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Le concept d'apoptose
LE CONCEPT D'APOPTOSE
Gerard Feldmann
a
R~sum6
Dans cette introduction, le concept d'apoptose est defini et les principales etapes de la caracterisation de cette forme de mort cellulaire sont decrites. Les differences entre apoptose et necrose, I'autre forme de mort cellulaire, sont soulignees. Les raisons pour lesquelles I'apoptose est aussi appelee la mort cellulaire programmee sont expliquees en decrivant le r61e de plusieurs genes pro ou anti-apoptotiques. La place de I'apoptose en physiologie cellulaire, en physiopathologie et dans beaucoup de maladies est soulignee. Enfin, les applications therapeutiques provenant de la decouverte recente des caspases, un groupe de proteases & cysteine qui semblent jouer un r61e essentiel dans I'apoptose, sont illustrees par quelques exemples. Apoptose-
e concept d'apoptose a 6te introduit en 1972 par Kerr, Wyllie et Currie [23] pour decrire une forme de mort cellulaire differente de la necrose, seule forme de mort cellulaire connue et bien individualisee jusqu'& cette date. Contrairement & la necrose en effet, I'apoptose se caracterise par une retraction de la cellule, une agglomeration autour du noyau d'organites cytoplasmiques encore intacts et une modification particuliere de la chromatine nucleaire qui se condense en volumineux amas, ensemble d'alterations rapidement suivi de la fragmentation de la cellule en corps apoptotiques qui se detachent alors du tissu pour 6tre phagocytes par les macrophages ou les cellules voisines. Le choix par Kerr et ses collegues du mot apoptose, qui vient du grec, rappelle cette derniere particularite : il signifie en effet chute et, avec un brin de poesie, comme le remarque Kerr, la cellule en apoptose se detache de ses voisines comme les petales qui se detachent de la fleur ou les feuilles qui tombent des branches en automne. En realite, au moment ou le mot est introduit dans la litterature medicale, ce type de mort cellulaire etait connu depuis Iongtemps mais faisait robjet de descriptions disparates. II n'avait pas en effet echappe aux anatomopathologistes qu'& c6te de la necrose, les cellules pouvaient aussi mourir en se contractant (necrose de coagulation ou necrose acidophile) ou en prenant une forme arrondie, comme momifiee (corps de Councilman), avant d'etre fragmentees en corps apoptotiques, ensemble de caracteres morphologiques totalement differents de la necrose o~ la cellule qui meurt presente une atteinte de sa membrane plasmique, un gonflement generalise ou ballonisation suivis d'une destruction de tous ses organites, en particulier des mitochondries. Toutefois, I'apoptose ne faisait pas, sauf exception [5], I'objet de descriptions detaillees et, d'une fagon generale, bien qu'assez souvent signalee en pathologie, elle etait plutSt consideree comme une curiosite morphologique mal expliquee. Apres la description princeps de Kerr et al., I'apoptose est restee pendant pres de 15 ans pratiquement ignoree bien que I'equipe de Kerr [41 ] ait insiste largement sur ses particularites morphologiques et sur son importance en pathologie. II revient toutefois & Wyllie d'avoir montre des 1980 [39] que la condensation de la chromatine avait une traduction biochimique particuliere caracterisee par la fragmentation reguliere de I'ADN en oligonucleosomes et en nucleosomes, structures qui constituent, comme on salt, le premier niveau d'organisation du filament d'ADN dans le noyau. Bien plus, Wyllie avait, des cette date, emis I'hypothese que cette fragmentation resultait vraisemblablement de I'activation d'une enzyme nucleaire, probablement une endonuclease, hypothese confirmee en 1998 [40].
L
necrose-
genes-
caspases.
Summary
In this introduction, the concept of apoptosis is defined and the main steps leading to the characterization of this form of cell death are described. Differences between apoptosis and necrosis, the other form of cell death, are underlined. The reasons why apoptosis is also called programmed cell death are explained by describing the role of several pro or anti-apoptotic genes. The place of apoptosis in cell physiology and in many physiopathologic and pathologic conditions is emphasized. Finally, the therapeutic appfications resulting from the recent discovery of caspases, a group of cysteine proteases which seem to play an essential role in apoptosis, are illustrated by some examples. Apoptosis - necrosis - genes - caspases.
a Inserm U.327 Faculte de medecine Xavier-Bichat Universite Paris 7-Denis-Diderot B.P. 416 758?0 Paris cedex 18 article re£u le 5 octobre, accepte le 20 novembre 1998.
