Utilisation de la chromatographie liquide haute performance pour la caractérisation et le dosage des principaux alcaloïdes du Papaver somniferum L

Journal of Chromatography,268 (1983) 125-130 Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam - Printed in The Netherlands CHROM. 15,995

Note

Utilisation de la chromatographie liquide caract6risation et le dosage des principaux niferum t*

haute performance pour ia alcaldides du Papswer SOM-

MICHEL HUTIN* et ANDR& CAVl? Luboratoire de Pharmacognosie, ERA 317 CNRS, Facultk de Pharmacie, 92290 Ctitenay-Malabry (France) et JEAN-PIERRE FOUCHER Luboratoire de Pharmacognosie, FacultP de Pharmacie, 14032 Caen Cedex (France) (R-u le 1 mars 1983; manuscrit modi% req~ le 18 mai 1983)

et le dosage simultanb des 6 alcalo’ides majeurs de Pupaver -morphine, codeine, thkba’ine, papadrine, noscapine et narcCine-- dans des extraits vegktaux, des prkparations pharmaceutiques ou des milieux biologiques est d’un grand int&t en pharmacognosie, dans l’industrie du mbdicament et en toxicologic. A notre connaissance il n’existe pas de mhthode rkllement spkifique, fiable et rap& permettant d’obtenir cette identification et ce dosage. La chromatographie en couche mince (CCM) permet l’identification’ et le dosage2 .de ces alcalo’ides. Malheureusement c’est une mbthode peu sensible rendue de surcroit peu reproductible par la sCrie de manipulations qu’elle demande. Malgrk cela, certains auteurs3 l’ont prtfkrke I la chromatographie en phase gazeuse (CPG) qui n’est utilisable que sous certaines conditions et limit&e & certains alcalojides4-7. La chromatographie liquide haute performance (CLHP) semble Ctre une mkthodologie de choix pour identifier et doser les alcaloTdes majeurs de P. somniferL’identification

somniferum L (Papaverackes)

zfm.

Depuis 10 ans de nombreux travaux ont Ctk rkalisks mettant en oeuvre des dparations par adsorption+13, partage14-16, appariement d’ions17-20 et Bchange d’ions21-23. Pour notre part IIOUSproposons de nouvelles techniques qui permettent l’identification et le dosage des 6 alcalo’ides majeurs de P. somnzjh.un. L’une d’elles -chromatographie de partage en phase inverse- est utilisable pour les 6 alcaloIdes simultankment.

l Une partie de ce travail a 6t& p&en& aux Joum&es de Chromatographie Liquiuk Haute Performance, Facult& de Mkakcine de Bichat, 8 et 9 juin 1982.

0021-9673/83/$03.00

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1983 Elsevier Science Publishers B.V.

NOTES

126 PARTIE EXPeRIMENTALE

MatCriei

Pompe 6000A ou pompe M45 Waters; injecteur U6K jection Rhtodine 7010 (20 ~1). Detecteur M440 Waters a 280 nm; programmateur de colonnes Waters de 30 cm x 3.9 mm I.D. garnies de PPorasil precolonne remplie de silice II Merck (phase normale) ou Merck (phase inverse).

Waters ou boucle d’ingradient M660 Waters, ou de PBondapak C1s; de LiChroprep RP-18

Conditions opkratoires de chromatographie

Detection a 280 mn; debit 2 ml/mm. Adsorption sur silice en isocratique. Phase mobile: hexane-dichloromCthane

ethanol absolu-triethylamine Adsorption

(300:60:60:20).

sur silice

avec gradient

d’..lution. Phase mobile: solvant A: hexanedichloromethane-triethylamine (300:60:20). Solvant B: ethanol absolu. Programmation lineaire de 2 a 50% du solvant B en 16 min. Partage en phase inverse. Phase mobile: eau distillteac~tonitrile-triethylamine (40:60:0.1). Partage en phase inverse avec appariement d’ions. Phase mobile: eau distill&emethanol-acide ac&ique (56:44: 1) acide heptanesulphonique (Pit B,) Waters tel que 0.005 M.

I

min

5

m

.

.

I

0

Fig. 1. Sbparation des alcaloides par adsorption isocratique en phase normale. 1 = Noscapine, papavkrine, 3 = thkba’ine, 4 = cod&e, 5 = morphine.

