Methode rapide de dosage selectif des chlorophylles a et b utilisation de la separation par chromatographie liquide haute pression

Water Re~. Vol. 16. pp. 987 to 993. 1982 Printed in Great Britain. All rights reserved

00J,3-1354 82 [email protected] 0 Copyright ~ 1982 Pergamon Press. Lid

METHODE RAPIDE DE DOSAGE SELECTIF DES CHLOROPHYLLES a ET b UTILISATION DE LA SEPARATION PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PRESSION A SELECTIVE AND RAPID METHOD OF CHLOROPHYLLS a AND b SEPARATIVE DETERMINATION BY HIGH-PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY J. BF..SSIEREet A. MONTIEL Service de Contr61e des Eaux de la Ville de Paris, 144 avenue Paul Vaillant Couturier, 75014 Paris, France (Re~'u septembre 1981)

R6Jam6--La chromatographie liquide haute pression en phase inverse et d6tection de la fluorescence 6mise/t 470 nm apr6s excitation k 427 rim, a 6t6 utilis6e pour le dosage des chlorophylles aet b. En effet, les m6thodologies courantes d'extraction des pigments chlorophylliens du phytoplancton par rac6tone/~ 90"/. et leur dosage/, partir de rextrait total par mesure de rabsorption/, diff6rentes Iongeurs d'onde, sembl©nt6tre insuf~,antes/l un certain nombr d'auteurs. Dans le but d'am61iorer la m6thode (extraction, dosage} on a recherch6 tout d'abord ie meilleur solvant d'extraction, I'ac6tone ne conduisant qu'a des rendements mediocres. Ce dosage s61ectif, sensible et rapide (20 rain) est rendu automatique par remploi d'un 6talon interne (fluoranth6ne).d'un passeur d'6chantillons et d'un int6grateur. Abstract--The usual extraction methodology of the phytoplankton chlorophylls by acetone at 90':,, and their usual detection by spectrophotometry of the global extract at different wave lengths seem to be insufficientto many authors. With intent to improve this method {extraction. detection}, we have verified firstthat methanol extraction was more effectivethan 9050 acetone extraction, and we have set up a method of detection as simple and rapid as the usual one but which allows measuring the chlorophylls quantitatively and specifically,once they are separated. The chlorophylls a and b were separated by high-pressure liquid chromatography in reversed phase with a spherisorb O D S Cts column eluted with methanol-water {97/3) at a flow-rate of I ml rain- t: after being eluted they were detected by spectrofluorometry (excitation 427 n m and detection 470 nm) {Figs I and 2). This selective,sensitive rapid (20 rain) determination can be automated by using an automatic injector and the recording on an integrator. The standardization of chlorophylls a and b was carried out with fluorantben {internal standard} which does not want preparing again at every set of determinations (Fig. 3). This is a great advantage when we consider the fast degradation of the standards. This method allows using absolute methanol which is an extracting solvent more efficient than acetone 90?/0 in the specific case of Scenedesmus subspicatus,whose pigments are known not to be easily extracted,and, in a broader sense, in the case of natural phytoplanktonic populations. To add BaCOs as a basic material during extraction is not recommended. This methodology may be used for biomass estimates by routine analysis as well as for the delicatemeasuring of pigments. Chromatographic profilesof Scenedesmus subspicatusextract and Seine river extract are presented in Figs 4 and 5.

La d6termination quantitative des chlorophylles a et b contenues dans les organismes phytoplanctoniques n6cessit© une extraction rapide et efficace, suivie d'un dosage s61ectif des pigments. L'extraction des pigments chlorophylliens est faite le plus couramment (Brooks & Liptak, 1979: Humphrey & Wooton, 1963: Khalanski & Brock, 1977: Konopka & Brock, 1978: Lorenzen. 1967: Loftus & Carpenter, 1971 : Margalef. 1960: Young & Ho, 1977) selon la m6thode pr6conis6e par ie SCOR UNESCO (1966). par I'ac6tone h 900,o. Le m6thanol absolu a 6t6 choisi comme solvant d'extraction en raison de son 987

el:licacit6bien sup6rieure comme ront d6j~ rapport6 certains auteurs (Holm-Hansen & Riemann, 1978, Parsons, 1963; Riemann, 1978c). Le dosage des chlorophylles se far le plus souvent sur rextrait total contenant les pigments actifs et leurs produits de d6gradation naturels (ph6ophytines, ph6ophorbides, chlorophyllides), par mesure de rabsorption (Lorenzen, I967; Riemann, 1978b; SCOR UNESCO, 1966), ou de la fluorescence (Boto & Bunt, 1978: LoRos & Carpenter, 1971; Tunzi et al. 1974),/l diff6rentes longueurs d'onde et calcul/l I'aide d'6quations trichromatiques.

