Les transporteurs d’oxygène à base d’hémoglobine et les tentatives de substituer les globules rouges

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Transfusion Clinique et Biologique 14 (2007) 464–473 http://france.elsevier.com/direct/TRACLI/

Revue générale

Les transporteurs d’oxygène à base d’hémoglobine et les tentatives de substituer les globules rouges Hemoglobin-based oxygen carrier and trials to substitute red blood cells Y. Smani a,b,*, P. Labrude a, C. Vigneron a, B. Faivre a a

Laboratoire d’hématologie et de physiologie, EA 3452, faculté de pharmacie, université de Nancy, 5, rue Albert-Lebrun, 54000 Nancy, France b Laboratoire de médecine et de chirurgie expérimentale, hôpital universitaire Virgen-del-Rocio, université de Séville, avenue Manuel-Siurot, 41013 Séville, Espagne

Résumé L’idée de construire un substitut sanguin a été stimulée par le besoin des militaires au cours des deux dernières guerres mondiales et par le désastre de la transmission transfusionnelle de germes pathogènes (hépatite B dans les années 1960, VIH dans les années 1980 et hépatite C dans les années 1990) qui a eu pour effet de réduire le nombre de donneurs potentiels. Parmi ces substituts sanguins, il existe les perfluorocarbures et les transporteurs d’oxygène à base d’hémoglobine. Ces derniers sont d’origine naturelle : humaine et bovine ou recombinante. Ces hémoglobines d’origine naturelle peuvent faire appel à trois types de modifications : chimiques (pontage intramoléculaire, polymérisation, conjugaison à des macromolécules et combinaison de plusieurs modifications chimiques), génétiques ou technologiques par microencapsulation. Ces transporteurs d’oxygène à base d’hémoglobine sont à différentes phases d’essais cliniques et certaines de ces solutions présentent des effets secondaires (hémodynamique et oxydatif). La compréhension de ces effets et la possibilité de les corriger conditionnent leur utilisation à grande échelle et les retombées économiques qu’ils peuvent générer. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Abstract The idea to develop a blood substitute was stimulated by the need of military in the last two world wars and by transmission of pathogenic germs (Hepatitis B in 1960, HIV in 1980 and Hepatitis C in 1990) during blood transfusion that limited the donor blood transfusion. There are two main groups of blood substitutes: perfluorocarbon emulsions and hemoglobin-based oxygen carriers (HBOC). These latter are of natural origin: human, bovine or recombinant and undergo three modifications types: chemicals (intramolecular cross-linking, polymerisation, conjugation to macromolecules and combination of several chemical modifications), genetics or technological by microencapsulation. HBOCs are in different phases of clinical trials and some of them present side effects (hemodynamic and oxidative). The understanding of these effects and the possibility of correcting them, condition their use on a large scale and the economic consequences, which they can generate. # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Hémoglobine ; Hémoglobine modifiée ; Transporteur d’oxygène ; Substitut sanguin ; Transfusion sanguine Keywords: Hemoglobin; Modified hemoglobin; Oxygen carrier; Blood substitute; Blood transfusion

La transfusion sanguine est bénéfique dans des situations spécifiques telles que les syndromes anémiques graves de nombreuses maladies, les saignements entraînés par certains gestes chirurgicaux. . . [1], mais il existe une longue liste de risques et d’effets secondaires liés à sa pratique [2]. Plusieurs études récentes indiquent que la transfusion sanguine est

* Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (Y. Smani).

associée à des risques de transmission des maladies infectieuses (virus, bactérie, prions) et d’autres pathogènes [3–6] et à des coûts très chers [7]. Dans les pays développés, le risque de transmission virale via la transfusion sanguine a diminué considérablement ces dernières années, cependant, de nouveaux virus sont détectés régulièrement [8]. Dans les pays moins développés, le risque de transmission de maladies infectieuses est encore extrêmement élevé [9]. La connaissance de ces risques lors de la transfusion de concentrés érythrocytaires ou d’autres dérivés sanguins a eu

1246-7820/$ – see front matter # 2008 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.tracli.2007.12.007

