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Métabolisme oxydatif dans les macrophages infectés par le VIH : rôle du glutathion et approche pharmacologique
Pathol Biol 2001 ; 49 : 567-71 2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés S0369-8114(01)00214-0/FLA
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Métabolisme oxydatif dans les macrophages infectés par le VIH : rôle du glutathion et approche pharmacologique P. Mialocq 1 , J. Oiry 3 , J.Y. Puy 3 , A.C. Rimaniol 1 , J.L. Imbach 3 , D. Dormont 1 , P. Clayette 1,2∗ 1 CEA, service de neurovirologie, DSV/DRM, CRSSA, EPHE, IPSC, 60-68, avenue de la Division Leclerc, BP 6, 92265 Fontenay-aux-Roses cedex, France ; 2 SPI-BIO, ZI de la Bonde, 2, rue du Buisson aux Fraises, 91741 Massy cedex, France ; 3 laboratoire de chimie organique biomoléculaire de synthèse, CNRS UMR 5625,
université Montpellier II, sciences et techniques du Languedoc, place Eugène-Bataillon, 34095 Montpellier cedex 5, France (Reçu le 10 mai 2001 ; accepté le 15 mai 2001)
Résumé Le stress oxydatif et le déficit en glutathion semblent jouer un rôle majeur dans la physiopathologie de l’infection par le VIH, et en particulier dans les atteintes du système nerveux central. Cependant, les effets bénéfiques des molécules proglutathion sont limités in vivo par leur faible biodisponibilité et les fortes concentrations nécessaires à l’obtention de l’activité biologique. Au cours de cette étude, nous nous sommes intéressés à évaluer les activités, antirétrovirale et antioxydante, de nouveaux composés proglutathion plus lipophiles, dans des macrophages infectés in vitro par le VIH-1. En effet, cette lignée cellulaire est impliquée à double titre dans ces processus physiopathologiques puisqu’elle est une des deux cibles cellulaires majeures du VIH et qu’elle est fortement impliquée dans la production et la détoxification des radicaux libres. Dans ces conditions expérimentales, une prodrogue de la N-acétylcystéine et de la ß-mercaptoéthylamine, la molécule I-152, a présenté une activité antirétrovirale significative, une capacité à augmenter le taux intracellulaire de GSH et à diminuer la synthèse de TNF-α. Cette molécule pourrait donc présenter un intérêt potentiel en tant que thérapeutique adjuvante des antirétroviraux actuels chez les patients infectés par le VIH, et plus particulièrement chez ceux présentant des désordres neurologiques ou des atteintes mitochondriales liées aux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse. 2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS glutathion / macrophage / stress oxydatif / VIH
Summary – Oxidative metabolism in HIV-infected macrophages: role of glutathione and pharmacological approach. Oxidative stress and glutathione deficiency seem to play a major role in the pathogenesis of HIV infection, as suggested by the increased survival of HIV-infected patients treated with N-acetylcysteine, a prodrug of glutathione. However, beneficious effects of GSH-replenishing drugs are restricted in vivo by the high concentrations needed to obtain biological effects and their low bioavailability. In this study, we evaluated the antiretroviral and antioxidant activities of new more lipophilic GSH-replenishing molecules, in macrophages infected in vitro with HIV-1. In these experimental conditions, a prodrug of N-acetylcystéine and β-mercaptoethylamine, I-152 demonstrated a potent anti-HIV activity, increased intracellular GSH level, and decreased TNF-α production. Altogether, these results suggest that I-152 could be beneficial as adjuvant therapy of antiretrovirals in HIV-infected patients, es-
∗ Correspondance et tirés à part.
Adresse e-mail : [email protected] (P. Clayette).
