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Les cyclodextrines substituées : un exemple de catalyseurs biomimétiques
© 2007. Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés
Ann Pharm Fr 2007, 65 : 126-133
Réunion « jeunes biologistes » Les cyclodextrines substituées : un exemple de catalyseurs biomimétiques N. Masurier (1), O. Lafont (2), F. Estour (1), Résumé. Parmi les molécules susceptibles de mimer une activité enzymatique, les cyclodextrines constituent une plateforme intéressante pour le développement de composés biomimétiques. Ces oligosaccharides peuvent en effet former des complexes d’inclusion avec divers substrats organiques, dont les agents organophosphorés qui sont la base à la fois des armes de guerre chimiques et des insecticides les plus efficaces. Le soman, un redoutable agent neurotoxique, une fois « piégé » dans la cavité interne de la β-cyclodextrine peut en outre subir l’attaque nucléophile d’un groupe hydroxyle de l’oligosaccharide, mimant ainsi l’étape de formation d’un complexe enzyme-substrat. La substitution sélective de la β-cyclodextrine par un dérivé de l’acide 2iodoso-benzoïque permet ainsi d’accéder à des catalyseurs d’hydrolyse des agents organophosphorés. Évaluée à partir d’un substrat organophosphoré modèle, le paraoxon, l’activité OPasique peut atteindre jusqu’à deux ordres de grandeur de celle de l’acide 2-iodosobenzoïque libre malgré un phénomène de saturation apparaissant dans le temps. Bien que l’activité soit fonction de la position relative du groupement réactif vis-à-vis de la β-cyclodextrine, ces résultats montrent l’intérêt de la stratégie visant à « piéger » le substrat organophosphoré dans la cavité interne de l’oligosaccharide pour le maintenir à proximité de la fonction catalytique.
Mots-clés : Cyclodextrines, Biomimétisme, Catalyseur, Organophosphoré.
Summary. Among all molecules used to develop biomimetic catalysts, cyclodextrins are extremely attractive compounds. These oligosaccharides can form inclusion complexes with various organic substrates and in particular with organophosphorus poisons, which are widely used as chemical weapons and insecticides. Soman, a frightening neurotoxic agent, once “trapped” in the internal cavity of β-cyclodextrin can moreover undergo the nucleophilic attack of an oligosaccharide hydroxyl group, miming the first step of the enzymatic process. Selective substitution of β-cyclodextrin by a 2-iodosobenzoic acid derivative has enabled effective synthesis of scavangers against organophosphorus compounds. Hydrolysis trials were carried out with paraoxon, as an organophosphorus model. The OP-hydrolyzing activity could reach more than two order of magnitude compared with free 2-iodosobenzoïc acid. Nevertheless, hydrolysis of paraoxon showed saturation kinetics. Although the activity was strongly dependent on the relative position of the reactive group, these results showed the interest of a strategy, resulting in the “trapping” of the organophosphorus substrate in the internal cavity of the oligosaccharide in order to maintain it near the catalytic function.
Key-words: Cyclodextrins, Biomimetic reactions, Catalyst, Organophosphorus compound. Substituted cyclodextrins: an example of biomimetic catalyzers. N. Masurier, O. Lafont, F. Estour. Ann Pharm Fr 2007, 65: 126-133.
(1) Umr 6014, Cnrs, Université de Rouen, INSA de Rouen, Laboratoire de pharmacochimie, Ufr de médecine et de pharmacie, 22, boulevard Gambetta, F 76183 Rouen. (2) Laboratoire de pharmacochimie, Département de chimie organique pharmaceutique, Faculté de médecine et de pharmacie de Rouen, 22, boulevard Gambetta, F 76183 Rouen Cedex 1. Présentation devant l’Académie nationale de pharmacie, séance du 3 mai 2006 (réunion « jeunes biologistes »). Correspondance : F. Estour, à l’adresse (1) ci-dessus.
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Cyclodextrines et biomimétisme
L
a chimie biomimétique permet d’appréhender le fonctionnement de processus biologiques en concevant des composés dont les propriétés se rapprochent de celles des molécules naturelles. Lorsque le but recherché est de mimer l’activité d’une enzyme au cours d’une réaction spécifique, on parle alors d’enzymomimétisme. Initialement, de nombreux biocatalyseurs ont été développés principalement pour une utilisation en synthèse organique [1, 2]. Cependant, de nouvelles approches débouchant sur des applications thérapeutiques sont très vite apparues [3, 4]. Dans ce cadre, le recours à des enzymes a néanmoins conduit à un nombre peu important d’utilisations dans le domaine médical, ceci en raison principalement des propriétés immunogènes de ces protéines. Aussi, le développement de catalyseurs biologiques s’est-il orienté sur de nouvelles plateformes susceptibles d’échapper au moins partiellement à un contrôle physiologique trop restrictif par l’organisme. Les enzymes sont des entités protéiques associant une haute spécificité de substrat à leur propriété de catalyse. Ainsi, les modèles conçus pour mimer la catalyse enzymatique d’une réaction devront tenir compte de ces deux principes régissant les activités enzymatiques, à savoir la reconnaissance du substrat d’une part, et la stabilisation de l’état de transition de la réaction catalysée d’autre part.