988

J. BBSSIERE et A MONTIEL

Les interf6rences, bien que partiellement +limindes par la proc6dure d'acidification, restent importantes (Holm-Hansen & Riemann, 1978 Riemann, 1978b; Shoaf, 1978; Whitney & Darley, 19791. Cette methodologie, si etle est simple, ne permet qu'une estimation approximative de la teneur en ces pigments Certains auteurs ont fait appel a. une separation pr~alable des pigments par c h r o m a t o g r a p h i c sur papier (Jeffrey & Allen, 1967: Riemann 1978a), sur t o u c h e mince (Iriyama. 1979: Shoaf & Lium. 1977), ou sur co[onne [Iriyama & Yoshiura. 1979; Iriyama er al.. 1979: Strain et al.. 19601. Mais seule, la sSparation par chromatographie liquide haute pression (Rebeiz et al.. 1978: Shoal'. 1978), coupl6e ~i une d~tection par absorption au fluorescence permet d'allier la s61ectivit+ du dosage :~ la simplicit6 et la rapidit6 de son execution, U n dosage original des chlorophylles a et b avec 6talon interne, par chromatographie liquide haute pression, coupl~e a un d/:tecteur par fluorescence a ~t~ mis au point,

I MATERIEL ET METHODE

I-1 Mise au point du dosage des chlorophylles a et..b L'etude de la s~paration et du dosage des ehlorophylles a et best men~e sur des ~talons produits par Sigma Chemical C.. m,s en solution m~thanolique h 1-3 mg 1-t (solution standard). Etant donn~e la polarit6 des chlorophylles, la ehromatographie de partage en phase inverse permettant d'utiliser des solvants polaires a ~t6 choisie. On a fait ,¢arier diff~rents param~tres afin d'obtenir la s~paration optimum; (a) on a test~ pour cela des colonnes de 25 crn, et 3 mm de diam~tre, rempties de diff~rentes phases gr~r£,ea: microsorb RP~ et RP~a. sph~risorb SSW C6 et ODS C ~ ; (b) il convenait de trouver parmi plusieurs m~langes eau-solvant, de ~'oree ~luante donn~e, celui qui, pour chaque cotonne, donne la meilleure r~solution des pies. l~s solvants ~tudi~ sont choisis parmi les plus polaires:m6thanol, ~thanol. lls sont~tudi~sendiff~rentes proport,onsdu m~lange binaire: solvant-..eau. Le d~bit de I',~luant at ~t~ fix~ .~ 1 ml rain- ~. Le solvant est d&gaz~ aux ultra-sons et conserv~ sous atmosph~:re d'h~lium; ta colonne est stabilis~ t5--30min avant usage. La solution standard est inject6e sous un volumede 50.ul;(c) on a compar~ le dosage par spectrophotom~trie visible (Perkin-Elmer LC 55) et par fluorim~trie (Seh~SeffelFS 970) en branchant en s~rie les deux d~tecteurs a p r ~ avoir d~termin~ les Iongueurs d'onde respectires d'adsorption et d'excitation donnant la mgilleure r~ponse pour rensemble des pilgnents (absorption: 654 nm. excitation: 427nm). L'enregistrement e,st assur~ par un int~rateur (Sigma 10 Perkin--Elmer); (d) ~tant donn~:e la d~gradation rapide des standards observ~ ~, -20°C (augmentation des produits de d6gradation nomm~s a~ et az au d~pgnd de la chlorophylle a, et bt au d~pend de la chlorophylle b), il nous a sembl~ important d'effeetuer la gamme d'~talommge par rapport ~ un ~talon interne, plus stable, que l'on a claerda~ parmi les compo~s pr~,entant une fluoresc~nce gt une Iongueur d'onde sup~rieure ~, 470 nm et absorbant & 427 rim. Parmi les hydrocarhures iaolycycliques aromatiqes, en exeluant les eompo,~-s cane~ig~nes, nous avons ehoisi d'utiliser le fluoranth~ne ~ tree teneur perrnettant sa dStection dans de bonnes conditions,