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pecially in those with damages to the central nervous system or with mitochondrial damages associated with highly active antiretroviral therapy. 2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS glutathione / HIV / macrophage / oxidative stress
L’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est associée avec une diminution du taux de glutathion réduit (GSH) dans la circulation systémique [1] et dans les tissus [2]. Si les mécanismes moléculaires conduisant à ce déficit ne sont pas bien connus, il semble à la fois résulter du stress oxydatif et de la réplication rétrovirale [3]. Ce déficit en GSH accentue le stress oxydatif et participe à d’autres évènements physiopathologiques de l’infection par le VIH : – la réplication virale, en favorisant l’activation de cette réplication par le facteur de transcription NF-κB ; – le dysfonctionnement du système immunitaire, en accentuant l’inflammation [4] et le déficit en lymphocytes T CD4+ via les processus apoptotiques [5, 6] ; – les atteintes au niveau du système nerveux central (SNC, mort neuronale, apoptose et démyélinisation) [7] ; – la diminution de la microbicidie ; – la diminution des capacités de détoxification des xénobiotiques. Ainsi, son déficit a été relié à une diminution de la survie des patients infectés par le VIH [8, 9]. Le glutathion est un tripeptide, le γ-glutamylcystéinylglycine. Il est le principal antioxydant cellulaire, en particulier dans les cellules de la lignée macrophagique : – en étant un composé “scavenger” du monoxyde d’azote (i.e. nitrosoglutathion) [10] ; – en neutralisant les peroxydes en tant que substrat de la GSH-peroxydase ; – en regénérant des molécules antioxydantes, comme l’ascorbate au titre de substrat de la GSH-deshydrogénase ; – en détoxifiant les composés toxiques endogènes et exogènes en tant que substrat de la GSH-S-transférase [11]. Le macrophage, outre son rôle dans la production (activité phagocytaire) et la neutralisation des radicaux libres, est la seconde cible majeure du VIH. Dans l’infection par le VIH, cette lignée cellulaire est donc impliquée à double titre. La diminution du taux intracellulaire de GSH dans cette population cellulaire et le lien observé in vitro avec la réplication virale le confirme (Mialocq, Clayette, données personnelles). L’administration orale de molécules pro-GSH telles que la N-acétylcystéine (NAC) accroît la survie des patients infectés par le VIH [8]. Cependant, l’efficacité de telles molécules est limitée par leur faible biodisponibilité, des fortes concentrations nécessaires pour obtenir un effet antiviral, et leur faible index de sélectivité [12]. Au cours de cette étude, nous nous sommes donc intéressés à évaluer l’activité antirétrovirale et antioxydante de nouveaux composés pro-GSH plus lipophiles à l’aide de cultures primaires de macrophages humains, dérivés des monocytes sanguins, infectés in vitro par le VIH-1.
MATÉRIELS ET MÉTHODES Isolement des monocytes par élutriation à contre-courant, différenciation, et culture des macrophages dérivés des monocytes (MDM) Les cellules mononucléées sont isolées du sang périphérique de donneurs sains par un gradient de densité sur un coussin de Ficoll (MSL 2000, Eurobio, Les Ulis, France). Les monocytes sont ensuite séparés des autres éléments figurés par élutriation à contre-courant, sont resuspendus dans du milieu de culture Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (Roche Products, Meylan, France) supplémenté par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (Roche Products ; +56◦ C pendant 45 min) et 1 % d’une solution de trois antibiotiques (pénicilline, streptomycine, néomycine [PSN], Life Technologies, Grand Island, NY, USA), et sont distribués dans chaque puits de plaques de 48 puits (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ, USA), à raison de un million de cellules par puits et de 1 mL de milieu de culture. Les cellules sont alors placées à +37◦ C en atmosphère humide sous 5 % de CO2 , et sont laissées à différencier en macrophages pendant sept jours.
Virus et infection par le VIH-1 Au terme de ces sept jours de différenciation, les MDM ont été infectés et/ou traités par différentes concentrations de chaque composé pro-GSH. Une heure après le traitement ou non des MDM, les cellules ont été infectées par 10 000 Tissue Culture Infectious Dose 50 % (TCID50) de l’isolat de référence à tropisme macrophagique VIH1/Ba-L ou de deux souches primaires à tropisme macrophagique, VIH-1-DAS et -THI [13]. Au laboratoire, ces virus ont été amplifiés à l’aide de cellules mononucléées du sang ombilical (CMSO), activées par 1 µg/mL de phytohémagglutinine-P (PHA-P). Les stocks viraux ont été titrés en utilisant des cellules mononucléées du sang périphérique activées par la PHA-P, et la TCID50, calculée au moyen de la formule de Kärber [14]. Par ailleurs, afin d’éliminer tout facteur soluble comme les cytokines, les surnageants ont été centrifugés à 360 000 g pendant 5 min et les culots ainsi obtenus, resuspendus dans du DMEM.