2 =

NOTES

127

PrPparation des solutb Les tchantillons a etudier sont, lorsque cela est possible, mis en solution dans la phase mobile. Dans le cas contraire on procede a une extraction des alcaloides totaux. Si besoin est, on peut s&parer les alcaloTdes en prod&s phtnoliques et produits non phenoliques. Les alcalo’ides totaux sont obtenus selon le schkma extractif suivant: epuisement dans un Soxhlet d pH alcalin par le chlorure de mtthyltne; extraction de la phase organique par une solution d’HCl(1 IV); extraction de cette phase aqueuse par le melange chlorure de mtthylene-isopropanol (3:l) apres alcalinisation par l’ammoniaque; la phase organique obtenue, &h&z sur Na2S04 anhydre laisse apres tvaporation sous pression rcduite, le residu d’alcalo’ides totaux. La separation des alcalo’ides ph&oliques et non phenoliques est effectuee a partir des extraits alcaldidiques totaux. On effectue une separation liquide-liquide entre l’ether et la soude normale. Les alcalo’ides sont r&cup&-es de facon classique, alcalo’ides non phtnoliques $ partir de la phase etherBe, alcaloides phenoliques d partir de la phase NaOH 1 N. RhULTATS

ET DISCUSSION

Chromatographie d’acisorption en phase normale A notre connaissance aucune des techniques chromatographiques de&es dans la litttrature ne permet, par CLHP en phase normale, d’identifier simultanement les 6 alcalo’ides de P. somniferum8-11. Nous presentons ici deux techniques de separation: la premiere, isocratique permet l’identification de 5 alcalo’ides, et la deuxiime, avec gradient d’blution permet d’identifier les 6 alcalo’ides. Technique isocratique (Fig. 1). La resolution des 5 alcaldides Clues est t&s satisfaisante. La force tluante de cette phase mobile ne permet pas l’elution de la narceine qui est trop polaire. En utilisant une phase mobile de force Cluante moindre (sans ethanol absolu -on obtient une meilleure separation des 3 premiers alcaldides et leur dosage est alors possible). Technique avec gradient d’klution (Fig. 2). Ziegler et Beasley1**13 ont d&it en 1975 la separation des alcalo’ides de P. somniferum en utilisant un gradient d’tlution en phase normale. En nous inspirant des conditions de separation isocratiques que nous avons d&c&es plus haut, nous avons augment& la force Cluante en utilisant un gradient d’elution d’ethanol absolu. La resolution des 3 premiers alcalo’ides ilues (noscapine, papadrine et thdbaYne) est moins bonne que celle obtenue par la technique isocratique, mais la separation des 3 derniers alcaloMes 61ds (codeine, morphine et narc4ine) est excellente. Un large exds de morphine, comme c’est le cas dans les alcalo’ides totaux de paille de pavot, ne perturbe pas la separation des autres alcaloJdes. Chromatographie de partage en phase inverse (Fig. 3) Parmi les techniques d&rites utilisant la CLHP ce sont celles de Wu et Wittick14, de Nobuhara et al.ls et de Pettitt et Damon16 qui semblent les plus interessantes. Jamais encore, $ notre connaissance, une technique d’identification des 6

NOTES

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\

i I

min

15

I

I

I

I

I

10

.

.

.

.

I

5

.

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.

.

\

0

Fig. 2. Sparation des alcaloiddes par adsorption avec gradient d’klution en phase normale. 1 = Noscapine, 2 = papavkrine, 3 = &bake, 4 = cod&e, 5 = morphine, 6 = narckine.

alcalo’ides majeurs de pavot n’a et6 proposee. La technique chromatographique que nous proposons est Bgalement applicable au dosage de ces alcalo’ides. L’identification des alcaloi;des est aisle, mais cette technique semble devoir ttre reservee a l’identification d’un ou de plusieurs de ces alcalo?des plutot qu’a I’analyse d’extraits bruts de plantes. En effet, les pies ont des temps de retention trts proches, et si un alcalo’ide est tr&s majoritaire (morphine dans P. somniferum ou thebake dans P. bructeatum) l’identification des autres alcalo’ides devient impossible. Cette methode est applicable au dosage des alcalo’ides mais il faut que l’alcaloide que l’on dose ne soit pas masque par un autre alcalo’ide present en quantite beaucoup plus importante. Chromatographie

en phase inverse en appariement d’ions (Fig. 4)

Jusqu’a ce jour aucun auteur n’a d&it de technique chromatographique

d’ap-

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NOTES

2

1

J

5-

min

0

min

10

0

5

Fig. 3. Skparation des alca.ldides par partage en phase inverse. 1 = Noscapine, 2 = papavkine, thkba’ine, 4 = codkine, 5 = morphine, 6 = narckine. Fig. 4. Stparation des alca.loYdespar appariement d’ions. 1 = Noscapine, 2 = papavkine, 4 = codkine, 5 = morphine, 6 = narckine, 7 = kryptopine.