1-2 3,Iise au point de Uextracrion des chloropi:.;i~e, a e, I-2-1 Determination des conditions optimales d'extr~:~r~ot~ L'etude a ere menee sur une culture de Scenedesmus subspieatus dont les pigments chlorophylliens sone reputes particuli~rement difficiles /t extraire ISCOR UNESCO. 1966) Les conditions de dosage par chromatographic l*quide haute pression ont em~ch,! l'emploi de certaines methodologics: notamment les mere ~ranes en derives de la cellulose pr~.conis~e par Humphrey & Wooton (19631 n'ont pu &re comparees aux filtres en fibre de ,,erre [Nolm-Hanson & Riemann. 19781 du fait de la dissolution des primi6res dans les solvants et augmentation de ta vlscoszte de l'extrait. La filtration sur membrane a ere utilisee comme mode de concentration des algues. L'ectatement cellulaire a ere obtenu par les ultra-sons. I-2-2 Comparaison des effieacit& relatit'es de trots solrants d'extraction. L'ac~tone a. 90°0, le m+thanol absolu et le dim~thylsulfoxyde tDMSOI ont ere compares, et ce. apres diff~rents temps de contact dans une limite de 4 h I-2-30pportunitd de I'ajout d'un agent basique de jTltratlon [BaCOn){Holra-Hansen & Riemann. 1978: Humphrey & Wooton, 1963; SCOR UNESCO. 1966). Un volume d6fini de culture de Scenedesmus subspicatus icontenant au moins 5 x l06 cellulesl est filtre sur membrane en fibre de verre (Whatman. porosite 0.45,um) pr~alablement recouverte ou non de poudre fine de BaCOn, 10mgcm--'. La membrane est d~posee dans un b~cher contenant 5 ml de solvant L'ensemble est plac~ 20 min dans un bac/t ultrasons {Bransonic 200), puis laiss~/t I'obscurite 10 rain, 1.2 et 3 h. L'extrait est alors filtr+ ~ travers une deuxieme membrane: le mat6rie[ est rince au moins 3 lois par le solvant jusqu'/i un volume d'extrait total de 8-10ml (protocole sp~eifique pour le DMSO (Shoaf & Lium, 19761. On y ajoute 80 ~1 d'une solution de fluoranthene a 800 mg I-t dans l'hexane.

II RESULTATS II-1 Mise au point de la s~paratton et du dosage des chlorophylles a et b ti-t-1 Choix de la colonne de separation. La Fig. 1 pr~sente les profiles c h r o m a t o g r a p h i q u e s des chtorophylles a et b t~moins obtenus avec les differents phases test~ea darts leurs meilleures conditions d'~lution. La colonne Sph~risorb SSW Phasep greff~e O D S C~a a p p o r t e ta r~solution o p t i m u m des pies: on d ~ n o m b r e 5 c o m p o ~ s fluorescents b~, associ6 h la chlorophylle b, a~ et aa associ~s ~ la chlorophylle a. I1-1-2 Choix du n~lan~e ~luant. La colonne O D S Cas, h u n d6bit de l m l m i n -~ a ~t~ 61tu~e par les m~ianges m~thanol--.eau (100/0--97/3-96/4) ou 6thanol--eau (90/10). La s~paration o p t i m u m pour le temps d'analyse le plus court (15--20rain) est obtenue avec u n rr~lange m~thanoi--eau (97/3). II-1-3 Choix de la ddtection: comparaison des rdponses obtenues parfluorim~trie ou absorption. Darts des conditions identiquea d'injection, la r~ponse obtehue par fluorescence eat scion lea pigments, de 2 h 12 fois plus ~lev~e que celle obtenue p a r absorption, lorsque pour l'une et l'autre des techniques nous n'amplifions pas le signal re~;u (Fig. 2). La fluorescence ,~mise a ~t6 choisie cornme mode de d~tection (excitation :~ 427 nrn, 6mission sup~:rieure h 470 nm). 1I-1-4 Etalonnage interne. Le fluoranth6ne a +t6 choisi p a r m i les molScules excitables ~t 427 n m et don-

