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Les noyaux de globules rouges de poussin : composition et analyse des phospholipides
BIOCHIMIE, 1976, 58, 1263-1271.
Les noyaux de globules rouges de poussin • composition et analyse des phospholipides. C6cilia SOUILL£RD et Georges SOULA~. L a b o r o t o i r e de B i o c h i m i e , F a c u l t d des S c i e n c e s P h a r m a c e u t i q u e s , 31 Alldes J. Guesde, 31300 T o u l o u s e . (16-8-1976).
Summary. - - While many works analyse lipid composition of cellular nuclei, essentially of liver, few describe bird erythrocyte nuclei. For them very di,scordant res,ults are reported due to very different me¢hods of preparation. In the method we adopted a good reproducibility is controlled by electron microscopy, evaluation of specific enzymatic activities and by protein, RNA and DNA determinations. Total lipid content and phospholipid eompositiorr were d.etermined showing, in agreement with other works, the predominance of phosph,atidylcholine and phosphatidylethanolamine. On the contrary, the nuclear fraction is poor in sphingomyelin, which is essentially a plasma membrane phosphvlipid.
De n o m b r e u x t r a v a u x se r a p p o r t e n t h l'6tude de la c o m p o s i t i o n l i p i d i q u e et de la d i s t r i b u t i o n des p h o s p h o l i p i d e s des n o y a u x cellulaires [1, 2~, surtout 5 p r o p o s du foie [3-6]. Bien que les t e c h n i q u e s d ' i s o l e m e n t diffbrent notablement, allant de l ' u t i l i s a t i o n d ' a c i d e citrique h des solutions i s o t o n i q u e s de saccharose, la p l u p a r t des t r a v a u x signalent, p a r m i les l i p i d e s nucl6aires la p r 6 d o m i n a n c e de p h o s p h o l i p i d e s et tout p a r t i c u l i b r e m e n t celle des p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s et des p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e s qui seraient surtout localis6es an n i v e a u de la m e m b r a n e n u c l 6 a i r e [7]. La t e n e u r en p h o s p h o l i p i d e s 6rant plus 61ev6e darts la c h r o m a t i n e active, il a 6t6 sugg6r6 [SJ que ceux-ci p o u r r a i e n t j o u e r un r61e r6gulateur de la synth6se du RNA.
ques. Nous aeons adopt6 la t e c h n i q u e de Zentgraft et al. [12] qui r6sout c o n v e n a b l e m e n t ces probl6mes et p e r m e t d ' o b t e n i r p a r c e n t r i f u g a t i o n dans des solutions de s a c c h a r o s e c o n c e n t r 6 e s des n o y a u x poss6dant leur double m e m b r a n e et exempts de mat6riel e x t r a n u e l 6 a i r e . Ce t r a v a i l a p o u r objet de d6finir la composition p h o s p h o l i p i d i q u e des n o y a u x d'h6maties d'oiseaux. I1 dolt nous p e r m e t t r e de m i e u x c o n n a i t r e la r 6 p a r t i t i o n des p h o s p h o l i p i d e s au n i v e a u du noyau, leur association avec la c h r o m a t i n e et leur p l a c e dans la m e m b r a n e nucl6aire. Le lieu de leur synth~se 6tant mal d6fini, le m~tabolisme des p h o s p h o l i p i d e s sera u l t 6 r i e u r e m e n t abord6 p a r l'6tude de l ' i n c o r p o r a t i o n de p r 6 c u r s e u r s au niveau de la c h r o m a t i n e et de la m e m b r a n e nucl6aire. M A T E R I E L E T METHODES.
On note b e a u c o u p m o i n s de t r a v a u x c o n c e r n a u t l ' i s o l e m e n t de n o y a u x d'h6maties et l'6tude de leur c o m p o s i t i o n en p h o s p h o l i p i d e s . Les r6sultats tr~s d i s c o r d a n t s sont dus aux m 6 t h o d e s d'isolem e n t des n o y a u x diff6rant c o n s i d 6 r a b l e m e n t soit p a r l ' a g e n t d ' h 6 m o l y s e : saponine, t y r o t h r i c i n e , lysol6cithines [9, 10, 11] soit p a r la m 6 t h o d e de s6paration des n o y a u x et des m e m b r a n e s p l a s m i Abrdviations : RNA : Acide ribonucl6ique. DNA : Acide dSsoxyribonucl~ique. NAD : Nicotinamide adSnine dinucl~otide. ATP : Adenosine triphosphate. PG : Phosphatidylglyc~rol. DPG : Diphosphatidylglyc~rol.
(~) A qui seront adress~es les demandes de tirds part.
ISOLEMENT DES NOYAUX.
Aprbs r u p t u r e de la j u g u l a i r e h des poussins fig6s de 15 jours, le sang est pr61ev6 sur u n e solution d ' h 6 p a r i n e h 1 p. cent P r o l a b o (0,15 m l p o u r 5 ml de sang total). Apr6s c e n t r i f u g a t i o n , le p l a s m a puts la c o u c h e l e u c o c y t o - p l a q u e t t a i r e sont 61imin6s p a r a s p i r a t i o n au cours des lavages. Les 6 r y t h r o c y t e s sont lav6s h t r o i s r e p r i s e s avec u n e solution i s o t o n i q u e de NaC1 "h 0,9 p. cent puts m6lang6s h quatre v o l u m e s de t a m p o n iris 0,01 M c o n t e n a n t s a c c h a r o s e 0,4 M, g o m m e a r a b i q u e h 3 p. cent, n o c t a n o l 4 raM, ajust6/L p H = 7,0 selon [12~. Le tout est agit6 dans un h o m o g 6 n 6 i s e u r h couteaux mod$le <> p e n d a n t 1 n m h unc
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C. S o u i l l a r d et G. S o u l a .
vitesse de rotation de 8000 rpm. L'homog6nat est filtr6 sur gaze puis cenlrifug6 8 m i n h 1500 x g (42'00 t o u r s / r a n dans u n appareil J o u a n 8.80). Le eulot est mis en s u s p e n s i o n dans le m6me m i l i e u d ' i s o l e m e n t que pr6c6demment, dans les m6mes p r o p o r t i o n s (1-4, v/v) et h n o u v e a u homog6n6is6 1 m n au Virtis h 8000 r p m puis centrifug6 8 Inn /~ 150,0 x g.
centrifug6 et sur le s u r n a g e a n t le p h o s p h o r e i n o r g a n i q u e est 6valu~ p a r la m+thode de Chen et coll. [15]. Les activit~s sp~cifiques de chaque fraction sont d6finies en m i c r o m o l e s de Pi p a r mg de prot6ines et par heure. Les activit6s sp~cifiques relatives sont ~gales au r a p p o r t de l'activit(~ sp6cifique de la fraction nucl6aire h l'activit~ sp~cifique de la cellule enti~re.
Le culot final est mis en s u s p e n s i o n dans 10 volulnes de saccharose 2,4 M h l'aide d ' u n homog6n6iseur de Potter ~Elvehjem. Le m61ange est ensuite centrifug6 90 m n "h 70 000 x g dans u n a p p a r e i l MSE 65 (rotor 6 X 16,5 ml, 25 000 t o u r s / mn). Les culots nucl6aires blanchfitres ainsi obtenus sont divis6s p o u r effectuer les examens en m i c r o s c o p i e ~lectronique, les dosages enzymatiques et les d 6 t e r m i n a t i o n s suivantes : prot6ines, RNA, DNA, lipides totanx, cholest6rol et phospholipides.
b. NAD p y r o p h o s p h o r y l a s e (ATP-NMN ad6nyltransf6rase EC 2.7.7.1). L'activit6 e n z y m a t i q u e est mesur6e selon la in~rhode d~crite p a r K o r n b e r g [1.6] et modifi~e par Kato el K u r o k a w a [17] p a r la formation de NAD + f o r m 6 sous Faction d ' u n e s u s p e n s i o n nuch~aire et d ' u n e s u s p e n s i o n d'~rythrocytes. Les cin~tiques enzymatiques p o u r chaque f r a c t i o n sont enregistr~es sur un spectrophotom~tre de type Ler~s $67.
Toutes les m a n i p u l a t i o n s d'isolement sont conduites entre 0 et 4°C avec des solutions refroidies. EXAMENS EN MICROSCOPIE ~LECTI:iONIQUE. Les s6diments nucl6aires sont fix6s dans u n e solution de glutarald6hyde h 5 p. cent p e n d a n t 1 heure h 4°C, lav6s au t a m p o n cacodylate de sodium 0,1 M, pH = 7,4 h plusieurs reprises. Les p r 6 p a r a t i o n s sont ensuite fix6es au tfitroxyde d ' o s m i u m h 2 p. cent p e n d a n t 1 h e u r e h 4°C puis soumises h des d 6 s h y d r a t a t i o n s successives dans des b a i n s d'alcool. L ' i n c l u s i o n est faite dans de l ' E p o n 8 [1311 Les coupes sont effectu6es h l'aide d ' u n u l t r a m i c r o t o m e P o r t e r Blum MT2, color6es -~ l'acfitate d ' u r a n y l e et au citrate de p l o m b puts examin6es dans u n m i c r o s c o p e 61ectronique OPL 75. DOSAGES ENZYMATIQUES.
