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Le sort et les effets de DNA hétérologue injecté dans des ȩufs de Batraciens en cours de développement
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Experimental
LE
SORT
INJECTa
ET LES DANS
EFFETS
DES
DE
(EUFS
1967 by Academic
Cell Research
DNA
Press Inc.
45, 146-157
(1966)
Hl?Tl?ROLOGUE
DE BATRACIENS
EN COURS
DE DfiVELOPPEMENT I.
ETUDES
CVTOLOGIQUES
ET
AUTORADIOGRAPHIQUES
E. SEMPIliSKAl Laboratoire
de Morphologie
animale,
Faculc6 Bruxelles, Repu
des Sciences, Belgique
le 5 aoQt
UniversitQ
Libre
de Bruxelles,
1966
DE
nombreux auteurs ont deja etudie le probleme de la p&r&ration et de l’utilisation biologique du DNA exogene dans differents systemes in vivo et in vitro. Une revue de ces travaux a paru recemment [7]. Ce qui est commun aux experiences de ce genre c’est que les molecules de DNA doivent traverser la membrane cellulaire avant d’atteindre l’interieur de la cellule et le noyau. Le probleme de la pinocytose et des conditions qui peuvent la faciliter se posent done en premier lieu. Des injections directes dans l’ccuf, surtout quand il se trouve au stade d’un ou deux blastomkres, permettent d’echapper a toutes les difficult& likes a la penetration de macromolecules a travers les membranes cellulaires. Billett et ~011. [I] ont entrepris un premier essai de transformation genetique chez les Amphibiens en injectant du DNA homologue extrait d’axolotls noirs dans les ccufs d’axolotls blancs. On pouvait espkrer un changement du phenotype blanc en noir, mais ces essais n’ont pas donne de resultats positifs. Les experiences de Fox et ~011. [4, 51 ont eu plus de succes : ils ont reussi a transformer un type mutant en l’espece sauvage et vice versa chez la Drosophile, par un traitement des ccufs in vitro avec le DNA correspondant extrait des mouches. Le travail que nous avons entrepris avait pour but 1’Ctude systkmatique du sort du DNA heterologue inject6 dans les ccufs des Batraciens apriis la fecondation et de son influence Cventuelle sur le developpement ulterieur des ceufs. 1 Adresse Experimental
permanente: Cell
Universitk
Research
45
de Mdi,
Dkpartement
de Biochimie,
Cdi,
Pologne.
DNA hktkrologue
injectt
MATkRIEL
dans des ceufs de Bafraciens ET
MtiTHODES
Nous avons travail16 sur des ceufs de Pleurodkles obtenus par injections aux femelles de Pregnyl (150 unit& par animal). Nous avons employ6 des ceufs au stade de deux ou quake blastomkres ou de morula-blastula. Nous avons inject6 aux ceufs: (I) du DNA de tbymus de veau (Sigma Typ I); (2) du DNA de E. coli, marqu6 au tritium. 1 Le DNA de tbymus a CtC employ6 surtout pour 1’Ctude des effets cytologiques (aprhs coloration j 1’Unna ou au Feulgen). Le DNA de E. coli a permis de suivre le sort du DNA hCtCrologue, inject6 dans les ccufs, par la mkthode autoradiographique. Ce DNA de E. coli a Ct6 p&park selon la mkthode de Marmur [S] g partir de E. coli CR,,Th-, cultivk en prksence de thymine-3H. Son activitk spkcifique Ctait d’environ 2.106 dpm/pg. Pour les injections, on a employ4 des aiguilles de verre prCparCes g l’aide d’une microforge de Fonbrune. Le volume inject6 Ctait voisin de 0,05 ~1. Les concentrations de DNA Ctaient : pour le DNA de thymus 1-3 mg/ml (dans 0,l M NaCl), pour celui de E. coli 250-300 pug/ml (dans 0,l M NaCl ou SSC).z Les ceufs ont CtC inject& dans l’un des deux premiers blastomkres ou dans la cavitt! blastocklienne (au stade de morulablastula). Pour l’autoradiographie, on a employ4 l’emulsion Ilford G5, qui permet de distinguer le marquage provenant du tritium, de la pigmentation des aeufs. Les d&ails de la technique ont Ctk dtkrits ailleurs [3]. Nous avons aussi CtudiC cytologiquement les effets d’injections de DNA de thymus de veau suivies par celles d’histones.3 Les effets des histones seules, sur le mktabolisme des acides nuclkiques et le dkveloppement des oeufs des Batraciens ont CtB CtudiCs par Brachet [2]. R&S
Observations
cytologiques
ULTATS
sur les ozufs inject&
avec du DNA
de thymus
de veau
Injections au stade de 2-4 blastomt!res.-Les ceufs ont @t6 fix& au Zenker 4, 2, 24 h, exceptionnellement 48 h, aprks l’injection du DNA de thymus de veau puis enrob& B la paraffine selon la m&hode usuelle. Les prCparations ont 6th examinCes au microscope aprits coloration B 1’Unna ou au Feulgen. Les premiers clivages des aeufs inject& &aient souvent irrcguliers; en particulier, la rkgion proche de l’endroit piqu6 se divisait plus lentement. La fig. 1 montre que ces ir&gularit& sont m&me visibles au stade blastula. On voit q’une partie de DNA inject6 est restke encore sous une forme suffisamment polym6risCe pour donner une coloration 5 1’Unna (en vert-violet) ou au Feulgen. Ces irrCgularit6s de la segmentation ont 6t6 suivies, dans la plupart des cas ( >90 %), par la cytolyse d’embryon au stade blastula ou par de l’exogastrulation. Dans les embryons les plus avan& on peut ob1 Prepare dans le laboratoire du Dr. L. Ledoux, C.E.N., ,Mol, Belgique. 2 SSC - 0,15 M NaCl + 0,015 M Na-citrate. 3 Les histones ont CtB preparkes A partir de thymus de veau par le Dr E. Schram. Experimental
Cell Research
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E. Sempiriska
Fig. l.-auf de pleurodele 24 h aprks l’injeclion de DNA de thymus de veau dans l’un des deux blastomhres. Coloration h I’Unna. On peut observer des irrCgularitCs darts la segmentation et on retrouve du DNA qui n’a pas dtk incorpork dans les noyaux des cellules de l’embryon. La teintc de la coloration (vert-violet) indique que ce DNA se trouve encore sous une forme polymkriske. Fig. 2.--3H-DNA quelques minutes
de E. eoli inject6 aprks l’injection.