Molécules, traitement et entretien des cultures La NAC, la β-mercaptoéthylamine (MEA), le buthionine sulfoximine (BSO) (Sigma, Quentin-Fallavier, France) et le composé I-152 ont été solubilisés dans du tampon
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phosphate (PBS, Life Technologies) ; les dilutions ont été préparées extemporanément à l’aide du milieu de culture décrit ci-dessus. Lors de l’évaluation de l’activité antirétrovirale de molécules pro-GSH, les surnageants de culture ont été collectés tous les trois ou quatre jours puis conservés à −20◦ C jusqu’au dosage de la réplication virale, et le milieu de culture et les molécules renouvelés.
Mesure de la réplication virale La réplication virale a été quantifiée dans les surnageants de culture en mesurant l’activité de la Transcriptase Inverse (TI), à l’aide de la méthode spectrophotométrique (RT Retrosys® kit), selon les recommendations de la Société Innovagen (Lund, Sweden).
Mesure de la viabilité cellulaire La cytotoxicité de I-152, de la NAC et de la MEA vis-àvis des MDM a été mesurée 24 heures et 12 jours après l’initiation du traitement, à l’aide du rouge neutre. Après un lavage en PBS, les MDM ont été incubés une heure à +37◦ C avec 500 µL d’une solution de 0,005 % (m/v) de rouge neutre. Au terme de cette incubation, les MDM ont été lavés et lysés par 150 µL d’un mélange éthanol/acide acétique (50/1) froid. La densité optique a été mesurée à une longueur d’onde de 540 sm.
Dosage du glutathion total intracellulaire et de la synthèse de TNF-α dans les surnageants de culture
RÉSULTATS Activité antirétrovirale de I-152 dans les MDM infectés par VIH-1 La souche de référence à tropisme macrophagique VIH1/Ba-L réplique fortement dans les MDM humains. Cette réplication virale est maximale entre le 12e et le 15e jour suivant l’infection (résultats non présentés). Dans ce modèle expérimental, l’activité antirétrovirale de plusieurs nouvelles molécules pro-GSH a été évaluée, et parmi celles-ci, la molécule I-152, une prodrogue de la NAC et de la MEA, s’est avérée la plus efficace. La DE50 de I-152 est ainsi égale à 50 µM, valeur six et 188 fois supérieure respectivement à celle de la MEA et de la NAC (DE50 de la MEA : 300 µM et DE50 de la NAC : 9,4 mM) (figure 1). De plus, à la différence de la NAC et de la MEA, cette activité antirétrovirale ne s’accompagne pas d’une diminution de la viabilité cellulaire (CC50 à 24 heures supérieure à 5 mM ; CC50 à 12 jours : 636 µM). Au vu de ces résultats encourageants, l’activité antirétrovirale de I-152 dans les MDM a été confirmée à l’aide de deux isolats primaires à tropisme macrophagique. Les isolats VIH-1-DAS et VIH-1-THI répliquent également à un niveau élevé dans les MDM, et dans ces conditions expérimentales, I-152 s’est avérée tout aussi efficace (figure 2).
Activité pro-GSH de I-152 dans les MDM Afin de confirmer le caractère anti-oxydant de I-152, sa capacité à augmenter le taux intracellulaire de GSH a été
Après 24 heures de traitement, le taux intracellulaire de glutathion total et la production de TNF-α ont été mesurés dans les cultures de MDM traités ou non par I-152, en l’absence de cystine dans le milieu de culture. Le taux intracellulaire de GSH a été mesuré dans les lysats de MDM à l’aide de la méthode de Griffith [15], selon les recommandations de la société Cayman (Ann Arbor, USA). La synthèse de TNF-α (Cayman) a été quantifiée dans les surnageants de culture de MDM préalablement stimulés par 1 µg/mL d’un lipopolysaccharide bactérien (Escherichia Coli, sérotype 0111 : B4, Sigma) et 100 U/mL d’interféron-γ (IFN) (R&D systems, Oxon, UK).
Analyse des résultats Chaque expérience a été menée en triplicat et repétée à l’aide de cellules isolées d’au moins deux autres donneurs de sang. Les doses effectrices et les concentrations cytotoxiques 50 % (DE50, CC50) de chaque composé ont été calculées à l’aide du logiciel informatique « Dose-effect analysis with microcomputers » (Biosoft, Cambridge, UK) [16].
Figure 1. Comparaison des activités antirétrovirales de la molécule I-152, de la NAC et de la MEA dans les MDM infectés par la souche VIH-1/Ba-L.