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pour effet de réduire le nombre de donneurs potentiels, conséquence d’une sélection accrue, alors que parallèlement la demande en ces produits ne cesse d’augmenter. Il est estimé que 13,4 millions d’unités de sang ont été collectées en l’an 2000 et 12,5 millions d’unités ont été transfusées aux États-Unis en l’an 2003, soit un taux de 93 % [10]. Ainsi face à ces risques, à cette baisse de dons et à cette demande croissante de produits dérivés du sang à partir des années 1980, il est devenu impératif de développer des stratégies alternatives [11]. Parmi ces stratégies alternatives, il existe les « substituts sanguins ». Deux axes de recherche ont été développés concernant deux classes pharmacologiques différentes de substituts sanguins : les perfluorocarbures ou PFC et les transporteurs d’oxygène à base d’hémoglobine ou HBOCs. Quelle que soit la molécule, le substitut idéal doit pouvoir délivrer de l’oxygène aux tissus, provoquer un minimum d’effets secondaires, ne pas nécessiter de contrôle de compatibilité, rester stable pendant tout la période de stockage, avoir une durée de demi-vie prolongée dans la circulation, être facilement reconstitué et avoir un coût raisonnable. À l’heure actuelle, aucun des produits en cours d’évaluation ne réunit toutes ces qualités. L’objectif de cette revue est de faire un rappel bibliographique sur les substituts sanguins et plus particulièrement les HBOCs : leur origines, les différentes modifications apportées, ainsi que les différents essais précliniques ou cliniques réalisés jusqu’à présent. 1. Les transporteurs d’oxygène à base d’hémoglobine 1.1. Les généralités Lorsque l’hémoglobine est soustraite de son environnement naturel, le globule rouge, elle reste capable de transporter l’oxygène et a, comme avantage, de ne pas induire de modification antigénique du fait de l’absence de la membrane cellulaire de globule rouge. En revanche, cette hémoglobine libre présente deux inconvénients majeurs :  lors de l’extraction des globules rouges, le 2,3 diphosphoglycérate (2,3-DPG) est libéré et n’est plus disponible pour la molécule d’hémoglobine, ce qui provoque un déplacement vers la gauche de la courbe de dissociation, avec comme conséquence une diminution de la pression partielle en oxygène pour laquelle 50 % de l’hémoglobine est sous forme oxyhémoglobine (P50). Cette P50 est inversement proportionnelle à l’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène. La P50 de l’hémoglobine humaine normale est aux alentours de 27 mmHg dans les conditions physiologiques, et devient égale à 12 mmHg dans les mêmes conditions lorsque l’hémoglobine est extraite du globule rouge. Cette trop forte affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène devient alors un facteur limitant pour l’oxygénation tissulaire ;  sa structure tétramérique n’est pas modifiée lors de son extraction du globule rouge, mais l’absence de la membrane de celui-ci soumet la molécule à différentes attaques

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chimiques, enzymatiques et mécaniques qui peuvent l’altérer. Elle est ensuite rapidement dissociée en dimères qui sont alors éliminés de la circulation par extravasation et filtration rénale. Il en résulte une néphrotoxicité [12] ou des œdèmes tissulaires. 1.2. L’historique Dès 1898, Von Stark administra une solution d’hémoglobine à des patients, afin de traiter une anémie, mais l’instabilité des solutions provoqua l’abandon des recherches [13]. En 1916, de faibles quantités d’hémoglobine ont été administrées à l’homme, afin d’étudier sa clairance rénale. Cette pratique mit en évidence des signes de toxicité rénale [14]. En 1937, fut découvert un effet vasopresseur systémique et pulmonaire chez l’animal, pas uniquement dû à l’expansion volémique [15]. En 1949, fut publié un cas clinique dans lequel l’action bénéfique potentielle de l’effet vasopresseur de l’hémoglobine a été constatée chez une jeune femme en choc hémorragique sévère du post-partum et ne répondant pas à l’administration de colloïdes, de cristalloïdes et de sang homologue [16]. En derniers recours, l’infusion de 300 mL d’une solution d’hémoglobine à 6 % avait augmenté la pression artérielle et donné lieu à une reprise de la conscience. L’effet vasomoteur est supposé à l’époque être dû au fait que l’hémoglobine libre capte un vasorelaxant appelé plutard le monoxyde d’azote (NO), entraînant ainsi une vasoconstriction. Il est constaté que lors de la réanimation d’un sujet en état de choc, une augmentation limitée des résistances vasculaires systémiques peut être bénéfique si elle améliore la perfusion des organes vitaux. Mais l’élévation des résistances vasculaires pulmonaires et coronaires peut avoir des effets indésirables majeurs chez certains patients. La toxicité de ces solutions d’hémoglobine libre a été attribuée à la présence de contaminants lipidiques et protéiniques des membranes érythrocytaires. Les aminophospholipides (phosphatidyléthanolamine et phosphatidylsérine) sont néphrotoxiques et entraînent une hémolyse. Ces substances activent également la coagulation intravasculaire, le complément, les plaquettes et les leucocytes, responsables de la libération des médiateurs de la réaction inflammatoire [17]. En 1970, la découverte des techniques de purification a permis d’éliminer certains effets toxiques de l’hémoglobine libre liés essentiellement à la présence des membranes érythrocytaires ou stromas. Ainsi fut mise au point la stroma-free hemoglobin ou SFH ou encore hémoglobine dépourvue de stroma [18]. Les progrès actuels observés dans le développement des solutions à base d’hémoglobine ont été permis grâce à une technologie très avancée totalement absente dans le premier quart de XXe siècle [19]. Les premiers travaux ont été de préparer une hémoglobine tétramérique naturelle. 1.3. Les origines des hémoglobines L’hémoglobine utilisée en tant que substitut sanguin est d’origine naturelle : humaine et bovine ou recombinante.

