Microdosage colorimétrique de la cystéïne et de la cystine

ANALYTICA

CHIM ICA ACTA

249

MICRODOSAGE COLORIMI?TRIQUE DE LA CYSTg.jiNE ET DE LA CYSTINE 1’.DU130UIaO%,

J. FONDARAI

Fa.xtZlCde M&Zeci?ie. LttDovitloire (1hp.t

ET I<. I’AVOSl~-~lr\RVII,I,I~

tic I’lt~siqtte-i~iologiqtre.

Ic .+ Scptcmbrc,

Mcrrseillr

(Fvrittcc)

1961)

Nous avons et6 amcnh A Ctudicr une mdthodc dc dosngc de la cyst&ne ct dc la cystine qui pcrmctte son cmploi en milieu biologiquc. Elk a commc caract&es cl’nboutir h unc rchction color& SC pr&nnt h un dosage photomCtriquc dans le spectre visible; cl’Ctrc facile il mcttre en ocuvrc, ct clc poss&der une bonne sensibilitk Nous nc dkrirons ici que lx tcchniquc utilish pour Ic dosage en solutions purcs. PRINCIPE

La tl~iofluorcsc&hc (Tl;) cst un rckctif quc nous avons clc!jA utilis6 pour lc closngc dcs perosydcs lipicliquesl*” car elle a la propriM d’&tre blcue cn solution alcaline et de SC dholorer sous l’influence d’un agent osydant tcl que l’iodc. On obtient lc mc’mc effct par l’osyg&nc molGculairc sous l’action d’une forte liimih-e. Cette dkoloration tracluit t&s probablcmcnt l’osydation dc?sgroupes -SH de la &

0.6

pg cystlnc

Pig. f. 0 I’oints obtcnus avcc unc solution dc 1’I: nyilnt, avant dhh-xation, unc clcnsitG optiquc dc 5. x Points obtcnus avcc unc solution de TF ayant, avant d&coloration. = zcm. unc densit optiquc 3.2 = 5850h;l Anal.

Chim.

Ada.

26 (1962) 249-252

I’. 13UI3OUI.O%,

250

J,

l:ONI>AR~41,

Il.

PAVONE-MARVILLE

molhllc de TF. En milicu acidc, dcux ntomes cl’iode dkolorcnt cluantitativemcnt unc molki~lc de pigment. I)ans ccrtaincs conditions, ccttc rkction est r&xsihle sous l’action d’un exc&s de --SH. Cc phrklomtinc cst certainement complese. Nous nous contcntcrons grotipes sans proposer les diverscs hypothbes qui pcuvent dc prbciscr les points suivants, lcs cspli(lucr. (u) Sculc la d&zoloration par In lumi&rc donne un compos6 qui SC recolore sous l’action dcs groupcs ---SM. clue nous avons essay& sont actifs; SH2 en (A) Tous les porteurs dc groupcs -SH cyst&ne, glutathion, cyst&amine, SH prot&iqucs. Mais la cow-be milieu ;ilc:ilin, spcctrxle clu composd color6 n’est pas csactenient iclcnticluc h ccllc de la ‘TF; elle vnric cluclque pcu, soit avec lc corps r&luctcur, soit avcc la tcmp6rnturc A laquclle se procluit la rckction. (c) 11 s’agit cl’une r&xtion &luilibr6e, et incompl&tc s’il n’y a pas un t&s gros La courbe cxprimant la concentration de la forme esc&s dc groupcs r~ductcurs. color&, en fonction dc la quantit6 clc sulxtnncc rbductrice, est complcxe (Fig. I). Ellc prf%cntc h son originc unc inflesion clui 0lAigc r‘radapter Its qunntit& de rcktif & l’orclrc tic grandcur p&urn6 de la cyst&inc h closer*. Lc principe de la tcchniquc cst rlonc lc suiwnt : 011 tl~colorc pw la liimi&re unc solution alcnlinc clc ‘IT. On iiitrocluit le corps h closer. On ;w2lhrc! la r&duction par un chauffagc convennblc, ct on mcsurc la coloration obtcnue h 5850 A.

