Le dosage de l'acide désoxyribonucléique dans les oeufs de batraciens

BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

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B BA 8098

LE DOSAGE DE L'ACIDE DI~SOXYRIBONUCLI~IQUE DANS LES OEUFS DE BATRACIENS E. B A L T U S E'r J. B R A C H E T Laboratoire de Morphologie animale, Facultd des Sciences de l'Universitd libre de Bruxelles, Br~txelles ( Belgiq~e ) (Requ le 19 janvier, 1962 )

SUMMARY

The estimation o/deoxyribonucleic acid in Batracian eggs I. A fluorometric method for the estimation of DNA in materials which contain very little of this nucleic acid is described. It can be used with as little as 5 amphibian eggs, which contain, altogether, about 0.5 #g of DNA. 2. The synthesis of DNA in developing Pleurodeles eggs has been studied. The results are similar to those described in the literature. 3. In early stages, 8o ~o of the total DNA can be sedimented by the ultracentrifugation of homogenates. 4. The significance of these results is briefly discussed.

INTROI)UCTION On salt que le dosage de la teneur en DNA des oeufs de Batraciens pr6sente, au d6but du d6veloppement, de grosses difficult6s techniques: en effet, la teneur en DNA de l'oeuf vierge est tr~s faible par rapport ~t la masse 6norme des r6serves deutoplasmiques et cette dilution du DNA augmente n6cessairement les causes d'erreurs. I1 importe donc d'utiliser pour ce dosage une m6thode aussi sp6cifique que possible; on admet, g6n6ralement, que celle qui est la plus spdcifique est la technique microbiologique 1-5. Elle fournit, en effet, des chiffres tr~s nettement inf6rieurs pour l'oeuf vierge ~t ceux qui ont 6t6 obtenus en dosant soit le phosphore du DNA 6, soit son d6soxyriboseL Cette m6thode microbiologique a montr~ que l'oeuf contient, d6j~ avant le d6veloppement, un exc6dent consid6rable de DNA par rapport ~ la quantit6 pr6sente dans le spermatozoide: il poss6derait une r6serve de DNA cytoplasmique, suffisante pour permettre la production de 500o (ou m~me plus) noyaux diploides, c'est ~ dire pour atteindre la stade blastula. Toutefois, selon BRACHET 7, plus de 9 ° % de cette r~iserve de DNA serait li6e au vitellus; s'il en est vraiment ainsi, il semble difficilement concevable qu'elle puisse servir ~t la multiplication des noyaux si on se souvient de ce que l'utilisation du vitellus est n6gligeable pendant la segmentation de l'oeuf. I1 nous a paru opportun de v6rifier cette observation, qui 6tait bas6e sur le dosage du d6soxyribose, en employant une technique plus sp~cifique. Le situation apparait encore plus compliqu6e lorsqu'on constate que l'oeuf de grenouille, pendant cette p6riode de segmentation, est capable de synth6tiser du DNA ~ partir de pr6curseurs simples comme la glycine s, la thymidine 9 et l'uriBiochim. Biophqs. Acta, 61 (1962) 157-163

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E. BALTUS, J. BRACHET

dine TM. On se trouve donc devant une situation paradoxale: (a) Au d6but de son d6veloppement, l'oeuf poss~de une r~serve de DNA cytoplasmique, mais il semble qu'il lui soit difficile de l'utiliser en raison de sa localisation intracellulaire. (b) Ses noyaux se mnltiplient sans qu'on puisse d~celer une synth~se nette de DNA. (c) L'oeuf f~cond6 est capable d'incorporer, dans le DNA des noyaux de segmentation, des prdcurseurs simples de cet acide nucl6ique. Le pr6sent travail ne pr6tend pas 6claircir cette situation paradoxale: il se contente de ddcrire une m6thode chimique sensible, prdcise et spdcifique, pour le dosage du DNA dans les oeufs de Batraciens et de fournir quelqnes pr6cisions sur la localisation intracellulaire et la synth~se de cet acide nucl6ique pendant le d6veloppement. L'utilitd d'une pareille m~thode a, d'ailleurs, 6t~ soulign6e rdcemment par LOVTRUP ET ROOS 11. PARTIE EXPJ~RIMENTALE