Methode rapide de dosage selectif

81Dk6riNrb 86W PhaNp 8reff6Q: C l 8 I milton mJtkanel-eau ~713. 26 em

mSthtnol-eam 8g,5/0,5. 20 cm

989

~ I

I ) ) ! ) I~Cbl.b•5,~

) t f fl~e,nS.e. ~ ~

,

t ! .~Od~

)/ierolorb Jferk, 1 rot/ran

RP8 m6thanol-eau 9416. 26 cm

8ph6rteorb 85W Phasep 8reff6e : C6 1 rot/ran m6thanol-etu 96/4. 26 cm

i

9 fl~euebm,

) b~ChLb

I t ,~.2~

~ . . ~ . t

Fig. 1. Choix de la colonne de s~paration (C6, RPs, RPIs. ODS C~s} clans leurs conditions optimum d'~lution {m~thanol--eau); profils chromatographiques des standards de chiorophylles a et b conserves en solution m~thanolique /l 200mgl -I /~ -20"~C, 3 mois, inject~s en m~lange en solutions dilu6es (1-3 ml I" i), sous un volume de 50 ~l. I~tcction par fluorescence: excitation 427 nm, ~mission 470 nm. Fig. 1. Choice of separation column (Cs, RPs, RPts. ODS Cis) in their optimal conditions of elution (methanol-water); chromatographic profile of standards of chlorophyll ~ and b conserved three months (methanolic solution at 200 mg I- ~) at - 20:C, and injected in a diluted (1-3 mg I- t) and mixed solution in a sample size of 50/~1. Fluorescence detection (excitation 427 nm. emission 470 nm}.

nant une ~mission/! une Iongueur d'onde sup~rieure/t 470 nm pour deux raisons: ce compos~ n'est pas dangereux d'utilisation;

est de 0,5 ng de chlorophylle a e t de 5 ng de chlorophylle b. II-1-5 Application de la siparation et du doso#e d des extraits m6thanoliques: ~une culture pure de Sccne-

sa s~paration chromatographique ne perturbe pas le dosage des diff~rents pigments chiorophylliens (Figs

desmus subspicatus. La Fig. 4 pr~ente le profil chromatographique d'une extrait d'une culture de Scene-

1 et 2). La gamme d'~taionnage est effectu~e extemporan~ment avec des standards (Fig. 3), auxqueis on ajoute 80 ~1 d'une solution /~ 800 mg 1- ' de fluoranth~ne dans l'hexane. Cette quantit~ a ~t~ choisie pour avoir une bonne r~ponse chromatographique. Dans ces conditions (injection de 50/zD, la limite de d~tection

desmus subspicatus en phase logarithmique de croissance. Cette aigue verte contient essentiellement de la chlorophylle a et de la chlorophylle b. O n note la pr6senc¢ de petites quantit6s de at et a2. D'une population natureUe contenue dans un litre d'eau de Seine (pr~lev~ ~ Orly en amont de Paris): La rn~thode chromatographique utilis~ permet de

990

J. BESSIEREet A. MOXTIEL

'~ flmoranth~ne

b I Chl.b

FLUORESCENCE ( filtre

aI

a2

C~l.a

m

A Aexc.:427 n m

d'$mission

> 470 nm)

bI

aI

Chl.b

ABSORPTION

a2

Chl.a

ra

A A: 6 5 4 a m

Fig. 2, Choix de la d~tection des chlorophyiles aet bet de leurs compost's associes s~par~s par chromatographie iiquide haute prcssion ~ partir d'une m~me injection de 50~1 par comparaison des r~ponses obtenues par fluorescence {excitation427 nm, ~mission 47Onto) et par absorption (654 nm}. Fig. 2. Choice of the detection of chlorophyll a, b and their degradation products ~parated by HPLC demonstrated by comparison of the chromatographic profiles of the same injection obtained first by fluorescence measurement (excitation 427 nm, emission 470 nm) and second by spcctrophotometry {at 654 nm).

separcr de nouvcaux pies (Fig. 5). On note la pr~ence de chlorophylle b et surtout de chlorophylle a en grande quantit& II-2 Mise au point des conditions d'extraction Les extractions /t l'ac~tone & 90% et au n~thanol absolu ont pfi ~tre compar~cs en dosant directement les extraits obtenus, car la r~pons¢ en fluorescence des standards mis en solution & n~me concentration dans dex deux solvants sont identiques. Le rendement de I'extraction & l'ac~tone A 90%, pour l'enscmble des essais ¢ff~tu~s avec des temps de contact inf~rieurs & 4 h (10 rain, 1, 2 et 3 h), ne represente que 50% de calui abtenu avec ie m~thanol a p r ~ 30rain de contact; 30rain ~tant I¢ temps suffisant potir obtenir 100% d'extraction par le n~",hanol (cos 30 rain comprcnant les 20rain 'ailitation aux ultra-sons), Le BaCO3 dispo~ en poudre find sur le fittre en fibre de verre semble donner un rendement K-g~rement inf~ieur (90~/0) clans le cas du m~thanol: la quantit~ de chiorophyll¢ a recueiltie avec les fibres recouverts de BaCOs est l ~ g b ~ w ~ t ir~rieure ~ calle obtenue sans BaCOn. De plus, Iorsque I'on ~tudie le

