Lipides spécifiques de Mycobacterium ulcerans

Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur) 1984, 135 A, 191-201

LIPIDES DE

SPI~CIFIQUES

MYCOBACTERIUM

ULCERANS

par M. Daft6, M. A. Lan6elle, J. Roussel et C. Asselineau

Centre de Biochimie et Gdndtique Celhdaires du CNRS Universitd Paul Sabalier, 118 Route de Narbonne, 31602 Toulouse Cedex (France)

SUMMARY SPECIFIC

L I P I D S F R O M ~( ~ Y C O B A C T E R I U M

ULCERANS

)~

The main lipids synthesized by Mgcobacterium ulcerans are specific for the species. Three products were isolated by chromatography. Their structures were determined by means of spectrographic methods performed on the natural substances or on their split products. The most a b u n d a n t products were phthiodiolone diphthioceranate and phenolphthiodiolone diphthioceranate. These structures have some analogies with those of phthiocerol dimycocerosate synthesized by M. tuberculosis and M. boris, and with those of phenolphthiocerol mycocerosate synthesized by M. boris. The reverse configuration of the polymethyl-branched-chain fatty acids isolated from the substances, according to their origin, remains to be pointed out. Little attention has generally been paid to the stereochemistry of such molecules. We verified t h a t the branched-chain fatty acids found in diaeyl phthiocerol and in the mycoside of M. leprae have the same configuration as in the analogous molecules isolated from M. tuberculosis or M. boris, contrary to M. ulcerans. Another peculiarity of phenolphthiodiolone isolated from M. ulcerans is the occurrence of the phenol group in free form. KEY-WORDS: Mycobaclerium ulcerans, lipid, Phthiodiolone diphthioceranate, Phenolphthiodiolone diphthioceranate.

INTRODUCTION Mycobaclerium ulcerous est une bact6rie pathog~ne pour F h o m m e m o n t r a n t quelques analogies avec M. leprae. Les deux esp~ces sont impliManuscrit regu le 12 s e p t e m b r e 1983, accept6 le 8 octobre 1983.

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M. DAFFE ET COLL.

qu~es directement ou indireetement dans des affections cutan~es, avee une predilection pour les parties les plus froides du corps humain, toutes deux se d6veloppent dans le eoussinet plantaire de souris [16, 17], et elles sont sensibles h la dapsone [15]. Enfin, l'analyse des constituants lipidiques obtenus par saponification des baet~ries m o n t r e que les deux esp~ees, it un degr~ d'homologie pros, synth~tisent les m~mes mycolates [5]. Aucune de ees analogies ne s'applique de mani~re restrictive ~ ees deux esp~ees, mais leur accumulation nous a ineitfis ~ reehereher de n o u v e a u x 61~ments de comparaison. De croissance tr~s lente, M. ulcerans est n6anmoins cultivable sur les milieux de laboratoire g6nfiralement utilisfis pour la culture des myeobaet6ries, contrairement it M. leprae, parasite obligatoire. Nous avons isol6 les constituants lipidiques superfieiels de M. ulcerans, afin de les comparer ~ ceux de M. leprae d~crits r~cemment, et dont terrains sont des d~terminants antigfiniques [10, 14]. Nous dfierivons ici les plus importants, q u a n t i t a t i v e m e n t , de ees constituants, et nous montrons leurs analogies et leurs differences avee ceux de M. leprae et de quelques autres mycobaet6ries.