La technique fluorom6trique que nous avons utilisde d6rive de celle de KISSANE ET ROBINsl~; elle est bas6e sur le fait que les ald6hydes du type R-CH2-CHO donnent une forte fluorescence lorsqn'on les traite par de l'acide diaminobenzo~que ~ chaud, en prdsence d'acides min~raux concentr6s. En raison de la pauvret6 en DNA des oeufs, la technique d'extraction suivante a dtl 6tre raise au point: 5 oeufs de Batraciens (Pleurod61es dans le cas present), ou plus, sont broy6s darts 4 ml d'alcool/~ 94 °. Apr6s IO rain ~ 5 o°, les homogdnats sont centrifuges et les culots sont lards deux fois ~ l'alcool ~ 94 °, une fois au butanol normal, une fois ~t l'alcool absolu et une fois ~t l'alcool-dther (3:1). Chacune de ces extractions, qui ont pour but d'assnrer une indispensable d61ipidation, s'effectue ~ 5 °0 pendant IO min. Le culot, une fois d~lipid6 et sdch~, est extrait par I ml de NaC1 ~ IO % pendant 60 min ~t IOO°. On centrifuge et le culot est extrait, de la m6me mani&re, avec 0.5 ml de NaC1 h IO %. Les deux surnageants sont combin6s et on leur ajoute 3 ml d'alcool absolu. Apr~s une nuit ~t basse temperature (2°), on centrifuge; le culot est redissous dans I ml de NaC1 ~ IO %. On aioute 2 ml d'alcool absolu et on centrifuge apr~s un s6jonr de quelques heures ~ 2 °. Le pr~cipit6 est remis en suspension dans IOO #1 de N H 4 0 H I N e t chauff6 IOO° pendant 30 rain. I1 reste, apr~s centrifugation, un petit culot qui est lay6 avec 50/tl de NH4OH I N; les deux extraits ammoniacaux sont r6unis. Des tubes 6talons sont prepares ~ ce moment: ils contiennent 22 #1 de solutions ayant une teneur connue en DNA (de 5 a 260/,g de DNA/ml de NH~OH I N). Le contenu de tons les tubes (6talons et inconnus) est dvapord fi sec. On aioute, ~ chaque tube, 22/,1 d'une solution d'acide diaminobenzoique ~t 3 ° ~o dans HC14N; cet acide est purifi6, juste avant l'emp]oi, par 5 adsorptions successives sur du charbon actif. Les tubes sont bouch6s et chauff6s pendant 3 ° rain /~ 60°; on leur ajoute 0.5 ml de HC1Oa 0.6 N. Apr~s m~lange, on prdl~ve un aliquot de 460/~1, qu'on aj oute dans les tubes du fluorom6tre (Farrand photoe]ectric fluorometer) prdalablement remplis de 0.5 ml de HC10~ 0.6 N. Les lectures sont effectu6es avec les filtres suivants: Filtres primaires: 3060, 4308, 5970; filtres secondaires: 5031, 3384 . RESULTATS

DNA puri]id La Fig. I repr6sente nne courbe 6talon typique: le point correspondant Biochim. Biophys. Acta, 61 (1962) I57-I63

DNA DES OEUFS DE BATRACIENS

159

la lecture la plus basse a 6t6 obtenu avec une solution de DNA ~ la concentration de 5.9 #g/ml: comme le volume de l'6chantillon utihs6 pour la mesure n'dtait que de 22 ~1, la quantit6 de DNA raise en oeuvre correspondait ~t o.13 #g. On obtient encore, comme nous l'avons v6rifi6, des lectures satisfaisantes en utilisant des quantitds de DNA sensiblement inf6rieures (de l'ordre de o.05/~g par prise).

/

1C

/o

1~

2'0

~o

4'o

~o

60 '

Fig. I. Courbe-6talon p o u r lc dosage du DNA p a r fluorom6trie.

jug DNA/rnl

Bien que la m6thode soit assez laborieuse, les rdsultats, dans le cas du DNA pur, sont extr~mement reproductibles: l'6cart entre deux tubes trait6s s6par6ment n'est g~n~ralement que de 0.5 % et il n'atteint que rarement 2 ~o. Ajoutons que l'addition au DNA d'une quantit6 500 lois sup~rieure de RNA n'exerce aucune influence sur les r6sultats obtenus. Nous nous sommes assurds aussi de ce que la m~thode d'extraction utilis6e permet une 61imination complete des compos~s solubles (d~soxyribo-nucl6osides et nucl6otides) qui seraient susceptibles de donner une r6action avec l'acide diaminobenzo~'que. Enfin, nous avons pu 6carter l'6ventualit6 d'une inhibition de la fluorescence du DNA lui-m6me par une substance pr6sente dans les oeufs: si on ajoute ~ un extrait de ceux-ci, une quantit6 connue de DNA, on la retrouve quantitativement.