Molécules biocompatibles susceptibles de mimer une activité enzymatique Le recours à d’autres protéines produites par l’organisme, les anticorps, a ouvert de nouvelles perspectives en étendant le champ d’investigation aux abzymes [5, 6]. Quoi qu’il en soit, les protéines ne sont pas les seules biomolécules susceptibles de pouvoir catalyser une réaction biochimique. Il a été notamment montré que des transferts de liens phosphates pouvaient être en particulier catalysés par des ARN naturels dénommés ribozymes [7, 8]. L’ensemble de ces dérivés biologiques en raison de leur relative fragilité peuvent néanmoins poser des problèmes de stabilité et cela nécessitera le développement de formules galéniques adaptées. En dépit de leur moindre biocompatibilité, les catalyseurs chimiques présentent généralement une meilleure stabilité (stockage et utilisation in
vivo), mais également une plus grande polyvalence que les biocatalyseurs. Dans ce cadre, l’impression polymérique d’une matrice est une technique qui s’est largement développée ces dernières années [9, 10]. Cependant, l’efficacité de telles structures polymériques demeure encore faible comparativement aux catalyseurs biologiques. La plupart des systèmes biomimétiques développés à ce jour l’ont été en utilisant des composés macrocyliques tels que les cyclodextrines [11, 12], les calixarènes [13], les éthers couronne [14], les porphyrines [15-19]. Nombre de ces macrocyles permettent de lier divers substrats organiques par différentes forces physiques. Une illustration de ce phénomène peut être faite à partir des cyclodextrines.
Les cyclodextrines : un piège entropique pour des substrats organiques Les cyclodextrines sont des oligosaccharides cycliques de forme toroïdale constitués de six, sept ou huit unités glucose, reliées entre elles par des liaisons α– (1,4), et dénommées respectivement α, β, et γcyclodextrines (fig. 1a). Elles présentent une cavité interne hydrophobe constituée par les atomes d’hydrogène et les atomes d’oxygène glucosidiques, alors que leur surface externe où se trouvent localisés les groupements hydroxyles des unités glucose a un caractère hydrophile. La forme tronconique des cyclodextrines requiert notamment un arrangement spécifique des différents groupes fonctionnels : ainsi, les fonctions hydroxyles primaires sont situées sur une extrémité du tore, alors que les fonctions hydroxyles secondaires se trouvent sur l’autre extrémité (fig. 1). Tout comme les calixarènes, les cyclodextrines sont connues pour leur capacité à former des complexes d’inclusion avec différents types de molécules organiques de dimension, de polarité et de nature chimique très diverses, ceci grâce essentiellement à des interactions hydrophobes entre le macrocycle et son substrat [20]. Dans ce processus, la molécule « hôte » (le récepteur) admet à l’intérieur de sa cavité une ou plusieurs autres molécules « invitées » (le(s) substrat(s)) sans qu’aucune liaison covalente ne s’établisse.
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N. Masurier et Coll. 1a
Structure des cyclodextrines
1b Exemple de composes organophosphorés O C2H5-O
OH HO
O NO2
P
C2H5-O
O-C2H5
O
n
n = 6 : α-cyckidextrine n = 7 : β-cyclodextrine n = 8 : γ-cyclodextrine
H3C
Tabun
O CH O
H3C
P CH3
Sarin
CN
N(CH3)2
Paraoxon
OH O
P
F
H3C
CH3 CH3
O
C
P
CH O
CH3
F
CH3 Soman
Figure 1. Cyclodextrine et composés organophosphorés. Cyclodextrin and organophosphorus.
La stabilité du complexe repose notamment sur la taille respective des partenaires et dépend donc de la qualité de l’adéquation entre eux. Les liens entre la molécule hôte et la molécule invitée étant des interactions faibles, ceci permet une dissociation aisée et douce du complexe d’inclusion ainsi formé. Cette propriété est particulièrement intéressante dans le domaine pharmaceutique. Elle est notamment mise à profit pour la solubilisation de principes actifs insolubles dans l’eau [21]. Il est de surcroît possible de modifier chimiquement une molécule de cyclodextrine pour optimiser les interactions entre la molécule incluse et la cyclodextrine. Il n’en demeure pas moins qu’une fois « piégé » dans la cavité interne d’une cyclodextrine, le substrat peut également réagir chimiquement avec la molécule d’oligosaccharide.
Les cyclodextrines : un modèle de complexe enzyme-substrat pour l’hydrolyse des agents organophosphorés Trouver un moyen permettant la dégradation rapide des agents neurotoxiques organophosphorés, aussi bien in vitro qu’in vivo pour décontaminer les matériels, protéger ou soigner les personnels, est une des principales préoccupations de la défense tant civile que militaire. Le recours à des
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dérivés de cyclodextrines apparaît particulièrement pertinent. Outre leur caractère biodégradable, de telles plateformes fonctionnalisables sont adaptées pour le développement de formes galéniques utilisables dans le cadre d’une protection cutanée (crèmes d’usage topique ou tissus fonctionnalisés) et d’une décontamination externe de la peau et des muqueuses exposées (sprays, lingettes, mousses, lotions…). Des premières études menées sur les interactions des cyclodextrines avec certains organophosphorés ont permis de montrer que ces oligosaccharides étaient capables d’accélérer le processus d’hydrolyse des diarylphosphates [22], des diarylméthylphosphonates [23], du 4-nitro-phénylphosphonate d’isopropyle [24] ainsi que le 4-nitrophényl-phosphate de diméthyle [25]. Dans ces réactions, le substrat complexé peut subir, en particulier, une attaque nucléophile de l’oligosaccharide, mimant ainsi l’étape de formation d’un complexe enzymesubstrat. Cependant, la formation de tels complexes est essentiellement conditionnée par l’ajustement du substrat à la cavité torique, donc fonction de leurs géométries et de leurs dimensions respectives. Elle dépend de surcroît de l’hydrophobie du substrat. Ainsi, d’autres études menées avec des agents neurotoxiques ont montré que le sarin (fig. 1b) est un substrat plutôt médiocre de l’α-cyclodextrine à pH 7,40 [26] et 9,00 [27, 28] et de la β-cyclodextrine dans les mêmes conditions [26]. Le tabun n’est pas un substrat de l’α- ni de la β-CD [26].