Ic chlorurc tic fluorcsc&inc par Now l’avons incliquk pr&klcmmcnt~ : 011 tlXitC NxSI-I CII solution alcoolicluc. Quclqucs modifications rcndcnt ccttc pr4paration plus ais&. 1.~ chlorurc tic fluorcsc&inc cst i~CtUC!ll~lllf2llt un procluit commercial**. II cst n&xssairc de lc purifier on Ic hvxnt, cn colonnc, par clc la potassc alcoolicluc, et de Ic rccristnlliscr tl;ux Ic chloroforme. Lc chlorure, unc fois purifi&, tloit brc: R peinc colord. A I g clc dichlorurc de fluorcsc6i’nc on njoutc unc solution tic NaSH obtcnue en faisnnt barbottcr pcnclant 3 11 clu SH:! clans IOO ml d’&hanol oil l’on a dissous I g de soclium. On fait bouillir h rcflus pentlxnt 30 min. Iail solution clcvicnt cl’uii blcu intense. Aprb rcfroiclisscmcnt on ncutrnlisc par CHnCOOH. Lc prkipitc! form6 cst lilt& rnpiclcmcnt au lL!lltlilllt plusicurs pt$parirtiorls clc cc procluit, **

NOUS awns

utilid

pnrIaitcmc:Ilt Ic protluit

cristallisdcs, ant donnd cxactcmcnt livr6 l>;lr la firrnc 13. D.l-I.

la niihc

courbc.

MICRODOSAGE

recueille les cristaus sous vidc. Prkfiaratio?~

DELACYSTsk'iNE

jaunes pAles qui, s&h&,

ET DE

LACYSTINE

sont conservCs

251

dans de petits tubes

des rt!actifs

(a) Sohtion de lhioflzcorescdi’ne. On rklise une solution de thiofluoresc&ine clans 1’acCtate d’&hyle ZLenviron 2 mg/ml. Cettc solution doit c?tre conservCe A la glacike. A une certaine quantit6 de tampon phosphate PH 8, 0.1 ikf, on ajoute une quantitd de solution dc TF telle clu’apr&s dilution au r/5 elle prc%ente unc absorption convenable et dont nous pr&ziserons plus loin la valcur. Puis on ddcolorc cettc solution par esposition h la lumic’re cl’unc lampe de xoo \Y A 15 cm. (Dur6e 15 min environ). (6) SoLMiolt de borate de sodium, 0.2 M. (c) Sohtion d’acide boriqrre el de KCI, l’un et I’autrc 0.2 ilf. (d) Sohtion cyanurde. On fait unc solution avcc: ICCN 130 mg, et solution borique ci-dessus : IO ml. (e) Sol,lrtion de cystine h 0.500 mg/ml qui scrvira cl’&alon. La cystinc cst dissoute dnns quelques gouttcs d’HC1 environ 4 N. On compktc par cle l’eau distill&. La solution est stable. Cortdtcite

du dosagc

(a) Dosage des SH (cysteiize). Ihns 1111tube A cssai on introcluit successivement: ml de la solution tl’acitlc boricluc, 1.2 ml de borate de Na, I ml de la solution :L closer, contcnant cntrc o.01 ct 3 pmolcs, ct 5 ml de solution clc thiofluorescc%nc d&.zolor&2. Commc nous l’nvons dit, la courbc cl’&alonnngc prCsentc unc inflesion h I’originc, qui rencl inccrtaincs les mesurcs portant sur clc t&s faiblcs quantitks de cyst&w (inf&icurcs r‘L5 ,ug ). On rend ccttc inflcsion n@ligcable cn operant avcc unc solution clc TF peu conccntr&. 11 y a avantage au contraire h utiliser une solution conccntr6c si lcs quantitck pr&umdes de cyst&inc sont sup&ieures. Dans lc premier cas (k-&s faibles concentrations) on utilisera une solution de TIT qui, avant cl&zoloration, aura unc tlcnsitC optiquc, mcsur6c B 5000 A, sous f cm, apt-& dilution au x/5, dc l’orclre de 0.5 h 0.0. Dans lc second ens on acloptera un r&actif ayant unc clcnsit6 optique dcus h trois fois plus forte. Nous utilisons comme tdmoin une solution de cystine, qui cst parfaitcment stable: on la traite par KCN pour la transformer, mol&.xlc h mokulc, en cyst&ne, scion le moclc oplcratoirc intliqu6 ci-apr6s. On dressera, pour chaquc dosage, unc courbc cl’btalonnage avcc 4 h 5 thmoins ZLclcs concentrations convcnablcs. La recoloration cst lentc. On peut selon lc liquicle i &uclier, soit abandonner la rdaction A clle meme pendant 15 11au rkfrigckateur A 4O; soit chauffer 30 min au bain mark h 50~ ,- soit op&-er h 70~ pendant 4 min. Au bout cle cc temps on rcfroidit, ou on rckhauffe, les tubes cn les plaqnnt pendant 15 min clans l’cau & la tempbrature clu laborntoirc. La lecture cst faite ensuitc au spcctrophotomQtre. 13icn que la courbc ait un masimum tr& arrondi, nous prenons habitucllcment trois points: 5800, 5850 et 5900 A. Un photom&tre B filtre donnerait probablement clcs rkultats satisfaisants en rnison prkis6ment clc la grande largeur de la bande. I1 y a avantage, surtout pour les faiblcs quantitk de cyst&ne, & opcker dans unc cuve dc 2 cm cl'dpaisseur. Le coefficient d’estinction sp&ifique varie un peu nvec la prhparation de TF, et a 1.2