dans
l’un
des deux
blastomizrei.
Image
autoradiographiquc
server de l’oedirme, ou des territoires dont le d6veloppement s’est a&t6 d&s la segmentation. Injections au stade morula ou blastula.-Les ceufs ont Cti: Egalement fix&s au Zenker (4, 2, 24 h, 3 jours et 7 jours apr6s l’injection du DNA), et enrob& SI la paraffine. L’examen microscopique des coupes a r~v~lC que le DNA inject6 persiste pendant un temps relativement long dans la cavitC blasto&lienne. Une demie et 2 h apr&s l’injection, on peut y observer une coloration verte (B L’Unna), qui progressivement passe au rouge-violet. Cette augmentation de la pyroninophilie est probablement un signe d’une lente degradation du DNA inject& Au tours du dt%eloppement ultkrieur des embryons inject&, on observe souvent un retard de la formation du syst&me nerveux et l’apparition d’oedkmes. Experimentat
Cell
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DNA IzCtCrologue inject6 dans des ozufs de Batraciens
Fig. 3.--3H-DNA 4 h apres l’injection.
de E. coli inject6 dans l’un des deux blastomeres. On observe que la radioactivite entoure les noyaux
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Image autoradiographique et commence a y penetrer.
Fig. 4.--3H-DNA de E. coli inject6 dans l’un des deux blastomeres. Image autoradiographique 24 h apres l’injection. On trouve de la radioactivite tant dans les noyaux que dans le cytoplasme, souvent sous la forme de masses compactes. On constate des irregularites dans la segmentation des oeufs.
Les injections dans le blastocele sont beaucoup moins toxiques pour les embryons que les injections faites aux premiers stades du developpement. Le pourcentage d’embryons qui se developpent jusqu’a l’eclosion depend de la concentration du DNA inject& Les concentrations superieures a 1 mg/ml (le volume inject& etant toujours de 0,05 ,ul) sont les plus toxiques; le poureentage des embryons qui atteignent le stade de tetards ne d&passe pas, dans ce Gas, quelques pourcents. Etudes autoradiographiques Injections au stade de deux ou quatre blastomkres.-Les aeufs ont 6th fixes dans de l’alcool-acide acetique (10:0,6), 3 h, 6 h et 24 h apres l’injection. Le tiers des preparations a ete soumis B l’action de l’acide trichloracetique Experimental
Cell Research
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E. Sempiriska
Fig. !I-~H-DNA de jeune blastula.
de E. co[i inject6 dans la cavitk blastocClienne d’un Image autoradiographique 2 h aprks I’injection.
Fig. 6.-Autoradiograpbie radioactivitk dans le tube
d’un Ward digestif.