Cyclodextrines et biomimétisme
Inactivation des organophosphorés par des cyclodextrines fonctionnalisées
Par contre, le soman (fig. 1b), qui est un agent neurotoxique extrêmement puissant, est un bon substrat de la β-cyclodextrine à pH 7,40 [26, 29]. Après complexation du substrat dans la cavité de l’oligosaccharide, l’inactivation du soman par la β-cyclodextrine résulte de l’attaque nucléophile sur l’atome de phosphore par l’anion obtenu par déprotonation d’un alcool secondaire de la cyclodextrine. L’anion ainsi formé à partir de la β-cyclodextrine inactive le soman 2 600 fois plus vite qu’un ion hydroxyde libre. De surcroît, le soman étant un mélange de quatre stéréoisomères identifiables [30] et isolables [31] l’interaction du soman avec la β-cyclodextrine est stéréosélective [29]. Elle inactive plus rapidement les deux isomères (SPSC et SPRC, où P et C représentent les deux centres asymétriques) présentant une plus forte activité anticholinestérasique [30].
2a
I
2b
O
O C
Si la β-cyclodextrine paraît être un matériel attrayant pour la réalisation de catalyseurs efficaces de l’hydrolyse du soman à pH physiologique, en revanche, compte tenu du pKa d’environ 12,1 d’une fonction alcool secondaire en position 2 de la β-CD, à pH 7,40 seulement une molécule sur 50 000 est ionisée. Ceci implique l’introduction d’un groupement supplémentaire (de pKa très inférieur à 12,1) sur la β-cyclodextrine pour accélérer l’inactivation de l’OP. Dans ce but, l’introduction d’un dérivé de l’acide 2-iodosobenzoïque sur la face secondaire de la β-cyclodextrine a été étudiée. Outre la capacité de cet acide à catalyser l’hydrolyse de divers composés organophosphorés
OH
6
Br
O
4
I
O
5
3
OH
Forme active de l’acide 2-iodosobenzoïque 2c
O C
OCH3
I
Dérivés du 2-iodobenzoate de méthyle
2d
CH2OH HO
CH2OH
O OH O 6 HO
CH2OH
HO I O
HO
O O
O
O OH O 6 HO
CH2OH
X
5'
HO I O X = H, Br, NO2, OCH3 O
Épurateur catalytiques potentiels des agents organophosphorés
6'
O O
O
O
Substitution du cycle aromatique de la partie catalytique
Figure 2. Catalyseurs et acides iodosobenzoïques. Catalysts and iodosobenzoic acids.
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N. Masurier et Coll. [32-36], y compris les agents neurotoxiques [37], son activité est de surcroît compatible avec les milieux aqueux neutres. L’activité de différents dérivés de l’acide ortho-iodosobenzoïque a été étudiée en solution. Dans ces conditions, ce type de composé donne lieu à un équilibre tautomérique (fig. 2a) déplacé en faveur de la forme 1hydroxy-1,2-benziodoxolin-3-one qui se trouve être un puissant O-nucléophile [38, 39]. Sous cette forme cyclique, les différents dérivés de l’acide 2-iodo-sobenzoïque possèdent un pKa compris entre 6,45 et 7,20. Ainsi, à pH neutre ou tout au moins proche de la neutralité, la forme cyclique se trouve partiellement déprotonée conduisant à un composé anionique à forte potentialité nucléophile (fig. 2).
Développement de catalyseurs par monosubstitution sélective de la β-cyclodextrine Dans le but d’établir des relations structure-activité, il s’est avéré nécessaire de réaliser une introduction sélective d’un groupe réactif sur la molécule de β-cyclodextrine utilisée comme le site de liaison d’un substrat hydrophobe. Aussi bien la substitution de la face primaire (hydroxyles en position 6) que la fonctionnalisation de la face secondaire (hydroxyles en position 2 et 3) de la β-cyclodextrine sont intéressantes pour obtenir un mime d’enzyme. Le choix de la position de monosubstitution est en partie conditionné par le mécanisme de liaison du substrat par la cavité oligosaccharidique [40]. Dans le cadre de cette étude, les interactions de deux composés organophosphorés avec la molécule de β-cyclodextrine ont été pris plus particulièrement en compte. Le premier est le soman qui est un agent neurotoxique extrêmement dangereux car résistant aux principaux traitements actuels. Le deuxième composé est le paraoxon (fig. 1b) : habituellement utilisé comme pesticide, il représente un bon modèle de l’hydrolyse du soman. L’hydrolyse du paraoxon par la β-cyclodextrine, tout comme celle du soman, résulterait également d’une proximité suffisante entre l’atome de phosphore de la molécule de pesticide et l’un des alcools secondaires de l’oligosaccharide [26, 40].