Oeu/s de PleurodEes Le Tableau I e t la Fig. 2 repr6sentent la synth~se du DNA au cours du d6veloppement: la teneur en DNA de l'oeuf, au moment de la ponte, est de l'ordre de 0.069 #g par oeuf. Cette teneur ne change pas pendant la segmentation et elle s%l~ve rapidement au cours de la gastrulation et de la neurulation. La forme de la courbe est identique ~ celles publi6es par les divers auteurs cit6s dans l'introduction. Dans une seconde s6rie d'exp6riences, nous avons examin6 les effets de la centrifugation sur des homog6nats d'oeufs indivis: une pattie des oeufs 6tait broy6e dans du saccharose 0.25 M e t l'homog6nat 6tait centrifug6 k 2 8 o × g pendant io rain (~ basse tempdrature), de fa~on ~ obtenir la s6dimentation du vitellus et du pigment. Le DNA a 6t6 dos6 d'une part dans le culot, d'autre part dans des oeufs entiers. Les r6Biochim. Biophys. Acta, 61 (I962) 157-163

160

E. BALTUS, J. BRACHET TABLEAU

I

t*g DE D N A PAR OEUF Les chiffres reli6s p a r une accolade r e p r 6 s e n t e n t deux mesures effectu~es i n d 6 p e n d a m m e n t sur une m6me ponte. Indivis

(o.o62f 0.069

{ o.o4o o.o51

{ o.o94 O.lO 3

Moyenne :o.o69

Morulas (jusqu'au stade 32 lolastonl~res)

f 0.055 (o.o5I

~ 0.040 t 0.044

f 0.049 (o.o41

Moyenne :0.046

Blastulas

j" o.o5o

J" O. I IO

I. 0 . 0 6 0

( o. I I 0

Gastrulas ]eunes (l~vre dorsale)

f 0.356 ( 0.385

Gastrulas moyennes (gros b o u c h o n vitellin)

0.490 { 0.530

0.580 { 0,590

Gastrulas avancdes (petit b o u c h o n vitellin)

1.o 5 { 1.o6

1.19 { 1.22

Plaque neurale

f 0.830 0.980

1.o 5

Goutti~re neurale

Moyenne : o.o82 1V[oyenne :0.37 ° o.61o { 0.620

f 0.820 (0.860

Moyenne :0.635 Moyenne:

Moyenne :o.9o 5 { 1.38 1.43

Moyenne:

f 2.05 1, 2.40

Neurulas avancdes (bourgeons caudaux)

vsll

1.13

1.29

M o y e n n e : 2.23

M u°r\ B,°s,u,T

.\

Gostruloi Gastrula~

nnob~nne/I Gastrulo~_

neur'ole q Gout.tiere~l neurale JTNeurulo ~_ avancee )I

~

•

~

.

" •

i

o.s

i

,.o

1!5

2'.0

)J9 E)NA/oef

Fig. 2. E v o l u t i o n de la t e n e u r en D N A des oeufs de pleurod~les au cours du d~veloppement,

sultats sont consign6s au Tableau n, qui montre que 65 % environ du DNA se s6dimente avec le vitellus et le pigment. L'analyse a 616 pouss6e plus loin dans la s6rie suivante d'exp6riences: on y a Biochim. Biophys, Acta, 6i (1962) I57-163

DNA

DES O E U F S D E B A T R A C I E N S TABLEAU

I0I

II

/~g DE 1 ) N A PAR OEIZF Oeu[s entiers

0.0690 0.0624

Fraction sddimentable

o.0425 (soit 04. 5 '!;, d u t o t a l ( o.o42o en rno~,_ e n n c )

dosd le DNA, non seulement dans les oeufs entiers et le culot obtenu apr6s IO min 28o >
III

/*g DE D N A p a r o~:::;F

Oeufs intacts O e u f s c e n t r i f u g a l s 5. _,8o~ pendant iomin O c u f s c e n t r i f u g 6 s ",k 5 q 3 o o " g p e n d a n t 2. 5 h

Pourcent darts le culot

Rdcup,~ration (%)