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1.3.1. L’hémoglobine humaine Est obtenue après la lyse des globules rouges de sang périmé ou non de donneurs. Il a été estimé que 5 à 10 % de ce sang humain périmé sert à la production des HBOCs [20]. Sa structure tétramérique physiologique au sein de globule rouge ne peut être conservée hors de celui-ci et elle se scinde en deux dimères alpha–bêta, ce qui réduit son poids moléculaire (PM) à environ 32 kDa. Elle exerce alors une pression oncotique plus forte [21], ce qui limite sa concentration d’utilisation à 7–8 g/dL. En solution, cette hémoglobine a plus d’affinité pour l’oxygène, puisque le 2,3-DPG n’est plus disponible, réduisant ainsi sa P50 de 27 mmHg à 12–14 mmHg. Administrée dans la circulation, elle la quitte rapidement pour être éliminée par les reins [22] et produire une diurèse osmotique dans l’heure suivant son administration intraveineuse [23]. Des effets indésirables ont été observés en présence de l’hémoglobine en solution, dont certains ont été attribués au stroma du globule rouge. Parmi ces effets, nous trouvons : les effets vasomoteurs ; la néphrotoxicité [23] ; l’interférence avec la fonction des macrophages ; le dépôt de fer ; l’histaminolibération ; les effets antigéniques et l’activation du complément, des kinines et de la coagulation. Les trois derniers effets sont attribués au stroma de globule rouge. Par ailleurs, en solution, cette hémoglobine est capable de s’autoxyder en méthémoglobine et doit de ce fait être stockée dans un milieu dépourvu d’oxygène. De par son origine humaine, elle n’est disponible qu’en quantité limitée et comporte un risque important de transmission virale. Certains des inconvénients décrits ci-dessus n’existent pas avec d’autres hémoglobines. 1.3.2. L’hémoglobine bovine L’hémoglobine d’autres espèces, en particulier celle des bovidés, offre l’avantage de ne pas nécessiter le 2,3-DPG et de ce fait la P50 est d’environ 30 mmHg, que l’hémoglobine soit située dans le globule rouge ou non. Cette P50 favorise la cession de l’oxygène aux tissus. Aussi, l’hémoglobine bovine est apparue comme une alternative intéressante à l’hémoglobine humaine, d’autant plus qu’elle est disponible en grande quantité et à un coût avantageux. Cependant, d’autres problèmes limitent actuellement son utilisation [24] tels que :  le risque de transmission du prion et donc de l’encéphalite spongiforme bovine à l’homme ;  la difficulté de purification avec persistance de déchets membranaires, donc la possibilité de production d’anticorps antibovin après infusion de grandes quantités de protéines bovines. 1.3.3. L’hémoglobine humaine recombinante Tout d’abord a été produite chez Escherichia coli (E. coli) (rHb 1.1, Somatogen), dont le génome a été modifié pour contenir les gènes codant à la fois pour les chaînes alpha et bêta de la globine [25]. Ces mêmes modifications génétiques ont été produites ultérieurement par la levure (Saccharomyces cerevisae) et le porc transgénique. Avec l’hémoglobine recombinante produite chez E. coli, le problème de l’affinité pour l’oxygène a été résolu par substitution d’un seul acide aminé

(bêta–asparagine par 108-bêta–lysine). La question de la dissociation en dimères alpha-bêta est réglée par un pont covalent, via une glycine, entre les deux chaînes alpha, réalisant ainsi une fusion terminale (dialphaglobine), ce qui a stabilisé le tétramère et augmenté sa demi-vie plasmatique. Ainsi, cette hémoglobine a une P50 de 30 à 33 mmHg, une demi-vie plasmatique quatre fois supérieure à celle de l’hémoglobine libre, une durée de conservation infinie sous forme congelée, de 24 heures à 4 8C et de cinq heures à température ambiante. Des études de tolérance [26] ont été réalisées chez 24 volontaires sains : quatre doses de 0,015 à 0,11 g/kg ont été injectées à un débit de 2,75 ml/kg par heure, la solution contrôle étant l’albumine humaine, n’ont montré aucune toxicité rénale, hépatique ou pulmonaire et aucune excrétion urinaire. La pression artérielle systolique ou diastolique n’était pas modifiée significativement. Mais une température corporelle supérieure à 38 8C apparaissait entre trois et huit heures après l’infusion chez 12 sujets, avec des céphalées, des myalgies et des frissons, qui ont cessé soit spontanément, soit après prise d’ibuprofen (400 à 600 mg). Ces risques typiques de la présence d’endotoxines ont imposé une amélioration dans les étapes de purification, ce qui a permis de faire disparaître ces effets indésirables. Des études de phase II avec l’OptroTM ou rHb 1.1 (une hémoglobine recombinante) développé par Somatogen sont en cours en Amérique du Nord pour des indications de pontages aortocoronariens [27]. Des études d’hémodilution normovolémique et d’utilisation en oncologie ont été planifiées. Des modèles d’hémoglobine recombinante exprimée par les végétaux sont également à l’étude. Des travaux menés par Dieryck et al., en 1997 à l’Inserm U299 (CHU de Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, France) en partenariat avec la société Biocem (Groupe Limagrain, Aubière, France) ont abouti à la production d’hémoglobine humaine dans les racines et les graines de plants de tabac transgénique (Nicotiana tabacum variété Xanthi transformé par Agrobacterium tumefaciens) [28]. L’hémoglobine obtenue est ensuite purifiée par chromatographie. Toutefois, la quantité d’hémoglobine synthétisée demeure actuellement trop réduite pour un transfert à l’échelle industrielle. Un nouveau prototype protéine–hème obtenu par génie génétique à partir des plantes et des micro-organismes tels que les bactéries (E. coli) et les champignons (Aspergillus niger) sera réalisé dans le cadre d’un projet européen Genomics and Blood Substitutes for 21st Century Europe ou EuroBloodSubstitutes. La fabrication et la mise en forme de prototype protéine–hème se réalisent actuellement par deux équipes italiennes. Elle sera ensuite évaluée par le laboratoire d’hématologie et de physiologie de la faculté de pharmacie de Nancy. Cette hémoglobine aura pour objectif de résoudre les problèmes associés avec la transfusion sanguine. 1.3.4. Une autre origine possible Les scientifiques avaient récemment recherché la possibilité d’employer l’hémoglobine de ver pour développer un substitut sanguin après avoir extrait avec succès l’hémoglobine à partir de deux vers communs : un ver de terre (Lumbricus terrestris) et un ver marin (Arenicola marina). L’hémoglobine de ces