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La monofonctionnalisation d’un alcool en position 2 de la β-cyclodextrine implique la déprotonation sélective d’un groupement hydroxyle qui peut alors réagir par substitution nucléophile avec un dérivé halogéné benzylique. Pour introduire la fonction acide iodosobenzoïque sur un alcool secondaire en position 2 de la β-cyclodextrine, quatre dérivés bromométhylés du 2-iodobenzoate de méthyle (fig. 2b) ont été synthétisés [41]. Le bras halogéno-alcane permettant la substitution nucléophile avec la β-cyclodextrine a été successivement introduit sur chacune des positions libres du cycle aromatique, le but étant de pouvoir modifier ainsi le positionnement de la fonction réactive vis-à-vis de l’organophosphoré piégé dans la cavité interne de l’oligosaccharide. La sélectivité de l’étape de substitution de la β-cyclodextrine selon des conditions opératoires déjà publiées [42] s’étant montrée dépendante de la position du bras bromométhylé, différentes conditions de fonctionnalisation de cet oligosaccharide ont été étudiées pour améliorer considérablement la régiosélectivité de la réaction et ainsi éviter des étapes ultérieures de purification relativement délicates [43]. L’utilisation du couple éthylate de sodium/ diméthylsulfoxide a permis d’obtenir avec de bons rendements sélectivement une monosubstitution sur la position O-2, et d’accéder après une étape d’oxydation-hydrolyse à quatre catalyseurs potentiels (fig. 2c).
Influence de la position relative du groupement catalytique sur l’activité OPasique Les premiers résultats cinétiques réalisés en suivant l’hydrolyse du paraoxon se sont montrés relativement prometteurs [41]. Le composé le plus actif a présenté une activité environ cent fois supérieure à celle de l’acide 2-iodosobenzoïque libre, montrant ainsi tout l’intérêt de piéger le substrat organophosphoré pour le maintenir à proximité du groupe réactif. Un phénomène de saturation apparaît au-delà de vingt minutes, phénomène dont il a été démontré qu’il résultait d’un « empoisonnement » du catalyseur par le paranitrophénol, produit de l’hydrolyse du paraoxon qui est solidement retenu en raison de sa densité
Cyclodextrines et biomimétisme électronique dans la cavité interne de l’oligosaccharide. Ce dernier aspect nécessitera d’apporter des modifications à la partie oligosaccharidique pour moduler l’affinité vis-à-vis des substrats organophosphorés et permettre ainsi à la fois le « piégeage » du composé organophosphoré, ainsi qu’une bonne libération de son produit d’hydrolyse. Toutefois, l’activité OPasique est directement influencée par la position relative du groupement catalytique vis-à-vis de la cavité interne de la βcyclodextrine, mais elle est également fonction de la flexibilité du bras étheroxyde liant la partie catalytique à l’oligosaccharide. Une expérience RMN de type NOESY a été effectuée à partir du catalyseur oligosaccharidique présentant la meilleure activité OPasique (fig. 2d, X = H) afin d’obtenir des informations supplémentaires quant au positionnement du groupe réactif vis-à-vis de la β-cyclodextrine. Les corrélations observées ont permis de mettre en évidence que les protons H-5’ et H-6’ de la partie aromatique du groupe catalytique sont orientés vers l’intérieur de la cavité oligosaccharidique. Un groupe supplémentaire (brome, nitro et méthoxy) a été introduit sur le cycle aromatique en position α (position 5’) de l’atome d’iode (fig. 2d). Des tests cinétiques préliminaires d’hydrolyse du paraoxon ont montré que, quelle que fût la nature du groupement supplémentaire introduit, et bien que l’agent organophosphoré fût toujours piégé dans la cavité interne de la cyclodextrine, une inhibition de l’activité hydrolytique était alors observée. Moss et al. avaient montré que la présence aussi bien d’un groupement électrodonneur qu’électroattracteur sur l’acide 2-iodosobenzoïque libre entraînait peu de variation sur la cinétique d’hydrolyse des organophosphorés. L’introduction de tels groupements semble donc affecter essentiellement l’orientation du groupement 2-iodosobenzoïque vis-à-vis de la cavité interne de la β-cyclodextrine et pourrait gêner partiellement l’accès de l’agent organophosphoré à la cavité de l’oligosaccharide.
une approche prometteuse. En dépit d’une moindre biocompatibilité des catalyseurs chimiques comparativement aux biocatalyseurs, leur plus grande stabilité permet d’entrevoir le développement ultérieur de formes galéniques adaptées à une protection et à une décontamination cutanée, mais également utilisables pour le traitement du matériel contaminé. L’introduction d’un groupe réactif, l’acide 2-iodosobenzoïque sur la face secondaire de la β-cyclodextrine a permis d’accéder à quatre composés, dont trois ont manifesté une activité hydrolytique catalytique intéressante vis-à-vis du paraoxon. Ces essais préliminaires ont permis de montrer que l’activité OPasique observée était toutefois régiocontrôlée, et qu’au cours du temps apparaissait un phénomène de saturation correspondant à un « empoisonnement » de la cavité interne du catalyseur oligosaccharidique qui réagit alors de façon stoechiométrique avec le substrat. L’introduction sélective de la partie catalytique sur l’oligosaccharide et son positionnement vis-à-vis de la cavité interne de la cyclodextrine devront être particulièrement étudiés pour déterminer les paramètres stériques permettant d’obtenir une réactivité optimale. Des modifications chimiques devront également être apportées au niveau de la cyclodextrine pour moduler les propriétés hydrophobes de sa cavité interne.
Remerciements Les auteurs adressent leurs plus sincères remerciements d’une part à la délégation générale pour l’Armement (DGA) pour son soutien financier (bourse de doctorat accordée à N. Masurier ; PEA 010807 – contrat d’objectif n° 03 CO 001-10), et d’autre part à J.-C. Debouzy pour la réalisation des expériences RMN NOESY.
