Mesure de l'agglutination immunologique des globules rouges par interférométrie ultrasonore

T C B 1994

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M moire original Mesure de l'agglutination immunologique des globules rouges par interfdromdtrie ultrasonore H. COULIBALY*, M. RAZAVIAN**, P. RAMEAU*, R. GUILLET***, C. DESAINT****, M. BOYNARD***, Y. BEUZARD* * INSERM U91, HOpital Henri Mondor, Crdteil France ** INSERM U28, H6pital Broussais, Paris *** Laboratoire de Biophysique Appliqude, UFR Biomddicale des Saints P~res, Universitd Paris V **** Centre Dfpartemental de Transfusion Sanguine, HOpital Henri Mondor, Cr~teil

Rdsumd L'interf6rom6trie ultrasonore est une nouvelle m6thodologie que nous avons raise au point pour mesurer rapidement et avec pr6cision la taille des particules, s6dimentant dans un liquide, sur une surface horizontale sous l'influence de la pesanteur. Appliqu6e aux globules rouges, cette m6thode permet d'6tudier la s6dimentation des globules rouges, leur agr6gation par des prot6ines ou des agents agr6gants ainsi que leur agglutination par des r6actions immunologiques directes ou indirectes. La mesure quantitative de l'agglutination des globules rouges a 6t6 appliqu6e a l'6tude des groupes sanguins e t a la recherche d'anticorps irr6guliers. Les r6sultats pr61iminaires montrent que l'interf6rom6trie ultrasonore est 1) quantitative permettant de mesurer la taille des agglutinats, 2) sensible, 3) sp6cifique, 4) tr6s rapide, 5) capable de d6tecter les anticorps irr6guliers.

M o t s clds : Groupes sanguins, ultrasons, agglutination, globules rouges, s6di-

mentation

Summary Agglutination of erythrocytes evaluated by ultrasonic interferometry Ultrasound interferometry is a new methodology which has been developped in our laboratories in order to measure precisely and quickly the size of particles sedimenting in liquid on horizontal surface, upon gravity. Applied to red blood cells, this method evaluates the sedimentation of erythrocytes, their aggregation induced by proteins or aggregating compounds as well as their agglutination upon immune reactions. The quantitative assessment of red cell agglutination was applied to the study of blood groups and to the search for red cell antibodies. Preliminary results show that ultrasound interferometry is 1) quantitative, measuring the size of agglutinates; 2) sensitive; 3) specific; 4) fast; 5) able to detect irregular antibodies.

Correspondance : Pr. YvesBeuzard, INSERMU91,H6pital Henri Mondor, 94010Cr6teil France.

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est normal, l'amplitude finale permet d'6valuer la concentration de l'h6moglobine intraglobulaire moyenne et de d6finir la densit6 cellulaire moyenne (Figure 2). Les propri6t6s physiques des globules rouges i~'ol6s, leur agr6gation par les prot6ines du plasma (la vitesse de s6dimentation du sang par exemple) ou par des mol6cules agr6gantes comme le Dextran 70 et l'agglutination immunologique peuvent 6tre analys6es par interf6rom6trie ultrasonore [1-7].

Introduction L'interf6rom6trie ultrasonore mesure l'amplitude d'une onde ultrasonore r6fl6chie par l'interface fixe s6parant un plan solide d'une suspension de particules ou de globules rouges [1, 2] (Figure 1). Lorsque ces particules s6dimentent, une seconde interface apparalt entre le s6diment et la suspension. Quand les deux interfaces (plan solide/s6diment et s6diment/suspension) sont proches l'une de l'autre, les ondes r6fl6chies entrent en interf6rence modifiant l'amplitude de l'onde r6sultante, en fonction de l'6paisseur du s6diment et de la longueur d'onde. La vitesse de s6dimentation de particules peut ainsi ~tre mesur6e. Elle est fonction des propri6t6s g6om6triques des particules en particulier du carr6 de leur rayon, pour des particules sph6riques, de leur densit6 et du milieu (densit6, viscosit6). Ainsi cette m6thode permet de mesurer la cin6tique de formation du s6diment (Figure 2) et d'6tudier les propri6t6s physiques des particules. Lorsque le s6diment est important l'onde r6fl6chie par l'interface plan solide/s6diment permet de d6terminer les propri6t6s du s6diment h cette interface, en particulier la concentration volumique de l'h6moglobine qui d6pend du compactage cellulaire. Si le compactage n

n

to

Mat6riel et m 6 t h o d e

Interfdromdtrie ultrasonore Le principe physique de la m6thode d'interf6rence des ultrasons et l'appareil (Echo-Cell) ont 6t6 d6crits en d6tail ant6rieurement [1, 2]. On peut simplement rappeler que la sonde 6mettrice/r6ceptrice de 8 mega Hertz est situ6e a l'extr6mit6 inf6rieure d'un cylindre creux d'altuglass, divis6 en deux compartiments par une plaquette horizontale d'altuglass. La cavit6 sup6rieure re~oit la suspension de particules (Figure 1). Les ondes r6fl6chies par les diverses interfaces sont indiqu6es. L'amplitude de l'6cho r6fl6chi E1 par l'interface I1 entre la plaquette et le s6diment

t3

t2

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Suspension

12(E2)