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Figure 2. Activité antirétrovirale de la molécule I-152 à la concentration de 250 µM, dans les MDM infectés par les isolats primaires VIH-1-DAS et -THI.
Figure 4. Effets de I-152 sur la synthèse de TNF-α par les MDM stimulés par 1 µg/mL de LPS et 100 U/mL d’IFN-γ.
Effets de I-152 sur la production de TNF-α dans les MDM Les processus, inflammatoire et oxydatif, sont très étroitement liés [8]. Ainsi, l’activation du facteur de transcription NF-κB, impliqué dans la réponse inflammatoire via le contrôle de l’expression de certains gènes comme celui du TNF-α , est régulée pour une part par le métabolisme oxydatif. Les effets de I-152 à réguler la synthèse du TNF-α ont donc été recherchés dans des cultures de MDM stimulés préalablement pendant 24 heures par 100 U/mL d’IFN-γ et 1 µg/mL de LPS. Cette stimulation augmente fortement la production de TNF-α, production diminuée de 49,3 % par 250 µM de I-152 (figure 4). Figure 3. Taux intracellulaire de GSH dans les MDM traités ou non 24 heures par la NAC et/ou la MEA, et I-152.
mesurée dans les MDM humains, infectés ou non par le VIH-1. Après 24 heures de traitement, I-152 augmente le taux intracellulaire de GSH de façon dose-dépendante (résultats non présentés). Cet effet est maximum à 250 µM, concentration à laquelle la NAC et/ou la MEA, les deux molécules composant I-152 sont inefficaces (figure 3). Cette augmentation du taux intracellulaire de GSH a été confirmée dans des MDM infectés par la souche VIH-1/Ba-L (résultats non présentés), et est liée à une synthèse de GSH de novo. En effet, un inhibiteur spécifique de la γ-glutamylcystéine synthétase, comme le BSO, inhibe totalement l’augmentation de GSH engendrée par I-152 (résultats non présentés).
DISCUSSION ET CONCLUSION Le stress oxydatif associé à l’infection par le VIH semble un des mécanismes par lesquels le rétrovirus active sa propre réplication et diminue les défenses immunitaires de l’organisme [17]. Le GSH, le principal antioxydant intracellulaire, semble jouer un rôle majeur dans l’installation de ce stress. D’une part, les taux de GSH sont diminués dans le plasma [1] et les tissus i.e. SNC des patients infectés par le VIH [2], et d’autre part, ils sont correlés à une diminution de la survie de ces patients [8]. Plusieurs composés pro-GSH comme la NAC et l’acide L-2-oxo-thiazolidine-4-carboxylique ont été testés chez des patients infectés par le VIH. Ces composés ont démontré une certaine efficacité biologique, celle-ci est néanmoins limitée par leur faible biodisponibilité et les fortes concentrations nécessaires à l’obtention de cette
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efficacité. De ce fait, nous nous sommes intéressés lors de cette étude à évaluer les activités, antirétrovirale et antioxydante, de nouveaux composés pro-GSH dont la lipophilie a été accrue. Cette évaluation a été réalisée à l’aide de cultures primaires de MDM humains, infectés ou non par le VIH-1. Le macrophage, en tant que première ligne de défense, est particulièrement impliqué dans les désordres oxydatifs et dans leur contrôle ; par ailleurs, il est la seconde cible majeure du VIH. Dans ce modèle expérimental, une prodrogue de la NAC et de la MEA, I-152, a présenté une activité antirétrovirale significative, augmenté le taux intracellulaire de GSH et diminué la synthèse de TNF-α. Par ailleurs, la réplication du VIH-1 dans les MDM engendre une diminution du taux intracellulaire de GSH. La molécule I-152 compense ce déficit, démontrant ainsi son aptitude à rétablir le taux intracellulaire de GSH dans une situation physiopathologique de stress oxydatif chronique. À ce titre, cette molécule pourrait constituer une excellente thérapeutique adjuvante aux antirétroviraux actuels, en interférant avec les processus oxydatifs et inflammatoires liés à l’infection par le VIH [18, 19], mais également ceux probablement liés aux traitements eux-mêmes, i.e. toxicité mitochondriale des inhibiteurs nucléosidiques de la TI [20, 21]. Toutefois, cet intérêt nécessite une exploration plus précise du mécanisme d’action de cette molécule, de ses interactions médicamenteuses avec les antirétroviraux, ainsi que l’évaluation de sa toxicité et de son efficacité dans un modèle animal approprié.