© Elsevier, Paris. RevueFranqaisedes Laboratoires,mars 1999, N° 311
Malgre I'importance de ces travaux, I'apoptose n'a acquis droit de cite que Iorsqu'on a compris que, contrairement & la necrose subie passivement par la cellule & la suite d'une agression exterieure, I'apoptose etait un phenomene actif necessitant de I'ATP et dependant de genes pro ou anti-apoptotiques. Cette decouverte essentielle a ete faite par Horvitz et son equipe [9] Iors de leurs etudes des mutants du nematode Caenorhaditis elegans. Ce vers presente la particularite de voir mourir par apoptose pendant son developpement un nombre constant de cellules. I 'analyse des facteurs intervenant dans cette mort naturelle a ainsi permis d'individualiser toute une serie de genes contr6lant I'ensemble des etapes de I'apoptose et dont trois ont paru d'emblee importants, les genes ced-3 et ced-4 dont I'expression favorise 27
Dossier scientifique Apoptose
le programme de mort cellulaire [9] alors que le gene ced-9 I'inhibe [19]. ,/k peu pres parallelement & ces travaux, une autre equipe a individualise en 1988 & partir du point de cassure de la translocation t(14;18) des lymphomes humains & cellules Bun autre gene, appele bcl-2 (B-ceil lymphoma), qui, quand il etait transfecte in vitro dans des cellules hematopoi"etiques, prolongeait de faoon significative la survie de ces cellules [36] et ceci, comme on s'en est rapidement aper?u, en bloquant I'apoptose [22]. Uetude des effets de la transfection du gene humain bcl-2 dans le nematode Caenorhabditis elegans [37], puis I'analyse de la structure des genes bcl-2 et ced-9 et des proteines qu'ils codent ont alors montre leur etroite analogie [20]. Un autre pas essentiel a ete franchi quand on a constate que le gene ced-3 codait une proteine dont la structure etait tres proche d'une proteine existant chez I'homme, I'enzyme de conversion de I'interleukine-1 -]3 [42]. Cet enzyme fait partie d'une famille de proteases, les proteases & cysteine dont dix au moins sont connues chez I'homme [8] et qu'on a appele caspases (pour cysteine aspartate specific proteinases) [2] & partir de leurs homologies structurales et fonctionnelles. Bien que d'autres proteases interviennent aussi dans I'apoptose, on s'est alors rendu compte que les caspases jouaient un rele essentiel dans la destruction apoptotique car elles pouvaient degrader un nombre important de proteines necessaires & la vie de la cellule [33]. Ces decouvertes ont alors donne & I'apoptose une dimension nouvelle et rapidement fascinante. Non seulement I'apoptose est differente de la necrose, tant sous I'angle morphologique que biochimique, mais de plus le deroulement de cette forme de mort cellulaire est sous un etroit contrele genetique. On a ainsi realise que I'apoptose representait une fonction cellulaire, jusqu'alors ignoree, et qui occupait une place probablement importante dans la cellule tout comme la differenciation ou le cycle cellulaire [38]. I 'apoptose est ainsi sortie du cadre de la pathologie pour devenir une fonction essentielle de la cellule normale. A partir de 1990, les travaux sur I'apoptose ont augmente de fa?on exponentielle et encore actuellement, en 1999, cinq & six cents publications consacrees a la mort cellulaire programmee, expression souvent utilisee pour designer I'apoptose, paraissent chaque mois dans la litterature biomedicale internationale. II est donc impossible dans cette courte introduction de resumer I'ensemble de ces travaux. Tout au plus peut-on essayer de degager une orientation generale. Tout d'abord, I'apoptose est un phenomene qu'on observe dans toutes les cetlules vivantes normales, aussi bien dans celles des mammiferes que celles des invertebres et qui existe chez les bacteries et aussi probablement dans les cellules vegetales. On trouve de I'apoptose chez I'adulte comme chez le foetus. Chez I'adulte, on s'accorde & penser que la mort cellulaire programmee est le pendant naturel de la multiplication cellulaire, c'est-&-dire que le renouvellement cellulaire normal est contrebalance par I'apoptose [1 O, 23]. L'apoptose contrele ainsi 6troitement I'homeostasie cellulaire, terme qui designe I'equilibre existant dans tout tissu adulte normal entre proliferation et mort cellulaire. Ceci explique par exemple que dans les epitheliums & renouvellement cellulaire rapide, comme I'epithelium intestinal, il y ait beaucoup de cellules en apoptose alors que dans ceux & renouvellement lent, comme I'epithelium hepatique, il y e n ait peu. Chez le foetus, I'apoptose intervient des les premieres etapes de I'embryologie et & tousles stades de I'histogenese et de I'organogenese. C'est I'apoptose qui survient par exemple dans la destruction des neurones surnumeraires ou dans la regulation du nombre des lymphocytes T [3]. C'est aussi par apoptose que se fait la disparition de vestiges embryologiques ou des membranes interdigitales [3]. Quel que soit I'organe ou la cellule, une fois declenchee, I'apoptose prend toujours le meme aspect morphologique, tandis que I'ADN se fragmente constamment en nucleosomes et que plusieurs caspases sont activees. L'apoptose presente egalement deux autres particularites. Quand on a pu la mesurer in vivo, on a constate que c'etait un phenomene rapide : pas plus de trois & quatre heures par exemple dans le foie [6]. C'est egalement une mort silencieuse qui, contrairement& la necrose, ne provoque aucune reaction inflammatoire cellu28
