Le poumon et son épithélium

CELLULESCIBLES

Le et son 6pithklium De grands

espoirs ont he’ place’s dam le traitement de la mucouiscidose par the’rapie ge’nique. Les premiers essais cliniques, tout en montrant la faisabilite’ d’une telle approche, incitent h adopter un optimisme prudent. a mucoviscidose (cystis fibrosis ou CF) est la plus frequente des maladies genetiques graves dans les populations d’origine europienne. Bien que d’autres epitheliums soient touches, c’est l’atteinte de l’epithelium respiratoire, avec ses manifestations pathologiques pulmonaires, qui fait la gravite de cette maladie monogenique a transmission autosomique recessive. Le clonage, en 1989, du gene CFTR (cystic fibrosis trammembrane conductance regulator), qui code une proteine membranaire ayant au moins un role de canal chlore, et la mise au point de diverses methodes de transfert de genes ont place de grands espoirs dans la therapie genique (1,2). En effet, meme si une connaissance approfondie des roles de la prottine CFTR peut ouvrir la voie a d’autres approches therapeutiques, notamment pharmacologiques, la therapie genique vise a itre un traitement radical et global.

effet, dans le cas particulier de l’ipithilium respiratoire, on ne peut guere envisager de recourir a la c(classique j) strategic ex vivo qui consiste a prelever le tissu cible, a le corriger genetiquement in vitro puis a le reimplanter in vivo. Bien que I’epithelium respiratoire soit assez facilement accessible par voie aerienne (instillation, aerosol), toute strategic de therapie ginique in vivo reste cependant delicate (2). D’une part, l’epithelium respiratoire a une structure complexe qui presente divers types cellulaires en surface et des glandes sous-muqueuses en profondeur. D’autre part, il s’etend sur une grande surface et sa structure varie tout au long des voies respiratoires, depuis la trachee jusqu’aux bronchioles. Enfin, dans la mucoviscidose, les voies aeriennes sont le siege d’un Cpais mucus, d’importants phenomenes inflammatoires et d’infections h repetitions.

> Une strategic de therapie genique in viva

> Quelles

Des strategies ont ete developpees pour transferer, au moyen de divers vecteurs, une copie normale du gene CFTR dans I’ipithClium respiratoire afin de complementer les deux alleles mutes (monogenotherapie somatique d’addition). Toutes sont bakes sur l’administration in viva du vecteur porteur du gene CFTR normal. En

La nature des cellules cibles qui doivent Otre corrigees par transfert du gene CFTR n’est pas encore parfaitement itablie (2, 3). Ceci reflete la comprehension encore imparfaite des mecanismes physiopathologiques de la mucoviscidose. En effet, alors que l’expression du gene CFTR est principalement localisee au niveau

cellules

cibles

?

* lnserm

U120,

HBpltal

Robert-

Deb&

48, bd

SBrurler. 75019

des glandes sous-muqueuses des voies aeriennes proximales (4), l’atteinte respiratoire clinique touche d’abord les voies aeriennes peripheriques. 11 apparait done crucial de savoir si l’on peut se contenter d’un transfert de gene
(1) SF Collins (1992)

Science256,774. 779. (2) P Lehn et a/ (1996) Mucoviscidose : de la theorie B la pratique. J Navarro et G Bellon (eds). iditions Espaces 34, Montpellier, France, pp 227-246.

(3) M Merten et F Becq (1995) Med &ill, 1442-1446.

(4) J Engelhardt eta/ (1992) Nat Genef 2. 240-248.

(5) JM Wilson (1995) J C/in lnvesf 96, 2547-2554.

(6) LG Johnson eta/ (1992) NatGenef2. 21-25.

+*

BIOFUTLJR 162

l

Decembre1996

Paris.

39

CELLULESCIBLES

(!)TR Flotte eta/ . (1993) Pm Nat/ Acad Sci USA 90, 10613-10617.

(8)A Pavirani eta/ (1996) Med Sci 12,

25-33.

(9) P Lehn eta/ (1996) Arch Pediatr 3 (suppl1),88-92.

(1O)JP Bioconjug

Behr(1994) Chem 5,

382-389.

(11) JPVigneron

et al (1996) Proc Nat/ Acad Sci USA 93, 9682-9686.