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espèces est présente en tant que grand polymère avec un PM de 3600 kDa [29]. Elle est 50 fois plus grosse que l’hémoglobine humaine [30]. Elle représente une perspective passionnante comme substitut sanguin potentiel. Sa grande taille laissait supposer qu’elle n’aurait besoin d’aucune modification chimique pour prévenir la néphrotocixité, la dimérisation et l’augmentation d’affinité pour l’oxygène retrouvées avec les autres hémoglobines dans la circulation sanguine. Les essais précliniques de cette hémoglobine mettent en évidence la conservation de sa capacité forte à transporter l’oxygène, l’absence de toxicité apparente et l’absence de réaction allergique chez la souris [31]. Cette hémoglobine est naturellement résistante à l’autoxydation et n’induit pas une vasoconstriction après son administration chez le rat [32]. Ces différentes catégories d’hémoglobines tétramériques présentent des inconvénients, cités précédemment, qui limitent leur utilisation. Pour prolonger la demi-vie vasculaire de l’hémoglobine libre, ralentir son élimination rénale et maintenir une affinité normale pour l’oxygène (atteindre une P50 proche de la valeur normale, autorisant une fraction d’oxygène inhalée de 21 %), plusieurs modifications ont été envisagées. 1.4. Les solutions d’hémoglobine modifiée Ainsi pour pallier à ces limites, des modifications chimiques et génétiques ainsi qu’une encapsulation dans une membrane lipidique synthétique pour réaliser des liposomes ont été successivement apportées à l’hémoglobine tétramérique humaine ou bovine hautement purifiée. Les modifications ont permis d’obtenir des produits très différents avec des caractéristiques uniques et un comportement clinique variable. Ces hémoglobines naturelles peuvent faire appel à trois types

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de modifications : chimiques, génétiques ou technologiques par microencapsulation. 1.4.1. Les modifications chimiques Quatre grands types de modifications chimiques sont à l’origine de produits actuellement en cours d’évaluation préclinique ou clinique : les pontages intramoléculaires, la polymérisation, la conjugaison à des macromolécules et la combinaison de plusieurs modifications chimiques. 1.4.1.1. Les pontages intramoléculaires. Sont des liaisons entre différentes sous-unités, de type alpha–alpha (Fig. 1A), bêta–bêta ou alpha–bêta. Ce type de liaison permet de stabiliser la structure tétramérique, sans modification de la masse moléculaire, de maintenir une affinité physiologique pour l’oxygène, et d’augmenter le temps de rétention dans la circulation sanguine [33]. Ce type de modification a été utilisé pour produire la diaspirin cross-linked hemoglobin (DCLHbTM). Dans ce cas, le 3,5-dibromosalicyl bisfumarate (DBBF ou diaspirine), agent bifonctionnel de faible masse moléculaire a été utilisé pour permettre un pontage entre les résidus alpha99Lys des deux sous-unités alpha de l’hémoglobine humaine. La P50 de cette solution est de l’ordre de 29 mmHg. Cette hémoglobine a été élaborée par l’armée des États-Unis, puis développée sous le nom d’HemAssistTM par Baxter Healthcare Corporation (Deerfield, IL, États-Unis) [34]. Les essais cliniques ont montré qu’elle possédait une demi-vie d’environ deux heures pour une dose injectée de 50 mg/kg et de quatre heures pour une dose de 100 mg/kg [34]. Le développement de ce produit a été stoppé dès 1998 en phase III des essais cliniques [27]. Trop d’effets secondaires tels que l’hypertension n’étant pas gérables. À l’heure actuelle la firme

Fig. 1. Hémoglobine modifiée chimiquement. (A) : tétramère ponté ; (B) : polymère composé de trois tétramères liés entre eux ; (C) : tétramère conjugué ; (D) : hémoglobine conjuguée avec des macromolécules et polymérisée. D’après Rémy et al., 1999 ; Chang, 1999.

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été approuvée pour une utilisation compassionate ou « soins palliatifs » chez les patients et elle attend une décision pour un usage clinique courant [37].

Fig. 2. Représentation de liposome encapsulant l’hémoglobine. D’après Stowell et al., 2001.