pic secondaire al, seul reeilcment detectable au cours de ccs essais, et pr~um~ produitde d,~'gtad~tion de la chlorophyll¢ & on obtient les r~sultats dorm,s clans le Tableau 1. Comme les quantit~s de a~ sont plus lmportantes en fonction du temps de contact daus l'extrait filtr~ sur BaCO3, al pourrait ~tre un chlorophyllide a produite par Faction d'un agent basique tel le BaCO3. Avec le DMSO. on obtient un rendemcnt variable et toujours inf~rieur /t l'extraction au m~thanoL Ces faibles renden'~nts s'expliqucnt par les pertes importants incombant, d'une part/* l'~mulsion de t ' ~ e r qui se forme dans la phase DMSO--cau. d'autre part au grand nombre d'~apes de ca protocole (le transfert des pigments du DM$O dans un autre solvant est n~cessaire car le DMSO est tr~s visqueux e:t entra]ne une tr~s mauvais¢ r~solution des pies s'il sert de solrant d'injection), IH C O N C L U S I O N

Le protocol¢ d ~ n i t i f d'extraction et de dosage est ainsi d~'crit.

Methode rapide de dosage s61ectif

I

t flu~ranthbne

t bI

t ChLb

991

t

t

t

a1

a2

Chl.a

Fig. 3. Profil chromatographique (HPLC) d'une solution m6thanolique contenant 10jag de chlorophylle a et 10gg de chiorophylle b 6talons (mires en solution extemporan6e) et addition6e de 80~1 d'un solution de fluoranth6ne/~ 800 mg I- t dans rhexane (s~paration obtenue sur colonne ODS Cts0 61uant: m6thanol-eau {97/3). d6bit: ! ml rain- t d6tection par fluorescence (excitation 427 rim, 6mission 470 nm). Pr6sence de b, associ6 ~ la chlorophylle b et de at et at et az associ6s a la chlorophylle a. Fig. 3. Chromatographic profile of a methanolic solution containing fresh standards: 10~g of chlorophyll a and 10~g of chlorophyll b and 80~1 of fluoranthen solution at 800 rag I-t in hexane. The separation (HPCL) is obtained in ODS Cts column eluted by methanol-water (97/3): flow rate: l ml m i n - t fluorescence detection: excitation 427 nm and emission 470 nm: sample size 50~1. In the fresh standards we note the presence of a compound b~ associated by chlorophyll b, at and a2 associated to chlorophyll a.

Un litre d'eau (volume suffisant si r6chantillon contient au minimum 0,1/~g de chlorophylle a et 1 ~g de chiorophylle b) est filtr~ imm~diatement apr~s pr~levement, sur filtre en fibre de verre de porosit~ 0.45/zm (Whatman). Le filtre est d6pos6 dans un b~cher contenant 5 ml de m6thanol absolu. Le b~cher est plac~ dans un bac A ultra-sons durant 20 rain. /~ l'obscurit6, puis laiss~, toujours /I l'obscurit6 encore 10 min. L'extrait est filtr6 sur fibre de verre (0,45 gm). 3---4ml de m6thanol absolu en 3 ou 4 fractions sont utilis6s au ring:age du b6cher et des filtres et ajout6s/! I'extrait. L'extrait final d'environ 10 ml est addition6 de 80 ~i d'une solution de fluranth6ne /I 8 0 0 m g l - ' clans I'hexane. Cet extrait peut 6tre conserv6 24 h au cong61ateur ( - 2 0 : C ) au dos6 imm6diatment par chromatographie liquide haute pression coupl6e /, un spectrofluorim6tre. La colonne de s6paration de 250 mm de Iongueur et 3 mm de diam6tre int6rieur, est remplie par une phase Spherisorb SSW Phasep, greff6e O D S C~s. Le solvant 61uant est constitu6 par un m61ange m6thanol-eau (97/3) pr6alablement d6gaz6 aux ultra-sons,/l un d6bit de 1 ml rain- ~. L'extrait est inject6 automatiquement sous un volume de 50#!. La longueur d'onde