Les dosages sont effectu6s h la fois sur des susp e n s i o n s nucl6aires et sur u n homog6nat d'6rythrocytes p o u r nous p e r m e t t r e de d6finir les activit6s sp6cifiques relatives.
a. A T P a s e (ATP p h o s p h o h y d r o l a s e EC 3.6.1.4). Le m i l i e u r&actionnel utilis6 est celui propos6 p a r Zentgraff et coll. ~14]. Les c o n c e n t r a t i o n s en prot6ines enzylnatiques sont de l ' o r d r e de 0,5 "h 1 mg de prot6ines p a r ml de m i l i e u d ' i n c u b a t i o n p o u r la s u s p e n s i o n nucl6aire et de 2 h 4 mg de prot6ines p a r ml de m i l i e u & i n c u b a t i o n p o u r l ' h o m o g 6 n a t 6 r y t h r o c y t a i r e total. La r6action est stopp6e p a r a d d i t i o n d ' u n 6gal volume d ' u n e solution d'acide i r i c h l o r a c 6 t i q u e h 10 p. cent, apr~s 30 m n au froid le pr6cipit6 est
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Les activitfis sp~cifiques sont calcul~es en micronmles de NAD + form~ par mg de prot~ines et p a r heure. Les activit~s sp6cifiques relatives sont ~gales au r a p p o r t de l'activit~ spbcifique de la fraction nucl6aire h l'activit5 sp~cifique de la cellule enti~re. ANALYSE DES CONSTITUANTS.
Ira s u s p e n s i o n nucl6aire est dialys6e p o u r 6Itm i n e r au n l a x i m u m le saccharose contre de l'eau distilMe fi 4°C p e n d a n t 4 jours sous agitation. Le dialysat est ensuite lyophilis6 dans u n a p p a r e i l de type E d w a r d s nlod~le E F 03 et le poids sec des n o y a u x r a p i d e l n e n t d6termin6. La p o u d r e nucl6aire est d61ipid6e p a r u n m6lange d ' i s o p r o p a n o l et de chloroforlne (11-7, v/v) selon la m6thode de Rose et Oklander [18J ; l'extrait lipidique, 6vapor~ h sec, est repris p a r u n m61ange de c h l o r o f o n n e et de m 6 t h a n o l (2-1, v/v) puts lay6 avec 0,2 volmnes d ' u n e solution de KC1 0,05 N. La phase o r g a n i q u e est (?vapor6e h sec p o u r dfiternliner le poids des lipides totaux. Les lipides totaux sont places en solution dans du chloroforme et fractionn&s sur colonne d'acide silicique selon u n e t e c h n i q u e d6j~ d6crite [19] 1)ermettant de s~parer les lipides n o n phosphor~s, filu4s p a r du chloroforme, des p h o s p h o l i p i d e s ~lu4s p a r du m~thanol. Sur la fraction c h l o r o f o r m i q u e le choles%rol est dos~ selon la m O h o d e de Clark et coll. [20]. La fraction m6thanolique, ~vapor4e ~ sec puts reprise p a r u n Iu~lange de chloroforme et de m~thanol (1-1, v/v), p e r m e t le dosage du p h o s p h o r e [15] et l ' a n a l y s e des phospholipides. Celle-ci est effectu6e p a r c h r o m a t o g r a p h i e bidim e n s i o n n e l l e sur couche m i n c e de silica gel G
Phospholipides
nucldaires
des hdmalies
de poussin.
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Merck (6paisseur : 0,25 ram) dans les syst~mes de solvants suivants : chloroforme-m6thanol-ammoniaque 28 N (65-35-5, v / v / v ) , p r e m i e r e d i m e n s i o n et chloroforme-m6thanol-eau (65-25-4, v / v / v ) , deuxibme d i m e n s i o n .
d ' o b t e n i r s6par6ment le DNA et le RNA. Le RNA est dos6 p a r la m O h o d e "h l ' o r c i n o l selon Slater !24] i n t r o d u i s a n t u n facteur de c o r r e c t i o n p o u r des traces de saccharose. Le DNA est 6 v a l u 6 ' p a r la m6thode h la d i p h 6 n y l a m i n e selon Burton [25!.
Apr~s s6paration, chaque p h o s p h o l i p i d e est r6cup6r~ et le phosphore 6valu6 apr~s min6ralisation de la poudre. PG et DPG recueillis en bloc, sont 61u6s p a r u n m61ange de chloroforme et de m6thanol (1-1, v/v) et soumis ~ u n e seconde chro-
RESULTATS. L ' e x a m e n en microscopie 61ectronique des h6maties de p o u s s i n (fig. 1) m o n t r e u n n o y a u volum i n e u x ",h c h r o m a t i n e homogbne entour6 de quel-
Fla. 1 . - A - Preparation d'hSmaties de poussins oblentze apr~s cenlrifu.qation dr. sang et laoage au sSrum physiolo.qique. On peut observer quelques petites mitochondries, atypiques,
rondes, dispersSes lmrs dli noyau. Le noyau, ovalaire, h ehromatine homog~ne, montre quelques interruptions de la membrane mlcl~aire dquivalant h des pores. Grossissement : 22 00O. B I Mitochondrie arcolSe 5 la m e m b r a n e nvcldaire. Grossissement : 30 000.
m a t o g r a p h i e n m n o d i l n e n s i o n n e l l e dans le s o l v a n t : chloroforme-m~thanol-acide ac6tique-eau (50-308-4, v / v / v / v ) . Cette sfiparation est etfectu~e apr~s u n rep6rage des taches gr5ce h des t~moins.
ques m i t o c h o n d r i e s souvent accol~es h la memb r a n e nucl6aire. Les m i t o c h o n d r i e s petites, r o n d e s avec peu de crates, t~moignent du peu d'activit6 de ces h6maties.
Les prot6ines sont ~valu6es p a r la m6thode de L o w r y et coll. [21] sur le r6sidu nuclfiaire d61ipid~ trait6 h deux reprises h froid par une solut i o n d ' a c i d e trichloracfitique ~ 10 p. cent dont le pr~cipit6 o b t e n u est dig~r6 par de la soude 0,6 N. Une autre partie de cette fraction, acidififie par de l'acide p e r c h l o r i q u e selon la m O h o d e de Moul~ [22] modif%e p a r F l e c k et Munro [23] permet
La figure 2 m o n t r e u n e p r e p a r a t i o n n o n purifi~e off le s6diment ~ r y t h r o c y t a i r e obtenu par broyage au Potter-Elvehjem, r e n f e r m e de n o m b r e u s e s m e m b r a n e s plasmiques. Apr~s broyage dans u n homog6n6iseur de type Virtis, materiel plasmatique et n o y a u x sont s~par6s mais on peut constater h fort grossissement que la m e m b r a n e p l a s m i q u e reste accol~e au noyau.
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C. S o u i l l a r d
Les pr6parations nucl6aires, aprbs ultracentrif u g a t i o n d a n s d u s a c c h a r o s e 2,4 M p e n d a n t 90 nan 70 000 x g, m o n t r e n t (fig. 3) fi d e s g r o s s i s s e n a e n t s d i f f 6 r e n t s , d e s 616naents e x e m p t s d e m e m b r a n e s
e l G. S o u l a .
p l a s n a i q u e s . L e s n o y a u x s o n t n e t s , b i e n d61imit6s p a r l e u r e n v e l o p p e n u c l 6 a i r e , le n a a t 6 r i e l c h r o m a t i n i e n est c o n d e n s 6 et r 6 p a r t i p a r p l a g e s h la p 6 r i p h 6 r i e , a c c o l 6 "h la m e m b r a n e n u c l 6 a i r e i n t e r n e .
B
Fro. 2. --- A - - Pr~'paration n u c l d a i r e b r u t e ( c o n t e n a n t de n o m b r e u s e s m e m b r a n e s p l a s m i ques) o b t e n u e apr~s b r o y a g e des h ~ m a t i e s an Virtis : stade pr~c6dant la purification sur saccharose 2,4 M. Grossissement : 8 000. B - - S d d i m e n t s d ' d r g t h r o c g t e s o b l e n u s p a r h o m o g d n d i s a t i o n au P o t t e r E l v e h j e m . Le noyau est net, limit6 p a r l'en•eloppe nucldaire c o n s t i t u t e de deux m e m b r a n e s : la m e m b r a n e i n t e r n e en contact 6troit avee l ' h 6 t 6 r o c h r o m a t i n e dispos6e parall61ement et la m e m b r a n e externe se d~tac h a n t p a r e n d r o i t s de ]a m e m b r a n e interne. Grossissement : 16 000. B I O C H I M I E , 1976, 58, n ° 10.