Baxter a abandonné totalement toute recherche et développement sur les substituts sanguins. 1.4.1.2. La polymérisation. S’effectue via des liaisons intermoléculaires (Fig. 1B). Ce type de pontage permet d’accroître la masse moléculaire et donc d’augmenter très fortement le temps de rétention vasculaire. La polymérisation permet d’éviter les problèmes de dissociation en dimères comme dans le cas de la SFHb. Le glutaraldéhyde, un agent bifonctionnel, permet de réaliser ce pontage grâce à ses fonctions aldéhydes actives. Il est utilisé dans la préparation d’HemopureTM [35] et de PolyHemeTM [36]. HemopureTM (HBOC-201), produit développé par la société Biopure Corp (Boston, MA, États-Unis), est préparé à partir de l’hémoglobine bovine qui possède naturellement une affinité réduite pour l’oxygène par rapport à l’hémoglobine humaine. Cette solution possède une P50 de 34 mmHg et, chez l’homme, une demi-vie proche de 20 heures pour une dose administrée de 45 g [35]. Il s’agit là, vraisemblablement, du produit le plus avancé. En Amérique du Nord, les essais cliniques de phase III sont terminés depuis août 2000, et leurs résultats sont soumis à la food drug administration (FDA) [27]. Cette solution a été approuvée pour une utilisation compassionate ou « soins palliatifs » chez les patients [37]. En Afrique du Sud, HemopureTM a obtenu une AMM limitée à une utilisation dans le traitement d’anémies sévères et la transfusion en raison des ravages faits par le sida et a été commercialisée courant 2001 [38]. PolyHemeTM est une solution développée par Northfield Laboratoires (Evanston, IL, États-Unis). Elle est préparée à partir d’hémoglobine humaine pyridoxylée afin d’augmenter la P50, polymérisée avec le glutaraldéhyde et purifiée pour enlever les résidus des tétramères [36]. Cette solution possède une P50 de 26 mmHg et une demi-vie chez l’homme de 24 heures pour une dose injectée d’environ 300 g [39]. Elle est développée comme une alternative aux globules rouges en chirurgie et en cas de traumatismes [39]. Cette solution est en phase III d’essais cliniques pour des indications de traumatismes [27]. Ces essais ne sont pas encore terminés, mais le protocole et les résultats préliminaires ont été discutés sur le site internet de Northfield Laboratoires [37]. Aux États-Unis, cette solution a

1.4.1.3. La conjugaison à des macromolécules. Cette modification chimique a pour but d’augmenter la masse moléculaire afin d’accroître la demi-vie plasmatique, en réduisant notamment les phénomènes d’extravasation et de fuite rénale, de diminuer la reconnaissance par le système immunitaire [40] et d’augmenter la viscosité et la pression oncotique des protéines. Les agents utilisés pour ce type de modification jouent de plus le rôle d’effecteur allostérique pour se substituer à la fonction du 2,3-DPG et d’augmenter la P50. Ils s’attachent sur des sites tels que les cystéines présents à la surface de la molécule d’hémoglobine [41] (Fig. 1C). Quatre hémoglobines conjuguées ont été développées, une seule est actuellement en essais cliniques. Parmi elles, il existe le polyxyéthylène glycolhémoglobine (PEG-Hb) [42], le polyxyéthylène glycolhémoglobine activé par le maléimide (MP4) [43], le polyoxyéthylène(POE)-hémoglobine pyridoxylée (PHP) [44] et l’hémoglobine conjuguée au dextran-benzène-tétracarboxylate (Hb-Dex–BTC) [45]. Pour le PEG-Hb, le PEG est utilisé dans la préparation d’un conjugué d’hémoglobine d’origine bovine par la compagnie Enzon (Piscataway, NJ, États-Unis). Le conjugué possède une demi-vie de 20 heures chez le rat et une P50 de 26 à 28 mmHg [42]. Les essais cliniques avec cette solution ont été arrêtés précocement en phase Ib [27]. Plus récemment, le MP4 a été développé par la compagnie Sangart (San Diego, États-Unis). Le PEG est utilisé dans la préparation de ce conjugué d’hémoglobine humaine appelé aussi HemospanTM. Ce conjugué possède une faible P50, un large diamètre moléculaire et une grande viscosité [46]. Les essais cliniques de phase I et II essentiellement pour des chirurgies orthopédiques sont complétés en Europe [47] et un autre essai clinique de phase II a commencé aux États-Unis en l’an 2005. Dans le cas de la PHP développée par Ajinomoto/Apex Bioscience Inc. (Durham, NC, USA), le POE est conjugué à l’hémoglobine humaine. La solution possède une demi-vie estimée à 36 heures dans un modèle canin d’échange transfusionnel de 80 % du volume sanguin. Les essais cliniques ont été arrêtés en phase III [27]. Pour l’Hb-Dex–BTC, le dextran 10 fixé au benzènetétracarboxylate est conjugué à l’hémoglobine humaine placentaire. Il a été mis au point conjointement par le laboratoire d’hématologie-physiologie de la faculté de pharmacie de Nancy, Pasteur-Mérieux Sérums & Vaccins (MarcyL’Étoile, France) et l’École nationale supérieure des industries chimiques (ENSIC, Nancy, France) [45]. Le conjugué d’HbDex–BTC présente une courbe de dissociation proche de celle de l’hémoglobine érythrocytaire avec une valeur de P50 de l’ordre de 23 mmHg. Sa demi-vie plasmatique a été estimée chez le cobaye à sept heures pour une dose de 0,35 g et à 9,6 heures pour une dose de 0,85 g [48]. Malgré des résultats précliniques intéressants et prometteurs, Pasteur-Mérieux Sérums & Vaccins a abandonné le projet en 1993, pour des