d'excitation est de 427 nm. Un filtre permet la d6tection des 6mission su~rieures /l 470nm. Les profils chromatographiques sont enregistr~s par un int~grateur qui communique les temps relatifs a r~talon interne (le fluoranth(~ne), et le rapport des aires des pics/l raire du pic du fluoranth~ne. La presence de r~talon interne ~vite r6talonnage de rappareil ~ chaque s6rie de dosages. Iv DISCUSSION La m6thode raise au point permet un dosage rapide (20 rain), s61ectif et sensible des chlorophylles a et b; ce dosage est rendu automatique grlce /~ un passeur d'6chantillons. Cette m6thode peut aussi permettre I'identification d'autres pigments. La s~paration par chromatographie liquide l'mute pression a pu mettre en 6vidence la puret6 relative des chlorophylles a et b, standards du commerce. La gamme d'6talonnage faite en pr6sence de fluoranth6ne permet d'6viter cet 6ialormage/l chaque s6rie de dosages, avantage consid6rable par rapport aux autres m6thodes par chromatographie iiquide haute pression d6crites par Shoaf (1978) ou Rebeiz et al.

~9-'

J. BESSIERE et A,. MONTIEL

t flum'a~h~ne

t tt Chl.b

a I a2

:hl.a

Fig. 4. Profilechromatographique (HPCL) d'un extrai!n~thanolique d'une culture en phase logarithmique de croissance de Scenedcsmus subspicarus (I,5 x IOT cellules)additionE de 80#I d'une solution h g00 m g I" i de fluoranthEne dans l'hexane.S~paration obtenue dans les conditions identiqucs/tla Fig. 3. Fig. 4. Chromatographic profile(HPLC) of a methanolic extract of a logarithmic growth culture of S('enedesmus subspicutus {1,5 x I0 ~ cells extracted): addition of 80~I of fluoranthcn solution at 800 m g I- J in hexane {separation obtained in the same conditions as Fig; 3).

. . . . .

i

f|~rlmtblme

t

t

Chl,b

sI

s2

Chl.a

Fig. 5. Profil chromatoip'aphiquc (HPLC):d~unextrait ~ h a ~ i i q u e de phytoplancton d ; . u doucc (1 [. d,eau de Seine pr~lev~ ~, Orly en Oclobre 19i~0}a ~ i t i o ~ de 80#I d'un¢ sotu|ion de fluoranthth~e 800 mg [- 'dans rhexane (s~paration obtcnue Sur ~|onM ODS C~,~l~t-m~th~mol~u ~(97/3)). d~biz: I ml rain-', d~t~ion:~r ~ (¢xCits~on ~'~:nm./mziss/on 470 nm). Fig. 5. C h r o ~ a p h i c profi~ (HPLC) Of a ~ I / c extract of:freshwaier~phyZoplankton (I I. sampled at Orly in October 1980). Addition of fluorant~n solution and separation made in the same conditions as Fig. 3.

Methode rapide de dosage selectif Tableau I. Teneur en at dans l'extrait m~thanolique exprim~ en aireat/aire Temps de contact du fluoranth~ne total Avec BaCO3 Sans BaCO3 30 rain I h 20 min 2 h 20 min 3 h 20 rain

0 0,064 0,137 0,217

0 0

0 0,141

(1978), &ant donn&~ la d~gradation rapide des solutions de chlorophylles n~anmoins conserv&s ~. --20°C. Cet ~talon interne limite de plus les erreurs d'injection et ~vite les remises ~ volume des extraits.

Cette m~thode permet I'utilisation du m&hanol absolu, solvant d'extraction plus performant que l'ac~tone ~ 90%. Le travail actuel n'a pas encore permis d'identifier les diff&ents pies recontr~s, associ~s aux t~moins (bl, al, a2), et ~galement presents dans les cellules en culture (Scenedesmus subspicatus), et dans des ~chantilIons phytoplanctoniques naturels. Cette d~termination qualitative semble nc~cessaire de par leur presence quasi systematique. On devra, de m~me, envisager l'identification des diff&ents pies, correspondant :1 des compos~s fluorescents, presents darts bon hombre d'extraits de populations algales naturelles, On peut d~j~. ~noncer la pr~somption scion laquelle certains de ces compos~s/l temps d'~lution tr~s courts (3-4 rain), seraient des chlorophylles ct et c2. BIBLIOGRAPHIE

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