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12{E2)

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Figure 1

B Amplitude(my)

_

Amplitudo(mv)

t de propagation(us)

Amp itude(mv)

t de propagation(us)

= L1

Amp itude(mv) E

t de propagation(p.s)

t de propagation(l~s)

Principe de fonctionnementde l'Echo Cell. A. La sonde 6mettrice r6ceptrice est plac6e sous le compartiment recevant la suspension de particules. Au temps toil n'y a pas de s6diment.L'6choE1est r6fl6chi par l'interface plaquette/suspension. Un s6dimentcr6e une deuxi6me interface ½, mobile, r6fl6chissant l'6cho E 2 a u x temps : tVt2, t 3. B. L'amplitudemaximumde l'6cho E1 varie en fonctiondu temps to, tl, t2, t 3.

MESURE DE L'AGGLUTINATION IMMUNOLOGIQUE

Amplitude

du si hal (my) I AO

Pi

8,g AM

8,8

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_ Af

8,6 I

I

i -,~.-- A t . ~

l

I

tm 118

I

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218

3;

t (ran)

Figure 2 Courbe de l'amplitude du signal en fonctiondu temps et param6tres caract6ristiques dans le cas d'une suspension de parti¢ules sph~riques de latex. AQ: amplitude initiate, PI : pente initiale, Af : Amplitudefinale, tmtemps du 1~ minimum, tMtemps du 1~rmaximum. est influenc6e par l'6cho r6fl6chi E2 par l'interface 12 (s6diment/suspension) lorsque les deux interfaces sont proches [3, 4]. La figure 2 repr6sente l'6volution temporelle de l'amplitude de l'6cho E1 obtenue avec des particules sph6riques de 7,0 gm + 0,5 gm de diam6tre et de densit6 de 1,312 de styr6ne divinyl benz6ne, s6dimentant dans un tampon phosphate (PBS). L'amplitude A 0 du signal, maximum au temps z6ro, caract6rise la suspension. L'amplitude d6crolt jusqu'~ un premier minimum A m (A minimum) pour t = t m (temps du i er minimum) puis augmente jusqu'a une valeur A M ( a maximum) au temps t M. L'amplitude oscille de mani6re amortie jusqu'a l'amplitude finale Af du plateau. Les deux temps t m e t t M sont respectivement ceux de la formation d'un s6diment d'6paisseur ~/4 et )~/2 (respectivement 50 et 100 g dans le cas d6crit ici) oh )~ est la longueur d'onde de l'onde ultrasonore. Ces temps d6pendent de la vitesse de s6dimentation des particules et donc de leur taille qui peut ~tre stable ou varier dans le temps [5]. Un autre param6tre exp6rimental important est la pente initiale du signal PI. Elle est 6galement fonction (en premi6re approximation) de la vitesse de s6dimentation des particules et donc de leur taille. Ce param6tre PI est mesur6 en quelques secondes alors que les temps tm e t t M n6cessitent de nombreuses minutes en cas de particules isol6es.

Les suspensions de globules rouges Les 6chantillons de sang ont 6t6 fournis par le Centre D6partemental de Transfusion Sanguine du Val de

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Marne (CDTS). Les s6rums pour la recherche d'anticorps irr6guliers ont 6t6 donn6s par le Dr Selami du Centre de Transfusion de l'H6pital Saint-Antoine et le Dr Bonin du CDTS. Le Dr Le Pennec a g6n6reusement fourni les globules rouges de r6f6rence du Centre National de R6f6rence pour les Groupes Sanguins (CNRGS). La m6thode de r6f6rence de Beth Vincent est celle classiquement utilis6e au CDTS du Val de Marne. Elle fut utilis6e en parall61e et en double insu avec la m6thode ultrasonore en utilisant les m6mes anticorps monoclonaux (SNTS 1989, recueil de techniques). B e t h V i n c e n t : La m6thode ultrasonore a 6t6 appliqu6e aux globules rouges ajust6s fi un h6matocrite final de 3 % dans un tampon PBS isoosmolaire de pH 7,4. 300 gl du m61ange de cette suspension et d'un anticorps monoclonal (anti A, anti B, ou anti A + B (transclone Diagnostic Transfusion CNTS) dilu6s h 25 %) sont incub6s 15 minutes ~ 25 °C ou ~ 4 °C. Apr6s incubation, le m61ange est remis en suspension. La lecture est effectu6e ~ 25 °C ou ~ 4 °C. S i m o n i n : Le