Références
Conclusion
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133
Ann Pharm Fr 2007, 65 : 126-133
Réunion « jeunes biologistes » Les cyclodextrines substituées : un exemple de catalyseurs biomimétiques N. Masurier (1), O. Lafont (2), F. Estour (1), Résumé. Parmi les molécules susceptibles de mimer une activité enzymatique, les cyclodextrines constituent une plateforme intéressante pour le développement de composés biomimétiques. Ces oligosaccharides peuvent en effet former des complexes d’inclusion avec divers substrats organiques, dont les agents organophosphorés qui sont la base à la fois des armes de guerre chimiques et des insecticides les plus efficaces. Le soman, un redoutable agent neurotoxique, une fois « piégé » dans la cavité interne de la β-cyclodextrine peut en outre subir l’attaque nucléophile d’un groupe hydroxyle de l’oligosaccharide, mimant ainsi l’étape de formation d’un complexe enzyme-substrat. La substitution sélective de la β-cyclodextrine par un dérivé de l’acide 2iodoso-benzoïque permet ainsi d’accéder à des catalyseurs d’hydrolyse des agents organophosphorés. Évaluée à partir d’un substrat organophosphoré modèle, le paraoxon, l’activité OPasique peut atteindre jusqu’à deux ordres de grandeur de celle de l’acide 2-iodosobenzoïque libre malgré un phénomène de saturation apparaissant dans le temps. Bien que l’activité soit fonction de la position relative du groupement réactif vis-à-vis de la β-cyclodextrine, ces résultats montrent l’intérêt de la stratégie visant à « piéger » le substrat organophosphoré dans la cavité interne de l’oligosaccharide pour le maintenir à proximité de la fonction catalytique.
Mots-clés : Cyclodextrines, Biomimétisme, Catalyseur, Organophosphoré.
Summary. Among all molecules used to develop biomimetic catalysts, cyclodextrins are extremely attractive compounds. These oligosaccharides can form inclusion complexes with various organic substrates and in particular with organophosphorus poisons, which are widely used as chemical weapons and insecticides. Soman, a frightening neurotoxic agent, once “trapped” in the internal cavity of β-cyclodextrin can moreover undergo the nucleophilic attack of an oligosaccharide hydroxyl group, miming the first step of the enzymatic process. Selective substitution of β-cyclodextrin by a 2-iodosobenzoic acid derivative has enabled effective synthesis of scavangers against organophosphorus compounds. Hydrolysis trials were carried out with paraoxon, as an organophosphorus model. The OP-hydrolyzing activity could reach more than two order of magnitude compared with free 2-iodosobenzoïc acid. Nevertheless, hydrolysis of paraoxon showed saturation kinetics. Although the activity was strongly dependent on the relative position of the reactive group, these results showed the interest of a strategy, resulting in the “trapping” of the organophosphorus substrate in the internal cavity of the oligosaccharide in order to maintain it near the catalytic function.
Key-words: Cyclodextrins, Biomimetic reactions, Catalyst, Organophosphorus compound. Substituted cyclodextrins: an example of biomimetic catalyzers. N. Masurier, O. Lafont, F. Estour. Ann Pharm Fr 2007, 65: 126-133.
(1) Umr 6014, Cnrs, Université de Rouen, INSA de Rouen, Laboratoire de pharmacochimie, Ufr de médecine et de pharmacie, 22, boulevard Gambetta, F 76183 Rouen. (2) Laboratoire de pharmacochimie, Département de chimie organique pharmaceutique, Faculté de médecine et de pharmacie de Rouen, 22, boulevard Gambetta, F 76183 Rouen Cedex 1. Présentation devant l’Académie nationale de pharmacie, séance du 3 mai 2006 (réunion « jeunes biologistes »). Correspondance : F. Estour, à l’adresse (1) ci-dessus.
126
Cyclodextrines et biomimétisme
L
a chimie biomimétique permet d’appréhender le fonctionnement de processus biologiques en concevant des composés dont les propriétés se rapprochent de celles des molécules naturelles. Lorsque le but recherché est de mimer l’activité d’une enzyme au cours d’une réaction spécifique, on parle alors d’enzymomimétisme. Initialement, de nombreux biocatalyseurs ont été développés principalement pour une utilisation en synthèse organique [1, 2]. Cependant, de nouvelles approches débouchant sur des applications thérapeutiques sont très vite apparues [3, 4]. Dans ce cadre, le recours à des enzymes a néanmoins conduit à un nombre peu important d’utilisations dans le domaine médical, ceci en raison principalement des propriétés immunogènes de ces protéines. Aussi, le développement de catalyseurs biologiques s’est-il orienté sur de nouvelles plateformes susceptibles d’échapper au moins partiellement à un contrôle physiologique trop restrictif par l’organisme. Les enzymes sont des entités protéiques associant une haute spécificité de substrat à leur propriété de catalyse. Ainsi, les modèles conçus pour mimer la catalyse enzymatique d’une réaction devront tenir compte de ces deux principes régissant les activités enzymatiques, à savoir la reconnaissance du substrat d’une part, et la stabilisation de l’état de transition de la réaction catalysée d’autre part.
