Mouvements de cholesterol in vitro entre les α- et les β-lipoproteines plasmatiques du rat et entre chacune d'elles et les globules rouges

110 BBA

BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

55966

MOUVEMENTS

DE CHOLESTEROL

/!?-LIPOPROTEINES D’ELLES

PLASMATIQUES

ET LES GLOBULES

F. D’HOLLANDER

ET

Labordoive

de Physiodogie

(Repu k 23

aot-lt,

IN ‘VITRO ENTRE

LES a- ET LES

DU RAT ET ENTRE

CHACUNE

ROUGES

F. CHEVALLIER de la Nutrition, Faculte’ des Sciences, 9x-Orsay [France)

1971)

SUMMARY

After administration of [4-Wlcholesterol to rats, blood was obtained and eventually the labeled plasma subdivided into a- and @-lipoprotein classes fd > 1.063 and d < 1.063). Incubation of plasma, or of a- or ~-~~~oteins with unlabeled erythrocytes, was performed at 37” for 7h or less. The changes in free and esterified cholesterol content and specific activity were studied, On the basis of these data, models of exchange were proposed, and checked by analogue computer. I. Incubation of a-lipoprotein solutions in the presence of erythrocytes, results, first, in exchange of free cholesterol and, second, in a net ioss of erythrocyte cholesterol (42%) which is related to an increase of free and esterified cholesterol in the cr-lipoproteins. From the isotopic results, it is calculated that 80% of cholesterol which become esterified derives from cholesterol lost by erythrocytes, and only 20% from a-lipoprotein-free cholesterol. Similar observations can be made about @poproteins during their incubation with erythrocytes, but the changes are smaller. 2. The fitting of the experimental curves, by analogue computer, is performed varying the value of the exchange rate of free cholesterol, and that of the partition coefficient in relation with the esteriiication pathway. The rate of exchange, determined by this method, is not constant during the course of incubation. Considering I g of red cells, the rate decreases from 0.029 to 0.007 mg/h in the case of cr-lipoproteins and from 0.024 to 0.019 mgjh in that of ~-~~proteins. The repartition of the amount of cholesterol esterified by the way of erythrocytes or lipoprotein cholesterol, calculated from isotopic results, is close to that obtained by analogue computer. 3. During short-time incubation of plasma (2 h), the newly formed cholesterol esters are associated only with the a-lipoproteins. The rate of exchange of free cholesterol between a- and &lipoproteins is about 0.06 n&h in I g of plasma. Furthermore, the results suggest the occurrence of exchange of ester cholesterol. 4. Finally, dialysis carried out at 5” before incubation is followed by a net esterification of only a-lipoproteins (37 %).M oreover, addition of erythrocytes to a Biochim. Biophys. Acta,

260

(1972)

110-132

MotfvEMEMTSDE CEOIESTEROL

III

sduti~n of a-lipoproteins results in a picking up af free cholesterol by the erythrocytes. This phenomenon iS not so obvious in the case af @-lipoproteins. All these results are discussed keeping in mind the heterogeneity of isolated lipoprotein fractions.

INTRODUCTION

Des &changes de cholesterol libre entre les diff&entes lipoprot&nes piasmatiques ont et& maintes fois mis en &idence an ~&a~-~, comme ia vi&oQa.Cependant, aucune valeur de leur vitesse n’a &5 avan&. Les auteurs ont seulement calculi! soit des taux horaires, soit des pourcentages d’&hanges. 11 en est de m&me pour les &changes entre les globules rouges et chaque lipoproteine. lci, encore, seuls des paurcentages ont t%tE: estimes et compares entre euxa*6*?. Des Bchanges de cholesterol ester&! entre les lipoproteines plasmatiques du singe ont et6 observes ilz vivo et in vitro&p6. Mais, d’autres auteurs ont constat& l’absence de tels echanges entre les lipoproteines de l’homme et entre celles du rata+. Le but du present travail est d’dtudier ilz V&O les mouvements de cholesterol entre les differentes lipoproteines plasmatiques du rat et entre chacune d’elles et les globules rouges. Ces premi&res don&es nous serviront dans une etude ult&ieure, du meme type, concernant le sang entier du rat. Au cows de ces etudes, la preservation du materiel biologique a &te une prB occupation constante. Ceci nous a conduits a prendre de nombreuses precautions et entre autres EL n’entreprendre qu’une ¶tion Grnentaire des lipoprot&nes dont la critique sera d&elopp&e ci-dessous. TECHNIQUES

(A) Collecte ah sasg Le sang est recueilli sur des rats Wistar ad&es par ponction de I’aorte abdominale a l’aide d’une seringue h6parinCe, refroidie 1 5”. Suivant les besoins exp&imentaux, la collecte est effecttree sur un ou plusieurs rats. De mCme, a certains d’entre eux, on a administre, au prealable I yCi de [4-l%Jcholest&ol par injection iutrap&itoneale.

Nous avons utilise une technique inspiree de celle de FREEMANet ~4.~.Le plasma est &pare des hhmaties par centrifugation de 0.5 h & 2200 x g et & 5”. Retire par aspiration, il est ensuite centrifuge (Spinco mod&le LS 50) pendant 24 h P 100000 xg (Rotor 40) et & 5*, dans des tubes en nitrate de cellulose (g ml par tube). Cette operation se deroule dans un milieu de densite 1.07 (obtenu par addition dune solution de NaBr et de NaCl de densit 1.182) et en presence de versenate de sodium. Par un orifice pratique au fond du tube a l’aide d’une aiguille, on collecte 7.5 ml de solution. Le reste est recueilli par Ccoulement, grattage et riucage du tube. Par commoditt[t, on dknommera les lipoproteines contenues dans les deux fractions successives, les a-lipoprottsines (a” > r.o63) et les @-lipoprotf5ines (d =z x.&3). Les fractions ainsi collect&s dans 2 exp&iences dif&entes ont &e analystles par

112

F. D’HOLLANDER, F. CHEVALLIER

blectrophorese sur gel de polyacrylamide (tampon Tris-glycine, pH 8.9). Les lipides ont CW rev&% selon la technique dite de “pre-coloration”, proposee par MC DONALD ET RIBETR~~~,avec le Noir Soudan dissous dans ~~thyl~ne-glycol. L’intensite des bandes a &C lue sur un appareil Vitatron. Ces dernieres analyses ont &? executees dans le Laboratoire du Dr. Infante. (C) Incubation Afin d’utiliser un materiel biologique aussi int&gre que possible, hematies en particulier, les incubations ne sont conduites que pendant 7 h au maximum. Les prelevements sont espaces de 0.75 ou I ou 2 h selon les cas. Ces courtes durees d’observation permettent de saisir les composantes rapides des mouvernents de cholesterol. On utilise un bain d’eau thermostat& en general P 37”. Lorsqu’il s’agit du plasma seul, l’incubation est realisee dans un erlenmeyer bouche a co1 long. 11 contient un volume de plasma tel qu’on puisse en prendre 12 ml a chaque prelevement. Le recipient est completement immerge dans le bain ce qui minimise la condensation d’eau sur ses parois. 11est soumis Qune agitation moyenne. Lorsque l’exprkience requiert des globules rouges, et soit des a-, soit des /I-lipoprotbines, celles-ci sont au prealable dialysees. Cette operation est effectuee a 5” avec un melange tampon (pH 7.5) isotonique au plasma, pendant 24 h et renouvelt! plusieurs fois. La composition du melange est la suivante: 50% NaClo.16 M (g g/l), 50% d’un tampon phosphate 0.16 M constitue de phosphate monopotassique (13 parties) a 21.7 g/l et de phosphate disodique (87 parties) a 57.3 g/l. Les lipoproteines sont ensuite incubcks en presence de globules rouges. On utilise plusieurs tubes, chacun correspond a un temps de prelevement. Les tubes sont bouches et immerges dans le bain. Chacun d’eux contient environ 15 ml du melange hematies-solution lipoproteique. L’htimatocrite initial est mesure. 11est compris entre IO et 15. Lorsque les tubes sont retires du bain-marie, I’hematocrite est it nouveau mesure pour suivre les Cventuels mouvements d’eau entre hematies et solution lipoproteique. Ceci permet de faire les corrections qui s’imposent sur les concentrations en cholesterol de chaque milieu. Les hematies sont &par&es de la solution lipoproteique par centrifugation de 0.5 h a 2200 xg et a 5”. Chaque milieu (hematies et lipoproteines) est recueilli dans un recipient tare, puis pese. Dosage et mesure des radioactivitb Les techniques appliquees ont BtCprecedemment decritesrl. Les concentrations sont exprimties en mg de cholesterol libre ou estkifie par g d’hematies ou de solution ~~prot~ique. On calcule ensuite ces concentrations en mg par g de melange a l’aide de la valeur de I’hematocrite et d’une correction de den&c! pour les hematies. (0)

MOUVEMENTS DE CHOLESTdROL (A) RRSULTATS (I) I~c~~atio~s de sohtions d’a-~ip~rot~ines en @hence d’hhaties A la fin des incubations on constate generalement une augmentation de l’hematocrite qui ne depasse jamais quelques pour cent. Cette variation traduit un passage d’eau de la solution lipoproteique vers les globules rouges. Ce mouvement est minime Bioc%m.Biophys.