laire et ne laisse dans le tissu aucune trace susceptible de I'identifier, en particulier aucune reaction mesenchymateuse & I'origine d'une fibrose. Ceci explique que meme actuellement les morphologistes peinent pour reconnaTtre et quantifier I'apoptose dans les tissus alors qu'ils identifient facilement la necrose. Pendant quelque temps, les histopathologistes ont cru que la fragmentation de I'ADN pouvait etre mise en evidence dans les cellules gr&ce & des techniques de biologie moleculaire utilisant des nucleotides marques susceptibles de Iocaliser dans les noyaux apoptotiques les extremites libres du filament d'ADN. La plus populaire de ces techniques, la technique TUNEL [12], acronyme qui a probablement favoris~ sa diffusion, est alors devenue un outil banal pour reperer I'apoptose aussi bien dans les tissus que dans les cellules en culture. Des doutes serieux existent toutefois maintenant sur la specificite de cette technique ou de ses variantes d'autant qu'on a montre qu'on pouvait aussi mettre en evidence par cette technique la fragmentation irreguliere du filament d'ADN qui survient dans la necrose [15] et que les conditions de son utilisation variaient de tissu & tissu et devaient etre particulierement rigoureuses excluant en pratique tout emploi en routine [26]. Aussi, la coloration histologique classique, I'hematoxyline/eosine et la microscopie electronique, si on peut la faire, restent toujours d'actualite pour reconnaftre la cellule en apoptose [11]. In vitro, la situation est heureusement differente. L'utilisation de fluorochromes s'intercalant specifiquement dans les bases d'ADN, comme le DAPI, permet de reconnaftre sans difficulte la condensation de la chromatine et la fragmentation du noyau. Ces memes fluorochromes peuvent aussi etre utilises en cytometrie en flux ce qui permet de quantifier de fa?on precise, mais toujours in vitro, le phenomene apoptotique. Ceci explique que bien qu'il y ait encore des incertitudes sur I'importance de I'apoptose & I'etat normal et en pathologie, un nombre considerable de publications a et6 fait ces dernieres annees sur les conditions de survenue de I'apoptose in vitro. On salt en effet que I'apoptose peut etre declenchee ou au contraire inhibee dans de multiples circonstances physiologiques ou physiopathologiques differentes [35]. On peut dire ainsi que beaucoup de perturbations metaboliques locales ou generales peuvent declencher la survenue de I'apoptose. Par exemple, quand une cellule se detache de son support matriciel, elte peut entrer en apoptose [27]. Quand certains facteurs de croissance sont retires du milieu de culture, ou quand certaines hormones sont deficitaires, en particulier les hormones sexuelles comme les estrogenes ou les androgenes, I'apoptose peut survenir dans les cellules cibles contrelees par ces facteurs de croissance ou ces hormones [35]. Certaines cytokines, comme le TNFo~ [35] provoquent la mort cellulaire programmee alors que d'autres comme I'interleukine-2 I'inhibent [3]. Les radiations et les rayons UV sont inducteurs d'apoptose [35]. De nombreux medicaments, en particulier des medicaments anticancereux, peuvent declencher I'apoptose [24, 35]. La Iiste des substances toxiques pro-apoptotiques s'allonge de jour en jour altant de molecules uniquement utilisees en laboratoires, comme le tetrachlorure de carbone [32], & des toxiques d'emploi courant comme I'alcool [13]. En d'autres termes, de multiples signaux sont capables d'induire I'apoptose. Est-ce & dire que tous peuvent dectencher le meme programme genetique qui contrele le deroulement de ce type de mort cellulaire ? Au stade de nos connaissances, il n'y a pas encore de reponse parfaitement claire car il existe plusieurs voles moleculaires qui aboutissent & la destruction de la cellule par apoptose [14]. Quelques exemples permettront de mieux comprendre la complexite des mecanismes qui, apres le signal initial, enclenchent I'apoptose. Le premier est fourni par les lesions de I'ADN. On salt que si on provoque une lesion de I'ADN par irradiation ou chimiotherapie, la cellule reagit en surexprimant le gene p53 qui bloque la division cellulaire en phase G1 jusqu'& la reparation de I'ADN. Si cette reparation ne s'effectue pas, le gene p53, qu'on a appele aussi te gardien du genome, peut provoquer une apoptose dont le mecanisme est complexe [4], I'apoptose pouvant survenir de differentes fa?ons dont I'une depend de I'action de la proteine p53 sur I'un des genes de la famine bcl-2, le gene bax qui lui est pro-apoptotique RevueFran?aisedes Laboratoires,mars1999, N° 311