2 h apr&
l’injection
de 3H-DNA
oeuf de pleurod&le
au stade
de E. coli. On retrouve
la
(TCA) 3 % a 0°C afin de verifier si le DNA n’a pas subi de degradation. Les coupes ont et6 traitees par quatre bains de TCA 3 % (5 min chaque fois). Un autre tiers des preparations a 86 soumis a l’action de la desoxyribonuclease (1 h a 37”) afin de v&rifler si la radioactivite observee provient exclusivement du DNA. Nous avons constatb que les traitments au TCA n’ont jamais modit% la radioactivite observable sur les coupes. Par contre apres le traitement a la DNase, le marquage disparaissait complbtement. Les injections de DNA marque dans l’un des deux premiers blastomeres n’empkhent pas la division de la cellule inject&e. Au tours de la segmentation, le DNA inject6 se partage entre les blastomeres fils. Les figs. 2-4 montExperimental
Cell
Research
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DNA hCtCrologue
injecte’ dans des oxfs
de Batraciens
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rent le sort du 3H-DNA inject& depuis le moment de l’injection jusqu’au stade morula-blastula. Pendant les 3-4 premiitres heures, la radioactivitk est localisbe dans le cytoplasme. Un faible marquage s’observe toutefois B l’inttkieur des noyaux. Apr&s 7 h, lo-20 % des noyaux sont marquks. Aprks 24 h, une portion considkable de la radioactivitk passe dans les noyaux, qui commencent g etre fortement marquks, surtout g proximitk du lieu de l’injection. Une partie du DNA inject@ reste cependant dans le cytoplasme. Aux stades plus avanck que le blastula, la radioactivitk devient de plus en plus difficile ZI dkceler. Rappelons que les ccufs inject&s avec du DNA au stade de deux blastom&es n’atteignent que rarement des stades plus avancits. La radioactivith qu’on observe au tours de la segmentation, & la fois dans les noyaux et dans le cytoplasme, apparait souvent sous la forme de masses compactes, et rksiste au traitment par le TCA ZI 3 %. Cette observation plaide en faveur d’une p&&ration du DNA &anger dans les noyaux des cellules de l’embryon sous une forme encore polym~ris~e. Ajoutons que la radioactivitk est toujours concentrke dans la region injectee B l’inverse de ce qu’on observe aprks injection de 3H-thymidine. Injections au stade morula-blastula.-Le DNA marquk inject& dans la cavitC blastochlienne se colle ?I la surface des cellules endoblastiques (fig. 5) et il y reste pendant longtemps (souvent jusqu’g 48 h). Sa diffusion g l’intkrieur des cellules semble fortement limitee par les membranes cellulaires. 24 h aprks l’injection, les noyaux des cellules entourant le blastockle ne montrent qu’une Egkre radioactivitk. Le marquage intense du cytoplasme phrinuclkaire et des noyaux, qu’on observe apt-&s les injections au stade de deux premiers blastomkres, ne se retrouve done pas. Le marquage des noyaux ne devient apprtkiable qu’au stade neurula. One ne peut exclure que le DNA inject6 ait ktk r@utili& par les noyaux aprEs une certaine d& gradation. Injections dans le jeune t&ard.-Si on injecte du DNA dans un t&tard, on le retrouve, aprtis 2 h, dans le tube digestif (fig. 6). Toute la radioactivitk y persiste pendant un certain temps. Apr&s 24 h, elle commence ZI se disperser et on la retrouve dans les noyaux de la larve autour de l’endroit de la piqiire. Injections de DNA de thymus de veau, suiviespar celles d’histones.-Les solutions aqueuses de DNA et d’histones, aux concentrations l-2 mg/ml, ont ktit inject&es successivement dans des ceufs au stade morula et de 2 blastomkres. Le DNA inject6 Gtait toujours en excks par rapport aux histones Experimental
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E. Sempixiska
(3: 2). Le volume total inject6 Ctait de 0,05-0,OS ~1. Les ceufs ont @te fixes au Zenker aprc’s 2 h, 6 h et 24 h. Pour l’examen microscopique, les coupes ont et& colorees a 1’Unna. Les resultats de ces experiences ne different guere de ceux qui ont ete decrits pour les injections d’histones seules [2]. Vingt-quatre heures apres l’injection au stade morula, on note un arret des mitoses et un aspect homogene de la chromatine. On observe, au pole des cellules de taille irreguliere. Plusieurs de celles-ci ont des animal, noyaux pales, saris nucliioles, ce qui paraft indiquer un arr&t des syntheses de DNA et de RN,4. Le developpement des embryons se ralentit et s’arrete aux stades de blastulas-gastrulas, parfois de neurulas. Les embryons inject&s au stade de 2 blastomeres cessent de se developper avant ou au stade de blastula. Ces effets sont saris doute produits par des histones qui ne se sont pas combine& au DNA. DISCUSSION
La question la plus importante dans le probleme de l’incorporation de DNA &ranger dans une cellule receptique est celui de la penetration de cc DNA h travers la membrane nucleaire sous sa forme native et de son integration dans le gknome de la cellule hBte. Les microinjections dans des ceufs creent des conditions exceptionnellement favorables pour que le DNA inject4 puisse etre fourni au genome en grandes quantites et sous une forme aussi peu degradee que possible. En effet, le cortex des aeufs d’Amphibiens, apres la fecondation, est fort resistant au passage de macromolecules et la seule immersion dans une solution contenant du DNA marque ne permet pas de retrouver de radioactivite a l’interieur de l’ceuf. Nos experiences montrent qu’apres des injections au stade de 2 blastomeres, la cellule inject&e continue a se diviser bien que du DNA etranger se trouve a l’interieur. Trois heures apres l’injection dans l’un des deux blastomeres, le 3H-DN,4 se rassemble autour des noyaux; apres 24 h, la radioactivite apparait a l’interieur de ces derniers. Ce DNA semble &tre assez resistant a l’action des nucleases intracellulaires, puisque la radioactivite ne diminue pas apres le traitement des coupes au TCA et que le marquage s’observe pendant plusieurs heures sous la forme de masses compactes tant dans le cytoplasme que dans les noyaux. La radioactivite se localise presque toujours dans la partie de l’aeuf qui a Cte inject&e, ce qui fait penser que la repartition du materiel inject6 entre des cellules se produit surtout lors de leurs divisions. Dans le cas des injections du DNA de thymus de veau oti la quantite du DNA inject& etait plus grande), on le retrouve apres 24 h par une simple Experimental