Molécules biocompatibles susceptibles de mimer une activité enzymatique Le recours à d’autres protéines produites par l’organisme, les anticorps, a ouvert de nouvelles perspectives en étendant le champ d’investigation aux abzymes [5, 6]. Quoi qu’il en soit, les protéines ne sont pas les seules biomolécules susceptibles de pouvoir catalyser une réaction biochimique. Il a été notamment montré que des transferts de liens phosphates pouvaient être en particulier catalysés par des ARN naturels dénommés ribozymes [7, 8]. L’ensemble de ces dérivés biologiques en raison de leur relative fragilité peuvent néanmoins poser des problèmes de stabilité et cela nécessitera le développement de formules galéniques adaptées. En dépit de leur moindre biocompatibilité, les catalyseurs chimiques présentent généralement une meilleure stabilité (stockage et utilisation in
vivo), mais également une plus grande polyvalence que les biocatalyseurs. Dans ce cadre, l’impression polymérique d’une matrice est une technique qui s’est largement développée ces dernières années [9, 10]. Cependant, l’efficacité de telles structures polymériques demeure encore faible comparativement aux catalyseurs biologiques. La plupart des systèmes biomimétiques développés à ce jour l’ont été en utilisant des composés macrocyliques tels que les cyclodextrines [11, 12], les calixarènes [13], les éthers couronne [14], les porphyrines [15-19]. Nombre de ces macrocyles permettent de lier divers substrats organiques par différentes forces physiques. Une illustration de ce phénomène peut être faite à partir des cyclodextrines.
Les cyclodextrines : un piège entropique pour des substrats organiques Les cyclodextrines sont des oligosaccharides cycliques de forme toroïdale constitués de six, sept ou huit unités glucose, reliées entre elles par des liaisons α– (1,4), et dénommées respectivement α, β, et γcyclodextrines (fig. 1a). Elles présentent une cavité interne hydrophobe constituée par les atomes d’hydrogène et les atomes d’oxygène glucosidiques, alors que leur surface externe où se trouvent localisés les groupements hydroxyles des unités glucose a un caractère hydrophile. La forme tronconique des cyclodextrines requiert notamment un arrangement spécifique des différents groupes fonctionnels : ainsi, les fonctions hydroxyles primaires sont situées sur une extrémité du tore, alors que les fonctions hydroxyles secondaires se trouvent sur l’autre extrémité (fig. 1). Tout comme les calixarènes, les cyclodextrines sont connues pour leur capacité à former des complexes d’inclusion avec différents types de molécules organiques de dimension, de polarité et de nature chimique très diverses, ceci grâce essentiellement à des interactions hydrophobes entre le macrocycle et son substrat [20]. Dans ce processus, la molécule « hôte » (le récepteur) admet à l’intérieur de sa cavité une ou plusieurs autres molécules « invitées » (le(s) substrat(s)) sans qu’aucune liaison covalente ne s’établisse.
127
N. Masurier et Coll. 1a
Structure des cyclodextrines
1b Exemple de composes organophosphorés O C2H5-O
OH HO
O NO2
P
C2H5-O
O-C2H5
O
n
n = 6 : α-cyckidextrine n = 7 : β-cyclodextrine n = 8 : γ-cyclodextrine
H3C
Tabun
O CH O
H3C
P CH3
Sarin
CN
N(CH3)2
Paraoxon
OH O
P
F
H3C
CH3 CH3
O
C
P
CH O
CH3
F
CH3 Soman
Figure 1. Cyclodextrine et composés organophosphorés. Cyclodextrin and organophosphorus.
La stabilité du complexe repose notamment sur la taille respective des partenaires et dépend donc de la qualité de l’adéquation entre eux. Les liens entre la molécule hôte et la molécule invitée étant des interactions faibles, ceci permet une dissociation aisée et douce du complexe d’inclusion ainsi formé. Cette propriété est particulièrement intéressante dans le domaine pharmaceutique. Elle est notamment mise à profit pour la solubilisation de principes actifs insolubles dans l’eau [21]. Il est de surcroît possible de modifier chimiquement une molécule de cyclodextrine pour optimiser les interactions entre la molécule incluse et la cyclodextrine. Il n’en demeure pas moins qu’une fois « piégé » dans la cavité interne d’une cyclodextrine, le substrat peut également réagir chimiquement avec la molécule d’oligosaccharide.
Les cyclodextrines : un modèle de complexe enzyme-substrat pour l’hydrolyse des agents organophosphorés Trouver un moyen permettant la dégradation rapide des agents neurotoxiques organophosphorés, aussi bien in vitro qu’in vivo pour décontaminer les matériels, protéger ou soigner les personnels, est une des principales préoccupations de la défense tant civile que militaire. Le recours à des
128
dérivés de cyclodextrines apparaît particulièrement pertinent. Outre leur caractère biodégradable, de telles plateformes fonctionnalisables sont adaptées pour le développement de formes galéniques utilisables dans le cadre d’une protection cutanée (crèmes d’usage topique ou tissus fonctionnalisés) et d’une décontamination externe de la peau et des muqueuses exposées (sprays, lingettes, mousses, lotions…). Des premières études menées sur les interactions des cyclodextrines avec certains organophosphorés ont permis de montrer que ces oligosaccharides étaient capables d’accélérer le processus d’hydrolyse des diarylphosphates [22], des diarylméthylphosphonates [23], du 4-nitro-phénylphosphonate d’isopropyle [24] ainsi que le 4-nitrophényl-phosphate de diméthyle [25]. Dans ces réactions, le substrat complexé peut subir, en particulier, une attaque nucléophile de l’oligosaccharide, mimant ainsi l’étape de formation d’un complexe enzymesubstrat. Cependant, la formation de tels complexes est essentiellement conditionnée par l’ajustement du substrat à la cavité torique, donc fonction de leurs géométries et de leurs dimensions respectives. Elle dépend de surcroît de l’hydrophobie du substrat. Ainsi, d’autres études menées avec des agents neurotoxiques ont montré que le sarin (fig. 1b) est un substrat plutôt médiocre de l’α-cyclodextrine à pH 7,40 [26] et 9,00 [27, 28] et de la β-cyclodextrine dans les mêmes conditions [26]. Le tabun n’est pas un substrat de l’α- ni de la β-CD [26].