[28]. Neanmoins, le gene bcl-2 peut bloquer I'apoptose induite par le gene p53 (7). On touche I& du doigt la finesse de la regulation genetique de I'apoptose, dont I'un des elements les plus etudies actuellement est represente par les genes de la famille bcl-2 dent certains, comme le chef de file bcl-2, mais aussi les genes bcI-XL, bcI-W, etc., bloquent I'apoptose alors que d'autres, comme les genes bax, bcI-Xs ou bad, provoquent I'apoptose [1] en agissant soit directement, soit indirectement, sur I'activation des caspases [1 ]. Un autre exemple est fourni par le systeme Fas et son ligand. II existe & la surface de certaines cellules une proteine trans-membranaire, la proteine Fas/apo-1 (CD 95) dont le domaine cytoplasmique a ete appele" domaine de mort " car, quand cette proteine est oligomerisee, par exemple sous rinfluence de son ligand, la structure biochimique du domaine cytoplasmique est reconnue par une proteine d'association qui active une caspase, la caspase 8, activation a I'origine d'une cascade d'activations enzymatiques, en particulier de la caspase 3 qui semble jouer un rele essentiel dans ce type d'apoptose [29]. Dans cette situation, il est admis que la vole de Fas court-circuite largement les genes de la famille bcl-2 [1]. Un troisieme exemple est fourni par le comportement de certains virus, en particulier de certains adenovirus dont les proteines presentent des homologies avec la proteine du gene bcl-2 [34], et qui, quand ils penetrent dans la cellule, inhibent I'apoptose, favorisant ainsi la survie cellulaire et la multiplication virale. ,/k I'inverse, il existe plusieurs virus qui provoquent I'apoptose [34] (sans apparemment passer par le gene bax) empechant ainsi la dissemination virale du fait de rencapsulation des virions dans les corps apoptotiques ou au contraire protegeant ces virus de I'action destructrice des anticorps neutralisants [34]. Si on aborde maintenant le cadre de la pathologie humaine et de I'apoptose, on peut classer les maladies en deux groupes, celles oQ I'apoptose est deficitaire et celles au contraire ot~ elle predomine [21, 35], une classification commode mais qui reste provisoire & cause des difficultes qu'on rencontre & quantifier in vivo le nombre de cellules en apoptose. Dans le premier groupe, on met certaines maladies autoimmuRes et le cancer ou au moins certains cancers oQ il est assez generalement admis que la perte de I'homeostasie cellulaire serait due & un deficit en apoptose [10, 16, 24], idee qui entrafne la recherche de nouvelles strategies therapeutiques pro-apoptotiques pour contrebalancer I'anarchie proliferative. Dans le deuxieme groupe, en plus du sida ou I'action pro-apoptotique du VIH a ete I'une des premieres reconnues [17], on place un grand hombre de maladies chroniques ou degeneratives, en particulier neurologiques [21,35], mais aussi certaines maladies hematologiques, cardiaques ou hepatiques ainsi que I'ischemie cardiaque ou cerebrale [21, 35]. Une potentielle applica-
tion therapeutique provient de I'etude des caspases. Ces enzymes semblent faciles & inhiber par des petits peptides de synthese capables d'agir in vivo [8]. Si, experimentalement, on declenche une activation de la proteine Fas, on provoque une hepatite fulminante caracterisee par une apoptose massive des hepatocytes [30]. On peut alors inhiber cette apoptose gr&ce & ces peptides [31]. Dans le meme ordre d'idee, on vient de montrer que differents inhibiteurs de caspases pouvaient reduire de faoon significative les lesions d'ischemie cerebrale induite experimentalement chez le rongeur [18]. Ces observations ouvrent evidemment la vole &bien des possibilites therapeutiques. Finalement, faut-il penser que la necrose n'a plus droit de cite et que I'apoptose est la principale forme de mort cellulaire ? Rien ne serait plus inexact. De nombreuses conditions physiopathologiques ou pathoIogiques qui s'accompagnent d'une apoptose peuvent aussi comporter une necrose. Devant un meme agent inducteur, une cellule peut mourir soit par necrose, soit par apoptose. On e n a de multiples exemples. Dans les hepatites virales humaines, coexistent dans le foie les deux types de mort cellulaire. Experimentalement, une meme drogue peut induire soit I'un, soit I'autre type de mort, sans qu'on en connaisse la raison. Aussi, ces observations illustrent I'une des tendances actuelles de certains specialistes de I'apoptose : necrose et apoptose ne seraient que les deux facettes d'un meme phenomene aboutissant & la destruction de la cellule et I'organite responsable de la mort cellulaire, quel que soit son type, ne serait pas le noyau, mais la mitochondrie. Alors que celle-ci est gravement atteinte dans la necrose, elle reste en principe intacte au cours de I'apoptose. Toutefois, comme le soutiennent plusieurs equipes dont celle de Kroemer [25] qui I'a observe avec beaucoup d'inducteurs d'apoptose, avant que la cellule prenne I'aspect morphologique caracteristique d'apoptose, cet organite peut etre altere fonctionnellement au niveau de sa membrane interne, alteration qui permet alors le passage dans le cytoplasme de la cellule de certains constituants mitochondriaux susceptibles d'activer les caspases, le contrele de cette activation etant sous la dependance des genes bcl-2 et bax. Si, pour des raisons encore mal elucidees (dose de toxique, susceptibilite de la cellule, micro-environnement defavorable, etc.), I'alteration mitochondriale se poursuit, une necrose qualifiee alors de post-apoptotique apparaff. Que cette conception s'applique & toutes les conditions ot~ apoptose et necrose sont presentes, en particulier en pathologie humaine, cela reste a demontrer mais illustre le formidable progres que le concept d'apoptose a introduit ces derRieres annees dans la connaissance de la physiologie et de la physiopathologie de la mort cellulaire.