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DNA hCtCrologue
inject4 dam des ceufs de Batraciens
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coloration B 1’Unna ou au Feulgen. 11 est done probable qu’aumoins pendant les premi&res segmentations, le DNA inject6 pCnEtre dans certains noyaux sous une forme polymCris&e. La plupart des ceufs inject& au stade 1 ou 2 blastomkres n’atteignent pas des stades avan&. Dans des cas rares oh les ceufs inject& avec du 3H-DNA se dEveloppent jusqu’aux stades gastrulas-neurulas, la radioactivitb disparait graduellement de l’embryon. On peut se demander si du DNA homologue se comporterait de la m&me manicre. L’arr8t rapide du d&veloppement qui suit l’injection aux premiers stades du clivage semble indiquer que le DNA etranger n’est pas seulement une source de pr@curseurs pour la synth&se du DNA de l’aeuf; en efI’et, les injections de thymidine ou de DNA hydrolyse ne sont pas toxiques pour les aeufs. Les injections dans la cavitk blastocklienne, au stade blastula, crkent des conditions qui ressemblent B celles qui existent lors de l’incorporation de DNA dans des cellules en cultures in vitro ou in vivo. Le DNA doit passer par les membranes des cellules qui entourent le blastoGle (surtout, les cellules endoblastiques). Cette p6nCtration est assez 1imitCe. Le DNA reste done longtemps co116 ZI la surface des cellules qui limitent le blastoGle. Ce n’est qu’au stade gastrula ou neurula qu’aprks injection de DNA triti6 la radioactivitk commence & apparaitre dans la plupart des noyaux de l’embryon. 11 est difficile d’affirmer que le DNA ne se dkgrade pas avant de p&Gtrer dans ces cellules. Dans le cas du DNA de thymus de veau, on le retrouve encore dans le blastoc3e apr&s 24 h B en juger par la coloration B I’Unna. Tant aprcs des injections de 3H-DNA au stade blastula qu’apr&s des injections au stade de 2 blastom&res, la majeure partie du matCrie1 radioactif inject6 est rejetke par l‘embryon au tours de son dCveloppement, saris s’&tre intCgrCe dans le gknome. 11 est B noter que, au tours de ces derniirres annCes, divers travaux ont apportt! des arguments en faveur d’une incorporation de DNA homologue et h&rologue sous la forme de macromol&ules, dans les cellules animales et v6g6tales [7]. Les r&ultats des expkriences de Szybalska et Szybalski [lo] ainsi que ceux de Podgajetskaja et ~011. [9] ont montrC que le DNA homologue peut exercer un effet biologique, en provoquant des transformations dans les cultures in vitro. L’efficacitC de ces transformations 6tant cependant peu importante, les effets biologiques ne peuvent Ctre observ& que dans des systkmes oti le mutant obtenu B la suite de la transformation est le seul qui puisse survivre dans les conditions d’expkrience [9]. Experimental
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Dans le cas des injections de DNA suivies de celles d’histones, il est difficile de dire si les effets que nous avons observ& resultent de complexes de nuclkohistones OLI d’histones seules qui ne seraient pas likes au DNA. Selon un travail de Kimmel [6], des extraits de foie, de muscles, de sperme, de reins, etc. . . . de Rana pipiens, ainsi que des extraits de divers tissus d’autres. Amphibiens et de bceuf arr&tent la segmentation des eufs de Rana au stade de blastula avancEe. 11 est, d& lors, CIvident que diverses protkines peuvent exercer un meme effet inhibiteur sur le d&eloppement des ceufs d’Amphibiens. SUMMARY
Injections of calf thymus highly-polymerized DNA and 3H-DNA, obtained from E. coZi CR,, thymineless bacteria strain, were administered into the eggs of Pleurodeles at various stages of their development. The cytological effect of injections and the fate of injected radioactive DNA has been studied, both by cytological and autoradiography methods. It was found that the radioactivity (in the form of 3H-DNA) injected into one of the two blastomeres (first stage of segmentation) was divided among the daughter cells. In 3-4 hr it surrounded the nuclei and then entered inside. After 24 hr most of the nuclei in the injected part of the egg were labeled. The radioactivity was nonextractable by TCA and was found to be present both in cytoplasm and in the nuclei. When the 3H-DNA was injected into the blastocoel cavity it remained attached to the cell walls surrounding the blastocoel during more than 24 hr after injection. Then it entered the nuclei during the development of the egg up to the gastrula-neurula stage. When the calf thymus DNA or E. coli 3H-DNA was injected at the first stage of segmentation, the block of development followed by cytolysis was observed as the biological effect. An attempt was also made to inject the thymus DNA mixed with a histone. The results were the same as those when using histone alone. Travail effect& cadre du contrat 016-61-10 ABIB.
dans le cadre avec 1’UNESCO
de 1’Cchange culture1 Belgo-Polonais, dans et dans le cadre du Contrat Euratom-U.L.B.
le
BIBLIOGRAPHIE 1. BILLETT, 2. BRACHET, 3. FICQ, A.,
F. S.,
HAMILTON, L. et NEWTH, D. J., Nature 207, no 4996, 507 (1965). in J. BRACHET et A. MIRSKY (eds.),
1959. Experimental
Cell Research
45
R., Heredity The
Cell,
19,
part 2, 259 (1964).
vol. 1, ch. 3. Acad. Press, New York,
DNA
he’ttkologue
inject& duns des ozufs de Batraciens
4. 5. 6. 7.