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REMERCIEMENTS Les auteurs souhaitent remercier le Centre de transfusion sanguine des armées Jean Julliard (Clamart, France), la Maternité Sainte-Félicité (Paris, France), le Commissariat à l’Énergie atomique (CEA), le Centre de recherche du service de santé des armées (CRSSA), l’École pratique des hautes études (EPHE) et l’Agence nationale de recherche sur le SIDA (ANRS).
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université Montpellier II, sciences et techniques du Languedoc, place Eugène-Bataillon, 34095 Montpellier cedex 5, France (Reçu le 10 mai 2001 ; accepté le 15 mai 2001)
Résumé Le stress oxydatif et le déficit en glutathion semblent jouer un rôle majeur dans la physiopathologie de l’infection par le VIH, et en particulier dans les atteintes du système nerveux central. Cependant, les effets bénéfiques des molécules proglutathion sont limités in vivo par leur faible biodisponibilité et les fortes concentrations nécessaires à l’obtention de l’activité biologique. Au cours de cette étude, nous nous sommes intéressés à évaluer les activités, antirétrovirale et antioxydante, de nouveaux composés proglutathion plus lipophiles, dans des macrophages infectés in vitro par le VIH-1. En effet, cette lignée cellulaire est impliquée à double titre dans ces processus physiopathologiques puisqu’elle est une des deux cibles cellulaires majeures du VIH et qu’elle est fortement impliquée dans la production et la détoxification des radicaux libres. Dans ces conditions expérimentales, une prodrogue de la N-acétylcystéine et de la ß-mercaptoéthylamine, la molécule I-152, a présenté une activité antirétrovirale significative, une capacité à augmenter le taux intracellulaire de GSH et à diminuer la synthèse de TNF-α. Cette molécule pourrait donc présenter un intérêt potentiel en tant que thérapeutique adjuvante des antirétroviraux actuels chez les patients infectés par le VIH, et plus particulièrement chez ceux présentant des désordres neurologiques ou des atteintes mitochondriales liées aux inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse. 2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS glutathion / macrophage / stress oxydatif / VIH
Summary – Oxidative metabolism in HIV-infected macrophages: role of glutathione and pharmacological approach. Oxidative stress and glutathione deficiency seem to play a major role in the pathogenesis of HIV infection, as suggested by the increased survival of HIV-infected patients treated with N-acetylcysteine, a prodrug of glutathione. However, beneficious effects of GSH-replenishing drugs are restricted in vivo by the high concentrations needed to obtain biological effects and their low bioavailability. In this study, we evaluated the antiretroviral and antioxidant activities of new more lipophilic GSH-replenishing molecules, in macrophages infected in vitro with HIV-1. In these experimental conditions, a prodrug of N-acetylcystéine and β-mercaptoethylamine, I-152 demonstrated a potent anti-HIV activity, increased intracellular GSH level, and decreased TNF-α production. Altogether, these results suggest that I-152 could be beneficial as adjuvant therapy of antiretrovirals in HIV-infected patients, es-
∗ Correspondance et tirés à part.
Adresse e-mail : [email protected] (P. Clayette).
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P. Mialocq et al.