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Dans cette introduction, le concept d'apoptose est defini et les principales etapes de la caracterisation de cette forme de mort cellulaire sont decrites. Les differences entre apoptose et necrose, I'autre forme de mort cellulaire, sont soulignees. Les raisons pour lesquelles I'apoptose est aussi appelee la mort cellulaire programmee sont expliquees en decrivant le r61e de plusieurs genes pro ou anti-apoptotiques. La place de I'apoptose en physiologie cellulaire, en physiopathologie et dans beaucoup de maladies est soulignee. Enfin, les applications therapeutiques provenant de la decouverte recente des caspases, un groupe de proteases & cysteine qui semblent jouer un r61e essentiel dans I'apoptose, sont illustrees par quelques exemples. Apoptose-
e concept d'apoptose a 6te introduit en 1972 par Kerr, Wyllie et Currie [23] pour decrire une forme de mort cellulaire differente de la necrose, seule forme de mort cellulaire connue et bien individualisee jusqu'& cette date. Contrairement & la necrose en effet, I'apoptose se caracterise par une retraction de la cellule, une agglomeration autour du noyau d'organites cytoplasmiques encore intacts et une modification particuliere de la chromatine nucleaire qui se condense en volumineux amas, ensemble d'alterations rapidement suivi de la fragmentation de la cellule en corps apoptotiques qui se detachent alors du tissu pour 6tre phagocytes par les macrophages ou les cellules voisines. Le choix par Kerr et ses collegues du mot apoptose, qui vient du grec, rappelle cette derniere particularite : il signifie en effet chute et, avec un brin de poesie, comme le remarque Kerr, la cellule en apoptose se detache de ses voisines comme les petales qui se detachent de la fleur ou les feuilles qui tombent des branches en automne. En realite, au moment ou le mot est introduit dans la litterature medicale, ce type de mort cellulaire etait connu depuis Iongtemps mais faisait robjet de descriptions disparates. II n'avait pas en effet echappe aux anatomopathologistes qu'& c6te de la necrose, les cellules pouvaient aussi mourir en se contractant (necrose de coagulation ou necrose acidophile) ou en prenant une forme arrondie, comme momifiee (corps de Councilman), avant d'etre fragmentees en corps apoptotiques, ensemble de caracteres morphologiques totalement differents de la necrose o~ la cellule qui meurt presente une atteinte de sa membrane plasmique, un gonflement generalise ou ballonisation suivis d'une destruction de tous ses organites, en particulier des mitochondries. Toutefois, I'apoptose ne faisait pas, sauf exception [5], I'objet de descriptions detaillees et, d'une fagon generale, bien qu'assez souvent signalee en pathologie, elle etait plutSt consideree comme une curiosite morphologique mal expliquee. Apres la description princeps de Kerr et al., I'apoptose est restee pendant pres de 15 ans pratiquement ignoree bien que I'equipe de Kerr [41 ] ait insiste largement sur ses particularites morphologiques et sur son importance en pathologie. II revient toutefois & Wyllie d'avoir montre des 1980 [39] que la condensation de la chromatine avait une traduction biochimique particuliere caracterisee par la fragmentation reguliere de I'ADN en oligonucleosomes et en nucleosomes, structures qui constituent, comme on salt, le premier niveau d'organisation du filament d'ADN dans le noyau. Bien plus, Wyllie avait, des cette date, emis I'hypothese que cette fragmentation resultait vraisemblablement de I'activation d'une enzyme nucleaire, probablement une endonuclease, hypothese confirmee en 1998 [40].
L
necrose-
genes-
caspases.
Summary
In this introduction, the concept of apoptosis is defined and the main steps leading to the characterization of this form of cell death are described. Differences between apoptosis and necrosis, the other form of cell death, are underlined. The reasons why apoptosis is also called programmed cell death are explained by describing the role of several pro or anti-apoptotic genes. The place of apoptosis in cell physiology and in many physiopathologic and pathologic conditions is emphasized. Finally, the therapeutic appfications resulting from the recent discovery of caspases, a group of cysteine proteases which seem to play an essential role in apoptosis, are illustrated by some examples. Apoptosis - necrosis - genes - caspases.
a Inserm U.327 Faculte de medecine Xavier-Bichat Universite Paris 7-Denis-Diderot B.P. 416 758?0 Paris cedex 18 article re£u le 5 octobre, accepte le 20 novembre 1998.