Culot

Surnageant

0.099 o.oO 7

-0.027

I ( )0

~'7

94

o.o79

o.o24

79

l 03

100

On voit que la quantit6 de DXA sfdimentable est un pen plus 61ev6e lorsqu'on proc6de ~ une ultracentrifugation (79 o,' /o) au lieu d'une centrifugation simple de 1'110mog6nat; darts ce dernier cas, les chiffres obtenus pour le DXA s6dimentable concordent parfaitement avec ceux obtenus lors de l'exp6rience prdc6dente (respectivement 67 et 64.5 %). On notera aussi l'accord tr6s satisfaisant en ce qui concerne la r4cup6ration obtenue en ajoutant l'une fl l'autre les valeurs obtenues pour les deux fractions. Enfin, dans une autre s6rie d'exp6riences, nous avons tent6 de doser, par difKrence, le DNA "libre" au cours du d6veloppement en comparant les valeurs obtenues, fl un m4me stade, pour des oeufs intacts et pour les s6diments apr~s ultracentrifugation fl 59 3 °o × g pendant 2.5 h. Les r6sultats ont, malheureusement, 6td trop erratiques pour que des conclusions valables puissent 6tre tir~'es de ces essais. La raison de ces difficult6s r6side apparemment dans le fait que, principalement au stade gastrula, les oeufs renfermeraient une fraction de DNA qu'il est possible de recueillir par ultracentrifugation, mais qui ne pr6cipite pas dans l'alcool avec le gros des nucl6oprot6ides. Pour obtenir des r6sultats clairs, il faudrait pouvoir doser directement le DNA pr6sent dans le surnageant apr6s ultracentrifugation; comme la simple prdcipitation/~ l'alcool, utilis6e dans la prdsente m6thode, ne donne, malheureusement, que des r6sultats al6atoires, nous nous proposons de rechercher ult6rieurement un proc6d6 de pr6cipitation plus efficace, tout en demeurant compatible avec la technique fluorom6trique utilis6e. Bmchim.

B i o p h q s . ~4cta, 6 i

(1962)

:57-I03

i62

E. BALTUS, J. BRACHET DISCUSSION

Le m~rite principal de la technique qui vient d'etre pr6sentde r6side dans le f a r qu'elle est utilisable dans tout laboratoire de biochimie disposant d'un fluorom&re. La m&hode, malgr6 son apparente longueur, ne pr6sente aucune difficult6 particuli~re d'ex&ution; les r6sultats sont reproductibles et sa grande sensibilit6 la rendra pr&ieuse chaque fois qu'on ne dispose que de faibles quantites de mat6riel. Sa spdcificit6 est un grand avantage lorsqu'on doit travailler sur nn mat6rial oh le DNA est peu abondant, comme c'est le cas pour les oeufs de Batraciens. Nous croyons qu'elle est appel6e ~ rendre de grands services en embryologie chimique, oh on est souvent limit6 par la faible quantit6 de mat&iel disponible (exp6riences sur des explantats ou sur des hybrides 16taux, par exemple). II est difficile de comparer exactement les r6snltats que nous avons obtenus avec ceux des auteurs pr&6dents, parce qu'ils ont travaill6 sur d'antres esp+ces de Batraciens. Comme il est bien ~tabli que les noyaux des Urod+les sont plus riches en DNA que ceux des Anoures, on peut s'attendre ~tce que les chiffres trouv6s pour le Pleurod+le soient un peu plus ~lev~s que ceux qni ont ~t~ signal,s pour la grenouille. Sans reprendre toutes les donndes de la litt~rature, rappelons que, chez cette derni+re, SZEs a indiqu6 une valeur de o.96 #g par oeuf en dosant le phosphore du DNA; l'un de nous, dosant le d6soxyribose, a trouv6 o.26 #g de DNA par oeuf r. Nos propres chiffres, pour l'oeuf indivis, sont, en moyenne, de o.o69/zg par oeuf: ils sont un peu sup~rieurs/t ceux qui ont 6t6 obtenus par les auteurs qui ont employ6 la m6thode microbiologique sur la grenouille. Les valeurs obtenues pour l'oeuf indivis par cette m6thode et publi&s dans la litt6rature sont, en effet, les suivantes: o.o65 #g par oeuf (Rana platyrrhina: HOFF-JORGENSEN ET ZEUTHEN1); 0.063 #g par oeuf (Rana pipiens: GREGG ET L0VTRVPa); 0.023 #g par oeuf (Rana pipiens: GRAZ~TS). Pour la blastula de Rana pipiens, GREGG ET LOVTRUP 4 donnent une valeur de o.19/,g par embryon. Compte tenu de la diff6rence d'esp+ce zoologique et du fait que nous avons travaill6 sur des oeufs f&ondgs et naturellement polyspermiques, on peut se d&larer tres satisfait de la concordance centre les deux types de m&hodes. Le fait que la courbe que nous avons obtenue pour la synth&se du DNA est quasi superposable ~ celles qui ont ~t6 publi6es par HOFF-JORGENSEN ET ZEUTHEN1 et par GREGG ET L0VTRUP3, 4 est une raison de plus pour faire confiance ~t la mdthode fluorom6trique. Nos exp6riences sont encore insuffisantes pour nous permettre de tenter d'expliquer le paradoxe, signal6 dans l'introduction du pr6sent travail, entre les r6sultats des dosages de DNA et les expfriences d'incorporation de pr6curseurs radioactifs dans les embryons. Nous pouvons cependant verser une pi&e suppl6mentaire au dossier: c'est que l'emploi de la m~thode trSs sp&ifique que nous avons mise au point confirme que la majenre partie (les 2/3 au moins) du DNA de l'oeuf vierge est li6e ~t des particules aisdment sddimentables (vitellus, pigment). Si ce DNA de r6serve est utilis6 pour la synth~se du DNA nucl6aire d~s la segmentation, il faudrait imaginer (et d6montrer) un mdcanisme enti~rement nouveau de d6gradation du vitellus: ce m 6 c a n i s m e - qui nous parait fort peu vraisemblable - devrait lib6rer le DNA du vitellus sans qu'il se produise de destruction morphologiquement visible de ce vitellus. I1 nous parait plus logique de penser, comme l'a soulign6 l'un de nous 13 que la synth~se du DNA doit se faire, chez l'oeuf en voie de d6veloppement comme partout ailleurs, c'est Biochim. Biophys. Acta, 6t (1962) I 5 7 - I 6 3