LidCal serait d’obtenir par thlrapie genique un effet i long terme, voire permanent. La duree de ce dernier dependant i la fois de la stabiliti du transgene dans les cellules transfectees et de la persistance de celles-ci, il serait particulierement intiressant d’arriver 1 corriger de facon stable les cellules souches de l’epithelium respiratoire. Mais il faudrait pour cela avoir determine la nature de ces cellules et disposer de vecteurs adequats... En effet, les vecteurs actuellement disponibles (adenovirus recombines, liposomes) ne permettent qu’une modification genetique transitoire (transgene instable en position extrachromosomique). 11 est necessaire, par consequent, de proceder i des administrations rep& tees. Certains programmes de recherche visent ainsi la correction des mutations du gene CFTR au niveau mime du genome des cellules cibles ou le transfert de structures genetiques stables (grands Cpisomes, vecteurs AAV [adeno-associated zkus])

(12)F Dupuit eta/ (1995) Hum Gene Ther6,1185-1193.

(13) B PBault ef al (1994) Hum Gene Ther4,1131-1137.

(7)

> Les vecteurs actuels Des vecteurs retroviraux ont Cti utilises lors des etudes initiales in vitro. Ceci a permis de dtmontrer que le defaut de transport du chlore de cellules CF pouvait etre corrige par le transfert d’une unique copie d’ADNc du gene CFTR normal. Cependant, l’emploi de ces vecteurs in vivo au niveau d’un epithelium h renouvelle-

ment plutdt lent - c’est le cas de l’epithelium respiratoire - est a priori limit6 par leur specificit pour des cellules en division, leur labiliti in z&o et le faible titre de leurs stocks viraux (voir article Les ve’hicules de E’ADN) . En revanche, les vecteurs adenoviraux presentent des caracteristiques inttressantes pour la transfection in viva de l’epithelium respiratoire (8) : un tropisme respiratoire marque, la possibilite d’infecter des cellules quiescentes aussi bien que des cellules en division, des particules virales resistantes, des stocks viraux de titre eleve. Mais ils presentent un serieux inconvenient : ils entrainent une reaction inflammatoire avec reponse immunitaire cytotoxique contre les cellules transduites, d’oti une limitation dans le temps de leur effet et la necessite d’administrations repetees. Ceci est d’autant plus g&rant dans le cas de la mucoviscidose qu’il existe deja un fort contexte inflammatoire. Le but des recherches actuelles est de mettre au point un vecteur adenoviral qui permette une duree d’expression du gene CFTR suffisamment longue saris entrainer de reaction inflammatoire trop intense afin de pouvoir effectuer des r&administrations efficaces et pas trop frequentes. Un emploi judicieux d’immunosuppresseurs pourrait d’ailleurs ttre utile ici. Les vecteurs viraux posent aussi des problemes de securite de fabrication et d’emploi (et par consequent de tout). Les recherches se sont done

Transfert du gene LacZ dans une culture primaire de cellules 6pith6liales respiratoires humaines A I’aide d’un vecteur adbnoviral (fourni par Michel Perricaudet, Villejuif). Les cellules transfectbes (bleu) sont situ6es en p&iph&ie de I’agrbgat cellulaire. 40 BIOFUTUR162

l

Dkembre1996

igalement orientees vers la mise au point et l’utilisation de vecteurs synthetiques (9) (voiv article Les v&icules de I’ADNj. Ces vecteurs chimiques, qui peuvent complexer I’ADN par interactions ilectrostatiques, sont generalement employis pour transferer des plasmides d’expression eucaryote dans les cellules. Au niveau de I’epithelium respiratoire, on a principalement utilist des lipides cationiques. Divers types de ces lipides ont id synthetises. 11ssont souvent utilises sous forme de liposomes (10, 11). Les recherches actuelles visent a ameliorer leur efficacite en leur conferant des caracteristiques mimant des proprietes virales essentielles pour le cheminement intracellulaire jusqu’au noyau (ccvirus synthetiques )j).