M A T / ~ R I E L S E T Mt~THODES

Bacl~ries. Les souches HB3436 et HB4834 de M. ulcerans (Collection Institut Pasteur, Paris) ainsi que la souche type ATCC19423, ont fit6 utilis6es. Les souches ATCC14478 de M. kansasii et de BCG (Collection Institut Pasteur) ont 6galement 6t6 cultiv6es pour fournir des 616ments de r6f6rence. Les bact6ries onL 6t~ cultiv6es en voile, sur bouillon trypticase-soja additionn6 de 4~o de glycerol. Elles ont 6t6 r~colt6es aprbs incubation h 32 ° C pendant trois, six ou douze mois pour M. ulcerans, et apr~s incubation h 37 ° C pendant quatre ou douze semaines pour M. kansasii ou BEG. Exlraction des lipides. Apr6s dlimination par pipetage du milieu de culture, les voiles baet6riens, ont 6t6 mis en suspension dans un solvant lipophile, choisi de mani~re h 6viter toute (c d6mixion au contact des bact6ries humides. Le mdlange ehloroforme+mfthanol (3/2, v/v) a fit6 utilis6 pour l'extraction des lipides libres, extraction totale apr6s trois traitements. Le pentane permet d'extraire une eouche lipidique superfieielle des baetdries, qui malgr6 ce traitement, peuvent donner naissance, apr6s incubation, ~ un nouveau voile baetdrien. Fraclionnement el analyse chromalographique des lipides. La fraction totale extraite par le mdlange chloroforme+m6thanol a ~t~ reprise par le dichloromfithane et l'eau et sfipar~e en une fraction liposoluble et une fraction hydrosoluble ou ~mulsionnable dans l'eau. La partie soluble dans le dichloromfithane a ~t~ fraetionnfie par chromatographic sur colonne d'aeide silieique, utilis~ h raison de 100 g d'adsorbant pour 1 g de lipides. L'filution a gt~ effeetufie par le diehlorom~thane, puis par un gradient diseontinu de ehloroforme darts le dichloromfithane, et enfin par un gradient de mfithanol dans le chloroforme.

LIPIDES DE MYCOBACTERIUM

ULCERANS

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La composition des extraits lipidiques totaux, ou de celle des fractions obtenues partir de ceux-l~, a 6t6 examin6e par chromatographie sur couche mince de gel de silice. Les solvants de d6veloppement employds sont l'6ther de pdtrole (6bullition 50-55 ° C) contenant 5 ~ 15% d'6ther (v/v) ou le chloroforme contenant 5 10% de mdthanol. Le choix du solvant a dt6 ddtermi,n6 par la polarit6 relative des fractions examindes, qui ddcoule en particulier de 1 ordre d'dlution ~ partir de la colonne. Les spots lipidiques ont 6t6 rdv61ds par aspersion par une solution de rhodamine B (0,01% dans le t a m p o n phosphate monosodique 0,25 M). Le traitement par le r6acti,f de Dittmer permet de distinguer les phospholipides [7], et lc traitement par 1 orcinol [11] ou par l anthrone (0,2% dans 1 acide sulfurique), les glycolipides. Les fractions ayant retenu l'attention ont ~t6 purifi6es par chromatographic pr@arative sur couche mince de gel de silice, jusqu'h obtention de substances chromatographiquement homog~nes, et de pouvoirs rotatoires constants.

Saponification des substances lipidiques d~finies isol~es. La saponification requiert des conditions 6nergiques. Le traitement de 10 mg de lipide par 3 m l d une solution de potasse ~ 5 % dans le m6thycellosolve (m6thoxy6thanol) contenant 5% d'eau, fi 110 o C pendant 4 h , permet une saponification totale. Apr6s refroidissement, la solution est acidifide par un exe6s d'acide sulfurique dilu~, et extraite par l'6ther. La solution ~th6r~e est large ~ l'eau pour l'6vacuation de l'acide sulfurique et du mdthylcellosolve, et s@hde sur sulfate de sodium. Les produits de la rdaction sont s6pards et purifids par chromatographie de la m6me mani6re, ddcrite ci-dessus, que pour les produits de ddpart. L'examen en chromatographie en phase vapeur des esters obtenues par mdthylation par le diazomdthane des acides rdsultant de ces saponifications a 6t6 rdalis6 dans des conditions ddj~ ddcrites [5].