© Elsevier, Paris. RevueFranqaisedes Laboratoires,mars 1999, N° 311
Malgre I'importance de ces travaux, I'apoptose n'a acquis droit de cite que Iorsqu'on a compris que, contrairement & la necrose subie passivement par la cellule & la suite d'une agression exterieure, I'apoptose etait un phenomene actif necessitant de I'ATP et dependant de genes pro ou anti-apoptotiques. Cette decouverte essentielle a ete faite par Horvitz et son equipe [9] Iors de leurs etudes des mutants du nematode Caenorhaditis elegans. Ce vers presente la particularite de voir mourir par apoptose pendant son developpement un nombre constant de cellules. I 'analyse des facteurs intervenant dans cette mort naturelle a ainsi permis d'individualiser toute une serie de genes contr6lant I'ensemble des etapes de I'apoptose et dont trois ont paru d'emblee importants, les genes ced-3 et ced-4 dont I'expression favorise 27
Dossier scientifique Apoptose
le programme de mort cellulaire [9] alors que le gene ced-9 I'inhibe [19]. ,/k peu pres parallelement & ces travaux, une autre equipe a individualise en 1988 & partir du point de cassure de la translocation t(14;18) des lymphomes humains & cellules Bun autre gene, appele bcl-2 (B-ceil lymphoma), qui, quand il etait transfecte in vitro dans des cellules hematopoi"etiques, prolongeait de faoon significative la survie de ces cellules [36] et ceci, comme on s'en est rapidement aper?u, en bloquant I'apoptose [22]. Uetude des effets de la transfection du gene humain bcl-2 dans le nematode Caenorhabditis elegans [37], puis I'analyse de la structure des genes bcl-2 et ced-9 et des proteines qu'ils codent ont alors montre leur etroite analogie [20]. Un autre pas essentiel a ete franchi quand on a constate que le gene ced-3 codait une proteine dont la structure etait tres proche d'une proteine existant chez I'homme, I'enzyme de conversion de I'interleukine-1 -]3 [42]. Cet enzyme fait partie d'une famille de proteases, les proteases & cysteine dont dix au moins sont connues chez I'homme [8] et qu'on a appele caspases (pour cysteine aspartate specific proteinases) [2] & partir de leurs homologies structurales et fonctionnelles. Bien que d'autres proteases interviennent aussi dans I'apoptose, on s'est alors rendu compte que les caspases jouaient un rele essentiel dans la destruction apoptotique car elles pouvaient degrader un nombre important de proteines necessaires & la vie de la cellule [33]. Ces decouvertes ont alors donne & I'apoptose une dimension nouvelle et rapidement fascinante. Non seulement I'apoptose est differente de la necrose, tant sous I'angle morphologique que biochimique, mais de plus le deroulement de cette forme de mort cellulaire est sous un etroit contrele genetique. On a ainsi realise que I'apoptose representait une fonction cellulaire, jusqu'alors ignoree, et qui occupait une place probablement importante dans la cellule tout comme la differenciation ou le cycle cellulaire [38]. I 'apoptose est ainsi sortie du cadre de la pathologie pour devenir une fonction essentielle de la cellule normale. A partir de 1990, les travaux sur I'apoptose ont augmente de fa?on exponentielle et encore actuellement, en 1999, cinq & six cents publications consacrees a la mort cellulaire programmee, expression souvent utilisee pour designer I'apoptose, paraissent chaque mois dans la litterature biomedicale internationale. II est donc impossible dans cette courte introduction de resumer I'ensemble de ces travaux. Tout au plus peut-on essayer de degager une orientation generale. Tout d'abord, I'apoptose est un phenomene qu'on observe dans toutes les cetlules vivantes normales, aussi bien dans celles des mammiferes que celles des invertebres et qui existe chez les bacteries et aussi probablement dans les cellules vegetales. On trouve de I'apoptose chez I'adulte comme chez le foetus. Chez I'adulte, on s'accorde & penser que la mort cellulaire programmee est le pendant naturel de la multiplication cellulaire, c'est-&-dire que le renouvellement cellulaire normal est contrebalance par I'apoptose [1 O, 23]. L'apoptose contrele ainsi 6troitement I'homeostasie cellulaire, terme qui designe I'equilibre existant dans tout tissu adulte normal entre proliferation et mort cellulaire. Ceci explique par exemple que dans les epitheliums & renouvellement cellulaire rapide, comme I'epithelium intestinal, il y ait beaucoup de cellules en apoptose alors que dans ceux & renouvellement lent, comme I'epithelium hepatique, il y e n ait peu. Chez le foetus, I'apoptose intervient des les premieres etapes de I'embryologie et & tousles stades de I'histogenese et de I'organogenese. C'est I'apoptose qui survient par exemple dans la destruction des neurones surnumeraires ou dans la regulation du nombre des lymphocytes T [3]. C'est aussi par apoptose que se fait la disparition de vestiges embryologiques ou des membranes interdigitales [3]. Quel que soit I'organe ou la cellule, une fois declenchee, I'apoptose prend toujours le meme aspect morphologique, tandis que I'ADN se fragmente constamment en nucleosomes et que plusieurs caspases sont activees. L'apoptose presente egalement deux autres particularites. Quand on a pu la mesurer in vivo, on a constate que c'etait un phenomene rapide : pas plus de trois & quatre heures par exemple dans le foie [6]. C'est egalement une mort silencieuse qui, contrairement& la necrose, ne provoque aucune reaction inflammatoire cellu28