A&a, 260 (rgp)

110-132

1x3

MOUVEMRNTS DE CHOLESTEROL

et ne s’accompagne d’aucune hemolyse visible, a quelques exceptions p&s qui ont 4th &art&es. Cette remarque pr&ninaire concerne aussi les incubations faites avec les /?-lipoproteines. (a) Rtbltats pond.&aw Avant d’etudier les mouvements de cholesterol lors de l’incubation on a pris deux precautions : (I) On a recherche si la dialyse de la solution d’cr-lipoproteines, effectueee a 5” pendant 24 h, s’accompagnait dune esterification. Celle-ci est active : la concentration en cholesterol libre passe de 0.067 a 0.043 mg/g soit une diminution de 37% (Tableau I). Simultanement, la concentration moyenne en cholest&ol est&ifiC s’accroit (576). La TABLEAU

I

VARlATIONS DES CONCENTRATIONS MOYENNES EN CHOLRSTtiROL LIBRB ET ESThIPIk DES AVANTET hm-&s DIALYSE Aso PENDANT 24h~~ IMM~D~ATRMENT~.PR$~M~LANGEAVE~DES~~.MATIE~

a-LIPOPROTlkNBS

E.S.:erreur standard surla moyenne.

Nombre d’exfihiences

4

Conditions

Concentration

ex~kvimentates

a-LipoprottGaes

Avant dialyse Aprhs dialyse ‘4 (%

4

i E.S.)

Avantmblange Ap&sm&snge d (%

f

E.S.)

en cholestPro1 (mg/g du dlange)

Cholest~ol libre

Cholest&ol estk+V

cholcstcrol total*

0.067 0.043 -36.7

0.321 0.337 $5.0 + 5.2

0.388 0.380

0.043

0.337

0.380

0.023 -46.5

0.335 -0.5 f

0.358 -5.8

& 12.8

f

14.2

2.5

Hkmaties

Mdlawges

Cholesttfrol like

Chdestivol to&z*

0.171 0.185 +8.2 &

0.551 o-543 -1.3

-2.0

4.6

+ Valeurs calcul6es. dispersion des rkmltats est importante (5% f 5). En consequence, a titre de vkification, on a r&list! des dialyses a 25’ pendant 24 h. Dans ces conditions, go% du cholesterol libre sont e&&ii&. (2) On a aussi recherche si la simple addition d’hematies Bla solution d’cc-lipoprot&es entralnait un mouvement de cholesterol entre les divers compartiments. Les hematies sont separees de la solution lipoproteique immkliatement aprb leur melange avec celle-ci. La concentration en cholesterol des hematies s’accroit de 0.171 Q 0.185 mgfg (Tableau I). Cet enrichissement est faible. 11prend, rknmoins, une &elk signification, car il est accompagne dune variation de meme amplitude de la con~ntration en cholesterol libre des dc-lipoprot&nes (0.043 a 0.023 mg/g). Par contre, la concentration en cholesterol esttkifie ne varie pas. L’incubation proprement dite engendre certaines modifications deja apparentes apr&s2 h et qui s’affirment pour des durees plus longues (Tableau II). C’est, ici encore, la concentration en cholesterol libre des a-lipoprotdines qui subit la plus grande variation relative: 206%, en moyenne, apres 7 h d’incubation. 11 s’agit d’une augmentation : 0.043 m&g au lieu de 0.014 mg/g. Une augmentation encore plus importante en valeur absolue est a noter pour le cholesterol esterif%: 0.359-o.408 mg/g. Ces variations sont compensees par une diminution de concentration du cholesterol des globules rouges (0.197 a 0.114 mg/g). L’incidence de ces variations quantitatives devra cltre prise en consid~tion lors de la d~te~ation des vitesses d’echanges. Mais le traitement math~matique dun modele non stationnaire ntkessite entre autres, la connaisBioclim.BiopiCys. Acta,

260(1972)

110-132

F. D’HOLLANDER,

1x4 TABLEAU

II

VARIATION

DRS

PROT&NES

ET D%fMATIES

CONCENTRATIONS EN

MOYBNNBS

FONCTION

DE

CHOLiSTEROL

XN

LA DURiE

DES

LIBRE

ET

INCUBATIONS

PSTliRlFI& A

Duvbe d’incubation a 37” (hf 0 2.25 4, 8.86 f% f 0

4 7 A, 7 (%)

D’UN

%&LANGE

D’U-LIPG-

37’

E.S. : erreur standard sur la moyenne. Pour mieux juger de la reproductibilM durde, les valeurs individuelles sent plac~es entie pare&h&es.

2

F. CHEVALLIER

des deux expkiences

de longue

Concentration en c~olesthol (mglg du m&ange) u-Lipofirotbines Cholestb7ol libre 0.01~ o.ozg +-7x i

Hbmaties

Mblange

Cholestb7ol estb7@b

Cholestb701 total *

Cholestb701 Mm

Cholestbroi total*

0.328 0,349 16.4 i

0.345 0.378 i-9.6

0.172 o.s32 -23 j= 2.8

0.5I7 0.5IO - 1.3

0.373

0.197 fo.Ig7-0.196) O.I27 (0.I2I-O.133) a.rrq (o.rxo-o.118) -42 (44-40)

0.570

70

I.03

E.S.f O.OI4 (o.oro-o.or8) 0.039 (0.044-o.o34) 0.043 (0.046-0.040) f206 (360-12~)

0.359 (0,368-0.350) 0.399 (0.410-0.388) 0.408 (u”427-0.390) +I4 (x6-11.5)

0.438 0.451 +20.9

0.565 0.565 -0.9

* Valeurs calcul8es. same des lois de variations de la taille des compartiments. Par simplification, on a admis que ces variations suivaient une loi exponentielle de la forme: a@--e-EL). Les param&res a et K ant MC ajust& de tulle sorte qu’8 chaque instant la fuite glob&ire du cholest&ul soit &gale&la somme des augmentations enregistr4es pour le cholestkol libre et est&ilS de la lipoprott%ne (Fig. x). Le [+WZ]cholest&rol est inject4 dans la cavitd intrap&ito&ale des rats 15. h avant leur sacrifice. Les solutions d’cc-l.ipoprot&nes, apr&s dialyze, sont mClangQs A des hCmaties non marqukes. On peut voir sur le Tableau III, clans le cas de deux expbriences, 1’Cvolution dans le temps des radioactivitks sptkifiqrtes du cholestkol de chaque milieu. Celles des hbmaties au temps z&o ne sont pas nulks, car elles sont mesur&s ap&s une skparation qni succ&de immkliatement an m&ange initial, Les sadioactivitb spkifiques du cholestkol libre des a-lipopsot&n~ d&roissent, alors que celles du cholest&ol des h&n&es croissent. Ia radioa&& spkifique du cholest&51 est&-ifi~ ne varie pratiquement pas. Les courbes de l’&olution de la radioactivit& spk&que du cholest&ol libre en fonction du temps sont report&s sur la Fig. 2. Elles sont exprimtSesen y0 de la radioactivitd spkciiique du compartiment le plus marque au temps z&o (c&poprotBines). On constate qu’elles prbentent de larges variations d’une exp&ience A.l’autre. On a tSgalement trace les courbes moyennes qui serviront A la d&termination de la vitesse d’khange.

(II)

Imzsbutions de solutions de j$lifqhx%ines en$w&nce d’Mn&ies (a) Rk&zts pondtkzzcx On a effectu& les m&mes expkiences que c&es faites pour les a-lipoproSnes_ La dialyse ne s’accompagne cette fois d’aucun muuv~eni de cholesttkol (Tableau IV). Lors du m&ange h~maties-solution ~poprot~ique~ on observe une &vation d’environ Biochim. Biophys.