s6rum ou le plasma du sujet est mis en contact avec les globules rouges de groupes ABO connus, suspendus h 2 % dans le tampon LISS (Low Ionic Strength Solution). Les globules rouges peuvent ~tre trait6s avec une enzyme (papaine) ou non trait6s. Le m61ange est incub6 a temp6rature du laboratoire sous agitation pendant 15 minutes puis centrifug6 pendant 3 minutes a 3 000 x g. Le culot globulaire est resuspendu dans 300 gl de tampon LISS pour 6viter l'agr6gation non sp6cifique, la viscosit6 et l'augmentation de la densitG dues au plasma ou au s6rum.

R4sultats Dans les conditions exp6rimentales de notre 6tude, la pente initiale du signal ultrasonore est proportionhelle au carr6 du rayon de la particule de latex (Figure 3). Cette observation est conforme au mod61e de Stokes concernant la vitesse de s6dimentation de particules sph6riques. Pour les 6rythrocytes agglutin6s, il existe 6galement une relation lin6aire entre Ia pente initiale du signal ultrasonore et la concentration d'un m61ange d'IgG et d'IgM antigroupe sanguin A (Figure 4). La d6termination de la taille des agglutinats peut ainsi ~tre faite et rapport6e au rayon de la particule ou au nombre moyen des globules rouges pr6sents dans la particule, de mani6re analogue au calcul de la taille des agr6gats induits par le Dextran 70, effectu6 ant6rieurement [2].

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H. COULIBALY ET AL.

7000

6000"

3324

k') 5000"

== w

4000"

m

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0. 1000 "

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0 20

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i

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RnU-R (%)

120

2

Figure 4

Relation entre la pente initiale du signal et la concentration de l'anticorps monoclonal anti A, lors de l'agglutination des globules rouges d'un sujet A.

Figure 3 Relation entre la p e n t e initiale et le carr6 d u r a y o n d e s particules de latex.

11 antig6nes diff6rents. La concordance des r6sultats obtenus par la m 6 t h o d e ultrasonore et celles utilis6es par les centres de transfusion est parfaite. A u c u n auto anticorps n o n sp6cifique n'a 6t6 mis en 6vidence en milieu polybr6ne.

La figure 5 illustre la caract6risation d u p h 6 n o t y p e d u g r o u p e sanguin de sujets A <~faible >>. Le sujet 3 est en fait u n sujet O. Les globules rouges des sujets 6 et 9 restent n o n agglutinables quelle que soit la m6thode globulaire utilis6e incluant le gel test Diamed. Le test de Simonin montre qu'ils sont bien d u g r o u p e A. L'6tude des antig6nes A 1 et H chez les sujets de g r o u p e A p e r m e t t a n t de caract6riser ais6ment les sujets A 1 et A 2 est illustr6e par la figure 6. La figure 7 m o n t r e les r6sultats obtenus lors de l'6tude de 60 pr616vements contenant u n anticorps irr6gulier contre

Discussion L'6volution des techniques d'agglutination utilis6es par les centres de transfusion a trois buts principaux : a u g m e n t e r la sensibilit6 et la sp6cificit6 des techniques, diminuer le volume, le temps des r6actions et

6000 t []

'~

Anti-A

sooo

'ooot1111 °"o00t|111

.. '0o0t|iiI Figure 5 Valeur de la p e n t e initiale d u signal de t'Echo Cell des globules r o u g e s de sujets de g r o u p e A faible s e l o n les m 6 t h o d e s classiques.

,oooltlL n .

~ 1

2

;"21 3

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. 7

Echantillons de Groupe R faible

8

9

MESURE DE L'AGGLUTINATION IMMUNOLOGIQUE

6000 1

m

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Anti-A1 (4%)

[]

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em_ 4 0 0 0 ' ID a u l

139

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Figure 6 Caract6risation de sujets de groupe A 1 e t A 2 par la m6thode de Beth Vincent. Valeur de la pente initiale du signal de l'Echo Cell.

0

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.

1

.

2

.

.