laire et ne laisse dans le tissu aucune trace susceptible de I'identifier, en particulier aucune reaction mesenchymateuse & I'origine d'une fibrose. Ceci explique que meme actuellement les morphologistes peinent pour reconnaTtre et quantifier I'apoptose dans les tissus alors qu'ils identifient facilement la necrose. Pendant quelque temps, les histopathologistes ont cru que la fragmentation de I'ADN pouvait etre mise en evidence dans les cellules gr&ce & des techniques de biologie moleculaire utilisant des nucleotides marques susceptibles de Iocaliser dans les noyaux apoptotiques les extremites libres du filament d'ADN. La plus populaire de ces techniques, la technique TUNEL [12], acronyme qui a probablement favoris~ sa diffusion, est alors devenue un outil banal pour reperer I'apoptose aussi bien dans les tissus que dans les cellules en culture. Des doutes serieux existent toutefois maintenant sur la specificite de cette technique ou de ses variantes d'autant qu'on a montre qu'on pouvait aussi mettre en evidence par cette technique la fragmentation irreguliere du filament d'ADN qui survient dans la necrose [15] et que les conditions de son utilisation variaient de tissu & tissu et devaient etre particulierement rigoureuses excluant en pratique tout emploi en routine [26]. Aussi, la coloration histologique classique, I'hematoxyline/eosine et la microscopie electronique, si on peut la faire, restent toujours d'actualite pour reconnaftre la cellule en apoptose [11]. In vitro, la situation est heureusement differente. L'utilisation de fluorochromes s'intercalant specifiquement dans les bases d'ADN, comme le DAPI, permet de reconnaftre sans difficulte la condensation de la chromatine et la fragmentation du noyau. Ces memes fluorochromes peuvent aussi etre utilises en cytometrie en flux ce qui permet de quantifier de fa?on precise, mais toujours in vitro, le phenomene apoptotique. Ceci explique que bien qu'il y ait encore des incertitudes sur I'importance de I'apoptose & I'etat normal et en pathologie, un nombre considerable de publications a et6 fait ces dernieres annees sur les conditions de survenue de I'apoptose in vitro. On salt en effet que I'apoptose peut etre declenchee ou au contraire inhibee dans de multiples circonstances physiologiques ou physiopathologiques differentes [35]. On peut dire ainsi que beaucoup de perturbations metaboliques locales ou generales peuvent declencher la survenue de I'apoptose. Par exemple, quand une cellule se detache de son support matriciel, elte peut entrer en apoptose [27]. Quand certains facteurs de croissance sont retires du milieu de culture, ou quand certaines hormones sont deficitaires, en particulier les hormones sexuelles comme les estrogenes ou les androgenes, I'apoptose peut survenir dans les cellules cibles contrelees par ces facteurs de croissance ou ces hormones [35]. Certaines cytokines, comme le TNFo~ [35] provoquent la mort cellulaire programmee alors que d'autres comme I'interleukine-2 I'inhibent [3]. Les radiations et les rayons UV sont inducteurs d'apoptose [35]. De nombreux medicaments, en particulier des medicaments anticancereux, peuvent declencher I'apoptose [24, 35]. La Iiste des substances toxiques pro-apoptotiques s'allonge de jour en jour altant de molecules uniquement utilisees en laboratoires, comme le tetrachlorure de carbone [32], & des toxiques d'emploi courant comme I'alcool [13]. En d'autres termes, de multiples signaux sont capables d'induire I'apoptose. Est-ce & dire que tous peuvent dectencher le meme programme genetique qui contrele le deroulement de ce type de mort cellulaire ? Au stade de nos connaissances, il n'y a pas encore de reponse parfaitement claire car il existe plusieurs voles moleculaires qui aboutissent & la destruction de la cellule par apoptose [14]. Quelques exemples permettront de mieux comprendre la complexite des mecanismes qui, apres le signal initial, enclenchent I'apoptose. Le premier est fourni par les lesions de I'ADN. On salt que si on provoque une lesion de I'ADN par irradiation ou chimiotherapie, la cellule reagit en surexprimant le gene p53 qui bloque la division cellulaire en phase G1 jusqu'& la reparation de I'ADN. Si cette reparation ne s'effectue pas, le gene p53, qu'on a appele aussi te gardien du genome, peut provoquer une apoptose dont le mecanisme est complexe [4], I'apoptose pouvant survenir de differentes fa?ons dont I'une depend de I'action de la proteine p53 sur I'un des genes de la famine bcl-2, le gene bax qui lui est pro-apoptotique RevueFran?aisedes Laboratoires,mars1999, N° 311