Acta, 260 (1972) 110-132

~~~VR~E~TS

DE CHOLESTEROL

Hhmatics

Fig, I. Vaieurs absolues des difF&ences de concentratians f@e-ctx 1) du cboiestkoi libre et e&&-if% en fonction de la dunk d’incubation B 37”* de solutions d’a-lipoprot&nes et de globules rouges. e-e, cbol&rol des globules rouges; O-O, cholest&oI est&ifi~ des r&poprot&nes; + -+ I cbolest&ol libre des a-lipoprot&nes. Fig. z. Evolution des radio&&it& sptkifiques relatives (R.A.S.) du cbolestkol libre des &ipoprot&nes et des glob&e+ rouges au cows de I’incubation de leer m&ange B 37*. - -. -, courbes otbenues pour dif&rentes expc?reruxs individuelles; -, courbe moyerme expkimentale ; +--+ , courbe obtenue par caku1 analogiqae. TABLEAU EVOLUTION ESTlkRIFIti

0

III EN PONCTION

6:

0.75 ‘-5

III

2.25

235

0 2.25 4.25

6

DW TEMPS

DRS RADIOACTlVITdS

DES HtiMATIlrcS ET DES OL-LIPOPROT~INES

:E: 92 10X

6847 5142 2926 2S6r 1685 569 461 396

SPiCIFIQWES

AU COURS

DE LEUR

DU CIiOLESTiROL INCUBATION

LIBRE

ET

A 37”

1620 1650 1620 1

%$340 328 321 316

IO~/~ de la concentration en cholest&ol des h&mat&s, Far contre, dans la solution lipoprot&ique, la chute du cbolest&ol libre n’est pas signifkative to.135 a 0.~26 mg/g), Elle est assock& Q une variation dans le meme sens du cholest&ol est&if% (0.220 I 0.204 ~~g) (Tableau IV). Enfkn, les mouvements de cholest&ol lors de ~~~u~tion des ~-~~prot~in~

BiocMn. Biup&s, A&,

260

(1972)

110-132

116

F.

D’HOLLANDER,F. CHEVALLIER

avec les hematies se p&tent aux m&mes observations que precedemment. Apres 7 h d’incubation, on note une chute de 24% du cholesterol des hematies, une augmentation de 23% du cholesterol libre des ~-li~prot~~es et une autre de 8% pour le cholesterol estk-ifie (Tableau V). Ces variations quantitatives sont traduites graphiquement sur la Fig. 3. L’imperfection de certains resultats experimentaux, ainsi que les imperatifs de la methode d’ajustement definie plus haut, expliquent le fait que les courbes TABLEAU IV VARIATIONSDESCONCENTRATIONSMOY~NNRSENCHOLEST~ROLLlBREETEST6RIFI~DES~-LIPOPROT~INESAVANT ETAPRBS DIALYSE A SOPENDANT 24h, ETAPRkS MdLANGE AVBCDESH6MATIES

E.S. : erreur standard sur la moyenne. Nombve d’exfibiences

Colrditions

Concentration en cholestd4ol (mglg du m&ange) &Lifmprot&i~es

w?Ci~nta~es

ChOl&tfTOE

ChoEestk4ol

libve

estJ4i;fb

0.133 0.135 t-r.5 rt 3.2

0.222 0.220 -1.0 f

3

Avant dialyse Apres dialyse d (% zt ES.1

3

Avant melange 0.135 Apres melange o. I 26 4 f% i E.S.1 -5.3 &

2.5

Mdlange C~O~~4~~ total*

0.255

0.610 0.611 +o.r

0

0.355 0.330

0.204 -8.1

Wmabies Ckdest~40~ I&e

0.355 0.355

0.220 11.0

CfioLs~~4ol total*

f

2.2

-7.0

0.281 +10.2

&

2.4

* Valeurs calculees. TABLEAU V VARIATIONS DES CONCENTRATIONS LIPOPROT~~NES~TD'H$~ATIESEN

MOYENNES EN CHOLESTdROL LIBRE ET EST&RIFXlk D'UN FONCTION DELADU&E DBSINCUBATIONS A 37”

MfLANGR

DE

@-

E.S. : erreur standard sur la moyenne. Pour mieux juger de la reproductib~t~ des deux experiences de longue duree, les valeurs individuelles sont placees entre parentheses. Nombve d’exp&iences

4

.&44&e #incubation 4 37O

/SLipoprott?ines

(h)

CholestL’rol Eib4e

0 2.25 A,-,.*, (% f 0 4 7 h-7

* Valeurs

(%)

Concentration en choleskfrol (mgjg du mdlange) Cholestdrol estk4i&

0.~46 0.168 +x5 ri 2.7

0.229

0.253 SIO.5

& 3.6

Hkmaties

Mdange

Cholest,drol total*

Cholest~401 l&e

Cholestb4ol total *

o-375 0.421 +12.3

0.253

0.628 0.639 +I.7

0.379

0.296 (0.332-0.260) 0.253 (0.300-0.206) 0.226 (0.27o--o.182) -24 (18.5-30)

0.218

-12.5

i

4.9

E.S.) 0.138 (0.121-0.156) 0.157 (0.147-0.168) 0.170 (0.164-0.176) + 23

0.241 (0.195-0.288) 0.258 (0.208-0.308) 0.260 (0.216-0.304) +8

(35.5-13)

b-6)

0.4x.5 0.430 +I3.5

0.675 0.668 0.656 -2.8

calcul&es.

traceessurla Fig. 3 ne sontpastoutQ fait reprbsentatives des poin~sex~~entaux dans le cas des variations du cholesterol e&&if& et, Q un degre moindre, de celles du cholesterol libre lipoproteique. L-es consequences dune telle approximation wont envisagees dans le chapitre VITESSESD%CHANGE DU CHOLESTEROLLIBRE. Biochim. Biophys. Acta, 260 (1972)

rro-132

MOUVEWENTS

DE CHOLESTEROL

1’7

(b) Rist&ts isot0piqtie.s Le Tableau VI four& deux exemples de l’evvlution daus ie temps des radioact&it& sptscifques du chvlest&ol libre et e&&if% des ~-~~prvt~~ marquees au [4-‘F]cbolestC ro 1, et incubees en presence d’hematies non marquees. Cvmme pour Ies a-lipoprvteines, on observe une diminution de la radioactivite specifique du cholesTABLEAU

VI

EVOLUTION

EN

FONCTION

DU

EST&KIFI&

DES

IitatATIES

ET DES @-LIFOPROTktWES

TEYPS

DES

RADIOACTIVIT~S AU

SK!kIFIQVES COUXS

RE LEUR

DU

CH#LlfsTdROL

iNCUBhTlON

Dude de

RadioactivitBs spkifiques

l’incubatian

Hkmaties

&Lipo$vvt&nes

(hl

Cholestkvol libre

Cholestkvol iibre

Cholestt’rol estti$d

0

46 159

4668 4323 4=04 3974

253 234 252 24.5

0*75 I.5 2.25 0

2.25 4.25 6

262

372 30

1421

110

1222

175

X083

220

989

A

LtBRE

ET

37”

(ipmlmg)

65 2: 57

t&v1 libre des j3-lipvprot&nes associtse A une augmentation de celle du cholesterol globulaire. De meme, la radioactivite spkifique du chvlest&rvl est&if& ne varie pratiquement pas. Les courbes de radioactivitb spcSci&quesen fonctiou de la d&e d’incubativn, svnt exprim&s en 0/ade la radivactivitt! spkifique des /?lipvprot&es au temps s&o, EIles sout repartees sur la Fig. 4, ainsi que les cvurbes moyennes.

C’est ce type d’expkiences qui a 4th la source du plus grand nombre de probl&mes. N’ayant plus le souci de la conservation des hematies, nvus avons entrepris des experiences de lvngue dunk, pensant ainsi amplifier la grandeur des variations de concentrations. L’irregularite des resultats est surprenante (Tableau VII). La concentration en cholesterol libre des cr-lipvprvteines baisse vu reste stationnsire, celle des /NipoprotCines evoke tvujours vers une valeur plus faible. Quant aux cvucentrations en chvlest&vl e&&if%, elks augmentent en g&&al mais diminuent ou restent stativnnaires dans quelques cas. Ces r&ultats sugg&rent qu’il existe un &@libre pr& cake entre bs TV-et les /?-l.ipvprot&nes isolees de ieur contexte physiologique. Ceci nous a conduits a realiser des incubations de courte durke en prenant, en vutre, plusiems precautions. (I) Tvutes les manipulations, en dehvrs de l’incubation, svnt effect&es dans des recipients ou des appareils refrvidis & 5”. (2) Pour chaque experience les mesures ne svnt faites que pour deux temps dif& rents, y cvmpris le temps z&v. Les lipvprvt&nes de chaque echantillon svnt separks dans deux ultracentrifugeuees diff&entes. L’ultracentrifugation, qui dure a4 h, n’est done pas interrompue dam ces conditions.

F. D’HOLLANDER,

118

F. CHEVALLIER

k

Fig. 3. Valeurs absolues dee differences de concentrations (Ic~,-c~~ I) du cholesterol libre et est&ifii en fonction de la duree d’incubation a 37O, de solutions de b-lipoprotiines et de globules rouges. 0 -0, cholesterol des globules rouges; O-O, cholest&ol estkifie des /?-lipoprot8nes; +-+ , cholest6rol libre des @-lipoproteines. Fig. 4. Evolution des radioactivitk sp&%iques relatives (R.A.S.) du cholesterol libre des /I-lipoprot&ws et des globules rouges au cows de l’incubation de leur melange B 37 . ---, courbes obtenues pour diffkentes experiences individuelles; -, courbe moyenne experimentale; +-+ courbe obtenue par calcul analogique. TABLEAU

VII

VARIATIONS DES CONCENTRATIONS COURS D'INCUBATIONS DELONGUES

D&e d’incubation !h)

EN CHOLESTEROL LIBRE ET EST&RIPI$ DURdES A 370B DE PLASMA

DES

a ET DES

~-LIP~PR~T~INRS

Concentration en cholestSvo1 (mglg de plasma) Cholestivol l&e

a-Li$ojwot&nes Cholestirol estf%$id

CholestCrol libre

Cholestdvol esteri$d

Plasma Cholest&ol total*

0

0.089

0.162 0.106

0.809

0.084

0.386 0.481

0.172

9

0.181

0.852

0

0.105

9

0.093

0.421 0.533

0.187 0.125

0.241 0.217

0.954 0.968

0.352 0.340

0.103 0.076

0.159 0.194

0.683 0.684

0.483 0.537

0.107

0.166 0.225

0.870 0.914

0

0.069

24

0.074

0 24

0.114 0.079

p-Lipopvothnes

0.073

* Valeurs calculees.

(3) Les erlenmeyers qui sex-vent & l’incubation sont prklablement rincks pendant 24 h en continu, afm de leur assurer une propret maximale. A l’aide de ces nouvelles conditions expkimentales, la reproductibilit6 des rCBiochim. Biophys. Acta, 260 (1972) 110-132

AU

119

DE CHOLESTEROL

MOUVEMENTS

&tats s’est afFumCe. L’examen du Tableau VIII qui reproduit les valeurs moyennes des concentrations de hnit exp&iences permet de faire les constatations suivantes. Un observe dans le plasma une diminution de o.o$ m&g de eholest&ol libre apr&s incubation, soii une variation de zoo/Ode sa masse initiale. Cette diminution touche essentiellement le cholest&ol libre des &poprotCines (0.033 mg/g). La baisse du choTABLEAU

VIII

\rARxATmNs DES CONCENTRATIONS~OYBNNES BN CHOLEST~~ROL AU &OURS D’INCUBATIONS DE PLASMA A 37” PENDANT 2 h E.S. : erreur standard

Dde

d’wp&~enccs

d’incubation

a3P P)

Con.centvat&m en cholestdrol (q/g de plasma) a_~ipopa~~~nes /I-Li f!w$wot&es

Chotestc’xol libre

0

f

Choiest&ol est&ij%

DRS CC-ET DIES #?-LIPOPROTISINES

Cholestdral est&i$L

0,397

0.135

0.188

0.085 -28.0

0.454 +14.4

0.127 --x3.3

0.182 -3.2

& 10.6

rfi

?c

E.S.)

2.0

$3.6

4.7

-_

--Fk??d

Cholestdrol Fib?%

o.rr8

k-8

(%

ET EST&RIPI&

sur la moyenne.

Nmnbre

8

LIBRR

?Xolest&ol libre

ChokstL’rol Cholestdtd estird~

t&d

0.253

0.5%

0.838

0.202 -20

0.636 -I-8.7

0 5.838

-

+ Valeurs calcul6ees.

lest&o1 libre des @ipoprot&nes n’est que de 0.018 mg/g. L’augmentation du cholest&o1 estkifit! des cc-lipoprot&nes est de 0.057 mg/g, soit une variation de 14% de sa masse initiale. Quant au cholestCro1 est&ifiB des /Hipoprot&nes, il ne varie pas. Ces rtlsultats, qui ne concernent que des variations dPceltSesentre o et z h d’incubation, ne permettent pas de tracer des caurbes de variations de concentration, commenousl’avons fait pour les incubations d’hgmaties en prhsence d’g- ou de #Mipoprot&nes. (b] R&&&S isotopiq%&?s C.omme pour les r&ultats pondtkaux, les premikes expkiences nous ont fourni des r&Mats isotopiques prkentant une grande variabilit& La rCpCtition des expCriences et Yam&oration des conditions expkrimentales et techniques nou.s ant permis d’aboutir A des rkultats plus constants. Des exemples de l’tlvolution des radioactivitQ sp&ifiques du cholest&ol libre et est&ii% des ct- et des #Mipoprot&nes lors d’incubation de plasma sont fovrnis sur le Tableau IX. Le plasma incub est issu d’un groupe de rats ayant subi une injection TABLEAU EVOLUTION ESTbRiFIf

IX EN

FONCTXON

DES

X ET DES

DU

TEMPS

DES

@_IPOPROT&INES

RADIOACTlWTk3 AU

COURS

I&r&e de

R~~~~t~u~t~s speki$gzces fipm~mp)

f’incubation (h?

Cholest&ol libre

0

a-Lipoprotdinss -

Cholestkral libre 24x5

61

20&3

57

56x3 4934 4854

92 Ia? =37

7657 6718

‘74 284

237 270

0

32=9

29

0.5

3315 3783

339 373 622 881

3

4298 7364

CIIOLESTERQL

LlBRE

ET

37”

p-Lipoprut&ineb

1729 1769

I

DU

DE PL.&%%A A

Cholestkrol estkrij&

0.5

0

SPlklFXQUES

D’INCUBATION

Biockim.

Biopkys.

Cholesterol &drifi~

Ada,

260

(x972)

x10--132

120

F. D'X~~~ANDER, F. CHRVALLIER

intra~~ton~~e de ~4-14C~choles~~l, 0.5 h avant leur sacrifice. La radioactivith sp& ciiique du cholest&rol libre des @ipoprott%es au temps z&o est sup&ieure & celle du cholestkol libre des a-lipoprot&nes. Pendant ~incubation la premi&e d&o&, alors que la seconde croit. On constate Itigalementl’augmentation de la radioactivitd spkcifique du cholestCro1 esttWi6 aussi bien dans les a- que dans les /Mipoprottines.

Les courbes de l’dvolution des radioactivikk spkifiques du cholestkol libre de chaque BpoprotCine, en fonction du temps, ainsi que les courbes moyennes sont reportees sur la Fig. 5. Elles sont exprimks en yO de La radioactivite spkifique du cholest&o1 libre des ~-~~prot~~es au temps z&o. I

i

1

2

3

heures

Fig. 5. Evolution des radioactivit6s sp&ifiques relatives (R.A.S.) du cholest&ol libre des a et des @-1ipoprottSines au cows d’incubation de plasma B 37”. - - -, courbes obtenues pour diMrentes expkiences individuelles; -, courbe moyerme expkimentale ; o o o , courbe obtenue par calcul analogique selon le modMe iuitial & compartiments variablea (void texte) ; -+-- + , courbe obtenue par calcul analogique selon un mod&le a compartimenkq d’khauges stationnaires.