flm4l.

Chinr.

Acla,

2G

(rgG2)

249-252

I’. I)UI3OIlI.OZ,

252

tcndance B climinuer lorsqu’elle clcnsit& optiqucs par o. I pmole

J.

FOXDARAI,

R. PAVONE-MARVILLE

vieillit: c’est pourquoi un Ctalon est nCcessaire. Les cle cyst&he (soit 12.1 pg) sous 2 cm, sont clc l’ordre de

0.15. (b) Dosrcges des SS (cyslinc). I)ans un tube 2Lessai on introduit : 1.2 ml de solution d’acicle boriquc, 0.4 ml de solution de borate de sodium, 0.8 ml de solution cyanurde, I ml de solution h closer contenant entrc 0.0x ct. 2 pmoles dc SS. Dans un second tube on introcluit lcs memes rdactifs, mais on rcmplace la solution dc cystine par I ml d’eau. Cc tdmoin cst nkcssairc, car KCN provoquc unc lr$+re coloration cle la TF oxycl&e. On lake IO min ZLla temphature du laboratoire puis on dose comme cidcssus. 13ien entcnclu apr&s action cle KCN, un groupe SS cst closc2 commc un scul groupe SH. Plusieurs centaines de closages effcctuf% avec cette mhthoclc ant montrd sa granclc scnsibilitk Son utilisation en milieu I~iologiquc, qui n’a pas &t& cl&rite ici, montre nhnmoins clu’clle n’cst influench, ni dans un sens ni dans l’autrc, par d’autrcs acidcs amink ou par les drkivc% osyghk dc la cyst&w. La m&hodc pamit clone assez spckificlue clcs groupes SH et SS. Lcs thctifs, in l’esccption clc la solution de KCN qui cloit Btre rcnouvclh journellcmcnt, SC cowervent bicn. Elk cst done cl’un maniement ais& ct rapiclc. Nous cn avons prkis6 Iit technique dans 1~ ens de Ia cyst&nc et dc la cystinc. Mais il est vraiscmhlablc qu’clle pourrait Gtrc snns clifficult6 &endue aux autrcs mol&zulcs poss6dant dcs groupemcnts sulpliydrylcs.

f..rr.thiofluorcscdi’nc -SI-1. 011 pcut par l’orclrc clu clixibic

ci~colordc Cc’

11loycn

tic pmolc.

!a llJJlli&rc cn llli~icu closer coloriiiiblric~uciii~Jlt

par

iddin,

SC

rCc(Jhx2

clcs quantitbs

clcs &pllpcs ct tic cystinc clc

sf111H 1’aCtiOn

clc cysldlnc

‘I’~lioflllorcscciil is I~lc;rcllc:tl in alkdinc rnrdium IN light but reforms ita colour on reaction with --SIi jircjups. This can Iw uwcl for the colorinictrL2 dctcrmination of cystinc and cystcinc in the in icroiwdar rwigc.

‘I’l~ic~fl~lc)rcscciri wirtl in alkulischcr lAOsung tlurch IAichtcinwirkung cntfiirbt. Durch I-IS-Gruppcn wircl wicclcr I~arl~l~ildiin~ wrurs;rcllt. bicsc 15igcnwchnft clcr IIS-Gruppcn wircl zur Ucstimmung VOll

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