[28]. Neanmoins, le gene bcl-2 peut bloquer I'apoptose induite par le gene p53 (7). On touche I& du doigt la finesse de la regulation genetique de I'apoptose, dont I'un des elements les plus etudies actuellement est represente par les genes de la famille bcl-2 dent certains, comme le chef de file bcl-2, mais aussi les genes bcI-XL, bcI-W, etc., bloquent I'apoptose alors que d'autres, comme les genes bax, bcI-Xs ou bad, provoquent I'apoptose [1] en agissant soit directement, soit indirectement, sur I'activation des caspases [1 ]. Un autre exemple est fourni par le systeme Fas et son ligand. II existe & la surface de certaines cellules une proteine trans-membranaire, la proteine Fas/apo-1 (CD 95) dont le domaine cytoplasmique a ete appele" domaine de mort " car, quand cette proteine est oligomerisee, par exemple sous rinfluence de son ligand, la structure biochimique du domaine cytoplasmique est reconnue par une proteine d'association qui active une caspase, la caspase 8, activation a I'origine d'une cascade d'activations enzymatiques, en particulier de la caspase 3 qui semble jouer un rele essentiel dans ce type d'apoptose [29]. Dans cette situation, il est admis que la vole de Fas court-circuite largement les genes de la famille bcl-2 [1]. Un troisieme exemple est fourni par le comportement de certains virus, en particulier de certains adenovirus dont les proteines presentent des homologies avec la proteine du gene bcl-2 [34], et qui, quand ils penetrent dans la cellule, inhibent I'apoptose, favorisant ainsi la survie cellulaire et la multiplication virale. ,/k I'inverse, il existe plusieurs virus qui provoquent I'apoptose [34] (sans apparemment passer par le gene bax) empechant ainsi la dissemination virale du fait de rencapsulation des virions dans les corps apoptotiques ou au contraire protegeant ces virus de I'action destructrice des anticorps neutralisants [34]. Si on aborde maintenant le cadre de la pathologie humaine et de I'apoptose, on peut classer les maladies en deux groupes, celles oQ I'apoptose est deficitaire et celles au contraire ot~ elle predomine [21, 35], une classification commode mais qui reste provisoire & cause des difficultes qu'on rencontre & quantifier in vivo le nombre de cellules en apoptose. Dans le premier groupe, on met certaines maladies autoimmuRes et le cancer ou au moins certains cancers oQ il est assez generalement admis que la perte de I'homeostasie cellulaire serait due & un deficit en apoptose [10, 16, 24], idee qui entrafne la recherche de nouvelles strategies therapeutiques pro-apoptotiques pour contrebalancer I'anarchie proliferative. Dans le deuxieme groupe, en plus du sida ou I'action pro-apoptotique du VIH a ete I'une des premieres reconnues [17], on place un grand hombre de maladies chroniques ou degeneratives, en particulier neurologiques [21,35], mais aussi certaines maladies hematologiques, cardiaques ou hepatiques ainsi que I'ischemie cardiaque ou cerebrale [21, 35]. Une potentielle applica-
tion therapeutique provient de I'etude des caspases. Ces enzymes semblent faciles & inhiber par des petits peptides de synthese capables d'agir in vivo [8]. Si, experimentalement, on declenche une activation de la proteine Fas, on provoque une hepatite fulminante caracterisee par une apoptose massive des hepatocytes [30]. On peut alors inhiber cette apoptose gr&ce & ces peptides [31]. Dans le meme ordre d'idee, on vient de montrer que differents inhibiteurs de caspases pouvaient reduire de faoon significative les lesions d'ischemie cerebrale induite experimentalement chez le rongeur [18]. Ces observations ouvrent evidemment la vole &bien des possibilites therapeutiques. Finalement, faut-il penser que la necrose n'a plus droit de cite et que I'apoptose est la principale forme de mort cellulaire ? Rien ne serait plus inexact. De nombreuses conditions physiopathologiques ou pathoIogiques qui s'accompagnent d'une apoptose peuvent aussi comporter une necrose. Devant un meme agent inducteur, une cellule peut mourir soit par necrose, soit par apoptose. On e n a de multiples exemples. Dans les hepatites virales humaines, coexistent dans le foie les deux types de mort cellulaire. Experimentalement, une meme drogue peut induire soit I'un, soit I'autre type de mort, sans qu'on en connaisse la raison. Aussi, ces observations illustrent I'une des tendances actuelles de certains specialistes de I'apoptose : necrose et apoptose ne seraient que les deux facettes d'un meme phenomene aboutissant & la destruction de la cellule et I'organite responsable de la mort cellulaire, quel que soit son type, ne serait pas le noyau, mais la mitochondrie. Alors que celle-ci est gravement atteinte dans la necrose, elle reste en principe intacte au cours de I'apoptose. Toutefois, comme le soutiennent plusieurs equipes dont celle de Kroemer [25] qui I'a observe avec beaucoup d'inducteurs d'apoptose, avant que la cellule prenne I'aspect morphologique caracteristique d'apoptose, cet organite peut etre altere fonctionnellement au niveau de sa membrane interne, alteration qui permet alors le passage dans le cytoplasme de la cellule de certains constituants mitochondriaux susceptibles d'activer les caspases, le contrele de cette activation etant sous la dependance des genes bcl-2 et bax. Si, pour des raisons encore mal elucidees (dose de toxique, susceptibilite de la cellule, micro-environnement defavorable, etc.), I'alteration mitochondriale se poursuit, une necrose qualifiee alors de post-apoptotique apparaff. Que cette conception s'applique & toutes les conditions ot~ apoptose et necrose sont presentes, en particulier en pathologie humaine, cela reste a demontrer mais illustre le formidable progres que le concept d'apoptose a introduit ces derRieres annees dans la connaissance de la physiologie et de la physiopathologie de la mort cellulaire.
R .f rences
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