(Bf DX~XJSS~ON Les techniques de s¶tion des iipoprotknes relat&es par diffkrents auteurs so~ent la n&es&P de cent~~tions successives pour isoler des fractions lipoprot&ques pures [email protected] outre, pour le plasma de rat, la cent~fugation en milieu de densitt! ~2163en&a&e une cont~ation des @-lipoprotkines par des a-lipoprot&nesl*. Pour vtsrifier T&endue de cette contamination en lipides, des analyses &ctrophor4tiques, &vies de coloration des &ides* ont btk r&&s&s. On note, en fait, une contamination croiske: 7% de lipides d’origine /MipoprotGque dans la fraction “a*’ et 15% de lipides d’origine a-lipoprotkique dans la fraction “/I”. Cette contamination peut dtre exprimk en cholesttkol, connaissant le pourcentage de cholestftrol par rapport aux lipides de chaque lipoprotkine. C.espourcentages sont respectivement de 27 et 56 pour les lipoprottines de densiti: infkieure et supkieure & 1.063, d’aprb KQGA et,&.I6 qui ont travaW sur du s&urn de rat. Ainsi 3.5% du cholesttkol de la fraction “a” sont d’origine ~-~~p~t~~que, et ~5% dn cholest&ol de la fraction “@” sont d’origine a-~~prot~ique. Cette mauvaise pu~cation des ~-~~prot~~es entrake done une contamination non nameable en cholesttjrol. ~~anmoins, la divergence des rkultats Biochinz.BG+%ys.A&, 260 (1972)

110-132

121

MOUVEMENTSDECHOLESTEROL

enregistres apres incubations d’hematies et soit d’a soit de t!?-lipoprot&nes atteste qu’il s’s& dentit& differentes. (I) Incltbations de solutions li$o#wott%q%esen prt?smce d’hhaties Au cows de la dialyse des lipoproteines a 3”, on note une esterification importante dans les solutions da-lipoproteines (37%), alorsqu’elle est nulle dam les solutions de /?-lipoproteines (Tableaux I et IV). Ces resultats sont en accord avec ceux de Lossow et aLIT. Ces auteurs n’observent aucune estkification au tours de I’incubation des lipoproteines de densite inferieure a 1.063 ; celle-ci est au contraire intense avec les lipoproteines de densite comprise entre 1.063 et I.ZI. Ajoutons que, rtkemment, RAZ et al.16 ont montre que la lecithine-cholesterol-acyl-transferase est contenue dans la fraction proteique (d > I.ZI),et que I’activite esterasique dCcelCe dans la fraction HDL est due a sa mauvaise purification. Nos conditions de separation impliquent done que l’enzyme soit associd a la fraction u-lipoproteique. Le melange des hematies aux solutions lipoproteiques dialysks provoque des phCnom&nes instantanb. 11 s’agit dune captation de cholesterol libre lipoproteique par les hematies. Ce fait est a rapprocher d’un Cvenement analogue observe a propos des chylomicrons la. La membrane plasmique des hematies est done capable de contracter des liaisons supplementaires avec des molecules de cholestkrol libre. L’enrichissement correspond ii 8% du cholesterol initialement contenu dans les hematies lorsqu’elles sont incubees avec les a-lipoproteines (Tableau I). Le probleme de la captation de cholesterol libre des @lipoprotCines par les hematies se pose dans les m&mestermes que pour les a-lipoproteines, mais dune facon beaucoup moins nette cependant (Tableau IV). On observe une augmentation de 10% du cholesterol des hematies. Mais, par rapport au cas precedent, il n’y a pas de correlation rigoureuse entre la masse de cholesterol libre perdue par les /&lipoprotCines et celle captee par les hematies. De plus, on ne peut prendre en consideration la diminution de la concentration en cholesterol es&if% (8%). 42% du cholesterol des htkaties quittent celles-ci lorsqu’elles sont incubees durant 7 h avec des a-lipoproteines, 24% s’il s’agit de /?-lipoproteines (Tableaux II et V) . Ainsi, les molecules de cholesterol de la membrane glob&ire ont des liaisons llches et peuvent s’en liberer. Ces molecules sont done “labiles”. Cette labilite se traduit par une “fuite de cholesterol globulaire”. Celle-ci a CM pr&demment observee par MURPHYI@ au niveau d’hematies incubees en p&en&de plasma dont la concentration en cholesterol libre Ctait diminuCe par une incubation prealable (eskkification). Cet auteur pense qu’il existe une correlation directe entre la fragilitC osmotique, la concentration en cholesterol libre plasmatique et l’intensite de la fuite. Nos conditions expkirnentales sont differentes puisqu’il s’agit de lipoproteines plasmatiques et non de plasma. De toute facon, il est clair pour nous que la fuite precede l’hemolyse, puisque celle-ci est nulle pendant la p&ode d’incubation. Par contre, il est vrai que la fuite importante de cholesterol des hematies incubees avec les a-lipoprotCines (42%) pourrait &tre en relation avec l’esterification prdalable de leur cholesterol au tours de la dialyse. Mais, dans le cas du melange /&lipoprot&nes-hematies la fuite observee (24%) n’a pas CtCdeclanchee par une esterification prtklable. La diminution de la concentration du cholesterol libre a la suite d’une ester& cation prealable paraft done Ctre un facteur favorisant la fuite sans en &re I’Clement dMerminant. S’il en est bien ainsi, on doit observer une fuite du cholesterol des hemaBiochitn.

Biophys.

Acta, z60 (1972) 110-132

F. D'HOLLANDER,

I22

F. CI~E~ALLIER

ties en presence d’a&poprot&nes dont la concentration en cholesterol libre a ete maintenue constante durant leur preparation. Des experiences complementaires ont CtCentreprises dans le but de verifier cette conclusion. Pour supprimer la chute du cholesterol libre des cr-lipoproteines au tours de leur dialyse, on a tout d’abord reduit la duree de celle-ci (8 h au lieu de 24). L’efficacite de cette mesure &ant insuffisante, on a port6 la solution a-lipoproteique a 57” avant la dialyse. Cette temperature, a laquelle l’enzyme est inhibee,. n’etant pas atteinte instantanement, une legbre est.&ification s’est encore developpee. Pour Cviter cet effet, la mCme procedure a CM appliq&e a des solutions da-lipoproteines auxquelles on a addition& au prealable de l’iodoadtamide (0.01 M). Dans ces conditions aucune esterification n’est enregistree aprb 24 h de dialyse. 3 experiences independantes ont CtCainsi realisees. Des globules rouges, incubes a 37” pendant 7 h avec ces solutions sont I’objet dune fuite de cholesterol qui affecte dans les 3 cas 10% de leur concentration initiale (moyenne: 0.132 au lieu de 0.147 mg/g de melange hematies-a-lipoproteines). L’activite de la l&ithine-cholesterol-acyl-transferase &ant inhibbe, l’incubation s’accompagne d’un augmentation du cholesterol libre des a-lipoprotbines (moyenne: 0.067 au lieu de 0.050 mg/g de melange). Ainsi, la chute du cholesterol libre de la lipoproteine pendant la dialyse, bien que favor&ant la fuite du cholesterol des hematies, n’est pas indispensable a son declenchement. Cette conclusion sera confirmee, par la suite, avec du sang entieraO. A la diminution de concentration du cholesterol des hematies est associee une augmentation de celle du cholesterol libre et estCrifiCdes a-lipoproteines. On peut en deduire que la vitesse d’estertication est inferieure a celle de la fuite. Dans le cas des p-lipoproteines, l’enrichissement en cholesterol esterifie (0.019 mg/g) est plus petit qu’avec les a-lipoproteines (0.051 mg/g) (Tableaux II et V). Cet enrichissement est, par ailleurs, surprenant puisqu’il n’y a pas de kithine-cholesterol-acyl-transferase Pour s’en assurer dans nos conditions experimendans la fraction /NipoprotCique 18917. tales on a incube des p-lipoproteines a 37’ pendant 24 h. Aucune esterification n’a CtC observee. Pour expliquer l’esterification de cholesterol au tours d’incubation de /3lipoproteines et d’hbmaties, on peut se demander si les globules rouges transvases ne seraient pas contamines par de la lecithine-cholesterol-acyl-transferase. 11pourrait, aussi, s’agir d’une association membranaire ayant un reel caractere biologique. En conclusion, l’incubation des globules rouges avec des a-lipoproteines aboutit a des mouvements de cholesterol: captation, fuite, esterification dont les amplitudes sont, en general, telles qu’il n’y a aucun doute sur la realite de ces processus. De plus, il y a toujours un synchronisme correct entre les divers mouvements de telle sorte que le bilan moyen final est inferieur a 2%. Ces mouvements sont moins marques dans le cas des fi-lipoproteines. MalgrC la presence de 25% de cholesterol a-lipoproteique dans la fraction /I-lipoproteines, il nous parait difficile d’admettre que les mouvements observes dans ce cas soient en relation avec la seule presence du contaminant cr-lipoprot&ique. 11est neanmoins possible que l’intensite de ces mouvements ait CtCencore reduite en l’absence d’a-lipoproteines. Des informations complementaires sont apportees par les resultats isotopiques (Tableaux II et VI et Fig. 2 et 4). La radioactivite spkifique du cholesterol libre aou @-hpoproteique decroit alors que celle des hematies croit. L’enrichissement en cholesterol libre deslipoproteines consecutif a la fuite globulaire pourrait Cventuellement expliquer la diminution de la radioactivite specifique du cholesterol des lipoproBb~him.

Biophys.

Ada,

260 (1972) IIC-132

MOUVEMENTS

123

DE CHOLESTEROL

tt%nes. Mais lamentation simultanee de celle des hematies tcimoigne d&changes entre celles-ci et les lipoprottkes, en accord avec les r&ultats d’autres auteurs6r7. L’etude des vitesses d’Cchange par calcul analogique fera l’objet d’un chapitre a part. La constance de la radioactivite spkcifique des esters de cholestCro1 aussi bien dans les GcQuedans les p-lipoprotkres est surprenante alors que les resultats quantitatifs montrent l’existence dune esttkification. Cette stabilite ne peut s’expliquer que s’il y a une estCrifkation simultanee, dans une proportion definie, d’une part de cholesterol des hematies de radioactivite speciflque faible, et d’autre part, de cholesterol libre des lipoproteines de radioactivitt! specifique forte. Le calcul fournit le resultat suivant: il y a environ quake fois plus de cholesterol qui s’esterifie directement Q partir des globules rouges qu’ii partir des ~-~~prot~~es. Dans le cas des ~cubations de @-lipoprotCines en presence d’hematies, le meme type de calcul montre que les z/3 de la quantite ester&e sont issus des hematies et r/3 seulement des @-lipoproteines. L’existence de ce partage dans les voies d’est&ification se trouvera justifiee par le calcul analogique. L’ensemble des mouvements de cholesterol observes “i% vitro” entre les hematies et soit les TVsoit les fi-lipoproteines est r&umC par deux schemas qui serviront de mod&le de base pour la determination des vitesses d’echange (Fig. 6 et 7).

A__-A-fii

I

I

Fig. 6. tkhdxna des motlvementsde cholest&olau tours de I’incubationd’un m&nge d%?maties et ~a-~~p~~~~ B 37”. czL, cholesterol hbre des oc-lipoprotiines; &, cholestdrol &&ifi~ des a-lipoprott?ines;H cholesterol des h&ma&s.La surfaceen trait plein d&nit la hilIe initiale dn compartiment.La surface trait pointilk d&nit la taille du compartiment en fin d’incubation. Les surfaces des carr& sont proportionnelles

aux valeurs expkimentaks.

Fig. 7. Sch&na des mouvements de cbolest6rol au cows de l’incubation dun melange d’hematies et de p-lipoprot6ines a 37”. #?L, choleetkol libre des @ipoprotdines; BE, cholestkol e&&f% des p-lipoprot6ines; H, cholesterol des bdmaties. La surface en trait plein ddfinit la taiile initiale du compartiment. La surface en trait pointill d&nit la taille du compartiment en fm d’incubation. Les surfaces des car& sont proportionnelles aux valeurs experimentales.

(II) Imcecbationde $izsma L’irr@aritC des rkltats emegistres au tours de la premiere serie d’experiences (Tableau VII) aurait pu &e imputk aux cont~na~ons des /?-lipoprotkines par des a-lipoproteines en quantite variable selon les experiences. Mais ce sont les precautions techniques, mises en oeuvre lors de la dew&me serie d’expkiences, qui ont conduit B

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124