Scission rdduclrice des substances lipidiques d~finies isol6es. La substance h traiter, en solution dilu6e darts le t~trahydrofuranne anhydre (environ 2 mg/ml) a 6t6 ajout@ ~ un volume 6gal d'une solution ~ 2 % d'hydrure double de lithium et d'aluminium dans le t6trahydrofuranne anhydre. Apr6s 15 rain d'6bullition en atmosph6re anhydre puis rdfroidissement, un exc6s d'ac6tate d'dthyle a dt6 ajout6 pour d6truire l'exc6s de rdactif. AprOs acidification par l'acide sulfurique, sous refroidissement, les substances lipidiques sont extraites par l'6ther et, apr6s traitement habituel, sont isol@s et purifi6es par chromatographic.

Caracldrisalion des produils. Les lipides naturels ou les produits de leur transformation ont 6t6 pour la plupart caractdris~s par leurs propridtds chromatographiques, leurs pouvoirs rotatoires et leurs spectres d'absorption dans l'ultraviolet et l'infrarouge, d6terminds dans les conditions ddfnies sur les tableaux I, II et III. La plupart des substances etudi~es ont 6t6 sounlises fi l'analyse par spectromdtrie de masse. Les spectres ont 6t6 enregistr6s /~ l'aide d'un appareil (( Varian Mat 311A ~, en impact 61ectronique. L'~nergie des ~leetrons 6rant de 70 ~leetronvolts, les dchantillons directement introduits dans la source ont dt6 soumis ~ une vaporisation fractionnde ; la temperature du creuset a dt6 61evde, avec de nombreux paliers, de 50 ~ 250 ° C, et les spectres ont 6t6 enregistr6s ~ chacune des ~tapes de vaporisation. Les spectres de rdsonnance magn6tique nucldaire (1RMN), enregistrds ~ l'aide d'un appareil ~ Cameca 250 ~,, par les soins du ~ Service Commun de RMN 7, de l'Universit6 Paul Sabatier, ont 6t6 utilis6s pour la confguration des structures.

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RI~SULTATS Mise en dvidence el isolement de lipides caractdristiques. P a r extraction par le mOlange m6thanol&chloroforme, dans les conditions d6crites ci-dessus, la masse bact6rienne r~colt~e a fourni 1,3 g de fraction soluble (lipides bruts) et 2,3 g de corps bact6riens d6lipid~s (pesOs apr6s s6chage sous vide, au dessicateur, en prOsence d'anhydride phosphorique), soit un rendement de 3 5 % en lipides bruts par rapport fi la masse bactOrienne totale. E t a n t donn~ le mode de r6colte et d'extraction des bact6ries, ces lipides brnts contiennent une quantit6 i m p o r t a n t e de substances hydrosolubles, dont l'Olimination n6cessiterait un lavage l'eau de la solution chloroformique, selon un proc~d6 classique. Notre propos ~tant ici, dans un premier temps de rep&er d'6ventuels mycosides p o u v a n t presenter un caract~re amphiphile, nous avons pr~f~r~ proc~der t o u t d'abord ~ leur recherche par chromatographic sur couche mince partir de l'extrait lipidique brut. Cette analyse met en ~vidence q u a t r e constituants insensibles aux r~aetifs sp~cifiques des phospholipides et des glycolipides. Les moins polaires de ces quatre substances, que nous d~signerons par A et B, sont en quantit~s n e t t e m e n t pr~pond~rantes par r a p p o r t anx deux autres, C et D. Q u a n t aux phospholipides et au seul glycolipide mis en ~vidence (et identifi~ au (¢ cord factor 0, ils apparaissent comme des constituants mineurs par rapport aux substances A et B. Les extraits lipidiques bruts, obtenus dans les m~mes conditions que ceux de M. ulcerans, i~ partir de M. kansasii et du BCG, ont ~t~ examines c o m p a r a t i v e m e n t par chromatographic sur touche mince. Cet examen fait apparaitre une teneur en phospholipides, par r a p p o r t aux autres lipides mis en ~vidence, n e t t e m e n t plus faible dans le cas de M. ulcerans que dans le eas des tdmoins. Les mycosides apparaissent sans ambigu~t~ dans les extraits de M. kansasii et de BCG, et sont r~v~l~s par l'anthrone plus intens~ment que le (c cord factor )). L ' e x t r a c t i o n par le pentane d'une culture de M. ulcerans d~barrassfie de son milieu de culture, p e r m e t d'isoler la m a j e u r e partie des substances A, B, C et D ainsi que du ¢¢cord factor )). Une extraction par le chloroforme-~m~thanol, subs~quente fi l'extraction par le pentane, ne contient plus que des traces de ces substances, ~ eSt~ de phospholipides et de glycfirides. Apr~s ensemencement des bact~ries lav~es au pentane, sur milieu de LSwenstein-Jensen ou sur bouillon trypticase glyc~rol~, la croissanee apparait et se d~veloppe apr~s deux h trois semaines. Afin de faciliter l'isolement des substances repfir~es par chromatographic analytique, l'extrait lipidique b r u t a ~t~ soumis ~ un partage entre le dichlorom6thane et l'eau. La fraction soluble dans le dichloromSthane r@r~sente 60 ~o de l'extrait lipidique brut, qui est ainsi d~barrass~ d'une fraction hydrosoluble (30%) et d'une fraction insoluble ~ la fois