Fox, A. S. et JOON, S. B., Genetics 52: 2, part 2, 444 (1965). JOON, S. B. et Fox, A. S., Genetics 52: 2, part 2, 485 (1965). KIMIXEL, D. L., JR., J. Erptl ZooI. 157, 361 (1964). LEDOUX, L., in DAVIDSON and COHN (eds.), Progress in nucleic acid research and molecular biology, vol. 4, p. 231, 1965. 8. MARMUR, J., Mol. Bid. 3, 208 (1961). 9. PODGAJETSKAJA, D. J., BRBSLER, V. M., SURIKO~, I. RI., IGNATOVA, T. N. et OLENOV, J. iV., Bioehim. Biophys. Acta 80, 110 (1964). 10. SZYBALSKA, H. et SZYBALSKI, IV., Proc. Satl Acad. Sci. 48, 2026 (1962).
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ET LES DANS
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Hl?Tl?ROLOGUE
DE BATRACIENS
EN COURS
DE DfiVELOPPEMENT I.
ETUDES
CVTOLOGIQUES
ET
AUTORADIOGRAPHIQUES
E. SEMPIliSKAl Laboratoire
de Morphologie
animale,
Faculc6 Bruxelles, Repu
des Sciences, Belgique
le 5 aoQt
UniversitQ
Libre
de Bruxelles,
1966
DE
nombreux auteurs ont deja etudie le probleme de la p&r&ration et de l’utilisation biologique du DNA exogene dans differents systemes in vivo et in vitro. Une revue de ces travaux a paru recemment [7]. Ce qui est commun aux experiences de ce genre c’est que les molecules de DNA doivent traverser la membrane cellulaire avant d’atteindre l’interieur de la cellule et le noyau. Le probleme de la pinocytose et des conditions qui peuvent la faciliter se posent done en premier lieu. Des injections directes dans l’ccuf, surtout quand il se trouve au stade d’un ou deux blastomkres, permettent d’echapper a toutes les difficult& likes a la penetration de macromolecules a travers les membranes cellulaires. Billett et ~011. [I] ont entrepris un premier essai de transformation genetique chez les Amphibiens en injectant du DNA homologue extrait d’axolotls noirs dans les ccufs d’axolotls blancs. On pouvait espkrer un changement du phenotype blanc en noir, mais ces essais n’ont pas donne de resultats positifs. Les experiences de Fox et ~011. [4, 51 ont eu plus de succes : ils ont reussi a transformer un type mutant en l’espece sauvage et vice versa chez la Drosophile, par un traitement des ccufs in vitro avec le DNA correspondant extrait des mouches. Le travail que nous avons entrepris avait pour but 1’Ctude systkmatique du sort du DNA heterologue inject6 dans les ccufs des Batraciens apriis la fecondation et de son influence Cventuelle sur le developpement ulterieur des ceufs. 1 Adresse Experimental
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DNA hktkrologue
injectt
MATkRIEL
dans des ceufs de Bafraciens ET
MtiTHODES
Nous avons travail16 sur des ceufs de Pleurodkles obtenus par injections aux femelles de Pregnyl (150 unit& par animal). Nous avons employ6 des ceufs au stade de deux ou quake blastomkres ou de morula-blastula. Nous avons inject6 aux ceufs: (I) du DNA de tbymus de veau (Sigma Typ I); (2) du DNA de E. coli, marqu6 au tritium. 1 Le DNA de tbymus a CtC employ6 surtout pour 1’Ctude des effets cytologiques (aprhs coloration j 1’Unna ou au Feulgen). Le DNA de E. coli a permis de suivre le sort du DNA hCtCrologue, inject6 dans les ccufs, par la mkthode autoradiographique. Ce DNA de E. coli a Ct6 p&park selon la mkthode de Marmur [S] g partir de E. coli CR,,Th-, cultivk en prksence de thymine-3H. Son activitk spkcifique Ctait d’environ 2.106 dpm/pg. Pour les injections, on a employ4 des aiguilles de verre prCparCes g l’aide d’une microforge de Fonbrune. Le volume inject6 Ctait voisin de 0,05 ~1. Les concentrations de DNA Ctaient : pour le DNA de thymus 1-3 mg/ml (dans 0,l M NaCl), pour celui de E. coli 250-300 pug/ml (dans 0,l M NaCl ou SSC).z Les ceufs ont CtC inject& dans l’un des deux premiers blastomkres ou dans la cavitt! blastocklienne (au stade de morulablastula). Pour l’autoradiographie, on a employ4 l’emulsion Ilford G5, qui permet de distinguer le marquage provenant du tritium, de la pigmentation des aeufs. Les d&ails de la technique ont Ctk dtkrits ailleurs [3]. Nous avons aussi CtudiC cytologiquement les effets d’injections de DNA de thymus de veau suivies par celles d’histones.3 Les effets des histones seules, sur le mktabolisme des acides nuclkiques et le dkveloppement des oeufs des Batraciens ont CtB CtudiCs par Brachet [2]. R&S