Phospholipides
nucldaires des hdmalies
La m e m b r a n e n u c l b a i r e e x t e r n e est a p p a r e n t e ruais m o i n s v i s i b l e q u e d a n s u n e p r 6 p a r a t i o n n o n purifi6e,
de p o u s s i n .
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L ' 6 t u d e d e s a c t i v i t 6 s e n z y m a t i q u e s est e n v i s a g e e c o m m e u n 616ment c o m p l 6 m e n t a i r e d e la p u r e r 6 d e s p r 6 p a r a t i o n s n u c l 6 a i r e s ( t a b l e a u I).
• : ~ili! ~i~i~iIIIII
~ii~!i,~~ iii ~i!!ii~,~I~I~ ~ i i~
i
F1s. 3. - - Preparations nucl~aires d'h~malies de poussins purifi(es apr~s ultracex~trifugation saccharosd 2,/~ M.
en milieu
Grossissements : 2 000 (A) - - 10 000 (B). On ne note p r a t i q u e m e n t pas d'impuret(~s de m e m b r a n e s plasmiques. Les noyaux sont bien d6!imit6s par l'enveloppe nuclt~aire, la c h r o m a t i n e est condens6e.
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C. Souillard et G. Soula.
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P r o t d i n e s et D N A s o n t les c o n s t i t u a n t s m a j e u r s des n o y a u x , r e s p e c t i v e m e n t : 61,5 et 30,7 p. c e n t ; les p h o s p h o l i p i d e s a v e c s e u l e m e n t 1,9 p. c e n t rep r ~ s e n t e n t p l u s de la m o i t i ~ des l i p i d e s t o t a u x nuclbaires : rapport phospholipides/lipides totaux
Par ultracentrifugation celles-ci sont enrichies p u i s q u e les f a i b l e s v a l e u r s d ' a c t i v i t 6 A T P ~ s i q u e i n d i q u e n t t ' a b s e n c e de m e m b r a n e s p l a s m i q u e s . P a r c o n t r e , l ' i m p o r t a n t e a c t i v i t 6 de la NAD p y r o p h o s p h o r y l a s e r e n f o r c e le c r i t ~ r e de p u r e r 6 des
TABLEAU 1.
Aetivitds enzymatiques de l'homog~nat de globules rouges et de la prdparation nucl~aire. Na+, K+ ATPase Fea¢~io~Js
Aetivit~ sp6eifique
I Activite i sp~eifique i relative r
Homog~natglobulairetotal
0,063
I
Noyau . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,019
[
n o y a u x sans p o u v o i r h e l l e s e u l e t o u t e f o i s a f f i r m e r l e u r int6grit6, l ' e n z y m e ~tant li6 h la c h r o m a t i n e et n o n h la m e m b r a n e n u c l 6 a i r e . N o u s n o u s s o m m e s p a r a i l l e u r s assur6s de l ' a b s e n c e de m i t o c h o n d r i e s p a r la tr~s f a i b l e a c t i v i t 6 c y t o c h r o m e c o x y dase. L ' 6 t u d e a n a l y t i q u e des c o n s t i t u a n t s n u c l 6 a i r e s est r a s s e m b l 6 e d a n s les t a b l e a u x II et I I I i n d i q u a n t la r 6 p a r t i t i o n des p r o t 6 i n e s , des l i p i d e s et a c i d e s n u c l 6 i q u e s p o u r 100 g de p o u d r e n u c l 6 a i r e l y o p h i lisle.
NAD+ pyrophosphorylase
1 0,30
Activit~ sp~eifique
Activit~ sp6eifique r~elle
~
0,012
1
I
0,80
46
: 0,59. N o t o n s 6 g a l e m e n t les f a i b l e s q u a n t i % s de R N A et de c h o l e s t 6 r o l : 2,1 et 0,44 p. cent. L e t a b l e a u IV r a s s e m b l e les r~sultats c o n c e r n a n t l ' a n a l y s e des p h o s p h o l i p i d e s apr~s p u r i f i c a t i o n s u r c o l o n n e d ' a c i d e s i l i c i q u e et s 6 p a r a t i o n par chromatographie bidimensionnelle sur couche m i n c e . I1 m e t en 6 v i d e n c e d e u x g r o u p e s de p h o s pholipides : - - d e u x ~lbanents a b o n d a n t s : p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s et p h o s p h a t i d y l ~ t h a n o l a m i n e s q u i r e p r ~ s e n -
TABLEAU II.
Poureentages des principaux constituants nucl~aires d'hdmaties de poussins dvaluds par rapport an poids sec de noyaux. Prot~ines . . . 61,50+_0,50 RNA . . . . . . . I 2,10-+-0,15 DNA . . . . . . . 30,70+0,40
TABLEAU III.
Rapports entre les taux de protdines totales, RNA, DNA, lipides totaux, phospholipides, et cholesterol. Phospholipidcs [ Lipides totaux . . . . . Cholest6rol / Phospholipides . . . . . . . . . Phospholipides / Prot6ines . . . . . . . . . . Phospholipides [DNA . . . . . . . . . . . . . . RNA/DNA .................. DNA/Prot6ines . . . . . . . . . . . . . . . RNA/Prot6ines . . . . . . . . . . . . . . .
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0,59 0,23 0,031 0,062 0,08 0,50 0,041
~___ 0,08 + 0,02 ~- 0,05 ~___0,005 ~- 0,008 ~ 0,01 ~- 0,004
Lipides t o t a u x . . Phospholipides . Cholesterol . . . . .
3,20 -~ 0,20 1,90 ~_~ 0,30 0,44 -t- 0,10
t e n t r e s p e c t i v e m e n t 44 et 29 p. c e n t des p h o s p h o ]ipides totaux, - - des c o n s t i t u a n t s m o i n s a b o n d a n t s p h o s p h a tidyls6rines, phosphatidy])nositols, sphingomy~lines, l y s o p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s , p h o s p h a t i d y l g l y c~rol et c a r d i o l i p i d e s , et des t r a c e s de l y s o p h o s phatidyl~thanolamines. A l o r s que les p h o s p h o l i p i d e s t o t a u x des 6ryt h r o c y t e s n u c l 6 e s a t t e i g n e n t 510 _+ 30 m g p o u r 100 m l El9], les p h o s p h o l i p i d e s n u c l 6 a i r e s : 55 _ 7 m g p o u r 100 ml, ne r e p r ~ s e n t e n t q u e 10 p. c e n t des p h o s p h o l i p i d e s g l o b u l a i r e s .
Phospholipides nucl~aires des h~maties de poussin.
1269
P a r r a p p o r t ~ la cellule enti6re [19] trois phosp h o l i p i d e s m o n t r e n t des taux plus 61ev6s : phosp h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e s , p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s et
Peu d'~tudes ont trait h l'isolement de n o y a u x de globules rouges nuc166s, ceux-ci u t i l i s a n t des t e c h n i q u e s tr~s diff6rentes p o u r la lyse des ~rythrocytes [9, 10, 11, 38].
TABLEAU IV.
Ces t e c h n i q u e s d o n n e n t des r6snttats peu reproductibles en p e r t u r b a n t la structure mSme des m e m b r a n e s lipoprot6iques, c'est le cas de la sapon i n e [9] ou en ne p e r m e t t a n t pas c'est le cas de la t y r o t h r i c i n e [10] d'enlever c o n v e n a b l e m e n t les m e m b r a n e s plasmiques. P o u r ces raisons, nous avons pr6f6r~ adopter la m~thode d ' i s o l e m e n t de Zentgraf et coll. [12] 6galement employ6e p a r F r a n k e et coll. [39] p o u r la p r 6 p a r a t i o n de n o y a u x de foie. Celle-ci laisse intacte, comme le m o n t r e n t les contr61es en m i c r o s c o p i c 61ectronique, la m e m b r a n e nucl6aire dont l'int6grii6 est confirm~e, en p a r t i c u l i e r p a r la forte activit6 de la NAD p y r o p h o s p h o r y l a s e sans toutefois qu'elle permette d'affirmer l'int6grit6 du n o y a u p u i s q u e l ' e n z y m e est li6 h la c h r o m a t i n e et n o n h la memb r a n e nucl~aire. P a r ailleurs la faible activit6 ATPasique c o n f i r m e l'absence de m e m b r a n e plasm i q u e donc la puret6 des p r 6 p a r a t i o n s nucl~aires.