LIPIDES DE MYCOBACTERIUM ULCERANS

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dans l'eau et le dichloromdthane. Nous n'avons pas, actuellement, 6tudi~ ces derni~res fractions. Les quatre substances rep6r6es par chromatographie analytique, concentr6es dans la solution de dichlorom6thane, ont ~t~ isol~es et purifi~es. Leurs caract~ristiques chromatographiques et leurs pouvoirs rotatoires figurent dans le tableau I. Leurs caract6ristiques spectroscopiques figurent dans les t a b l e a u x II et III. TABLEAU I. - - Caraet~ristiques chromatographiques et pouvoirs rotatoires des substances A, B, C et D.

Hf

(a) (b)

(c) [a]~ (d) (e)

A

B

C

0,61 0,88

0,11 0,22

0,06 0,17

+6,8 ° (c=2) +13,3 ° (c=2)

+6,50 ( c = 2 ) +10,7 ° (c=2)

+4,10 ( c = 1 ) +16,7 ° (c=l)

D

0,51 +3,8 ° (c=1,8)

Les Rf indiquds c o r r e s p o n d e n t au ddveloppement du c h r o m a t o g r a m m e p a r lc mdlange dther de p d t r o l e + d t h e r (9/1, v / v ) p o u r les substances A, B et C, avcc unc seule 6lution en (a), et t r o i s dlutions successives en (b). P o u r la substance D, le Rf est indiqud en (c) apr6s une seule ~lution par le mdlange c h l o r o f o r m e + m d t h a n o l (95/5, v/v). Lcs p o u v o i r s rotatoires o n t 6td mesurds h l'aide de l'appareil (( Perkin E l m e r 141 ,, dans une c u r e de 10 cm de longueur. Les mesures concernent des solutions chloroformiques eu (d), et des solutions clans l'dther en (e).

TABLEAU II. - - Spectres ultraviolets des substances A, B et C.

A) k max. B) k max. ¢ C) k max. ¢

222 5.800 222 6.000

Milieu n e u t r c

Milieu alcalin

280 100 278 1.400 278 1.500

280 100 284 1.200 284 1.300

231 10.600 231 13.800

291 4.600 291 5.300

Les spectres ultraviolcts ont (it6 enregistrds h l'aide d ' u n appareil (( Perkin E l m e r ,,, module l a m b d a 5, une prcmi~re Iois en solution cyclohexanique, et une seconde lois apr~s alcalinisation [8] de cette solution p a r une trace de b u t y l - l i t h i u m en solution hexanique. Les m a x i m u m s d ' a b s o r p tion s o n t exprimds en n a n o m b t r e s (nm). ¢ ~ extinction mol~culaire.