Observations
cytologiques
ULTATS
sur les ozufs inject&
avec du DNA
de thymus
de veau
Injections au stade de 2-4 blastomt!res.-Les ceufs ont @t6 fix& au Zenker 4, 2, 24 h, exceptionnellement 48 h, aprks l’injection du DNA de thymus de veau puis enrob& B la paraffine selon la m&hode usuelle. Les prCparations ont 6th examinCes au microscope aprits coloration B 1’Unna ou au Feulgen. Les premiers clivages des aeufs inject& &aient souvent irrcguliers; en particulier, la rkgion proche de l’endroit piqu6 se divisait plus lentement. La fig. 1 montre que ces ir&gularit& sont m&me visibles au stade blastula. On voit q’une partie de DNA inject6 est restke encore sous une forme suffisamment polym6risCe pour donner une coloration 5 1’Unna (en vert-violet) ou au Feulgen. Ces irrCgularit6s de la segmentation ont 6t6 suivies, dans la plupart des cas ( >90 %), par la cytolyse d’embryon au stade blastula ou par de l’exogastrulation. Dans les embryons les plus avan& on peut ob1 Prepare dans le laboratoire du Dr. L. Ledoux, C.E.N., ,Mol, Belgique. 2 SSC - 0,15 M NaCl + 0,015 M Na-citrate. 3 Les histones ont CtB preparkes A partir de thymus de veau par le Dr E. Schram. Experimental
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E. Sempiriska
Fig. l.-auf de pleurodele 24 h aprks l’injeclion de DNA de thymus de veau dans l’un des deux blastomhres. Coloration h I’Unna. On peut observer des irrCgularitCs darts la segmentation et on retrouve du DNA qui n’a pas dtk incorpork dans les noyaux des cellules de l’embryon. La teintc de la coloration (vert-violet) indique que ce DNA se trouve encore sous une forme polymkriske. Fig. 2.--3H-DNA quelques minutes
de E. eoli inject6 aprks l’injection.
dans
l’un
des deux
blastomizrei.
Image
autoradiographiquc
server de l’oedirme, ou des territoires dont le d6veloppement s’est a&t6 d&s la segmentation. Injections au stade morula ou blastula.-Les ceufs ont Cti: Egalement fix&s au Zenker (4, 2, 24 h, 3 jours et 7 jours apr6s l’injection du DNA), et enrob& SI la paraffine. L’examen microscopique des coupes a r~v~lC que le DNA inject6 persiste pendant un temps relativement long dans la cavitC blasto&lienne. Une demie et 2 h apr&s l’injection, on peut y observer une coloration verte (B L’Unna), qui progressivement passe au rouge-violet. Cette augmentation de la pyroninophilie est probablement un signe d’une lente degradation du DNA inject& Au tours du dt%eloppement ultkrieur des embryons inject&, on observe souvent un retard de la formation du syst&me nerveux et l’apparition d’oedkmes. Experimentat
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Fig. 3.--3H-DNA 4 h apres l’injection.
de E. coli inject6 dans l’un des deux blastomeres. On observe que la radioactivite entoure les noyaux
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Image autoradiographique et commence a y penetrer.
Fig. 4.--3H-DNA de E. coli inject6 dans l’un des deux blastomeres. Image autoradiographique 24 h apres l’injection. On trouve de la radioactivite tant dans les noyaux que dans le cytoplasme, souvent sous la forme de masses compactes. On constate des irregularites dans la segmentation des oeufs.
Les injections dans le blastocele sont beaucoup moins toxiques pour les embryons que les injections faites aux premiers stades du developpement. Le pourcentage d’embryons qui se developpent jusqu’a l’eclosion depend de la concentration du DNA inject& Les concentrations superieures a 1 mg/ml (le volume inject& etant toujours de 0,05 ,ul) sont les plus toxiques; le poureentage des embryons qui atteignent le stade de tetards ne d&passe pas, dans ce Gas, quelques pourcents. Etudes autoradiographiques Injections au stade de deux ou quatre blastomkres.-Les aeufs ont 6th fixes dans de l’alcool-acide acetique (10:0,6), 3 h, 6 h et 24 h apres l’injection. Le tiers des preparations a ete soumis B l’action de l’acide trichloracetique Experimental
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Fig. !I-~H-DNA de jeune blastula.
de E. co[i inject6 dans la cavitk blastocClienne d’un Image autoradiographique 2 h aprks I’injection.
Fig. 6.-Autoradiograpbie radioactivitk dans le tube
d’un Ward digestif.