Cyclodextrines et biomimétisme
Inactivation des organophosphorés par des cyclodextrines fonctionnalisées
Par contre, le soman (fig. 1b), qui est un agent neurotoxique extrêmement puissant, est un bon substrat de la β-cyclodextrine à pH 7,40 [26, 29]. Après complexation du substrat dans la cavité de l’oligosaccharide, l’inactivation du soman par la β-cyclodextrine résulte de l’attaque nucléophile sur l’atome de phosphore par l’anion obtenu par déprotonation d’un alcool secondaire de la cyclodextrine. L’anion ainsi formé à partir de la β-cyclodextrine inactive le soman 2 600 fois plus vite qu’un ion hydroxyde libre. De surcroît, le soman étant un mélange de quatre stéréoisomères identifiables [30] et isolables [31] l’interaction du soman avec la β-cyclodextrine est stéréosélective [29]. Elle inactive plus rapidement les deux isomères (SPSC et SPRC, où P et C représentent les deux centres asymétriques) présentant une plus forte activité anticholinestérasique [30].
2a
I
2b
O
O C
Si la β-cyclodextrine paraît être un matériel attrayant pour la réalisation de catalyseurs efficaces de l’hydrolyse du soman à pH physiologique, en revanche, compte tenu du pKa d’environ 12,1 d’une fonction alcool secondaire en position 2 de la β-CD, à pH 7,40 seulement une molécule sur 50 000 est ionisée. Ceci implique l’introduction d’un groupement supplémentaire (de pKa très inférieur à 12,1) sur la β-cyclodextrine pour accélérer l’inactivation de l’OP. Dans ce but, l’introduction d’un dérivé de l’acide 2-iodosobenzoïque sur la face secondaire de la β-cyclodextrine a été étudiée. Outre la capacité de cet acide à catalyser l’hydrolyse de divers composés organophosphorés
OH
6
Br
O
4
I
O
5
3
OH
Forme active de l’acide 2-iodosobenzoïque 2c
O C
OCH3
I
Dérivés du 2-iodobenzoate de méthyle
2d
CH2OH HO
CH2OH
O OH O 6 HO
CH2OH
HO I O
HO
O O
O
O OH O 6 HO
CH2OH
X
5'
HO I O X = H, Br, NO2, OCH3 O
Épurateur catalytiques potentiels des agents organophosphorés
6'
O O
O
O
Substitution du cycle aromatique de la partie catalytique
Figure 2. Catalyseurs et acides iodosobenzoïques. Catalysts and iodosobenzoic acids.
129
N. Masurier et Coll. [32-36], y compris les agents neurotoxiques [37], son activité est de surcroît compatible avec les milieux aqueux neutres. L’activité de différents dérivés de l’acide ortho-iodosobenzoïque a été étudiée en solution. Dans ces conditions, ce type de composé donne lieu à un équilibre tautomérique (fig. 2a) déplacé en faveur de la forme 1hydroxy-1,2-benziodoxolin-3-one qui se trouve être un puissant O-nucléophile [38, 39]. Sous cette forme cyclique, les différents dérivés de l’acide 2-iodo-sobenzoïque possèdent un pKa compris entre 6,45 et 7,20. Ainsi, à pH neutre ou tout au moins proche de la neutralité, la forme cyclique se trouve partiellement déprotonée conduisant à un composé anionique à forte potentialité nucléophile (fig. 2).
Développement de catalyseurs par monosubstitution sélective de la β-cyclodextrine Dans le but d’établir des relations structure-activité, il s’est avéré nécessaire de réaliser une introduction sélective d’un groupe réactif sur la molécule de β-cyclodextrine utilisée comme le site de liaison d’un substrat hydrophobe. Aussi bien la substitution de la face primaire (hydroxyles en position 6) que la fonctionnalisation de la face secondaire (hydroxyles en position 2 et 3) de la β-cyclodextrine sont intéressantes pour obtenir un mime d’enzyme. Le choix de la position de monosubstitution est en partie conditionné par le mécanisme de liaison du substrat par la cavité oligosaccharidique [40]. Dans le cadre de cette étude, les interactions de deux composés organophosphorés avec la molécule de β-cyclodextrine ont été pris plus particulièrement en compte. Le premier est le soman qui est un agent neurotoxique extrêmement dangereux car résistant aux principaux traitements actuels. Le deuxième composé est le paraoxon (fig. 1b) : habituellement utilisé comme pesticide, il représente un bon modèle de l’hydrolyse du soman. L’hydrolyse du paraoxon par la β-cyclodextrine, tout comme celle du soman, résulterait également d’une proximité suffisante entre l’atome de phosphore de la molécule de pesticide et l’un des alcools secondaires de l’oligosaccharide [26, 40].