D~gradations contrdldes des substances A, B el C el analyse de leurs constituanls primaires. L'ensemble des r6actions effectu6es et leurs r6sultats sont sch~matis~s sur la figure 1 (les formules sont donn6es dans le tableau IV).

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M. DAFF~ ET COLL. TABLEAU III. - - Spectres infrarouges des substances A, B et C.

Bandes communes a u x trois s u b s t a n c e s

P o s i t i o n des b a n d e s d'absorption (fr6quences en c m -~)

S t r u c t u r e s mises en 6vidence

1735, 1170-1130 725

F o n c t i o n ester Enchainement polym6thyl6nique

Bandes communes a u x seules s u b s t a n c e s A e t B

1715

Fonction c6tone

Bandes communes a u x seules s u b s t a n c e s B e t C

3500 1615, 1595, 1515 825

Hydroxyle Cycle a r o m a t i q u e P h 6 n o l s u b s t i t u 6 en p o s i t i o n para

Les s p e c t r e s i n f r a r o u g e s o n t 6t6 enregistr6s h l ' a i d e d ' u n a p p a r e i l (

I q- I I Saponification

t

Substance :

4

Scission r 6 d u e t i v e

I+

\7 I A

A

FIG. 1.

-

-

C

A ¥+

I + IV

\S t

B

V+VI I

III

\S I

I IV

V + IV

l~6duction

+V

Schdma des trans[ormations appliqudes aux substances A, B e t

C.

Les forlnules c o r r e s p o n d a n t a u x s u b s t a n c e s I ~ ¥ I s o n t reprdsentdes sur le t a b l e a u IV.

Le m61ange d'acides gras I lib6r4 par saponification de chacune de ces substances repr6sente 60 h 62% de la substance mise en jeu, d'apr6s la pes4e des produits de la r6action s6par6s par chromatographie. Le m~lange d'esters m6thyliques pr4par6s h partir de ce m61ange d'acides gras a 6t6 soumis A l'analyse par spectrom6trie de masse. Les principaux pics observes et leur interpr6tation sont sch6matis~s par la formule I. I1 ressort de cette analyse que le m61ange est constitu6 de trois esters d'acides gras homologues, respectivement en C~, C=7 et C29, portant des ramifications m6thyle en 2, 4 et 6. Le pouvoir rotatoire de ces esters, [~]~==~7,8 ° (chloroforme, c = 2 ) est de m~me valeur absolue que celui des mycoc~rosates, mais de signe contraire. Puisqu'on sait que les mycoc6rosates isol6s de M. tuberculosis sont des m61anges d'homologues constitu~s essentiellement de trim6thyl-2D,4D,6D-hexacosanoate et de t6tram4thyl2D,4D,6D,8D-octacosanoate [4], les esters isol6s de M . ulcerans doivent ~tre consid4r6s comme des esters polym6thyl ramifi6s de s6rie L. Les m61anges d'esters I, produits par saponification des substances A et B suivie de m6thylation des acides, fournissent par r6duction par l'hydrure double de lithium et d'aluminium un m61ange d'alcools V, [~]~==--3 ° (chloroforme, c=0,2) identique au produit de r6duction directe des subs-

TABLEAU I V . ~

S t r u c t u r e s des p r i n c i p a u x p r o d u i t s ~tudi~s. r

.

.

.

.

.

.

i"

iI

.

~

. . . .

CH3--(CH2)n--~,~H--~--CH2-~- CH --7-CH.----r-CH --C02----- CH 3 .