2 h apr&
l’injection
de 3H-DNA
oeuf de pleurod&le
au stade
de E. coli. On retrouve
la
(TCA) 3 % a 0°C afin de verifier si le DNA n’a pas subi de degradation. Les coupes ont et6 traitees par quatre bains de TCA 3 % (5 min chaque fois). Un autre tiers des preparations a 86 soumis a l’action de la desoxyribonuclease (1 h a 37”) afin de v&rifler si la radioactivite observee provient exclusivement du DNA. Nous avons constatb que les traitments au TCA n’ont jamais modit% la radioactivite observable sur les coupes. Par contre apres le traitement a la DNase, le marquage disparaissait complbtement. Les injections de DNA marque dans l’un des deux premiers blastomeres n’empkhent pas la division de la cellule inject&e. Au tours de la segmentation, le DNA inject6 se partage entre les blastomeres fils. Les figs. 2-4 montExperimental
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injecte’ dans des oxfs
de Batraciens
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rent le sort du 3H-DNA inject& depuis le moment de l’injection jusqu’au stade morula-blastula. Pendant les 3-4 premiitres heures, la radioactivitk est localisbe dans le cytoplasme. Un faible marquage s’observe toutefois B l’inttkieur des noyaux. Apr&s 7 h, lo-20 % des noyaux sont marquks. Aprks 24 h, une portion considkable de la radioactivitk passe dans les noyaux, qui commencent g etre fortement marquks, surtout g proximitk du lieu de l’injection. Une partie du DNA inject@ reste cependant dans le cytoplasme. Aux stades plus avanck que le blastula, la radioactivitk devient de plus en plus difficile ZI dkceler. Rappelons que les ccufs inject&s avec du DNA au stade de deux blastom&es n’atteignent que rarement des stades plus avancits. La radioactivith qu’on observe au tours de la segmentation, & la fois dans les noyaux et dans le cytoplasme, apparait souvent sous la forme de masses compactes, et rksiste au traitment par le TCA ZI 3 %. Cette observation plaide en faveur d’une p&&ration du DNA &anger dans les noyaux des cellules de l’embryon sous une forme encore polym~ris~e. Ajoutons que la radioactivitk est toujours concentrke dans la region injectee B l’inverse de ce qu’on observe aprks injection de 3H-thymidine. Injections au stade morula-blastula.-Le DNA marquk inject& dans la cavitC blastochlienne se colle ?I la surface des cellules endoblastiques (fig. 5) et il y reste pendant longtemps (souvent jusqu’g 48 h). Sa diffusion g l’intkrieur des cellules semble fortement limitee par les membranes cellulaires. 24 h aprks l’injection, les noyaux des cellules entourant le blastockle ne montrent qu’une Egkre radioactivitk. Le marquage intense du cytoplasme phrinuclkaire et des noyaux, qu’on observe apt-&s les injections au stade de deux premiers blastomkres, ne se retrouve done pas. Le marquage des noyaux ne devient apprtkiable qu’au stade neurula. One ne peut exclure que le DNA inject6 ait ktk r@utili& par les noyaux aprEs une certaine d& gradation. Injections dans le jeune t&ard.-Si on injecte du DNA dans un t&tard, on le retrouve, aprtis 2 h, dans le tube digestif (fig. 6). Toute la radioactivitk y persiste pendant un certain temps. Apr&s 24 h, elle commence ZI se disperser et on la retrouve dans les noyaux de la larve autour de l’endroit de la piqiire. Injections de DNA de thymus de veau, suiviespar celles d’histones.-Les solutions aqueuses de DNA et d’histones, aux concentrations l-2 mg/ml, ont ktit inject&es successivement dans des ceufs au stade morula et de 2 blastomkres. Le DNA inject6 Gtait toujours en excks par rapport aux histones Experimental
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(3: 2). Le volume total inject6 Ctait de 0,05-0,OS ~1. Les ceufs ont @te fixes au Zenker aprc’s 2 h, 6 h et 24 h. Pour l’examen microscopique, les coupes ont et& colorees a 1’Unna. Les resultats de ces experiences ne different guere de ceux qui ont ete decrits pour les injections d’histones seules [2]. Vingt-quatre heures apres l’injection au stade morula, on note un arret des mitoses et un aspect homogene de la chromatine. On observe, au pole des cellules de taille irreguliere. Plusieurs de celles-ci ont des animal, noyaux pales, saris nucliioles, ce qui paraft indiquer un arr&t des syntheses de DNA et de RN,4. Le developpement des embryons se ralentit et s’arrete aux stades de blastulas-gastrulas, parfois de neurulas. Les embryons inject&s au stade de 2 blastomeres cessent de se developper avant ou au stade de blastula. Ces effets sont saris doute produits par des histones qui ne se sont pas combine& au DNA. DISCUSSION
La question la plus importante dans le probleme de l’incorporation de DNA &ranger dans une cellule receptique est celui de la penetration de cc DNA h travers la membrane nucleaire sous sa forme native et de son integration dans le gknome de la cellule hBte. Les microinjections dans des ceufs creent des conditions exceptionnellement favorables pour que le DNA inject4 puisse etre fourni au genome en grandes quantites et sous une forme aussi peu degradee que possible. En effet, le cortex des aeufs d’Amphibiens, apres la fecondation, est fort resistant au passage de macromolecules et la seule immersion dans une solution contenant du DNA marque ne permet pas de retrouver de radioactivite a l’interieur de l’ceuf. Nos experiences montrent qu’apres des injections au stade de 2 blastomeres, la cellule inject&e continue a se diviser bien que du DNA etranger se trouve a l’interieur. Trois heures apres l’injection dans l’un des deux blastomeres, le 3H-DN,4 se rassemble autour des noyaux; apres 24 h, la radioactivite apparait a l’interieur de ces derniers. Ce DNA semble &tre assez resistant a l’action des nucleases intracellulaires, puisque la radioactivite ne diminue pas apres le traitement des coupes au TCA et que le marquage s’observe pendant plusieurs heures sous la forme de masses compactes tant dans le cytoplasme que dans les noyaux. La radioactivite se localise presque toujours dans la partie de l’aeuf qui a Cte inject&e, ce qui fait penser que la repartition du materiel inject6 entre des cellules se produit surtout lors de leurs divisions. Dans le cas des injections du DNA de thymus de veau oti la quantite du DNA inject& etait plus grande), on le retrouve apres 24 h par une simple Experimental