3 =

3 = thkba’ine,

pariement d’ions permettant la separation des 6 alcaloides nous intkressant. Les principaux travaux decrivient: soit des techniques d’identification d’alcaldides de l’opium ’ ’ ou des alcaloides morphiniques et de leurs derives synthttiquesla, soit des techniques de dosage d’un seullg ou de quatre alcaloides en melange (morphine, codeine, noscapine et papaverine)20. La technique de chromatographie que nous utilisons nous permet de s&parer et de doser les 6 alcaldides majeurs de P. somniferum ainsi qu’un alcaloide mineur de P. somniferum: la cryptopine. La resolution est satisfaisante mais ici encore la presence dune quantite trop importante de morphine g&e le dosage de la codeine. Pour eviter ce phenomene de masquage nous proposons l’extraction de la morphine par formation d’un phtnate en presence d’une solution aqueuse de soude. Ainsi on peut doser la morphine dune part et les alcaloi’des non phenoliques d’autre part. CONCLUSION

Les methodes propostes,

fondles SW des principes differents, adsorption,

par-

130

NOTES

tage, appariement d’ions sont tout $ fait adapt&es $ la caracterisation simultanee des principaux alcalo’ides du P. somniferum. Elles sont Cgalement utilisables POUF le dosage de ces alcalo’ides. La plus grande precision pour le dosage de la morphine, de la codeine et de la thebame est obtenue par les techniques d’adsorption et d’appariement d’ions. Pour la papaverine et la noscapine, la technique de partage donne les meilleurs result&s. Pour la narckine, la technique d’adsorption avec gradient d’elution est la plus satisfaisante, bien que le risque de d&activation de la phase stationnaire ne soit pas negligeable (presence d’une precolonne indispensable). Dans ie cas ou la morphine est tres majoritaire, une separation prealable des alcaldides non phenoliques amkliore la precision des dosages. BIBLIOGRAPHIE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B. F. Engelke et P. G. Vincent, J. Ass. Off. Ad. Chem., 62 (1979) 538-544. N. Y. Mary et E. Brochmann-Hanssen, J. Nut. Prod., 26 (1963) 223-228. M. Paris, J. P. Gramond et R. R. Paris, Ann. Phczrm. Fr., 32 (1974) 97-102. E. Brochmann-Hanssen et T. Furuya, J. Phdrm. Sci., 53 (1964) 1549-1550. E. Brochmann-Hanssen et A. Baerheim Svendsen, J. Pharm. Std., 52 (1963) 1134-l 136. G. Fischer et R. Gillard, J. Pharm. Sk., 66 (1977) 421423. J. W. Fairbairn et K. Helliwell, J. Pharm. Pharmacoi., 27 (1975) 217-221. D. W. Smith, Th. Beasley, R. L. Charles et H. W. Ziegler, J. Pharm. Sci., 62 (1973) 1691-1694. P. G. Vincent et B. F. Engelke, J. Ass. Ojic. Anal. Chem., 62 (1979) 31&314. R. Verpoorte et A. Baerheim Svendsen, J. Chromatogr., 100 (1974) 227-230. J. W. Fairbairn et M. J. Steele, Phytochemistry, 19 (1980) 2317-2321. T. H. Beasley, D. W. Smith, H. W. Ziegler et R. L. Charles, J. Ass. Ofic. Anal. Chem., 57 (1974) 8590. H. W. Ziegler, T. H. Beasley et D. W. Smith, J. Ass. Ofic. Anal. Chem., 58 (1975) 888-897. C: Y. Wu et J. J. Wittick, Anal. Chem., 49 (1977) 359-363. Y. Nobuhara, S. Hirano, K. Namba et M. Hashimoto, J. Chromatogr., 190 (1980) 251-255. B. C. Pettitt, Jr. et C. E. Damon, J. Chromatogr., 242 (1982) 189-192. I. Lurie, J. Ass. Ofl Anal. Chem., 60 (1977) 1035-1040. C. Olieman, L. Maat, K. Waliszewski et H. C. Beyerman, J. Chromatogr., I33 (1977) 382-385. E. J. Kubiack et J. W. Munson, J. Pharm. Sci., 69 (1980) 152-156. W. Lindberg, E. Johansson et K. Johansson, J. Chromatogr., 211 (1981) 201-212. J. H. Knox et J. Jurand, J. Chromatogr., 82 (1973) 398401. S. H. Hansen, J. Chromatogr., 212 (1981) 229-233. L. W. Doner et A.-F. Hsu, J. Chromatogr., 253 (1982) 120-123.