I

CH 3

CH 3

2

I

CH 3

n = 15, 17, i9 I : Esters mgthyliques des acides phtioc~raniques

197

153

%-<%) '4-?. - - % ~ c~--(%)4,+ OH

c~-4co-- %-- %

L

'; I

OH

i

CH3

369-~i m = 14 ou 16

341 j"

~,F351 (-H20----------~ [323

II : Phtiodiolone

H0

197

153


t

CHz-~I(CH2)p- ~

H ~-- CH2-r-- H --(CHo)4- ~- CH ~

OH : 374]~ _._J 346J ~-H)

107*-J

OH

CO --CH2--CH 3

CH 3

p = 15, 17, 19 III: Phenol-phtlodlolone

HO ~ - - ~

CH2--- (CH2) ~'- ~H --

C H 2 - - CH - - (CH2)4----- ~H - -

I

OH

OH

CO - -

CH2-- CH 3

CH 3

p = 15, 17, 19 IV : Phenol-phtiotriol

CH~-- (CH~3 - - C H - - CHo---CH --CH~--- CH-- CH~-- OH CH 3

CH 3

CH 3

n = 15, 17, 19 V : Phtioc~rano]

CHx-J (CH 2 ~----CH--CH~--CHm [ " z ] (CH 2) $-- ~I~- - ~ H -- CH2-- CH3 OH

OH

CH 3

OH

m = 14, 16 VI : Phtiotriol

OH

OH

CH 3 0 C H 3

q = 20, 22 VII : Phtioc6rol

Les valeurs soulign~es indiquent l'homologue preponderant. Les ruptures en spectrom6trie de masse, et la masse des ions observes, sont indiqu~s par les formules I ~ III, ~ titre d'exemples. Ann. Microbiol. (Inst. Pasteur), 135 A, n ° 2, 1 9 8 4 .

l~

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M. DAFF]~ ET COLL.

tances A, B ou C, et dont le pouvoir rotatoire est tr6s proche de l'inverse de celui du mycoc~ranol [4]. Cela montre que les conditions ~nergiques de la saponification n'ont pas provoqu~ d'~pim6risation du centre asym~trique voisin du carboxyle. Apr~s d~termination de leurs proportions et v~rification de l'absence de diast~r6oisom~res par chromatographic en phase vapeur, le m~lange d'esters apparait comme constitu6 de trimdthyl-2L,4L,6L-t6tracosanoate (85%) accompagnd de ses homologues inf~rieur (12 %) et sup~rieur (3 %). La comparaison des actions respectives de la potasse et de l'hydrure de lithium et d'aluminium sur les substances A, B e t C - - sch~matis6e par la figure 1 - - montre que A et B contiennent une fonction r~ductible en dehors de la fonction ester, tandis que C n'en contient pas. Les propri~t~s spectroscopiques (tableaux II et III) des trois substances sont compatibles avec la presence dans A et B d'une fonction c~tone qui n'apparait pas dans C. D'apr~s le spectre de r6sonance magn~tique nucl6aire, cette fonction c~tone est voisine d'une part d'un carbone tertiaire porteur d'une ramification m~thyle, et d'autre part d'un m~thyl5ne portant lui-m~me un m6thyle terminal. Le fait que B e t C conduisent aux m~mes produits par r~duction montre que cette fonction c6tone prSsente dans B e s t ainsi ~ransform~e en fonction alcool secondaire, pr~sente darts C. L'ensemble des propri~t~s spectroscopiques de ]3 et C montre la presence d'un groupement phenol libre, et d'une substitution sur le noyau aromatique, en para par rapport ~ l'hydroxyle ph~nolique. L'ensemble des r~sultats ci-dessus sugg~re une analogie entre les trois substances isol6es de M. ulcerans et les compos6s de la famille du phtioc~rol VII (tableau IV) et du ph~nol-pbtioc~rol d~j& isol~s de plusieurs esp~ces de mycobact~ries. La spectrom6trie de masse des produits neutres de saponification des substances A, B e t C confirme cette hypoth~se, et conduit & leur attribuer les formules II, III et IV (tableau IV). Les principaux pics observes et leur interpretation sont mentionn6s sur les formules. Aucun homologue portant la fonction oxyg6n6e sur le carbone voisin du m~thyle terminal n'a ~t~ d~cel~, contrairement h ce qui est observ~ dans le cas des d~riv6s du phtioc~rol isol~s de M. tuberculosis et de M. boris [12]. Le c~to-diol II, [~]~2 _ 2 ° (chloroforme, c = 1 ) pr~sente un pouvoir rotatoire voisin de celui de la phtiodiolonc obtcnue & partir des produits de saponification du m~lange d'esters de phtioc6rol et de ses compagnons isol~s de M. boris [13, 19]. Nous noterons que, dans les deux cas, le centre asym~trique voisin de la fonction c~tone a ~t~ 6pim~ris~ en milieu alcalin. La ph6nol-phtiodiolone III, qui pr6sente les m~mes centres asym6triques que la phtiodiolone, montre un pouvoir rotatoire tr6s voisin, donc une configuration identique. Le ph6nol-phtiotriol IV a ~t6 obtenu en trop faible quantit6 pour une mesure significative de pouvoir rotatoire. Structure des substances A, B el C.