Poarceutages des phospholipides nucl~aires d'h~maties de poussins (P % du P total) mogenne de bait experiences. Phosphatidylcholines . . . . . . . . . . . . . . Phosphatidyl~thanolamines . . . . . . . . Phosphatidylsfirines . . . . . . . . . . . . . . . Phosphatidylinositols. . . . . . . . . . . . . . Lysophosph atidylcholines . . . . . . . . . . Sphingomyfilines. . . . . . . . . . . . . . . . . . Diphosphatidylglyc6rol . . . . . . . . . . . . Phosphatidylglyc~rol . . . . . . . . . . . . . . Acides phosphatidiques . . . . . . . . . . . .
44,30 29,30 5,70 6,80 4,50 5,70 1,80 2,50 0,20
~- 1,0 -~- 0,50 ~- 0,30 -+- 0,20 -I- 0,15 ~--+',0,20 -t- 0,005 ~- 0,10 -~ 0,005
l y s o p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s . Par contre, phosphatidyls6rines et sphingomy61ines sont ~ des taux nettement plus faibles dans la fraction nucl6aire, p a s s a n t de 12 ~ 5,7 p. cent p o u r les premibres et de 19,5 h 5,7 p. cent p o u r les secondes. DISCUSSION. De n o m b r e u x t r a v a u x relatent l'isolement de n o y a u x de divers tissus : foie, cerveau, r e i n [26, 27, 28]. La p l u p a r t des t e c h n i q u e s d'isolement utilisent des solutions de saccharose de haute densit6, en g6n6ral 2 M, d6rivSes de la m6thode de Chauveau [291 qui pr6serve la s t r u c t u r e nucl6aire. L'utilisation d ' u n g r a d i e n t de densit6 est n6cessaire p o u r permettre d'61iminer la c o n t a m i n a t i o n p a r des m i t o c h o n d r i e s et par l'ergastoplasme [30, 31, 32]. Certains auteurs p r ~ c o n i s e n t l ' u t i l i s a t i o n de K + et de Mg2+ dans le m i l i e u d ' i s o l e m e n t [33] p o u r pr6server le nucl6ole et emp6cher le gonflem e n t du noyau, ou la pr6sence de Ca e+ [34, 35] qui r6duit l ' a g g l u t i n a t i o n des noyaux. Ces m~mes auteurs conseillent, p a r ailleurs, u n pH o p t i m u m de 6,8 du milieu d'isolement, des pH alcalins dans des solutions salines concentr6es favorisant la r u p t u r e de la m e m b r a n e nucl6aire et la formation de gels [36]. Gurr et coll. [37] ont compar6 la structure de n o y a u x pr6par6s en m i l i e u saccharos6 et en pr6sence d ' a c i d e citrique : dans le p r e m i e r cas Ies n o y a u x sont allong6s, la double m e m b r a n e nucl6aire b i e n visible et la c h r o m a t i n e condens6e. Dans le second cas, p a r contre, les n o y a u x sont ronds, h c h r o m a t i n e diffuse el h double m e m b r a n e peu visible.
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 10.
Alors que les activit6s sp6cifiques de l'homog6nat et de la f r a c t i o n nucl6aire sont plus faibles que celles indiqu6es par Zentgraf et coll. [14], nous sommes p a r contre en accord avec eux p o u r les vaieurs d'activit6s relatives. L'6tude des c o n s t i t u a n t s nucl6aires m o n t r e surtout la richesse en prot6ines et DNA ; le taux des p h o s p h o l i p i d e s est faible mats en accord toutefois avec les donn6es c o n c e r n a n t la c o m p o s i t i o n des n o y a u x d'autres tissus. Le cholesterol 6 r y t h r o c y t a i r e m o n t r e des valeurs lr6s faibles, en majorit6 sous forme libre [40] au n i v e a u des m e m b r a n e s et en partie sous forme d'esters dans le h y a l o p l a s m e et la m a t r i c e nucl6aire [41]. Ges r6sultats s, a c c o r d e n t avec ceux de Zentgraf et coll. [14] qui i n d i q u e n t r e s p e c t i v e m e n t p o u r p h o s p h o l i p i d e s et ¢holest6rol chez la poule 1,5 et 0,3 p. cent. Certains rapports sont aussi int6ressants ~ consid~rer en p a r t i c u l i e r le r a p p o r t RNA/D,NA qni p e r m e t d'6valuer la puret6 des p r 6 p a r a t i o n s nucl6aires [42] et qui peut 6tre c o n s i d 6 r a b l e m e n t influenc6 p a r la t e c h n i q u e d'isolement choisie. Ce r a p p o r t augmente en p a r t i c u l i e r lors des c o n t a m i n a t i o n s p a r des microsomes c o n t e n a n t des quantit6s appr6ciables de RNA et par de faibles quantit6s de DNA [33, 4.3]. Le r a p p o r t p h o s p h o l i p i d e s / D N A , ici 6gal h 0,062 permet de m e s u r e r selon L e m a r c h a l et B o r n e n s
1270
C. Souillard el G. Soula.
[44], l ' i n t 6 g r i t 6 d e la m e m b r a n e n u c t 6 a i r e p u i s q u e s e l o n K l e i n i g [45] les p h o s p h o l i p i d e s n u c l 6 a i r e s s o n t l o c a l i s 6 s e n g r a n d e p a r t i e au n i v e a u de la membrane nucl+aire.
cl6aire. U n e forte t e n e u r en l y s o p h o s p h a t i d y l c h o -
Le r a p p o r t c h o l e s t 6 r o l / p h o s p h o l i p i d e s est lui a u s s i cit6 c o m m e i n d i c a t e u r d e s t r u c t u r e d e s m e m b r a n e s n u c l 6 a i r e s [45] ; n o t r e v a l e u r de 0,23 c o r r e s p o n d h celle de Zentgraf.
Ces donn6es raises en place, notre but est d ' a b o r d e r l'6tude m6tabolique des p h o s p h o l i p i d e s nucl6aires et de pr6ciser le r6te du n o y a u dans le cadre des processus de biosynth6se des phospholipides.
De n o m b r e u x t r a v a u x [27, 28, 44] o n t a b o r d 6 l ' 6 t u d e d e s p h o s p h o l i p i d e s d e n o y a u x de d i v e r s
tissus et m o n t r e n t d'assez i m p o r t a n t e s v a r i a t i o n s selon la t e c h n i q u e d'isolement, la n a t u r e de Forgane e t l e s m6thodes choisies p o u r la s6paration des phospholipidcs. P h o s p h a t i d y l c h o l i n e s et p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e s sont toujours c e p e n d a n t les p h o s p h o l i p i d e s les plus a b o n d a n t s alors que les sphingomy61ines s o n t ~ des c o n c e n t r a t i o n s tr6s faibles (5,7 p. cent) c o m p a r a t i v e m e n t ~ leur taux dans les globules r o u g e s [26]. S e u l s q u e l q u e s t r a v a u x [46, 47, 48] d ~ n o t e n t la p r 6 s e n c e d e d i p h o s p h a t i d y l g l y c 6 r o l , ce p h o s p h o -
lipide 6rant consid6r+ comme u n i n d i c a t e u r mitoc h o n d r i a l [27, 49J. La faible activit6 c y t o c h r o m e c oxydase m o u t r e l'absence de m i t o c h o n d r i e s donc PG et DPG d6cel6s p a r nos t e c h n i q u e s sont b i e n d ' o r i g i n e nucl6aire. Dans la p l u p a r t des cas, le taux des lysophosp h a t i d y l c h o l i n e s nucl6aires est faible, compris entre 1 et 2,3 p. cent. Nos valeurs sont plus 61ev6es, en accord avec celle de L e m a r c h a l et Bornens [44] qui t r o u v e n t darts le n o y a u h6patique quatre fois plus de ce p h o s p h o l i p i d e que dans le tissu entier. Bien que notre t e c h n i q u e d'isolement des n o y a u x d6rive de celle de Kleinig [45~ nous notons quelques diff6rences au niveau des phosp h o l i p i d e s choliniques et de l ' e n s e m b l e phosphatidylglyc6rol et cardiolipide. P a r contre, les pourcentages de phosphatidyls6.rines et p h o s p h a t i d y l inositols sont tr6s voisins. Les diff6rences not6es dans la c o m p o s i t i o n p h o s p h o l i p i d i q u e des h6maties et des n o y a u x sont assez p r o n o n c 6 e s p o u r les p h o s p h a t i d y l s 6 r i n e s , les sphingomy61ines e t l e s l y s o p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s . Les taux faibles de p h o s p h a t i d y l s 6 r i n e s et de sphingomy61ines nucl6aires sont en faveur de la forte t e n e u r de ces p h o s p h o l i p i d e s darts les memb r a n e s plasmiques ESO] ; p a r contre, le taux 61ev6 des l y s o p h o s p h a t i d y l c h o l i u e s darts la fraction nucl6aire pose le probl6me de leur localisation an n i v e a u de la c h r o m a t i n e ou de la m e m b r a n e nuBIOCHIMIE, 1976, 58, n o 10.
lines au n i v e a u des m e m b r a n e s nucl6.aires serait en accord avec leur i m p o r t a n t e activit6 acyltransf6rasique signal6e p a r Stadler et F r a n k e [51].