~~~~o~ation de la repr~uctib~t~ des rksultats (Tableau VIII). La cont~ination citee ci-dessus n’est done pas la cause majeure de la variabilitk des premiers resultats. Lorsque du plasma de rat est incube pendant z h, la quantite de cholesterol ester&? s’accroit dans les seules a-lipoproteines (Tableau VIII). Ce fait suggere le role prioritaire de cette lipoproteine dans l’esterification du cholesterol plasmatique. Des incubations de plasma suivies de separations lipoproteiques ont deja C?tCrapportees dans la litterature. Mais, elles sont toutes conduites pendant des temps longs (24 ou 36 h) et, de plus, les separations lipoproteiques effectuees sont plus fines que les n&es (VLDL, LDL, HDL). Dans ces conditions, avec du plasma humain, l’esterification affecte autant le cholesterol libre des ~-~~~ot~ines (VLDL et LDL) que celui des a-lipoprotkines (HDL), et ~au~entation en cholesterol est&if% s’effectue aussi bien dans ks ~-~~prot~~es que dans les a-~~prot~~esls~*~. On remarquera qu’une tr& longue duree d’incubation peut aboutir a masquer le r&e dun processus initial lorsque celui-ci n’est qu’une composante dun systeme complexe. En faveur du role prioritaire des a-lipoprotCines dans I’esterification du cholesterol plasmatique, on noteraque GLOMSET~~U~.** ont montre in vitro, avec du plasma humain, que le renouvellement des esters de cholesterol &it IO fois plus rapide dans les a-lipoproteines que dans les /?-lipoproteines. GOQDMAN~ a constate ce mCme fait in viva. Par contre, un travail, analogue a ce dernier, rklise avec du plasma de rat, montre que le cholesterol es&if% des VLDL se renouvelle plus rapidement que celui des HDL, et luim&me plus rapidement que celui des LDLES. Sur le plan isotopique on observe une au~entation de la radioactivite specifique du cholesterol libre des a-~poprot~~es et une caution de celle des ~-~~protiines (Tableau IX et Fig. 5). Ces variations sont le reflet dun transfert bidirectionnel de cholesterol libre entre les tl- et les &lipoprotCines. On note, par ailleurs, une augmentation des radioactivites specifiques des esters de cholesterol soit a- soit /?-lipoprotdique. Sur le plan quantitatif nous avons vu que le cholesterol libre qui quitte les aet les /?-lipoproteines se retrouve sous forme d’esters uniquement dans la fraction a-lipoproteique, puisque les variations de concentrations en cholestkrol esterifie /l-Spoproteique sont quasi nulles (Tableau VIII). Pour tenter de concilier les donnees pond&ales et isotopiques, on fournira des phenomenes observes l’explication suivante. D’une part, il est logique d’attribuer ril’augmentation de la radioactivite sptlcifique du cholesterol est&ifiC des a-1ipoproGiies une double origine: cholesterol libre des a- et des ~-~~prot~~es. Le calcul montre que la variation de radioactivite specifique du cholesterol esterifie des a-~poprot~ines, ?I la suite de cette double est~~cation, est nettement supkieure Q celle observbe expkimentalement (de 622 a 1x40 ipm/mg au lieu de 622 B 881 ipm/mg dans le cas de l’experience o-3 h du Tableau IX). D’autre part, pour expliquer l’augmentation de la radioactivite sptkifique du cholesterol est.&rifii: des &lipoprotCines, sans variation de concentration, deux solutions peuvent &tre envisagees : (I) L’apport de radioactivite resulte de l’esterification dune trbs faible masse de cholesterol libre a- ou I-, ou tc- et /?-lipoproteique. Cette masse ne peut etre que tres faible, car la radioactivite specifique du cholesterol libre des a-lipoproteines est, en moyenne, IO fois superieure A celle du cholesterol ester&$ ce facteur est de 45 pour les /I-lipoproteines. Par ailleurs, la Constance de la concentration des /I-lipoprotBnes. se&t obtenue par un transfert simultane de cholesterol ester& et de masse identique dans le comp~t~ent a”~poprot~ique. Biochim.