En conclusion, ces trois substances sont les diphtioc6ranates de phtiodiolone, de ph6nol-phtiodiolone et de ph6nol-phtiotrio], respeetivement.

LIPIDES DE MYCOBACTERIUM ULCERANS

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Dans tousles cas, le principal homologue de l'acide phtioc6ranique engag6 dans ces structures est l'aeide trim6thyl-2L,4L,6L-t6tracosanoique. Structure de la substance D. La substance D lib6re par saponification. (1) une fraction soluble dans l'6ther apr6s acidification, et (2) une fraction hydrosoluble, isol6e apr6s ~limination des sels min6raux par passage sur r6sine MB3, et lyophilisation de la solution. La fraction lipidique est constitu6e par un m61ange d'acides mycoliques identique au m61ange obtenu directement apr6s saponification des bact6ries enti6res [5]. La fraction hydrosoluble a 6t6 identifi6e au glyc6rol et dos~e par chromatographie en phase vapeur apr6s trim6thylsilylation [18]. Le glyc6rol repr6sente environ 6% de la substance D. Celle-ci est donc le monomycolate de glyc6rol, dont la pr6sence dans diverses mycobact6ries a d6jh 6t6 signal6e [2]. DISCUSSION I1 ressort de cette 6rude que M. ulcerans accumule des constituants lipidiques ayant une eertaine parent6 strueturale avec les diacyl-phtioc6rol et diacyl-ph~nol-phtiocfirol synth6tis6s par M. leprae [10], ainsi que par quelques autres mycobaet6ries [1]. Toutefois, les eonstituants isol6s de M. ulcerans pr6sentent quelques partieularit~s. Tout d'abord, l'abondanee de la phtiodiolone et de la ph6nol-phtiodiolone, en l'absence de phtioc6rol, est ~ souligner puisque la phtiodiolone avait 6t6 consid~r6e jusqu'ici comme un ~ compagnon )~ quantitativement mineur du phtioc4rol [6]. Plus surprenante est l'cst6rification de la fonction diol par des acides phtioc~raniques, alors que dans M. tuberculosis et M. boris qui syntMtisent pourtant de tels acides, int6gr6s aux sulfatides [1], le phtioc6rol et le ph6nol-phtioc6rol sont diest6rifi6s par des acides mycoc6rosiques 6nantiom6res des acides phtioc~raniques [3]. Mais il faut remarquer que la st6r6ochimie des acides gras polym6thyl-ramifi6s impliqu4s dans les d6riv6s du phtioc6rol et du ph6nol-phtioc6rol ne semble avoir ~t6 v6rifi6e que dans le cas des substances isol4es de M. tuberculosis et de M. boris, la d6signation acide mycoc6rosique 6tant admise par analogie dans le cas de M. kansasii [8] et de M. leprae [10]. Nous avons v~rifiG dans le cas du diacyl phtioc6rol et du glycolipide d~riv6 du ph6nol-phtioc6rol de M. leprae, que les acides gras polym6thyl-ramifi4s appartiennent ~ la s6rie mycoc6rosique, comme dans le cas de M. tuberculosis et de M. boris (M. Daf%, M. A. Lan6elle, C. Asselineau et H. David, r~sultats in6dits). Deux des subtances lipidiques isol~es de M. uleerans pr6sentent la particularit6 d'une fonction ph6nol libre, alors que dans tousles cas connus jusqu'a pr6sent, concernant le ph6nol-phtiocerol, la fonction ph6nol est engag6e soit darts une liaison osidique comme dans les mycosides de M. boris [1], de M. kansasii [1] ou de M. laprae [10], soit dans un groupement m6thoxyle comme dans le c~lipide indicateur d'att6nuation ~ des souches