R~svM~. Alors que de n o m b r e u x travaux ont d6crit la composition lipidique des noyaux cellulaires, s u r t o u t ceux du foie, peu &entre eux se r a p p o r t e n t aux noyaux d%rythrocytes d'oiseaux. P o u r ees derniers des r6sultats tr6s diseordants sont dus h des m6thodes de pr6p.aration tr+s diff6rentes. Dans la m~thode de prdparation que nous avons adopt6e une bonne reproductibilit~ est obtenue, contrSlde h la fois par microscopie ~leetronique, par le dosage des activit~s e n z y m a t i q u e s sp6eifiques et p a r la d~termination des prot6ines, du RNA et du DNA. La t e n e u r en lipides totaux e t l a r 6 p a r t i t i o n des phospholipides sont d~termin~s, montrant, en accord aver les travaux ant6rieurs, la pr6dominance des p h o s p h a t i d y l e h o l i n e s et des p h o s p h a t i dyl6thanolamines. P a r eontre, la fraction nuel6aire est pauvre en sphingomy61ines, ces phospholipides 6rant plut6t loealis~s au niveau de la m e m b r a n e ptasmique. BIBLIOGRAPHIE. 1. Rees, K. R., Rowland, G. F. & Vareoe, J. S. (1963) Biochem. J., 86, 130-136. 2. Gahan, P. B. (1965) Exptl. Cell Res., 39, 136-144. 3. Donner, A. L. (1943) J. Biol. Chem., 151, 221-223. 4. Biezenski, J. J. & Spaet, T. H. (1961) Biochim. Biophys. Acta, 51, 221-226. 5. Harth, S., Borkowski, T., Mardell, R. & Mandel, P. (1'962) Exp. Cell Res., 26, 587-590. 6. Altmann, B. P., Hampson, S. E. & Chayen, R. (1964) Nature, 202, 1215-1216. 7. Gurr, M. I., Finean, J. B. & Hawthorne, J. N. (1963) Bioehim. Biophys. Aela, 70, 406-416. 8. Rose, H. G. ~ Frenster, S. H. (1965) Bioehim. Biophys. Aeta, 108, 577-591. 9. Dounee, A. L. & Holan, T. (1943) Science, 97, 584585. 10. Villela, G. G. (1947) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 66, 398-401. 11. Laskows~i, M. (1942) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 49, 354-356. 12. Zentgraff, H., Deumling, B. & Franke, W. ~V. (1969) Exp. Cell Res., $6, 333-337. 13. Reynolds, E. S. (1963) J. Cell. Biol., 17, 208-212. 14. Zentgraff, H., Deumling, B., Jarash, D. & Franl~e, V¢. W. (19'71) J. Biol. Chem., 246, 2986-2995. 15. Chen, P. S., Toribara, T. Y. & Warner, H. (1958) Anal. Chem., 28, 1756-1758. 16. Kornberg, A. (1950) J. Biol. Chem., 182, 779-793. 17. Kato, T. & Kuroka'wa, M. (1967) J. Cell. Biol., 32, 650-662. 18. Rose, H. G..& Oklander, M. (i965) J. L i p i d Res., 6, 428-431. 19. Soula, G. (1972) Bioehimie, 54, 14~3-1486. 20. Clarc~, B. R., Rnbin, T. R. a Arthur, R. J. (1968) A n a l Biochem., 24, 27-33. 21. Lowry, O. H., Rosebronch, N. J., Farr, A. I. & Randall, R. J. (1951) Y. Biol. Chem., 193, 265-275. 22. Moule, Y. (1953) Arch. Sci. Physiol., 7, 161-197. 23. Fleck, A. ,& Munro, H. (1962) Bioehim. Biophgs. Acta) 55, 571-583.
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Les noyaux de globules rouges de poussin • composition et analyse des phospholipides. C6cilia SOUILL£RD et Georges SOULA~. L a b o r o t o i r e de B i o c h i m i e , F a c u l t d des S c i e n c e s P h a r m a c e u t i q u e s , 31 Alldes J. Guesde, 31300 T o u l o u s e . (16-8-1976).
Summary. - - While many works analyse lipid composition of cellular nuclei, essentially of liver, few describe bird erythrocyte nuclei. For them very di,scordant res,ults are reported due to very different me¢hods of preparation. In the method we adopted a good reproducibility is controlled by electron microscopy, evaluation of specific enzymatic activities and by protein, RNA and DNA determinations. Total lipid content and phospholipid eompositiorr were d.etermined showing, in agreement with other works, the predominance of phosph,atidylcholine and phosphatidylethanolamine. On the contrary, the nuclear fraction is poor in sphingomyelin, which is essentially a plasma membrane phosphvlipid.
De n o m b r e u x t r a v a u x se r a p p o r t e n t h l'6tude de la c o m p o s i t i o n l i p i d i q u e et de la d i s t r i b u t i o n des p h o s p h o l i p i d e s des n o y a u x cellulaires [1, 2~, surtout 5 p r o p o s du foie [3-6]. Bien que les t e c h n i q u e s d ' i s o l e m e n t diffbrent notablement, allant de l ' u t i l i s a t i o n d ' a c i d e citrique h des solutions i s o t o n i q u e s de saccharose, la p l u p a r t des t r a v a u x signalent, p a r m i les l i p i d e s nucl6aires la p r 6 d o m i n a n c e de p h o s p h o l i p i d e s et tout p a r t i c u l i b r e m e n t celle des p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s et des p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e s qui seraient surtout localis6es an n i v e a u de la m e m b r a n e n u c l 6 a i r e [7]. La t e n e u r en p h o s p h o l i p i d e s 6rant plus 61ev6e darts la c h r o m a t i n e active, il a 6t6 sugg6r6 [SJ que ceux-ci p o u r r a i e n t j o u e r un r61e r6gulateur de la synth6se du RNA.
ques. Nous aeons adopt6 la t e c h n i q u e de Zentgraft et al. [12] qui r6sout c o n v e n a b l e m e n t ces probl6mes et p e r m e t d ' o b t e n i r p a r c e n t r i f u g a t i o n dans des solutions de s a c c h a r o s e c o n c e n t r 6 e s des n o y a u x poss6dant leur double m e m b r a n e et exempts de mat6riel e x t r a n u e l 6 a i r e . Ce t r a v a i l a p o u r objet de d6finir la composition p h o s p h o l i p i d i q u e des n o y a u x d'h6maties d'oiseaux. I1 dolt nous p e r m e t t r e de m i e u x c o n n a i t r e la r 6 p a r t i t i o n des p h o s p h o l i p i d e s au n i v e a u du noyau, leur association avec la c h r o m a t i n e et leur p l a c e dans la m e m b r a n e nucl6aire. Le lieu de leur synth~se 6tant mal d6fini, le m~tabolisme des p h o s p h o l i p i d e s sera u l t 6 r i e u r e m e n t abord6 p a r l'6tude de l ' i n c o r p o r a t i o n de p r 6 c u r s e u r s au niveau de la c h r o m a t i n e et de la m e m b r a n e nucl6aire. M A T E R I E L E T METHODES.
On note b e a u c o u p m o i n s de t r a v a u x c o n c e r n a u t l ' i s o l e m e n t de n o y a u x d'h6maties et l'6tude de leur c o m p o s i t i o n en p h o s p h o l i p i d e s . Les r6sultats tr~s d i s c o r d a n t s sont dus aux m 6 t h o d e s d'isolem e n t des n o y a u x diff6rant c o n s i d 6 r a b l e m e n t soit p a r l ' a g e n t d ' h 6 m o l y s e : saponine, t y r o t h r i c i n e , lysol6cithines [9, 10, 11] soit p a r la m 6 t h o d e de s6paration des n o y a u x et des m e m b r a n e s p l a s m i Abrdviations : RNA : Acide ribonucl6ique. DNA : Acide dSsoxyribonucl~ique. NAD : Nicotinamide adSnine dinucl~otide. ATP : Adenosine triphosphate. PG : Phosphatidylglyc~rol. DPG : Diphosphatidylglyc~rol.
(~) A qui seront adress~es les demandes de tirds part.
ISOLEMENT DES NOYAUX.