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L’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est associée avec une diminution du taux de glutathion réduit (GSH) dans la circulation systémique [1] et dans les tissus [2]. Si les mécanismes moléculaires conduisant à ce déficit ne sont pas bien connus, il semble à la fois résulter du stress oxydatif et de la réplication rétrovirale [3]. Ce déficit en GSH accentue le stress oxydatif et participe à d’autres évènements physiopathologiques de l’infection par le VIH : – la réplication virale, en favorisant l’activation de cette réplication par le facteur de transcription NF-κB ; – le dysfonctionnement du système immunitaire, en accentuant l’inflammation [4] et le déficit en lymphocytes T CD4+ via les processus apoptotiques [5, 6] ; – les atteintes au niveau du système nerveux central (SNC, mort neuronale, apoptose et démyélinisation) [7] ; – la diminution de la microbicidie ; – la diminution des capacités de détoxification des xénobiotiques. Ainsi, son déficit a été relié à une diminution de la survie des patients infectés par le VIH [8, 9]. Le glutathion est un tripeptide, le γ-glutamylcystéinylglycine. Il est le principal antioxydant cellulaire, en particulier dans les cellules de la lignée macrophagique : – en étant un composé “scavenger” du monoxyde d’azote (i.e. nitrosoglutathion) [10] ; – en neutralisant les peroxydes en tant que substrat de la GSH-peroxydase ; – en regénérant des molécules antioxydantes, comme l’ascorbate au titre de substrat de la GSH-deshydrogénase ; – en détoxifiant les composés toxiques endogènes et exogènes en tant que substrat de la GSH-S-transférase [11]. Le macrophage, outre son rôle dans la production (activité phagocytaire) et la neutralisation des radicaux libres, est la seconde cible majeure du VIH. Dans l’infection par le VIH, cette lignée cellulaire est donc impliquée à double titre. La diminution du taux intracellulaire de GSH dans cette population cellulaire et le lien observé in vitro avec la réplication virale le confirme (Mialocq, Clayette, données personnelles). L’administration orale de molécules pro-GSH telles que la N-acétylcystéine (NAC) accroît la survie des patients infectés par le VIH [8]. Cependant, l’efficacité de telles molécules est limitée par leur faible biodisponibilité, des fortes concentrations nécessaires pour obtenir un effet antiviral, et leur faible index de sélectivité [12]. Au cours de cette étude, nous nous sommes donc intéressés à évaluer l’activité antirétrovirale et antioxydante de nouveaux composés pro-GSH plus lipophiles à l’aide de cultures primaires de macrophages humains, dérivés des monocytes sanguins, infectés in vitro par le VIH-1.
MATÉRIELS ET MÉTHODES Isolement des monocytes par élutriation à contre-courant, différenciation, et culture des macrophages dérivés des monocytes (MDM) Les cellules mononucléées sont isolées du sang périphérique de donneurs sains par un gradient de densité sur un coussin de Ficoll (MSL 2000, Eurobio, Les Ulis, France). Les monocytes sont ensuite séparés des autres éléments figurés par élutriation à contre-courant, sont resuspendus dans du milieu de culture Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (Roche Products, Meylan, France) supplémenté par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (Roche Products ; +56◦ C pendant 45 min) et 1 % d’une solution de trois antibiotiques (pénicilline, streptomycine, néomycine [PSN], Life Technologies, Grand Island, NY, USA), et sont distribués dans chaque puits de plaques de 48 puits (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ, USA), à raison de un million de cellules par puits et de 1 mL de milieu de culture. Les cellules sont alors placées à +37◦ C en atmosphère humide sous 5 % de CO2 , et sont laissées à différencier en macrophages pendant sept jours.
Virus et infection par le VIH-1 Au terme de ces sept jours de différenciation, les MDM ont été infectés et/ou traités par différentes concentrations de chaque composé pro-GSH. Une heure après le traitement ou non des MDM, les cellules ont été infectées par 10 000 Tissue Culture Infectious Dose 50 % (TCID50) de l’isolat de référence à tropisme macrophagique VIH1/Ba-L ou de deux souches primaires à tropisme macrophagique, VIH-1-DAS et -THI [13]. Au laboratoire, ces virus ont été amplifiés à l’aide de cellules mononucléées du sang ombilical (CMSO), activées par 1 µg/mL de phytohémagglutinine-P (PHA-P). Les stocks viraux ont été titrés en utilisant des cellules mononucléées du sang périphérique activées par la PHA-P, et la TCID50, calculée au moyen de la formule de Kärber [14]. Par ailleurs, afin d’éliminer tout facteur soluble comme les cytokines, les surnageants ont été centrifugés à 360 000 g pendant 5 min et les culots ainsi obtenus, resuspendus dans du DMEM.
Molécules, traitement et entretien des cultures La NAC, la β-mercaptoéthylamine (MEA), le buthionine sulfoximine (BSO) (Sigma, Quentin-Fallavier, France) et le composé I-152 ont été solubilisés dans du tampon
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phosphate (PBS, Life Technologies) ; les dilutions ont été préparées extemporanément à l’aide du milieu de culture décrit ci-dessus. Lors de l’évaluation de l’activité antirétrovirale de molécules pro-GSH, les surnageants de culture ont été collectés tous les trois ou quatre jours puis conservés à −20◦ C jusqu’au dosage de la réplication virale, et le milieu de culture et les molécules renouvelés.