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M. DAFFE ET COLL.

de virulence att6nu6e de M. tuberculosis [1]. Les lipides de M. ulcerans se pr6sentent done, par rapport ~ ces autres structures connues, eomme des myeosides ineomplets. Un blocage de la synth6se des myeosides, r6sultant d'exigenees st6r6oehimiques non satisfaites, pourrait expliquer les structures observ6es. Mais on ne peut rejeter l'hypoth~se de l'existenee transitoire d'un mycoside qui, apr~s avoir subi une d6gradation partielle li6e h l'autolyse des bact6ries, conduirait /~ un aglycone difficilement m6tabolisable. L'autolyse pourrait expliquer l'abondance relative de diacyl-phtiodiolone et de diacyl-ph6nol-phtiodiolone, largement pr6pond6rants parmi les lipides, alors que des constituants essentiels des baet6ries, tels les phospholipides, sont en proportion inhabituellement faible. Cependant, ees rapports quantitatifs ne varient pas de m a n i ~ r e signifieative avee l'fige des cultures, et aucun myeoside n'a pu 6tre mis en 6vidence dans des cultures de trois mois de M. ulcerans, alors que le myeoside de BCG subsiste darts des cultures de re@me fige. S'il ne s'agit pas d'autolyse, le fait que la quasi totalit6 de ces d6riv6s de la phtiodiolone puisse 6tre extraite, en m6me temps que le ~ cord factor )), par un simple lavage au pentane, sans entrainer la mort des baet~ries, d6signerait ees substances comme des produits d'excr6tion. La pathog6nicit6 de M. ulcerans a 6t6 reli6e /t la production d'une exotoxine de nature phospholipoglycoprot~inique [9], et il a ~t6 montr6 que le lavage de cette substance par l'6ther de p6trole d6truit son pouvoir cytotoxique. Cela pourrait refl6ter une association non covalente entre lipide et prot6ine, et il conviendrait d'examiner le r61e que pourraient y jouer les lipides particuliers pr6sents /~ la superficie de M. uIcerans.

RESUM£ Les lipides superficiels de Mgcobaclerium ulcerans ont 6t6 isol6s par chromatographic. Les structures des plus abondants de ces lipides ont 6t6 6tablies. I1 s'agit de diphtioc6ranate de phtiodiolone et de diphtioc6ranate de ph6nol-phtiodiolone, particuli6rement abondants, accompagn6s de diphtioe6ranate de phfinol-phtiotriol. Ces structures sont apparent6es celles des dimycoe6rosates de phtiocerol synth6tis6s par M. tuberculosis et M. boris, et $ eelle du dimycoc6rosate de ph6nol-phtioc6rol qui est l'aglycone du mycoside B isol6 de M. boris. Mais la sp6eifieit6 configurationnelle des groupements acyle, selon l'origine des lipides, est ~ souligner, ainsi que la fonetion ph6nol libre, inhabituelle. lVloTS-CLI~S : Mgcobacterium ulcerans, Lipide, Diphtio@ranate de phtiodiolone, Diphtioc6ranate de ph6nol-phtiodiolone. REMERCIEMENTS

Ce travail a bdn6fici6 d'une subvention de la Fondation pour la Recherche mddicale, que nous remercions.

LIPIDES DE M Y C O B A C T E R I U M

ULCERANS

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