Aprbs r u p t u r e de la j u g u l a i r e h des poussins fig6s de 15 jours, le sang est pr61ev6 sur u n e solution d ' h 6 p a r i n e h 1 p. cent P r o l a b o (0,15 m l p o u r 5 ml de sang total). Apr6s c e n t r i f u g a t i o n , le p l a s m a puts la c o u c h e l e u c o c y t o - p l a q u e t t a i r e sont 61imin6s p a r a s p i r a t i o n au cours des lavages. Les 6 r y t h r o c y t e s sont lav6s h t r o i s r e p r i s e s avec u n e solution i s o t o n i q u e de NaC1 "h 0,9 p. cent puts m6lang6s h quatre v o l u m e s de t a m p o n iris 0,01 M c o n t e n a n t s a c c h a r o s e 0,4 M, g o m m e a r a b i q u e h 3 p. cent, n o c t a n o l 4 raM, ajust6/L p H = 7,0 selon [12~. Le tout est agit6 dans un h o m o g 6 n 6 i s e u r h couteaux mod$le <
1264
C. S o u i l l a r d et G. S o u l a .
vitesse de rotation de 8000 rpm. L'homog6nat est filtr6 sur gaze puis cenlrifug6 8 m i n h 1500 x g (42'00 t o u r s / r a n dans u n appareil J o u a n 8.80). Le eulot est mis en s u s p e n s i o n dans le m6me m i l i e u d ' i s o l e m e n t que pr6c6demment, dans les m6mes p r o p o r t i o n s (1-4, v/v) et h n o u v e a u homog6n6is6 1 m n au Virtis h 8000 r p m puis centrifug6 8 Inn /~ 150,0 x g.
centrifug6 et sur le s u r n a g e a n t le p h o s p h o r e i n o r g a n i q u e est 6valu~ p a r la m+thode de Chen et coll. [15]. Les activit~s sp~cifiques de chaque fraction sont d6finies en m i c r o m o l e s de Pi p a r mg de prot6ines et par heure. Les activit6s sp~cifiques relatives sont ~gales au r a p p o r t de l'activit(~ sp6cifique de la fraction nucl6aire h l'activit~ sp~cifique de la cellule enti~re.
Le culot final est mis en s u s p e n s i o n dans 10 volulnes de saccharose 2,4 M h l'aide d ' u n homog6n6iseur de Potter ~Elvehjem. Le m61ange est ensuite centrifug6 90 m n "h 70 000 x g dans u n a p p a r e i l MSE 65 (rotor 6 X 16,5 ml, 25 000 t o u r s / mn). Les culots nucl6aires blanchfitres ainsi obtenus sont divis6s p o u r effectuer les examens en m i c r o s c o p i e ~lectronique, les dosages enzymatiques et les d 6 t e r m i n a t i o n s suivantes : prot6ines, RNA, DNA, lipides totanx, cholest6rol et phospholipides.
b. NAD p y r o p h o s p h o r y l a s e (ATP-NMN ad6nyltransf6rase EC 2.7.7.1). L'activit6 e n z y m a t i q u e est mesur6e selon la in~rhode d~crite p a r K o r n b e r g [1.6] et modifi~e par Kato el K u r o k a w a [17] p a r la formation de NAD + f o r m 6 sous Faction d ' u n e s u s p e n s i o n nuch~aire et d ' u n e s u s p e n s i o n d'~rythrocytes. Les cin~tiques enzymatiques p o u r chaque f r a c t i o n sont enregistr~es sur un spectrophotom~tre de type Ler~s $67.
Toutes les m a n i p u l a t i o n s d'isolement sont conduites entre 0 et 4°C avec des solutions refroidies. EXAMENS EN MICROSCOPIE ~LECTI:iONIQUE. Les s6diments nucl6aires sont fix6s dans u n e solution de glutarald6hyde h 5 p. cent p e n d a n t 1 heure h 4°C, lav6s au t a m p o n cacodylate de sodium 0,1 M, pH = 7,4 h plusieurs reprises. Les p r 6 p a r a t i o n s sont ensuite fix6es au tfitroxyde d ' o s m i u m h 2 p. cent p e n d a n t 1 h e u r e h 4°C puis soumises h des d 6 s h y d r a t a t i o n s successives dans des b a i n s d'alcool. L ' i n c l u s i o n est faite dans de l ' E p o n 8 [1311 Les coupes sont effectu6es h l'aide d ' u n u l t r a m i c r o t o m e P o r t e r Blum MT2, color6es -~ l'acfitate d ' u r a n y l e et au citrate de p l o m b puts examin6es dans u n m i c r o s c o p e 61ectronique OPL 75. DOSAGES ENZYMATIQUES.
Les dosages sont effectu6s h la fois sur des susp e n s i o n s nucl6aires et sur u n homog6nat d'6rythrocytes p o u r nous p e r m e t t r e de d6finir les activit6s sp6cifiques relatives.
a. A T P a s e (ATP p h o s p h o h y d r o l a s e EC 3.6.1.4). Le m i l i e u r&actionnel utilis6 est celui propos6 p a r Zentgraff et coll. ~14]. Les c o n c e n t r a t i o n s en prot6ines enzylnatiques sont de l ' o r d r e de 0,5 "h 1 mg de prot6ines p a r ml de m i l i e u d ' i n c u b a t i o n p o u r la s u s p e n s i o n nucl6aire et de 2 h 4 mg de prot6ines p a r ml de m i l i e u & i n c u b a t i o n p o u r l ' h o m o g 6 n a t 6 r y t h r o c y t a i r e total. La r6action est stopp6e p a r a d d i t i o n d ' u n 6gal volume d ' u n e solution d'acide i r i c h l o r a c 6 t i q u e h 10 p. cent, apr~s 30 m n au froid le pr6cipit6 est
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 10.
Les activitfis sp~cifiques sont calcul~es en micronmles de NAD + form~ par mg de prot~ines et p a r heure. Les activit~s sp6cifiques relatives sont ~gales au r a p p o r t de l'activit~ spbcifique de la fraction nucl6aire h l'activit5 sp~cifique de la cellule enti~re. ANALYSE DES CONSTITUANTS.
Ira s u s p e n s i o n nucl6aire est dialys6e p o u r 6Itm i n e r au n l a x i m u m le saccharose contre de l'eau distilMe fi 4°C p e n d a n t 4 jours sous agitation. Le dialysat est ensuite lyophilis6 dans u n a p p a r e i l de type E d w a r d s nlod~le E F 03 et le poids sec des n o y a u x r a p i d e l n e n t d6termin6. La p o u d r e nucl6aire est d61ipid6e p a r u n m6lange d ' i s o p r o p a n o l et de chloroforlne (11-7, v/v) selon la m6thode de Rose et Oklander [18J ; l'extrait lipidique, 6vapor~ h sec, est repris p a r u n m61ange de c h l o r o f o n n e et de m 6 t h a n o l (2-1, v/v) puts lay6 avec 0,2 volmnes d ' u n e solution de KC1 0,05 N. La phase o r g a n i q u e est (?vapor6e h sec p o u r dfiternliner le poids des lipides totaux. Les lipides totaux sont places en solution dans du chloroforme et fractionn&s sur colonne d'acide silicique selon u n e t e c h n i q u e d6j~ d6crite [19] 1)ermettant de s~parer les lipides n o n phosphor~s, filu4s p a r du chloroforme, des p h o s p h o l i p i d e s ~lu4s p a r du m~thanol. Sur la fraction c h l o r o f o r m i q u e le choles%rol est dos~ selon la m O h o d e de Clark et coll. [20]. La fraction m6thanolique, ~vapor4e ~ sec puts reprise p a r u n Iu~lange de chloroforme et de m~thanol (1-1, v/v), p e r m e t le dosage du p h o s p h o r e [15] et l ' a n a l y s e des phospholipides. Celle-ci est effectu6e p a r c h r o m a t o g r a p h i e bidim e n s i o n n e l l e sur couche m i n c e de silica gel G
Phospholipides
nucldaires
des hdmalies
de poussin.
1265
Merck (6paisseur : 0,25 ram) dans les syst~mes de solvants suivants : chloroforme-m6thanol-ammoniaque 28 N (65-35-5, v / v / v ) , p r e m i e r e d i m e n s i o n et chloroforme-m6thanol-eau (65-25-4, v / v / v ) , deuxibme d i m e n s i o n .
d ' o b t e n i r s6par6ment le DNA et le RNA. Le RNA est dos6 p a r la m O h o d e "h l ' o r c i n o l selon Slater !24] i n t r o d u i s a n t u n facteur de c o r r e c t i o n p o u r des traces de saccharose. Le DNA est 6 v a l u 6 ' p a r la m6thode h la d i p h 6 n y l a m i n e selon Burton [25!.
