps l’observation microscopique, puis si celle-ci est confirmée, le dosage. Une étape de validation biologique est dans tous les cas indispensable avant le rendu du résultat. Elle implique la mise en perspective du dosage des lipides avec l’ensemble des paramètres disponibles sur le prélèvement en tenant compte du contexte clinique — médical, chirurgical et thérapeutique — du patient. Ce n’est qu’après toutes ces étapes que le dosage des lipides est validé et peut être rendu.
Conclusion La démarche qualité en coprologie est à l’image du prélèvement : complexe. Elle implique plusieurs étapes et plusieurs outils complémentaires : l’utilisation de contrôles de qualité et d’étalons commercialisés, et du contrôle de qualité fécal développé au laboratoire ; la mise en œuvre de méthodologies variées pour une analyse donnée et leur adaptation aux caractéristiques du prélèvement ; la notion de bilan coprologique c’est-à-dire l’interprétation conjointe de l’ensemble des résultats disponibles pour un prélèvement, leur comparaison aux bilans précédents et la prise en compte du contexte clinique. Cette démarche nous permet de rendre des résultats de qualité, fiables et reproductibles, de répondre aux attentes des cliniciens et ainsi de participer efficacement à la prise en charge et au suivi au long cours des patients.
Tableau I. — Concordance entre l’estimation semi-quantitative des lipides par observation microscopique des selles et la concentration lipidique de la matière fécale sèche déterminée par dosage selon la technique de Van de Kamer. Les valeurs en gras correspondent aux valeurs normales. Agreement between semiquantitative estimation of lipids by microscopic observation of stool sample and lipid content of the fecal matter determined by the de Van de Kamer technique. The bold values indicate normal values. Estimation semiquantitative des lipides (0 à 15 croix)
Concentration lipidique attendue (g lipides/100 g matière fécale sèche)
0–2
<5
2–4
5–9
4–6
9 – 14
6–8
14 – 18
8 – 10
18 – 23
10 – 12
23 – 28
12 – 14
28 – 32
14 – 16
32 – 37
16 – 18
37 – 41
Références 1. Arrêté du 2 novembre 1994 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale, publié au Journal Officiel du 4 décembre 1994, 17193-201. 2. Gobert JG, Bernoit MO, Cazalet C, Savel J. Mise au point d’un contrôle de qualité en coprologie fonctionnelle. Ann Biol Clin 1979 ; 37 : 114-5. 3. Van de Kamer JH, Ten Bokkel Huinik H, Weyers HA. Rapid method for determination of fat in feces. J Biol Chem 1949; 177: 347-55. 4. Jeejeebhoy KN, Ahmad S, Kozak G. Determination of fecal fats containing both medium and long chain triglycerides and fatty acids. Clin Biochem 1970; 3: 157-63.
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