DNA DES OEUFS DE BATRACIENS

163

/t dire k partir du "pool" de ribo- et de d6soxyribo-nucl6osides et nucl6otides. Faisons remarquer, pour terminer, que nos rfsultats sont tr6s semblables 5. ceux que DURAND14 a obtenus rfcemment sur l'oeuf de criquet: chez cet insecte, comme chez les Batraciens, l'oeuf vierge contient une importante r6serve de DNA li6e en majeure partie aux granules ais6ment centrifugeables. Mais on doit 5. DURAND1¢ la d6monstration d'un fait suppl6mentaire et fort important: c'est que la composition en bases de ce DNA de rfserve est enti6rement diffdrente de celle du DNA pr6sent dans les noyaux du criquet; cela signifie qu'on ne peut lui attribuer un r61e gfndtique et qu'il ne s'agit que d'une simple r6serve, au m~me titre que les phosphoprot6ides qui constituent le gros des plaquettes vitellines. Ce DNA doit n6cessairement 6tre dfgrad6 avant de pouvoir 6tre utilis6 pour ]a syntli6se du mat6riel g6n6tique de l'embryon. I1 nous parait hautement probable qu'il doit en aller de m~me chez les Batraciens. REMERCIEMENTS

Le pr6sent travail a 6t6 effectu6 dans le cadre du contrat d'association entre l ' E u r a t o m et l'Universit6 libre de Bruxelles o16-61-1o ABIB. E. B. est charg6 de Recherches du Fonds National de la Recherche Scientifique Belge. R~SUM~ I. Une m6thode fluorom6trique pour le microdosage du DNA dans des mat6riaux pauvres en cet acide nucl6ique est d6crite. Elle est applicable 5. 5 oeufs d'Amphibiens, qui eontiennent, en tout, environ o. 5 #g de DNA. 2. La synth6se du DNA a 6t6 suivie au cours du d6veloppement des oeufs de Pleurod61es. Les r6sultats obtenus sont comparables 5. ceux qui ont 6t~ pr6alablement d6crits dans la litt6rature. 3. Au d6but du d6veloppement, 80 % du DNA total est s6dimentable par ultracentrifugation d'homog4nats. 4- Ces r6sultats sont bri6vement discut6s. BIBLIOGRAPHIE 1 2 a a 5 6 s 9 10 11 12 ~3 la

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