3

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5

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12

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i_i 17

18

19

,I 20

Groupe A

type papaine, diminuant ainsi les fausses r6actions positives. L'incubation et la lecture a 37 °C pour les anticorps irr6guliers 6vite la fixation d'anticorps ~> souvent sans int6r~t transfusionnel. A l'oppos6, la caract6risation a 4 °C des groupes faibles dans le cadre du Beth Vincent permet d'accroitre la sensibilit6 de l'agglutination par les IgM sp6cifiques.

de la mesure, augmenter le rendement du personnel et r6duire les co6ts financiers. L'utilisation du tampon LISS, ayant une faible force ionique am61iore la liaison des immunoglobulines sur les globules rouges et r6duit les ph6nom6nes d'agr6gation non sp6cifiques. La m6thode ultrasonore permet de r6duire les temps d'incubation et la concentration d'enzyme de

I

5ooo115

15

4000

W 3000 m s

| i

'--

2000

co.I 1ooo Figure 7 Recherche d'anticorps irr6guliers par mesure de la pente initiale de l'Echo Cell, Les c~iffres repr6sentent le n o m b r e - d e fois o6 l'anticorps a 6t6 d6tect6.

0

Antl-D Anti-Kell Anti-E Anti-C Anti-Jka Anti-M Anti-c AnU-PI Anti-Le a

Anti-Fya Anti-Le b

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: Coombs

indirect

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Sur l'ensemble des tests effectu6s, il n'a pas 6t6 observ6 de faux n6gatif ni de faux positif. Contrairement aux autres m6thodes souvent qualitatives, la m6thode ultrasonore donne des valeurs quantitatives reproductibles d6terminant la taille des agglutinats. La m6thode ultrasonore utilisant t o u s l e s param6tres (pente initiate, temps du minimum, temps du maximum et valeurs des temps interm6diaires) permet d'6tudier la cin6tique d'agglutination et de mettre en 6vidence des sous-populations de globules rouges agglutin6s ou au-dessous du seuil d'agglutination. La mesure de la pente initiale est particuli6rement sensible pour mettre en 6vidence une petite population de globules rouges agglutinables. Une modification des concentrations respectives des glo.bules rouges et des anticorps devrait permettre d'optimiser la mise en 6vidence de sous-populations agglutinables et de mieux quantifier leur proportion. Lors du d6pistage des anticorps irr6guliers par la m6thode ultrasonore, les pentes initiales sont tr6s diff6rentes selon la sp6cificit6 des antig6nes, soit tr6s dispers6es, c'est le cas des anti-D, soit au contraire tr6s homog6nes. Ces diff6rences peuvent 6tre li6es d'une part aux diff6rences de concentration des anticorps pr6sents dans le s6rum des patients mais 6galement ~ la diversit6 ou, ~ l'opposG ~ l'homog6n6it6 des sites de liaison de ces anticorps. L'6nergie d'interaction entre antig6ne et anticorps pourrait ~tre mesur6e par la m6thode ultrasonore apr6s criblage des anticorps reconnaissant le m~me 6pitope mol6culaire. Ainsi la m6thode ultrasonore pourrait permettre de mieux caract6riser la r6action antig6neanticorps. En conclusion, cette 6tude pr61iminaire montre que la m6thode d'interf6rence ultrasonore est - t r 6 s rapide, grfice a la mesure en quelques secondes de la pente initiale, - aussi sensible que les m6thodes les plus sensibles pour mesurer l'agglutination immunologique des globules rouges, directement ou indirectement, - aussi sp6cifique que les m6thodes les plus sp6cifiques,

quantitative, permettant de d6terminer la taille des agglutinats. L'6nergie d'interaction pourrait 6tre d6duite si les sites sont quantifi6s ou inversement le nombre de sites pourrait 6tre connu si l'6nergie d'interacti6n antig6ne-anticorps d'un lot d'anticorps est connu, capable de d6tecter une petite population agglutinable en pr6sence d'une importante population de globules rouges non agglutinables. Les 6tudes en cours ont pour objet de d6velopper des automates de petite, moyenne ou grande capacit6 et de d6terminer la place potentielte de ce type de m6thode de lecture des r6actions immunologiques cellulaires dans la pratique des centres de transfusion et des r6actions immunologiques particulaires en g6n6ral. Enfin, d'autres applications m6dicales ou biologiques et, d'une mani6re g6n6rale, l'6tude des interactions de faible 6nergie entre prot6ines et cellules ou entre cellules de m~me type ou de types diff6rents sont en cours d'6tude [4, 6, 7].

R 6 f 4 r e n c e s

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