Biophys.

Ada,

60

(1972) 110-132

MOUvE~E~TSDE CHOLESTEROL

125

(2) rapport de radioactivitC et la Constance de la concen~ation sent rtMis& en m&me temps par des transferts bidirectionnels de cholestCro1 e.&ri@ entre les a- et les j9-lipoprotkines. Dans les deux cas, ces phdnom&nes ont pour consCquence d’augmenter la radioactivitk sptkiiique du cholestkol estCrifi6 des #?-lipoprotBines et de diminuer celle du cholestCro1 estCrifi6 des a-lipoprotckes. Ceci expliquerait que la variation de radioactivit6 spCcifique du cholestkrol estCrifiCdes cc-lipoprott5inescalculk. plus haut soit supkrieure B la variation experimentale, car l’hypoth&se de calcul ne tenait pas compte du transfert ou des Cchanges B pax-k du compartiment #I-lipoprotCique. En fait, c’est la solution numkro deux qui parait devoir &re retenue. En effet, comme on I’a dit plus haut, il suffirait qu’une masse infime de cholestbol libre s’est&%e dans les #?-lipoprot&es, pour expliquer ~au~entation de radioactivitg spkifique. Par con&quent, la mCme masse serait transferhe dans les a-lipoprotCines et cette quantitC produirait une dilution trop faible, incompatible avec celle requise pour faire chuter la radioactivitt! du cholestCro1est&if% u-lipoprotCique. La conclusion relative B l’existence probable d’khanges de cholestCro1 esttkifik s’oppose B celle de ROHEIMet al.8 qui ont aussi travailld sur du plasma de rat. Par contre, avec du plasma humain REHNBORGET NICHOLSON ont mis en Cvidence des transferts nets de cholestCro1 estCrifiC,des LDL aux VLDL, d’une part, et desLDL aux HDL, d’autre part. En outre NICHOLSET SMITW 84ont &al&$ des incubations de plasma humain en prtkence de concentrations accrues de VLDL, et observC des transferts d’esters de cholestkol des LDL et des HDL vers les VLDL. L’ensemble des mouvements de cholestkol entre a- et ~-li~prot~ines est r&um4 par un schtsma (Fig. 8).

Fig. 8. Sch6mades mouvementsde cholestkol des Q- et des @-lipoprotiines au c0m-s de l’incubtion de plasma ?A37’. aL, cholest6rol libre des a-lipoprotdines; CCE. cholestkol esttSrifi6 des Q1ipoproMines. /?L, cholestkol libre des jSlipoprot&es, @I, cholest&ol est&ifi6 des @ipoprot&nes, La surfwe en trait plein d&nit la taille initiale du compartiment. La sm-face m trait poj&lld d&nit la taille du compartiment en fin d’incubation. Los surfaces des car& sent proportionne&s aux valeurs exp6timentales.

BiocrSim. Bic@ys.

Acta, 260 (1972)

IIQ-132

126

F. D’HOLLA~DER,

VITESSE

(A)

D’$CHANGE

DU CHOLESTfiROL

F. CREVALLIER

LSBRB

MfiTHODOLOGIE

L’etude cinetique qui suit a CtCentreprise al’aide du calcul analogique, son application &ant particulierement favorable aux systemes non stationnaires qui sont les nbtres. La machine utilisk est de type EAI 231 R. Une telle etude requiert les don&es suivantes : (I) Le modele theorique de fonctionnement du systeme (Fig. 6, 7 et 8). A ce modele est associe un systeme d’equations differentielles exprimant les variations instantanees de radioactivitC dans chaque compartiment. (2) Les grandeurs des com~~ents et lems variations en fonction du temps (Fig. I et 3). (3) I-es courbes de radioactivite specifique moyenne du cholesterol libre de chaque compartiment en fonction du temps (Fig. 2, 4 et 3). Les seules inconnues thkiques sont les vitesses d’echange. En jouant sur ces parametres, si le modele propose est correct, on doit pouvoir superposer les courbes foumies par la machine aux courbes exp&imentales. (B)

RkcXJLTATS

Le modele suggere par les resultats isotopiques et pondkaux (Fig. 6) n’a pas permis de reproduire, a l’aide de la machine des traces voisins de ceux obtenus par Sexperience. On s’est alors orient6 vers une hCtCrogt%itc! du cholesterol globulaire. Cette idee nous tltait directement suggeree par l’existence de la fuite. Elle a ete testee par calcul analogique, en supposant que le cholesterol des hematies constituait deux compartiments. Le premier compartiment, forme de la totalite des molecules labiles, est directement en relation de transfert avec le cholesterol c+lipoprotCique. Le second contient des molecules de cholesterol qui ne s’echangent avec celles des lipoproteines que par l’intermkiiaire du premier. MalgrC l’introduction de ces nouveaux parametres dans le modele, les r&&tats restent toujours mediocres. ~h~t~rog~n~it~ pouvait au& se situer au niveau ~poprot~ique. En effet, le sacrifice des animaux ayant lieu 1.5 h apres l’injection du marqueur, I’equilibre des radioactivites specifiques du cholesterol libre des fractions a-lipoproteiques (si celles-ci ne constituaient pas un compartiment homogene) n’etait peut-&re pas atteint. On a done attribue, dans divers essais, des radioactivitds specifiques differentes a deux sous-compartiments de tailles differentes de facon a ce que leur somme soit egale a la quantite de cholesterol libre u-lipoproteique et a ce que la radioactivite spkifique moyenne soit &gale a celle de l’unique compartiment initial. Toutes ces tentavives ont echoue. En fait, l’examen des courbes obtenues avec le modele initial (deux compartiments: hematies et a-lipoprotdines), montre que l’ajustage des courbes est correct pour la premiere partie (o a3 h.), mais devient mauvais ensuite. Cette observation nous a sugg&% que la vitesse de transfert pouvait &tre variable en fonction du temps. Nous avons choisi une variation de vitesse de type decroissance exponentielle tendant Biochin&. Biophys.