130
La monofonctionnalisation d’un alcool en position 2 de la β-cyclodextrine implique la déprotonation sélective d’un groupement hydroxyle qui peut alors réagir par substitution nucléophile avec un dérivé halogéné benzylique. Pour introduire la fonction acide iodosobenzoïque sur un alcool secondaire en position 2 de la β-cyclodextrine, quatre dérivés bromométhylés du 2-iodobenzoate de méthyle (fig. 2b) ont été synthétisés [41]. Le bras halogéno-alcane permettant la substitution nucléophile avec la β-cyclodextrine a été successivement introduit sur chacune des positions libres du cycle aromatique, le but étant de pouvoir modifier ainsi le positionnement de la fonction réactive vis-à-vis de l’organophosphoré piégé dans la cavité interne de l’oligosaccharide. La sélectivité de l’étape de substitution de la β-cyclodextrine selon des conditions opératoires déjà publiées [42] s’étant montrée dépendante de la position du bras bromométhylé, différentes conditions de fonctionnalisation de cet oligosaccharide ont été étudiées pour améliorer considérablement la régiosélectivité de la réaction et ainsi éviter des étapes ultérieures de purification relativement délicates [43]. L’utilisation du couple éthylate de sodium/ diméthylsulfoxide a permis d’obtenir avec de bons rendements sélectivement une monosubstitution sur la position O-2, et d’accéder après une étape d’oxydation-hydrolyse à quatre catalyseurs potentiels (fig. 2c).
Influence de la position relative du groupement catalytique sur l’activité OPasique Les premiers résultats cinétiques réalisés en suivant l’hydrolyse du paraoxon se sont montrés relativement prometteurs [41]. Le composé le plus actif a présenté une activité environ cent fois supérieure à celle de l’acide 2-iodosobenzoïque libre, montrant ainsi tout l’intérêt de piéger le substrat organophosphoré pour le maintenir à proximité du groupe réactif. Un phénomène de saturation apparaît au-delà de vingt minutes, phénomène dont il a été démontré qu’il résultait d’un « empoisonnement » du catalyseur par le paranitrophénol, produit de l’hydrolyse du paraoxon qui est solidement retenu en raison de sa densité
Cyclodextrines et biomimétisme électronique dans la cavité interne de l’oligosaccharide. Ce dernier aspect nécessitera d’apporter des modifications à la partie oligosaccharidique pour moduler l’affinité vis-à-vis des substrats organophosphorés et permettre ainsi à la fois le « piégeage » du composé organophosphoré, ainsi qu’une bonne libération de son produit d’hydrolyse. Toutefois, l’activité OPasique est directement influencée par la position relative du groupement catalytique vis-à-vis de la cavité interne de la βcyclodextrine, mais elle est également fonction de la flexibilité du bras étheroxyde liant la partie catalytique à l’oligosaccharide. Une expérience RMN de type NOESY a été effectuée à partir du catalyseur oligosaccharidique présentant la meilleure activité OPasique (fig. 2d, X = H) afin d’obtenir des informations supplémentaires quant au positionnement du groupe réactif vis-à-vis de la β-cyclodextrine. Les corrélations observées ont permis de mettre en évidence que les protons H-5’ et H-6’ de la partie aromatique du groupe catalytique sont orientés vers l’intérieur de la cavité oligosaccharidique. Un groupe supplémentaire (brome, nitro et méthoxy) a été introduit sur le cycle aromatique en position α (position 5’) de l’atome d’iode (fig. 2d). Des tests cinétiques préliminaires d’hydrolyse du paraoxon ont montré que, quelle que fût la nature du groupement supplémentaire introduit, et bien que l’agent organophosphoré fût toujours piégé dans la cavité interne de la cyclodextrine, une inhibition de l’activité hydrolytique était alors observée. Moss et al. avaient montré que la présence aussi bien d’un groupement électrodonneur qu’électroattracteur sur l’acide 2-iodosobenzoïque libre entraînait peu de variation sur la cinétique d’hydrolyse des organophosphorés. L’introduction de tels groupements semble donc affecter essentiellement l’orientation du groupement 2-iodosobenzoïque vis-à-vis de la cavité interne de la β-cyclodextrine et pourrait gêner partiellement l’accès de l’agent organophosphoré à la cavité de l’oligosaccharide.
une approche prometteuse. En dépit d’une moindre biocompatibilité des catalyseurs chimiques comparativement aux biocatalyseurs, leur plus grande stabilité permet d’entrevoir le développement ultérieur de formes galéniques adaptées à une protection et à une décontamination cutanée, mais également utilisables pour le traitement du matériel contaminé. L’introduction d’un groupe réactif, l’acide 2-iodosobenzoïque sur la face secondaire de la β-cyclodextrine a permis d’accéder à quatre composés, dont trois ont manifesté une activité hydrolytique catalytique intéressante vis-à-vis du paraoxon. Ces essais préliminaires ont permis de montrer que l’activité OPasique observée était toutefois régiocontrôlée, et qu’au cours du temps apparaissait un phénomène de saturation correspondant à un « empoisonnement » de la cavité interne du catalyseur oligosaccharidique qui réagit alors de façon stoechiométrique avec le substrat. L’introduction sélective de la partie catalytique sur l’oligosaccharide et son positionnement vis-à-vis de la cavité interne de la cyclodextrine devront être particulièrement étudiés pour déterminer les paramètres stériques permettant d’obtenir une réactivité optimale. Des modifications chimiques devront également être apportées au niveau de la cyclodextrine pour moduler les propriétés hydrophobes de sa cavité interne.
Remerciements Les auteurs adressent leurs plus sincères remerciements d’une part à la délégation générale pour l’Armement (DGA) pour son soutien financier (bourse de doctorat accordée à N. Masurier ; PEA 010807 – contrat d’objectif n° 03 CO 001-10), et d’autre part à J.-C. Debouzy pour la réalisation des expériences RMN NOESY.
Références
Conclusion
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