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inject4 dam des ceufs de Batraciens
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coloration B 1’Unna ou au Feulgen. 11 est done probable qu’aumoins pendant les premi&res segmentations, le DNA inject6 pCnEtre dans certains noyaux sous une forme polymCris&e. La plupart des ceufs inject& au stade 1 ou 2 blastomkres n’atteignent pas des stades avan&. Dans des cas rares oh les ceufs inject& avec du 3H-DNA se dEveloppent jusqu’aux stades gastrulas-neurulas, la radioactivitb disparait graduellement de l’embryon. On peut se demander si du DNA homologue se comporterait de la m&me manicre. L’arr8t rapide du d&veloppement qui suit l’injection aux premiers stades du clivage semble indiquer que le DNA etranger n’est pas seulement une source de pr@curseurs pour la synth&se du DNA de l’aeuf; en efI’et, les injections de thymidine ou de DNA hydrolyse ne sont pas toxiques pour les aeufs. Les injections dans la cavitk blastocklienne, au stade blastula, crkent des conditions qui ressemblent B celles qui existent lors de l’incorporation de DNA dans des cellules en cultures in vitro ou in vivo. Le DNA doit passer par les membranes des cellules qui entourent le blastoGle (surtout, les cellules endoblastiques). Cette p6nCtration est assez 1imitCe. Le DNA reste done longtemps co116 ZI la surface des cellules qui limitent le blastoGle. Ce n’est qu’au stade gastrula ou neurula qu’aprks injection de DNA triti6 la radioactivitk commence & apparaitre dans la plupart des noyaux de l’embryon. 11 est difficile d’affirmer que le DNA ne se dkgrade pas avant de p&Gtrer dans ces cellules. Dans le cas du DNA de thymus de veau, on le retrouve encore dans le blastoc3e apr&s 24 h B en juger par la coloration B I’Unna. Tant aprcs des injections de 3H-DNA au stade blastula qu’apr&s des injections au stade de 2 blastom&res, la majeure partie du matCrie1 radioactif inject6 est rejetke par l‘embryon au tours de son dCveloppement, saris s’&tre intCgrCe dans le gknome. 11 est B noter que, au tours de ces derniirres annCes, divers travaux ont apportt! des arguments en faveur d’une incorporation de DNA homologue et h&rologue sous la forme de macromol&ules, dans les cellules animales et v6g6tales [7]. Les r&ultats des expkriences de Szybalska et Szybalski [lo] ainsi que ceux de Podgajetskaja et ~011. [9] ont montrC que le DNA homologue peut exercer un effet biologique, en provoquant des transformations dans les cultures in vitro. L’efficacitC de ces transformations 6tant cependant peu importante, les effets biologiques ne peuvent Ctre observ& que dans des systkmes oti le mutant obtenu B la suite de la transformation est le seul qui puisse survivre dans les conditions d’expkrience [9]. Experimental
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Dans le cas des injections de DNA suivies de celles d’histones, il est difficile de dire si les effets que nous avons observ& resultent de complexes de nuclkohistones OLI d’histones seules qui ne seraient pas likes au DNA. Selon un travail de Kimmel [6], des extraits de foie, de muscles, de sperme, de reins, etc. . . . de Rana pipiens, ainsi que des extraits de divers tissus d’autres. Amphibiens et de bceuf arr&tent la segmentation des eufs de Rana au stade de blastula avancEe. 11 est, d& lors, CIvident que diverses protkines peuvent exercer un meme effet inhibiteur sur le d&eloppement des ceufs d’Amphibiens. SUMMARY
Injections of calf thymus highly-polymerized DNA and 3H-DNA, obtained from E. coZi CR,, thymineless bacteria strain, were administered into the eggs of Pleurodeles at various stages of their development. The cytological effect of injections and the fate of injected radioactive DNA has been studied, both by cytological and autoradiography methods. It was found that the radioactivity (in the form of 3H-DNA) injected into one of the two blastomeres (first stage of segmentation) was divided among the daughter cells. In 3-4 hr it surrounded the nuclei and then entered inside. After 24 hr most of the nuclei in the injected part of the egg were labeled. The radioactivity was nonextractable by TCA and was found to be present both in cytoplasm and in the nuclei. When the 3H-DNA was injected into the blastocoel cavity it remained attached to the cell walls surrounding the blastocoel during more than 24 hr after injection. Then it entered the nuclei during the development of the egg up to the gastrula-neurula stage. When the calf thymus DNA or E. coli 3H-DNA was injected at the first stage of segmentation, the block of development followed by cytolysis was observed as the biological effect. An attempt was also made to inject the thymus DNA mixed with a histone. The results were the same as those when using histone alone. Travail effect& cadre du contrat 016-61-10 ABIB.
dans le cadre avec 1’UNESCO
de 1’Cchange culture1 Belgo-Polonais, dans et dans le cadre du Contrat Euratom-U.L.B.
le
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