Mesure de la réplication virale La réplication virale a été quantifiée dans les surnageants de culture en mesurant l’activité de la Transcriptase Inverse (TI), à l’aide de la méthode spectrophotométrique (RT Retrosys® kit), selon les recommendations de la Société Innovagen (Lund, Sweden).
Mesure de la viabilité cellulaire La cytotoxicité de I-152, de la NAC et de la MEA vis-àvis des MDM a été mesurée 24 heures et 12 jours après l’initiation du traitement, à l’aide du rouge neutre. Après un lavage en PBS, les MDM ont été incubés une heure à +37◦ C avec 500 µL d’une solution de 0,005 % (m/v) de rouge neutre. Au terme de cette incubation, les MDM ont été lavés et lysés par 150 µL d’un mélange éthanol/acide acétique (50/1) froid. La densité optique a été mesurée à une longueur d’onde de 540 sm.
Dosage du glutathion total intracellulaire et de la synthèse de TNF-α dans les surnageants de culture
RÉSULTATS Activité antirétrovirale de I-152 dans les MDM infectés par VIH-1 La souche de référence à tropisme macrophagique VIH1/Ba-L réplique fortement dans les MDM humains. Cette réplication virale est maximale entre le 12e et le 15e jour suivant l’infection (résultats non présentés). Dans ce modèle expérimental, l’activité antirétrovirale de plusieurs nouvelles molécules pro-GSH a été évaluée, et parmi celles-ci, la molécule I-152, une prodrogue de la NAC et de la MEA, s’est avérée la plus efficace. La DE50 de I-152 est ainsi égale à 50 µM, valeur six et 188 fois supérieure respectivement à celle de la MEA et de la NAC (DE50 de la MEA : 300 µM et DE50 de la NAC : 9,4 mM) (figure 1). De plus, à la différence de la NAC et de la MEA, cette activité antirétrovirale ne s’accompagne pas d’une diminution de la viabilité cellulaire (CC50 à 24 heures supérieure à 5 mM ; CC50 à 12 jours : 636 µM). Au vu de ces résultats encourageants, l’activité antirétrovirale de I-152 dans les MDM a été confirmée à l’aide de deux isolats primaires à tropisme macrophagique. Les isolats VIH-1-DAS et VIH-1-THI répliquent également à un niveau élevé dans les MDM, et dans ces conditions expérimentales, I-152 s’est avérée tout aussi efficace (figure 2).
Activité pro-GSH de I-152 dans les MDM Afin de confirmer le caractère anti-oxydant de I-152, sa capacité à augmenter le taux intracellulaire de GSH a été
Après 24 heures de traitement, le taux intracellulaire de glutathion total et la production de TNF-α ont été mesurés dans les cultures de MDM traités ou non par I-152, en l’absence de cystine dans le milieu de culture. Le taux intracellulaire de GSH a été mesuré dans les lysats de MDM à l’aide de la méthode de Griffith [15], selon les recommandations de la société Cayman (Ann Arbor, USA). La synthèse de TNF-α (Cayman) a été quantifiée dans les surnageants de culture de MDM préalablement stimulés par 1 µg/mL d’un lipopolysaccharide bactérien (Escherichia Coli, sérotype 0111 : B4, Sigma) et 100 U/mL d’interféron-γ (IFN) (R&D systems, Oxon, UK).
Analyse des résultats Chaque expérience a été menée en triplicat et repétée à l’aide de cellules isolées d’au moins deux autres donneurs de sang. Les doses effectrices et les concentrations cytotoxiques 50 % (DE50, CC50) de chaque composé ont été calculées à l’aide du logiciel informatique « Dose-effect analysis with microcomputers » (Biosoft, Cambridge, UK) [16].
Figure 1. Comparaison des activités antirétrovirales de la molécule I-152, de la NAC et de la MEA dans les MDM infectés par la souche VIH-1/Ba-L.
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Figure 2. Activité antirétrovirale de la molécule I-152 à la concentration de 250 µM, dans les MDM infectés par les isolats primaires VIH-1-DAS et -THI.
Figure 4. Effets de I-152 sur la synthèse de TNF-α par les MDM stimulés par 1 µg/mL de LPS et 100 U/mL d’IFN-γ.