Apr~s s6paration, chaque p h o s p h o l i p i d e est r6cup6r~ et le phosphore 6valu6 apr~s min6ralisation de la poudre. PG et DPG recueillis en bloc, sont 61u6s p a r u n m61ange de chloroforme et de m6thanol (1-1, v/v) et soumis ~ u n e seconde chro-
RESULTATS. L ' e x a m e n en microscopie 61ectronique des h6maties de p o u s s i n (fig. 1) m o n t r e u n n o y a u volum i n e u x ",h c h r o m a t i n e homogbne entour6 de quel-
Fla. 1 . - A - Preparation d'hSmaties de poussins oblentze apr~s cenlrifu.qation dr. sang et laoage au sSrum physiolo.qique. On peut observer quelques petites mitochondries, atypiques,
rondes, dispersSes lmrs dli noyau. Le noyau, ovalaire, h ehromatine homog~ne, montre quelques interruptions de la membrane mlcl~aire dquivalant h des pores. Grossissement : 22 00O. B I Mitochondrie arcolSe 5 la m e m b r a n e nvcldaire. Grossissement : 30 000.
m a t o g r a p h i e n m n o d i l n e n s i o n n e l l e dans le s o l v a n t : chloroforme-m~thanol-acide ac6tique-eau (50-308-4, v / v / v / v ) . Cette sfiparation est etfectu~e apr~s u n rep6rage des taches gr5ce h des t~moins.
ques m i t o c h o n d r i e s souvent accol~es h la memb r a n e nucl6aire. Les m i t o c h o n d r i e s petites, r o n d e s avec peu de crates, t~moignent du peu d'activit6 de ces h6maties.
Les prot6ines sont ~valu6es p a r la m6thode de L o w r y et coll. [21] sur le r6sidu nuclfiaire d61ipid~ trait6 h deux reprises h froid par une solut i o n d ' a c i d e trichloracfitique ~ 10 p. cent dont le pr~cipit6 o b t e n u est dig~r6 par de la soude 0,6 N. Une autre partie de cette fraction, acidififie par de l'acide p e r c h l o r i q u e selon la m O h o d e de Moul~ [22] modif%e p a r F l e c k et Munro [23] permet
La figure 2 m o n t r e u n e p r e p a r a t i o n n o n purifi~e off le s6diment ~ r y t h r o c y t a i r e obtenu par broyage au Potter-Elvehjem, r e n f e r m e de n o m b r e u s e s m e m b r a n e s plasmiques. Apr~s broyage dans u n homog6n6iseur de type Virtis, materiel plasmatique et n o y a u x sont s~par6s mais on peut constater h fort grossissement que la m e m b r a n e p l a s m i q u e reste accol~e au noyau.
BIOCHIMIE, 1976, 58~ n" 10.
1266
C. S o u i l l a r d
Les pr6parations nucl6aires, aprbs ultracentrif u g a t i o n d a n s d u s a c c h a r o s e 2,4 M p e n d a n t 90 nan 70 000 x g, m o n t r e n t (fig. 3) fi d e s g r o s s i s s e n a e n t s d i f f 6 r e n t s , d e s 616naents e x e m p t s d e m e m b r a n e s
e l G. S o u l a .
p l a s n a i q u e s . L e s n o y a u x s o n t n e t s , b i e n d61imit6s p a r l e u r e n v e l o p p e n u c l 6 a i r e , le n a a t 6 r i e l c h r o m a t i n i e n est c o n d e n s 6 et r 6 p a r t i p a r p l a g e s h la p 6 r i p h 6 r i e , a c c o l 6 "h la m e m b r a n e n u c l 6 a i r e i n t e r n e .
B
Fro. 2. --- A - - Pr~'paration n u c l d a i r e b r u t e ( c o n t e n a n t de n o m b r e u s e s m e m b r a n e s p l a s m i ques) o b t e n u e apr~s b r o y a g e des h ~ m a t i e s an Virtis : stade pr~c6dant la purification sur saccharose 2,4 M. Grossissement : 8 000. B - - S d d i m e n t s d ' d r g t h r o c g t e s o b l e n u s p a r h o m o g d n d i s a t i o n au P o t t e r E l v e h j e m . Le noyau est net, limit6 p a r l'en•eloppe nucldaire c o n s t i t u t e de deux m e m b r a n e s : la m e m b r a n e i n t e r n e en contact 6troit avee l ' h 6 t 6 r o c h r o m a t i n e dispos6e parall61ement et la m e m b r a n e externe se d~tac h a n t p a r e n d r o i t s de ]a m e m b r a n e interne. Grossissement : 16 000. B I O C H I M I E , 1976, 58, n ° 10.
Phospholipides
nucldaires des hdmalies
La m e m b r a n e n u c l b a i r e e x t e r n e est a p p a r e n t e ruais m o i n s v i s i b l e q u e d a n s u n e p r 6 p a r a t i o n n o n purifi6e,
de p o u s s i n .
1267
L ' 6 t u d e d e s a c t i v i t 6 s e n z y m a t i q u e s est e n v i s a g e e c o m m e u n 616ment c o m p l 6 m e n t a i r e d e la p u r e r 6 d e s p r 6 p a r a t i o n s n u c l 6 a i r e s ( t a b l e a u I).
• : ~ili! ~i~i~iIIIII
~ii~!i,~~ iii ~i!!ii~,~I~I~ ~ i i~
i
F1s. 3. - - Preparations nucl~aires d'h~malies de poussins purifi(es apr~s ultracex~trifugation saccharosd 2,/~ M.
en milieu
Grossissements : 2 000 (A) - - 10 000 (B). On ne note p r a t i q u e m e n t pas d'impuret(~s de m e m b r a n e s plasmiques. Les noyaux sont bien d6!imit6s par l'enveloppe nuclt~aire, la c h r o m a t i n e est condens6e.
BIOCHIMIE, 19'76, 58, n ° 10.
87
C. Souillard et G. Soula.
1268
P r o t d i n e s et D N A s o n t les c o n s t i t u a n t s m a j e u r s des n o y a u x , r e s p e c t i v e m e n t : 61,5 et 30,7 p. c e n t ; les p h o s p h o l i p i d e s a v e c s e u l e m e n t 1,9 p. c e n t rep r ~ s e n t e n t p l u s de la m o i t i ~ des l i p i d e s t o t a u x nuclbaires : rapport phospholipides/lipides totaux
Par ultracentrifugation celles-ci sont enrichies p u i s q u e les f a i b l e s v a l e u r s d ' a c t i v i t 6 A T P ~ s i q u e i n d i q u e n t t ' a b s e n c e de m e m b r a n e s p l a s m i q u e s . P a r c o n t r e , l ' i m p o r t a n t e a c t i v i t 6 de la NAD p y r o p h o s p h o r y l a s e r e n f o r c e le c r i t ~ r e de p u r e r 6 des
TABLEAU 1.
Aetivitds enzymatiques de l'homog~nat de globules rouges et de la prdparation nucl~aire. Na+, K+ ATPase Fea¢~io~Js
Aetivit~ sp6eifique
I Activite i sp~eifique i relative r
Homog~natglobulairetotal
0,063
I
Noyau . . . . . . . . . . . . . . . . . .
0,019
[
n o y a u x sans p o u v o i r h e l l e s e u l e t o u t e f o i s a f f i r m e r l e u r int6grit6, l ' e n z y m e ~tant li6 h la c h r o m a t i n e et n o n h la m e m b r a n e n u c l 6 a i r e . N o u s n o u s s o m m e s p a r a i l l e u r s assur6s de l ' a b s e n c e de m i t o c h o n d r i e s p a r la tr~s f a i b l e a c t i v i t 6 c y t o c h r o m e c o x y dase. L ' 6 t u d e a n a l y t i q u e des c o n s t i t u a n t s n u c l 6 a i r e s est r a s s e m b l 6 e d a n s les t a b l e a u x II et I I I i n d i q u a n t la r 6 p a r t i t i o n des p r o t 6 i n e s , des l i p i d e s et a c i d e s n u c l 6 i q u e s p o u r 100 g de p o u d r e n u c l 6 a i r e l y o p h i lisle.
NAD+ pyrophosphorylase
1 0,30
Activit~ sp~eifique
Activit~ sp6eifique r~elle
~
0,012
1
I
0,80
46
: 0,59. N o t o n s 6 g a l e m e n t les f a i b l e s q u a n t i % s de R N A et de c h o l e s t 6 r o l : 2,1 et 0,44 p. cent. L e t a b l e a u IV r a s s e m b l e les r~sultats c o n c e r n a n t l ' a n a l y s e des p h o s p h o l i p i d e s apr~s p u r i f i c a t i o n s u r c o l o n n e d ' a c i d e s i l i c i q u e et s 6 p a r a t i o n par chromatographie bidimensionnelle sur couche m i n c e . I1 m e t en 6 v i d e n c e d e u x g r o u p e s de p h o s pholipides : - - d e u x ~lbanents a b o n d a n t s : p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s et p h o s p h a t i d y l ~ t h a n o l a m i n e s q u i r e p r ~ s e n -
TABLEAU II.