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raisons économiques, pour des problèmes de traçabilité du sang placentaire et suite au procès de la transfusion en France. 1.4.1.4. La combinaison de plusieurs modifications chimiques. La préparation de certains HBOCs peut s’effectuer par une combinaison de plusieurs des modifications chimiques décrites ci-dessus. Ainsi, la société Hemosol Inc., (Toronto, Canada) a élaboré une solution d’hémoglobine humaine pontée et polymérisée, HemoLinkTM, en utilisant un agent polyfonctionnel, l’o-raffinose [49] (Fig. 1D). L’o-raffinose se fixe intermoléculairement entre les chaînes bêta pour former un tétramère stable de 64 kDa. Mais il réagit également avec les acides aminés de surface du tétramère stabilisé pour former un polymère de 128 à 600 kDa. La solution finale est un mélange de 40 % de tétramère stable à 64 kDa et de 55 % de polymère [50]. L’HemoLinkTM, à une concentration de 100 g/ L, présente une P50 de l’ordre de 34 mmHg et une demi-vie plasmatique chez l’homme de 5,4 heures à la dose de 0,1 g/kg et de 14,8 heures à la dose de 0,5 g/kg [51]. Au Canada et en Royaume Uni, les essais cliniques de phase III sont terminés. Les indications thérapeutiques sont essentiellement la chirurgie cardiaque. Une autre combinaison est une polymérisation de l’hémoglobine associée à la conjugaison de molécules protectrices telles que la catalase et la superoxyde dismutase (SOD) permettant de réduire les effets toxiques dus à l’oxydation de la protéine et à la production de radicaux libres qui en résulte [52]. Les auteurs ont pu mettre en évidence l’intérêt de ce produit dans un modèle d’ischèmie–reperfusion intestinale chez le rat, situation pathologique générant de nombreuses espèces radicalaires hautement toxiques. Durant l’ischémie, le système hypoxanthine–xanthine oxydase est activé, puis pendant la reperfusion, la xanthine oxydase convertit l’oxygène et l’hypoxanthine en anions superoxydes (O2) qui, via la formation des radicaux libres, induit un dommage tissulaire. Une autre étude a montré que le dommage de la barrière hématoencéphalique et l’œdème cérébral sont réduits significativement après la reperfusion par cette hémoglobine [53]. 1.4.2. Les modifications génétiques La production d’hémoglobine recombinante par génie génétique est une approche plus récente motivée par la raréfaction de la matière première dans les établissements de transfusion sanguine. Par ailleurs, des modifications appliquées au niveau génique permettent d’aboutir à la synthèse d’hémoglobine acellulaire présentant des propriétés fonctionnelles proches de celles de l’hémoglobine érythrocytaire. L’avantage potentiel de cette approche est d’utiliser des structures moléculaires homogènes et d’avoir des sources d’hémoglobine non humaines et non animales [54]. Ce type d’hémoglobine peut être synthétisé chez différents hôtes tels que les bactéries et les levures, systèmes permettant d’éliminer virtuellement tout risque de transmission virale. La société Somatogen Inc. (Boulder, CO, États-Unis) a développé une hémoglobine humaine recombinante exprimée chez E. coli. Cette hémoglobine (rHb1.1) est modifiée en deux étapes :

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premièrement, les deux chaînes alpha sont assemblées par l’insertion d’un acide aminé (la glycine) entre le C-terminal d’une chaîne alpha et le N-terminal de l’autre (Arg(141alpha1) GlyVal(1alpha2)) et deuxièmement, un acide aminé de la chaîne bêta (Asn(108bêta)) est remplacé par le lysine [55]. Avec l’assemblage des chaînes alpha, l’hémoglobine native alpha2bêta2 est stabilisée. Cet assemblage a augmenté le temps de rétention intravasculaire d’un à deux heures [55] et a éliminé virtuellement la toxicité rénale [56]. La mutation de la chaîne bêta diminue l’affinité à l’oxygène ce qui donne une P50 de rHb1.1 de 33 mmHg [55] similaire à celle du sang humain natif (P50 : 28 mmHg). Le produit généré, rHb 1.1 ou OptroTM a fait l’objet d’essais cliniques initiés en 1991 [26,55]. La société Baxter Healthcare Corporation (Round Lake, IL, États-Unis) a pris en charge le développement de rHb 1.1 en 1998, la phase II de ces essais cliniques est terminée depuis 1999 pour diverses chirurgies, mais ce projet est aujourd’hui abandonné. La production d’hémoglobine humaine recombinante chez des porcs transgéniques fut une voie envisagée par la société américaine DNX Inc (Princetown, NJ, États-Unis) [57], mais elle souleva le problème de transmissions virales de l’animal à l’homme, ainsi que des difficultés d’ordre bioéthique et religieux, si bien que le développement du produit dut être interrompu. 1.4.3. L’hémoglobine encapsulée Une autre approche consiste à encapsuler l’hémoglobine naturelle dans une structure de type nanocapsule ou liposome par une membrane artificielle fine composée de phosphatidylcholine(Fig. 2) [58], afin de réduire l’élimination rénale et l’extravasation de l’hémoglobine et donc d’accroître sa persistance vasculaire [59]. Cette préparation peut être lyophilisée afin d’augmenter sa stabilité durant sa conservation. Les premières études avec l’hémoglobine microencapsulée remontent à 1957 [60] et à 1964 [61]. L’encapsulation est réalisée à partir d’hémoglobine chimiquement modifiée, telle que la DCLHbTM, et permet d’obtenir des solutions aux propriétés oxyphoriques proches de celles de l’hémoglobine érythrocytaire. Par ailleurs, certains auteurs ont proposé d’encapsuler conjointement certains systèmes enzymatiques ou certaines molécules permettant de limiter les effets indésirables engendrés par l’hémoglobine libre. Ainsi, le groupe Terumo Corp. (Kanagawa, Japon) a reconstitué dans des liposomes le système de la méthémoglobine réductase dans le but de prévenir l’oxydation de l’hémoglobine [62]. De même, le 2,3-DPG ou le pyrodoxal 50 -phosphate ont pu être coencapsulés afin de réguler l’affinité pour l’oxygène [63]. Enfin des enzymes, tel que la catalase et la SOD, ont pu être coencapsulées pour protéger contre la peroxydation lipidique [64]. Le développement de ces produits est encore au stade préclinique [65]. Leur évaluation chez l’animal, après un modèle d’hémodilution normovolémique [66] et un modèle de choc hémorragique [67], a montré que certains problèmes restent à résoudre, tels que la viscosité élevée, la faible quantité d’hémoglobine encapsulée, ou l’activation du complément suite à leur administration [68]. Mais le principal inconvénient