Effets de I-152 sur la production de TNF-α dans les MDM Les processus, inflammatoire et oxydatif, sont très étroitement liés [8]. Ainsi, l’activation du facteur de transcription NF-κB, impliqué dans la réponse inflammatoire via le contrôle de l’expression de certains gènes comme celui du TNF-α , est régulée pour une part par le métabolisme oxydatif. Les effets de I-152 à réguler la synthèse du TNF-α ont donc été recherchés dans des cultures de MDM stimulés préalablement pendant 24 heures par 100 U/mL d’IFN-γ et 1 µg/mL de LPS. Cette stimulation augmente fortement la production de TNF-α, production diminuée de 49,3 % par 250 µM de I-152 (figure 4). Figure 3. Taux intracellulaire de GSH dans les MDM traités ou non 24 heures par la NAC et/ou la MEA, et I-152.
mesurée dans les MDM humains, infectés ou non par le VIH-1. Après 24 heures de traitement, I-152 augmente le taux intracellulaire de GSH de façon dose-dépendante (résultats non présentés). Cet effet est maximum à 250 µM, concentration à laquelle la NAC et/ou la MEA, les deux molécules composant I-152 sont inefficaces (figure 3). Cette augmentation du taux intracellulaire de GSH a été confirmée dans des MDM infectés par la souche VIH-1/Ba-L (résultats non présentés), et est liée à une synthèse de GSH de novo. En effet, un inhibiteur spécifique de la γ-glutamylcystéine synthétase, comme le BSO, inhibe totalement l’augmentation de GSH engendrée par I-152 (résultats non présentés).
DISCUSSION ET CONCLUSION Le stress oxydatif associé à l’infection par le VIH semble un des mécanismes par lesquels le rétrovirus active sa propre réplication et diminue les défenses immunitaires de l’organisme [17]. Le GSH, le principal antioxydant intracellulaire, semble jouer un rôle majeur dans l’installation de ce stress. D’une part, les taux de GSH sont diminués dans le plasma [1] et les tissus i.e. SNC des patients infectés par le VIH [2], et d’autre part, ils sont correlés à une diminution de la survie de ces patients [8]. Plusieurs composés pro-GSH comme la NAC et l’acide L-2-oxo-thiazolidine-4-carboxylique ont été testés chez des patients infectés par le VIH. Ces composés ont démontré une certaine efficacité biologique, celle-ci est néanmoins limitée par leur faible biodisponibilité et les fortes concentrations nécessaires à l’obtention de cette
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efficacité. De ce fait, nous nous sommes intéressés lors de cette étude à évaluer les activités, antirétrovirale et antioxydante, de nouveaux composés pro-GSH dont la lipophilie a été accrue. Cette évaluation a été réalisée à l’aide de cultures primaires de MDM humains, infectés ou non par le VIH-1. Le macrophage, en tant que première ligne de défense, est particulièrement impliqué dans les désordres oxydatifs et dans leur contrôle ; par ailleurs, il est la seconde cible majeure du VIH. Dans ce modèle expérimental, une prodrogue de la NAC et de la MEA, I-152, a présenté une activité antirétrovirale significative, augmenté le taux intracellulaire de GSH et diminué la synthèse de TNF-α. Par ailleurs, la réplication du VIH-1 dans les MDM engendre une diminution du taux intracellulaire de GSH. La molécule I-152 compense ce déficit, démontrant ainsi son aptitude à rétablir le taux intracellulaire de GSH dans une situation physiopathologique de stress oxydatif chronique. À ce titre, cette molécule pourrait constituer une excellente thérapeutique adjuvante aux antirétroviraux actuels, en interférant avec les processus oxydatifs et inflammatoires liés à l’infection par le VIH [18, 19], mais également ceux probablement liés aux traitements eux-mêmes, i.e. toxicité mitochondriale des inhibiteurs nucléosidiques de la TI [20, 21]. Toutefois, cet intérêt nécessite une exploration plus précise du mécanisme d’action de cette molécule, de ses interactions médicamenteuses avec les antirétroviraux, ainsi que l’évaluation de sa toxicité et de son efficacité dans un modèle animal approprié.
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REMERCIEMENTS Les auteurs souhaitent remercier le Centre de transfusion sanguine des armées Jean Julliard (Clamart, France), la Maternité Sainte-Félicité (Paris, France), le Commissariat à l’Énergie atomique (CEA), le Centre de recherche du service de santé des armées (CRSSA), l’École pratique des hautes études (EPHE) et l’Agence nationale de recherche sur le SIDA (ANRS).
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