> Des Etudes prrhliniques... De nombreuses etudes in vitvo ont test& l’efficacite de divers vecteurs viraux ou chimiques au niveau de lignees cellulaires d’origine pulmonaire et de cultures primaires d’epithelium respiratoire humain, notamment dans le but de caractiriser les cellules effectivement transfectees sur le plan biologique (12). Les etudes precliniques in vivo ont, quant i elles, CtC effectuees chez des animaux sains (souris, rats, rats des cotonniers, primates...) ou chez des modeles murins de la mucoviscidose (souris CF). Elles ont demontre l’efficacite transitoire des vecteurs adenoviraux pour transferer par instillation ou par aerosol divers genes, dont le gene CFTR, au niveau de l’epithelium respiratoire (8). Le rat des cotonniers a souvent et6 utilise, car sa sensibilite a l’adenovirus sauvage est voisine de celle de l’homme. Les adenovirus se sont aussi rev&s efficaces chez divers primates (babouins, singes rhesus), dont l’epithelium respiratoire (anatomic, physiologie) est voisin de celui de l’homme. Les primates constituent done un bon modele preclinique de faisabilite pratique. Mais ces experiences ont aussi rtvelt la manifestation possible d’une reaction inflammaaigue toire dose-dependante. Enfin, l’efficaciti des vecteurs adinoviraux a ete demontree dans un modele de xtnogreffe d’epithelium respiratoire fcetal humain chez des souris immunodeficientes (souris SCID) (13). Divers types de liposomes cationiques ont aussi ttt utilises lors

d’Ctudes prkcliniques in viva chez des souris saines ou des souris CF (9). Les complexes lipides-ADN ont gtnkalement ttC administres par instillation intratrachtale ou par aCroso1. Uemploi de &es rapporteurs a permis de dimontrer une transfection variable et transitoire chez des souris saines. Surtout, des mesures klectrophysiologiques ont permis de montrer que les anomalies de transport du chlore pouvaient Etre partiellement, voire compkement, corrigkes de faGon transitoire au niveau de l’tpithklium respiratoire de souris CF aprks transfert de plasmides CFTR (14). > . . . aux essais cliniques Les rkultats des travaux in vitro et surtout in viva chez I’animal ont ouvert la voie aux premiers essais cliniques de thkrapie gCnique de la .mucoviscidose, en dCpit des incertitudes concernant, notamment, les mkanismes physiopathologiques de la maladie humaine, la nature des vkritables cellules cibles, l’efficacitk de transfection nkessaire pour obtenir un reel eifet thkrapeutique et

la nature du vecteur id&al. En effet, si l’on prend en compte la structure de l’ipith6lium respiratoire, les conskquences pathologiques du dlficlt en CFTR et la sensibilitk aux vecteurs, notamment adknoviraux, il n’existe pas actuellement de modkle animal c(parfait >b). D’oti I’inttrit d’essais cliniques bien construits et informatifs, au moins sur le plan biologique. Les quelques essais de phase I dCji rCali& ont fait appel, soit 3. des adknovirus recombinks, soit 2 des liposomes cationiques pour transfkrer le gkne CFTR humain normal au niveau de la muqueuse nasale ou bronchique chez des patients atteints de mucoviscidose. Leur objectif Ctait de tester la faisabilitk, 1’efficacitC biologique et la toxicitt du vecteur employ6 (2, 15, 16). 11s ont montk qu’il Ptait possible de transfkrer de faGon transitoire le gtne CFTR dans l’ipithilium respiratoire et d’y dktecter son fonctionnement, notamment par des mithodes klectrophysiologiques. Une &action inflammatoire nasale et pulmonaire a Ct6 notke avec l’adknovirus g fortes doses, alors qu’aucune toxicit loca-

Pour tout savoir dans le domaine

le n’a et6 observie au niveau nasal avec des liposomes cationiques. Ces essais ont done abouti g des risultats positifs, mCme si ceux-ci ne sont pas aussi fantastiques que le laissait espCrer I’hypermidiatisation de l’approche en thkrapie gknique.

(14) SC Hyde eta/ (1993) Nature362. 250-255.

z=Un optimisme prudent

(16) G Bellon and A

Une meilleure connaissance des mtkanismes physiopathologiques de la mucoviscidose et la mise au point de meilleurs modkles animaux devraient permettre dans le futur de dtvelopper des strakgies plus efficaces de thkrapie gknique employant des vecteurs encore plus performants. La vectorologie reste kidemment ici aussi le fer de lance de la th&-apie gkique. Par ailleurs, la multidisciplinaritk de ce type de recherche thkrapeutique invite ?I une collaboration encore plus 6troite entre chercheurs de diverses disciplines, partenaires industriels et cliniciens en charge des patients, afin de permettre g la phase actuelle (cd’optimisme prudent )) de dkboucher sur les progrks scientifiques nicessaires et leur application clinique.

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(15) RG Crystal (1995)Science270, 404-410.

Pavirani (1996) Arch Pmdf3 (suppl 1). 82-87.

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