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Tableau 1 L’état d’avancement des essais cliniques de transporteurs d’oxygène à base d’hémoglobine Produit (Société)

Source d’hémoglobine (modification)

Niveau d’essai clinique

Application

PHP (Ajinomoto/Apex) HemAssistTM (Baxter)

Humaine (conjuguée au POE) Humaine (pontée)

Phase III (arrêt) Phase II

OptroTM (Somatogen/Baxter)

Recombinante (pontée)

HemopureTM (Biopure)

Bovine (polymérisée)

Oxyglobin (Biopure) PEG hemoglobin (Enzon) HemoLinkTM (Hemosol)

Bovine (polymérisée) Bovine (conjuguée au PEG) Humaine (polymérisée)

Phase III a Approuvée Phase Ia (arrêt) Phase II Phase III (arrêt)

PolyHemeTM (Northfield) HemospanTM (Sangart)

Humaine (polymérisée) Humaine (conjuguée au PEG)

Phase III Phase II

Choc induit par NO Choc septique, hémodialyse, choc hémorragique, circulation extracorporelle Traumatisme, accident vasculaire cérébral Hémodilution normovolémique aiguë, chirurgie Erythropoïse dans la maladie rénale, anémie réfractaire Erythropoïse Radiosensibilisant, glioblastome Crise drépanocytaire, oncologie, chirurgie orthopédique, urologie, vasculaire, cardiaque, traumatisme Angioplastie coronaire, chirurgie cardiaque et orthopédique Anémie vétérinaire, perte sanguine aiguë Radiosensibilisant pour tumeurs Circulation extracorporelle. Hémodilution normovolémique aiguë, chirurgie orthopédique, perte sanguine aiguë, dialyse Chirurgie cardiaque Traumatisme, chirurgie Chirurgie

a

Phase III (arrêt) Phase II Phase I (arrêt) Préclinique Phase I Phase II

Approuvée en Afrique du Sud [27].

de ces suspensions est leur capture par les macrophages spléniques et hépatiques. En dépit de la variété des procédés développés pour l’élaboration d’une solution d’hémoglobine adaptée aux besoins transfusionnels [69], les produits encore testés à ce jour en essais cliniques sont très peu nombreux et la majorité résulte de modifications chimiques de l’hémoglobine naturelle. Le Tableau 1 regroupe l’ensemble des produits faisant l’objet d’essais cliniques en septembre 2005. Nous compléterons celui-ci en précisant que la firme Baxter a abandonné depuis juin 2006 toute recherche et diagnostic dans ce domaine.

l’oxygène. L’utilisation d’hémoglobine bovine est une autre solution puisqu’elle fonctionne sans 2,3 DPG et est régulée par les ions chlorure. Enfin, la technologie recombinante permet de modifier, par mutagenèse, le site de fixation du 2,3 DPG ou d’introduire des sites de fixation des ions chlorure [55]. Ces solutions d’hémoglobine, du fait de leur petite taille et de leur faible viscosité, ont plus de facilité à circuler dans la microcirculation que les globules rouges. Ces deux propriétés physicochimiques font que ces solutions d’hémoglobine peuvent améliorer la perfusion et l’oxygénation tissulaire [71].

1.5. Les principales caractéristiques physicochimiques et pharmacologiques des HBOCs

1.5.2. Le pouvoir oncotique La pression oncotique (p) peut être aussi appelée « pression colloïdale osmotique ». Elle est décrite par l’équation de Van’t Hoff (Éq. (1)) et dépend proportionnellement de la concentration de la protéine et spécifiquement des propriétés macromoléculaires de cette protéine comme la masse moléculaire, la taille et la charge. La pression oncotique agit en opposition à la pression hydrostatique pour maintenir la balance de distribution de fluide entre le sang et le compartiment interstitiel [72]. Dans des conditions physiologiques normales, la pression oncotique est comprise entre 20 et 25 mmHg. Les globules rouges possèdent un faible pouvoir oncotique, leur pression oncotique est de 25 mmHg [73].