Acta, 260

(1972)

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MOUVEMENTS

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DE CHOLESTEROL

vers une valeur finie. Cette nouvelle hypoth+se s’est r&&?e fructueuse, dans le seul cas ou la r&artition des masses qui s’estkifknt (directement 8, partir du cholesterol glob&ire ou indirectement apr& m&nge avec le cholesttkol libre a-lipoprot&ique) est voisine de celle calculee a partir des resultats isotopiques. Ce sont done les deux parametres (vitesse de transfert variable et repartition des masses en fonction de leur voie d’esterification) qui, ajustes conjointement, ont conduit a une tres bonne reproduction des courbes expkimentales (Fig. 2). Les resultats obtenus sont les suivants: la vitesse de transfert du cholesterol libre dans I g du ZnClangehematies-a-lipoprotCines est don&e par l’equation suivante : @l&j= (0.008-0.002)@*St + 0.002

en mg/h

La vitesse initiale est done de 0.008 mg/h et la vitesse finale de 0.002. RappoSe A I g d‘hematies, la vitesse initiale est de 0.070 mg/h. D’autre part, l’estkification se fait pour 82% avec du cholesterol libre directement issu des globules rouges et pour 18% avec du cholesterol Iibre d’origine globulaire prdalablement melange au cholesterol libre a-1ipoprotCique. (II)

Vitesse d’M.ange entre hkmaties et p-lipo~rotkilzes Tout ce qui a Btt!&once pour les a-lipoprot&nes est valable pour les @ipoproteines. Les m&mes es&s ont ett5 effect& et ont abouti aux mCmes kultats. Le modele est du m&me type (Fig. 7). La vitesse d’echange dans I g du melange hematies~-~~prot~ines est variable et don&e par l’kpration : eltg,=

(0.010-0.008)

e--O**t + 0.008

en mg/h

Rapportee & I g d’hematies, la vitesse initiale est de 0.064 mg/h. L’esterification se fait pour 66% directement a partir du cholesterol de fuite des globules rouges et pour 33% a park de cholesterol libre d’origine globulaire prealablement melange a celui des /MipoprotCines. Les courbes analogiques sont reproduites sur la Fig. 4. (III)

Vitesse d’khaltge entre a- et /l-lipoprotbines Le modele theorique d&change B deux compartiments (Fig. 8) ne permet pas de reproduire les courbes expkimentales de radioactivit&+ specifiques. L’hypothese d’une vitesse d’echange variable a MBtest&e, mais le resultat est reste nkgatif. 11semble que les variations de tailles des compliment choke&&o1 libre a- et @-lipopt oteique sont beaucoup trop importantes. En effet, lorsqu’on annule ces variations, rendant ainsi les compartiments stationnaires, les courbes fournies par la machine deviennent t&s voisines des courbes experimentales (Fig. 5). Dans ces conditions, la vitesse d’echange du cholesterol libre entre a- et p-lipoproteines est de 0.06 mg/h. Inversement, si l’on impose cette m&me vitesse, tout en faisant dCcro9tre les tailles des compartiments, en accord avec les resultats expkrimentaux, les courbes analogiques sont deplacees vers des valeurs t&s inferieures aux valeurs experimentales (Fig. 5). (c)

DISCUSSION

(I) Echasges en&e &n&es et tipo~o~i~s La reproduction, par calcul analogique, des cot&es Bhkim.

Biopkys.

experimentales a exige R&a.

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d’ajuster conjointement les coefficients de variations des vitesses de transfert et les coefficients de partage du cholesterol labile des hematies en fonction de leur voie d’esterification. Cette exigence constitue en elle-m&me un argument supplementaire de l’existence dune esterification directe du cholesterol des hematies au niveau de leur membrane. Les travaux d&its jusqu’a present, en particulier ceux de GLOMSET~~, montraient que le cholestkol libre des B-lipoprotemes et surtout celui des a-lipoproteines Ctaient des substrats de la lCcithine-cholestCrol-acyl-transferase. Lors de l’incubation d’u- ou de /Hipoproteines en presence d’hematies, I’estCrification se Porte preferentiellement sur le cholesterol labile des hematies. Ce mecanisme inattendu est retrouve lorsqu’on incube du sang entieP. Soulignons, en outre, que 1’ClCmentle plus sensible du modele test& mise a part la variation de vitesse, n’est pas le niveau de la fuite en tant que tel (a * 20%), mais le coefficient de partage entre esterification directe et esterification diff&Ce. Une large approximation sur les valeurs des parambtres a et K des equations traduisant les variations de taille des compartiments (Fig. I et 3), n’invalide en aucun cas les valeurs de vitesses d’echange dCterminCesa l’aide de ces parametres. La deuxieme curiosite de nos resultats concerne l’existence d’un gradient de vitesses d’echange. Remarquons au prealable que ce gradient affecte surtout les Cchanges de cholesterol entre a-lipoproteines et hematies et qu’il est moins important pour les Cchanges entre les /?-lipoproteines et les hematies. La participation des a-lipoproteines dans la fraction “/?I’ peut Ctre suspectee. Les consequences quantitatives de cette contamination ne peuvent &tre precisees. A l’extreme, la vitesse de transfert du cholesterol entre #l-lipoproteines et hematies serait constante, la faible gradient observe n’etant imputable qu’a la presence du contaminant a-lipoproteique. Nous discuterons maintenant des causes possibles de ce gradient de vitesse. 11peut etre impute a la degradation des conditions de milieu. On entend par la, le fait que l’organisation structurale des hematies ou des lipoproteines se modifierait progressivement avec le temps. Ces modifications atteignent, pour le moins, les hematies, leur hemolyse finale pour de longues durees d’incubation, en temoigne. Mais, l’hypothese formulee ici concerne des modifications fines s’amorcant d&s que hematies ou lipoproteines sont soustraites de leur milieu physiologique. On peut Cgalement donner de cette vitesse variable une autre interpretation. On s’est demand6 si les mCmes courbes de radioactivite specifique pouvaient &tre obtenues, soit a l’aide d’un modele a deux compartiments s’echangeant avec une vitesse decroissante dans le temps (Modele I), soit a l’aide dun modele catenaire ii n compartiments s’echangeant avec des vitesses constantes (Modele 2). La Fig. 9 illustre ce probleme. Dans cet exemple, le Compartiment A du Modele I est subdivise en quatre sous-compartiments. La resolution du probleme a necessite une etude mathematique poussee et sa verification a et6 realisee par calcul numerique et analogique*a. Le resultat est le suivant: le Modele 2 fournit la m&me reponse que le Modble I pour n = 2 et pour une valeur pdcise du rapport des deux sous-compartiments. 11 suffit done de subdiviser en deux sous-compartiments et dans un rapport de&i le cholesterol globulaire ou lipoproteique pour parvenir, avec une precision de 3%, aux m&mes courbes que celles obtenues dans les essais ou l’on imposait une vitesse variable entre deux compartiments seulement. Ce resultat n’est pas en contradiction avec ceux relates dans le paragraphe precedent. On s’btait, en effet, place dans des conditions telles que ce rapport n’etait pas respect4 puisqu’on lui avait don& des valeurs suggerees par les resultats experimentaux. 11faut ajouter, Biochim. Biophys.

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MO~VE~ENTS

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de plus, que la dtSmonstration faite pour B = 2, t’est a fortiori ponr B = 3,4,5 . . . II y a done une infmite de solutions permettant l’identit& de r+onse des Mod&s I et 2. On peut done ponser que l’une d’entre elks correspond a la &alit6 physiologique. La vitesse d’kchauge variable, ainsi observee entre les hematies et les a- ou /Mipoprotdiness, pourrait Ctre l’image globale d’echanges constants de cholesterol entre 7~sous-compartiments globulaires en chaine et entre le k&me et le compartiment lipoprotrlique, ou au contraire entre n sous-compartiments lipoproteiques et le nibme et les hematies. Modilo

1

Modilr 2

Fig. g. Mod&s d’t?chauge entre deux compartiments (A et B) pouvant aboutir aux m&mes COUTbes de radioactivit& sp&%ques dans ces compartiments (void texte). Dans le c-as da Mod&le I, la vitesse cn est variable en fonction du temps. Dans le c~fl du ModPle 2, les vitesses b, et, c)r. et @a sont constantes.