1.5.1. L’affinité pour l’oxygène L’affinité pour l’oxygène est l’une des caractéristiques physicochimiques majeures des HBOCs. Leur affinité est inférieure à celle de l’hémoglobine des globules rouges sauf dans le cas de la MP4. Cette différence est due à la présence de 2,3 DPG dans les globules rouges. La plupart des HBOCs tels que l’hémoglobine pontée fixent l’oxygène plus facilement et empêchent sa libération, car les agents de pontage disponibles tentent de stabiliser la molécule d’hémoglobine à l’état T (forme deoxy) [70]. La courbe de dissociation des HBOCs est légèrement déplacée vers la droite par rapport au sang humain, sauf dans le cas de la MP4. Plusieurs techniques ont permis de restaurer la P50 à une valeur physiologique (26–28 mmHg). Ainsi le pontage intramoléculaire par certains agents dérivés du pyridoxal 50 -phosphate au niveau des deux sous-unités bêta ou par des dérivés benzènecarboxylate liant les chaînes alpha–alpha, bêta–bêta ou alpha–bêta en fonction du pH, permet de simuler la fixation du 2,3 DPG et donc de réguler l’affinité pour

Qf ¼ kððPc þ pi Þ  ðPi  pp ÞÞ

(1)

Qf : mouvement nette de fluide vasculaire ; Pc : pression hydrostatique capillaire ; Pi : pression hydrostatique interstitielle ; pi : pression osmotique interstitielle ; pp : pression osmotique plasmatique ; k : coefficient de filtration spe´cifique pour la membrane vaculaire. Dans le cas de l’hémoglobine libre, certaines modifications chimiques de celle-ci telles que le pontage intermolé-

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Tableau 2 Caractéristiques physicochimiques des solutions d’hémoglobines modifiées

DCLHbTM rHb1.1 rHb2.0 HBOC-201 PolyHemeTM HemoLinkTM MP4

Source d’Hb

Modification intramoléculaire

Pontage intermoléculaire

Concentration (g/dL)

MetHb (%)

Viscosité (cP)

COP

P50

Tl/2

Sang perimé Recombinaison humaine Recombinaison humaine Bovine Sang perimé Sang perimé Sang perimé

Diaspirine Glycine

Non Non

10 5-10

<5

1,3 1,9

42 42

32 33

24 2

Fusion des chaînes alpha a

Basé au PEGa

10

2,4

68

31

Glutaraldéhyde Glutaraldéhyde o-raffinose Non

131 10 10 4,2  0,2

1,3

17

2,5  1

55  20

38 26–32 39  12 62

Phosphate péridoxale o-raffinose Conjugation au PEG

<5 <8 <15 <0,5

24 24 20 24

Hb : hémoglobine ; MetHb : méthémoglobine ; COP : pression oncotique colloïdale ; P50 : pression partiale associée avec 50 % de saturation de l’hémoglobine ; T1/2 : demi-vie intravasculaire PEG : polyéthylène glycole. a Pas plus d’informations disponibles en juin 2004 [43].

culaire peuvent diminuer la pression oncotique. Cela est dû au petit nombre de macromolécule/hème oncotiquement active. En revanche, la plupart des solutions d’hémoglobine libre modifiée aussi chimiquement exercent une forte pression oncotique et peuvent donc augmenter le volume sanguin d’une quantité supérieure à celle transfusée [74]. Gould et Moss ont supposé que les solutions d’hémoglobine tel que la PEG-Hb à 15 g/dL pourraient augmenter la pression oncotique de 300 %, en décalant la balance d’eau [75]. Cela est dû, dans le cas de la PEG-Hb, à l’interaction entre les polymères PEG conjugués à la surface de l’hémoglobine libre et l’eau dissolvante. Les caractéristiques physicochimiques de certains HBOCs sont résumées dans le Tableau 2. 1.5.3. Les effets secondaires De nombreux effets indésirables ont été observés avec ces HBOCs et expliquent l’abandon du développement de certains. Parmi les effets secondaires les plus fréquents, il existe : les effets hémodynamiques et les effets oxydatifs. 1.5.3.1. Les effets hémodynamiques. L’administration des HBOCs in vivo induit des effets secondaires d’ordre hémodynamique tels qu’une vasoconstriction qui provoque une augmentation de la pression artérielle systémique. Cet effet a été constaté dans les études précliniques et cliniques avec la plupart de ces solutions [76]. Les mécanismes par lesquels l’hémoglobine aurait cet effet implique une libération de radicaux libres tel que l’O2 [77], une pénétration de l’hémoglobine dans la paroi vasculaire [78], un piégeage du NO [76], une libération d’endothéline-1 [79] et une stimulation des récepteurs alpha adrénergiques périphériques [80]. 1.5.3.2. Les effets oxydatifs. Par ailleurs, les HBOCs s’autoxydent rapidement dans la circulation sanguine et induisent la libération des espèces réactives oxygénées responsables de dommages tissulaires et cellulaires et influencent le tonus vasculaire [77,81].

2. Conclusion Un grand progrès dans le développement des substituts sanguins (cas d’HBOCs) a été réalisé au cours des dernières années, mais aucun d’entre eux n’est mis sur le marché ni aux États-Unis, ni au Canada, ni même en Europe. Les différentes formes d’hémoglobine développées jusqu’à ce jour n’ont pas fait la preuve clinique de leur capacité à remplacer les globules rouges. Elles se heurtent aux difficultés de compréhension des effets secondaires d’ordre hémodynamique et oxydatif, ainsi qu’aux problèmes de mise au point des procédés de production de grande quantité, tant pour l’hémoglobine d’extraction que pour l’hémoglobine de recombinaison génétique, et à l’optimisation des technologies de purification assurant l’innocuité des produits. Aussi apparaît-il que les recours aux globules rouges humains de donneurs de sang seront encore une nécessité pendant une longue période. Les évolutions seront probablement dues à des modifications de type pegylation ou traitement enzymatique [82]. L’avancement des essais cliniques de ces produits reste le prochain grand objectif pour les différentes compagnies [43].

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