11s’agit done de savoir si la dCc&ration des &changes de cholesterol libre entre lipoprotCines plasmatiques et hematies lors de leur incubation, s’explique par une organisation structurale contingente au caractere in vitro de l’expkimentation ou inherente au materiel biologique utilisC, Dans les deux cas, il suffit que l’un des Clements (hematies ou ~~prot~~es) prbente l’une de ces particularitb. On remarquera que le gradient de vitesse est plus &eve dans le cas des ~-~pop~t~~es (o.oo8 a 0.002 m&h) que dans celui des ~-~poprot~ines (o.oro A o.ooS m&h). Or la fuite du cholesterol glob&&e est a~o~mativement deux fois plus importante avec les a-lipoprot&nes qu’avec les /?-lipoproteines (42% et 24%). La disparition dune fraction du cholest&ol membranaire des hematies au tours de l’incubation pour&t ainsi entraver la disponibilitt! des autres molecules aux &changes. Par ailleurs, l’existence m&me de la fuite, peut suggker que le cholesterol des membranes globulaires est r6parti dans des compartiments diff&emment accessibles aux Cchanges. Dans une seconde Bventualite, le gradient cinetique est impute aux lipoproteines. D’une part. les separations lipoprotkiques que nous avons rCalisr5essont gross&es et les fractions isol&ss ne sont pas homogenes. L’h&&og&u!ite structurale dont nous parlions plus haut est done directement impliquee par ce fait meme. D’autre part, les variations de concentrations en cholesterol libre et estkifie au sein des lipoproteines pendant les ~cubations sugg&rent des modifications structurales consecutives a t’incubation elle-m&me. Ce sont d’ailleurs Bimhim.

Biophys.

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les a-lipoproteines qui prksentent simultanement les plus grandes variations ponderales et cinetiques. Aucun element ne permet actuellement de guider notre choix. On soulignera que, dans le cas oh l’existence du gradient cinetique s’explique par une modification du materiel biologique affectant les hematies, la portee physiologique des valeurs des vitesses initiales depend de la remarque suivante. Chez nos rats, un gramme de sang entier contient respectivement 0.043 et 0.076 mg de cholesterol libre dans les c+ et les p-lipoproteines pour 0.6 mg de cholesterol globulaire. Or, rapportees a cette m&me masse globulaire, les quantites de cholesterol libre des cc- et b-lipoproteines utilisees dans les experiences relatees ici sont respectivement de 0.060 et 0.360 mg. La question est done de savoir si la concentration en cholesterol libre des lipoproteines influe sur la vitesse de ses Cchanges. Nous verrons qu’il n’en est pas ainsi24. Les valeurs des vitesses initiales auraient, done, dans l’hypothbse retenue ci-dessus, une reelle signification physiologique. On constate qu’elles sont voisines l’une de l’autre. Exprimees par rapport a I g d’hematies (soit, 1.5 mg de cholesterol), elles atteignent 0.070 mg/h pour les a-lipoproteines et 0.064 mg/h pour les /?-lipoproteines. Exprimees par rapport a I g de sang (0.6 mg de cholesterol), on a respectivement 0.029 et 0.025 mg/h). Signalons enfin que BASFORD et aL6 avaient mis en evidence l’existence d’un compartiment de cholesterol libre non Cchangeable dans les ct-lipoproteines. Nos r-Csultats s’accordent avec cette observation puisque la vitesse d’echange tend vers une valeur tres faible (0.002mg/h). (II)

Echanges entre cc- et fi-lipofwot&aes Ce type d’incubations a necessite un certain nombre de precautions. En particulier, les mesures n’ont CtC eff ectuees qu’a deux temps : temps zero et apres I, 2 ou 3 h dincubation. Ceci Bvite soit de faire attendre les Cchantillons au refrigerateur, soit d’interrompre le cycle d’ultracentrifugation. En consequence, on n’a pu determiner l’evolution des variations de concentrations en fonction du temps comme cela a ete fait pour lesautres types d’expkences. La description du modele est done incomplete dans ces conditions, et la resolution par calcul analogique devient plus delicate vu le nombre de parametres a definir. Par contre, pour les “experiences isotopiques” il est necessaire de mesurer les radioactivites specifiques Q plusieurs temps (3 ou 4 au minimum). Dans ces conditions certains Cchantillons ont attendu au refrigerateur avant d’&tre centrifuges. Pendant cette p&ode, des &changes, sans doute ralentis, devaient avoir lieu, et fausser ainsi les resultats. Ces imperfections dam l’experimentation sont la cause probable des mauvais resultats enregistrb. Neanmoins, nous pensons que la valeur de la vitesse ainsi mesuree dans I g de plasma (0.06 mg/h) donne, une idee correcte de l’intensite des echanges. Exprimee pour I g de sang (hematocrite 0.4), elle est de 0.036 mg/h. On remarque que, dans I g de sang, la vitesse d’echange du cholesterol libre entre les CI-et &hpoprotCines et les vitesses initiales d’echanges entre chacune d’elles et les hematies sont du m&me ordre de grandeur. Une note preliminaire a ce memoire a CtC precedemment pubhCee6.

Apres administration Bbochim. Biophys.

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a des rats, le plasma a BtC prClevC et

MOUVEYENTS

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subdivise en deux fractions lipoproteiques: a (d > 1.063) et /?(a < 1.063). On a procede a des incubations a 37”, n’excedant pas une dunk de 7 h. soit de plasma seul, soit de solutions a- ou /Hipoproteiques, en presence d’hematies non marquees. L’etude des variations de concentrations et de radioactivites sptkifiques du cholesterol libre et est&ifiC, a conduit a des schemas de mouvements de cholesterol. Ils ont &tB testes par calcul analogique. I. Pendant l’incubation de solutions d’a-lipoproteines en presence d’hematies, on observe, outre les Cchanges de cholesterol libre, une fuite de 42% du cholesterol globulaire et, correlativement, une augmentation des concentrations en cholesterol libre et esterifie de la lipoproteine. Les resultats isotopiques permettent de calculer que l’esterification s’effectue pour 80% directement a partir du cholesterol labile des hematies et pour 2074, seulement, a partir de cholesterol libre a-lipoproteique. Les mCmes observations sont faites a propos des /I-lipoproteines incubees avec des hematies, mais l’amplitude des mouvements est moindre. 2. L’ajustage des courbes obtenues par calcul analogique, aux courbes fournies par l’experience, a CtCreal&C en jouant a la fois sur la valeur de la vitesse d’echange du cholesterol libre et sur celle du coefficient de repartition relative a la voie d’estkification. La vitesse d’echange mesuree par cette methode est variable en fonction du temps. ExprimCe par rapport a I g d’hematies, elle passe de 0.029 a 0.007 mg/h dans le cas des a-lipoproteines, et de 0.024 a 0.019 mg/h dans le cas des /l-lipoproteines. La repartition, en fonction de leur origine, des quantites de cholesterol qui s’esterifient, determinCe par calcul analogique est voisine de celle calculee a park des radioactivites specifiques. 3. Au tours d’incubations de plasma, d’une duree de deux heures, l’esterification ne s’effectue qu’au niveau des a-lipoproteines. La vitesse d’echange du cholesterol libre entre u- et B-lipoproteines dCterminCe par calcul analogique, est de l’ordre de 0.06 mg/h pour I g de plasma. Les resultats suggerent, par ailleurs, l’existence d’Cchanges de cholesterol estCrifiC. 4. Ajoutons qu’au tours des dialyses prealables aux incubations de lipoproteines, une esterification de cholesterol libre s’effectue seulement dans le cas a-lipoprotkines (37% en 24 h). En outre, la simple addition d’hematies a une solution d’a-lipoproteines s’accompagne d’une captation instantanee de cholesterol libre d’origine a-lipoproteique, par les hematies (8%). Ce phenomene est moins net dans le cas des /Hipoproteines. Ces divers resultats sont discutb, compte tenu de 1’hCtCrogCnCitCdes fractions lipoproteiques isolees. REMERCIEMENTS

Ce travail a CtCaccompli pourl’essentiel dans le departement de Biologie duCommissariat a 1’Energie Atomique au centre de Saclay. Les auteurs sont reconnaissants a Madame SIMONNET et a Madame VERNEAU de leur assistance technique. Ce travail a Cte enfin pour&vi et acheve grace a une subvention de la D.G.R.S.T. (contrat No. 707-2,

447). Une calculatrice EAI 231 R a CM mise a notre disposition par le Departement d’electronique gemkale de Saclay. Nous remercions vivement Messieurs CAILLET, Biochim. Biophys. Acta.

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F. I)‘HOLLANI)ER, F. CHEVALXZER

DEAT, BONNE~LAY et SEYMETES, pour les multiples cons&s qu’ils nous ant prod&u& for-9 de notre initiation au calcul analogique, et lors du traitement effectif de notre probkme. Nous tenons Cgalement Q remercier le Docteur INFANTE, et en particulier, Mademoiselle CATALA qui a rklis6 pour now les analyses Gxtrophor&iques et les colorations lipidiques des fractions lipoprotkiques que nous lui awns fonrnies (Unit6 INSERM de l’H8pital Saint Antoine & Paris). BIBLIOGRAPHIE

9 to 11 x2 “3 x4 15 x6 =7 E8 19 20 21 22 23 24 25 26

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