Poureentages des principaux constituants nucl~aires d'hdmaties de poussins dvaluds par rapport an poids sec de noyaux. Prot~ines . . . 61,50+_0,50 RNA . . . . . . . I 2,10-+-0,15 DNA . . . . . . . 30,70+0,40
TABLEAU III.
Rapports entre les taux de protdines totales, RNA, DNA, lipides totaux, phospholipides, et cholesterol. Phospholipidcs [ Lipides totaux . . . . . Cholest6rol / Phospholipides . . . . . . . . . Phospholipides / Prot6ines . . . . . . . . . . Phospholipides [DNA . . . . . . . . . . . . . . RNA/DNA .................. DNA/Prot6ines . . . . . . . . . . . . . . . RNA/Prot6ines . . . . . . . . . . . . . . .
BIOCHIM1E, 19'76, 58, n ° 10.
0,59 0,23 0,031 0,062 0,08 0,50 0,041
~___ 0,08 + 0,02 ~- 0,05 ~___0,005 ~- 0,008 ~ 0,01 ~- 0,004
Lipides t o t a u x . . Phospholipides . Cholesterol . . . . .
3,20 -~ 0,20 1,90 ~_~ 0,30 0,44 -t- 0,10
t e n t r e s p e c t i v e m e n t 44 et 29 p. c e n t des p h o s p h o ]ipides totaux, - - des c o n s t i t u a n t s m o i n s a b o n d a n t s p h o s p h a tidyls6rines, phosphatidy])nositols, sphingomy~lines, l y s o p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s , p h o s p h a t i d y l g l y c~rol et c a r d i o l i p i d e s , et des t r a c e s de l y s o p h o s phatidyl~thanolamines. A l o r s que les p h o s p h o l i p i d e s t o t a u x des 6ryt h r o c y t e s n u c l 6 e s a t t e i g n e n t 510 _+ 30 m g p o u r 100 m l El9], les p h o s p h o l i p i d e s n u c l 6 a i r e s : 55 _ 7 m g p o u r 100 ml, ne r e p r ~ s e n t e n t q u e 10 p. c e n t des p h o s p h o l i p i d e s g l o b u l a i r e s .
Phospholipides nucl~aires des h~maties de poussin.
1269
P a r r a p p o r t ~ la cellule enti6re [19] trois phosp h o l i p i d e s m o n t r e n t des taux plus 61ev6s : phosp h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e s , p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s et
Peu d'~tudes ont trait h l'isolement de n o y a u x de globules rouges nuc166s, ceux-ci u t i l i s a n t des t e c h n i q u e s tr~s diff6rentes p o u r la lyse des ~rythrocytes [9, 10, 11, 38].
TABLEAU IV.
Ces t e c h n i q u e s d o n n e n t des r6snttats peu reproductibles en p e r t u r b a n t la structure mSme des m e m b r a n e s lipoprot6iques, c'est le cas de la sapon i n e [9] ou en ne p e r m e t t a n t pas c'est le cas de la t y r o t h r i c i n e [10] d'enlever c o n v e n a b l e m e n t les m e m b r a n e s plasmiques. P o u r ces raisons, nous avons pr6f6r~ adopter la m~thode d ' i s o l e m e n t de Zentgraf et coll. [12] 6galement employ6e p a r F r a n k e et coll. [39] p o u r la p r 6 p a r a t i o n de n o y a u x de foie. Celle-ci laisse intacte, comme le m o n t r e n t les contr61es en m i c r o s c o p i c 61ectronique, la m e m b r a n e nucl6aire dont l'int6grii6 est confirm~e, en p a r t i c u l i e r p a r la forte activit6 de la NAD p y r o p h o s p h o r y l a s e sans toutefois qu'elle permette d'affirmer l'int6grit6 du n o y a u p u i s q u e l ' e n z y m e est li6 h la c h r o m a t i n e et n o n h la memb r a n e nucl~aire. P a r ailleurs la faible activit6 ATPasique c o n f i r m e l'absence de m e m b r a n e plasm i q u e donc la puret6 des p r 6 p a r a t i o n s nucl~aires.
Poarceutages des phospholipides nucl~aires d'h~maties de poussins (P % du P total) mogenne de bait experiences. Phosphatidylcholines . . . . . . . . . . . . . . Phosphatidyl~thanolamines . . . . . . . . Phosphatidylsfirines . . . . . . . . . . . . . . . Phosphatidylinositols. . . . . . . . . . . . . . Lysophosph atidylcholines . . . . . . . . . . Sphingomyfilines. . . . . . . . . . . . . . . . . . Diphosphatidylglyc6rol . . . . . . . . . . . . Phosphatidylglyc~rol . . . . . . . . . . . . . . Acides phosphatidiques . . . . . . . . . . . .
44,30 29,30 5,70 6,80 4,50 5,70 1,80 2,50 0,20
~- 1,0 -~- 0,50 ~- 0,30 -+- 0,20 -I- 0,15 ~--+',0,20 -t- 0,005 ~- 0,10 -~ 0,005
l y s o p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s . Par contre, phosphatidyls6rines et sphingomy61ines sont ~ des taux nettement plus faibles dans la fraction nucl6aire, p a s s a n t de 12 ~ 5,7 p. cent p o u r les premibres et de 19,5 h 5,7 p. cent p o u r les secondes. DISCUSSION. De n o m b r e u x t r a v a u x relatent l'isolement de n o y a u x de divers tissus : foie, cerveau, r e i n [26, 27, 28]. La p l u p a r t des t e c h n i q u e s d'isolement utilisent des solutions de saccharose de haute densit6, en g6n6ral 2 M, d6rivSes de la m6thode de Chauveau [291 qui pr6serve la s t r u c t u r e nucl6aire. L'utilisation d ' u n g r a d i e n t de densit6 est n6cessaire p o u r permettre d'61iminer la c o n t a m i n a t i o n p a r des m i t o c h o n d r i e s et par l'ergastoplasme [30, 31, 32]. Certains auteurs p r ~ c o n i s e n t l ' u t i l i s a t i o n de K + et de Mg2+ dans le m i l i e u d ' i s o l e m e n t [33] p o u r pr6server le nucl6ole et emp6cher le gonflem e n t du noyau, ou la pr6sence de Ca e+ [34, 35] qui r6duit l ' a g g l u t i n a t i o n des noyaux. Ces m~mes auteurs conseillent, p a r ailleurs, u n pH o p t i m u m de 6,8 du milieu d'isolement, des pH alcalins dans des solutions salines concentr6es favorisant la r u p t u r e de la m e m b r a n e nucl6aire et la formation de gels [36]. Gurr et coll. [37] ont compar6 la structure de n o y a u x pr6par6s en m i l i e u saccharos6 et en pr6sence d ' a c i d e citrique : dans le p r e m i e r cas Ies n o y a u x sont allong6s, la double m e m b r a n e nucl6aire b i e n visible et la c h r o m a t i n e condens6e. Dans le second cas, p a r contre, les n o y a u x sont ronds, h c h r o m a t i n e diffuse el h double m e m b r a n e peu visible.
BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 10.
Alors que les activit6s sp6cifiques de l'homog6nat et de la f r a c t i o n nucl6aire sont plus faibles que celles indiqu6es par Zentgraf et coll. [14], nous sommes p a r contre en accord avec eux p o u r les vaieurs d'activit6s relatives. L'6tude des c o n s t i t u a n t s nucl6aires m o n t r e surtout la richesse en prot6ines et DNA ; le taux des p h o s p h o l i p i d e s est faible mats en accord toutefois avec les donn6es c o n c e r n a n t la c o m p o s i t i o n des n o y a u x d'autres tissus. Le cholesterol 6 r y t h r o c y t a i r e m o n t r e des valeurs lr6s faibles, en majorit6 sous forme libre [40] au n i v e a u des m e m b r a n e s et en partie sous forme d'esters dans le h y a l o p l a s m e et la m a t r i c e nucl6aire [41]. Ges r6sultats s, a c c o r d e n t avec ceux de Zentgraf et coll. [14] qui i n d i q u e n t r e s p e c t i v e m e n t p o u r p h o s p h o l i p i d e s et ¢holest6rol chez la poule 1,5 et 0,3 p. cent. Certains rapports sont aussi int6ressants ~ consid~rer en p a r t i c u l i e r le r a p p o r t RNA/D,NA qni p e r m e t d'6valuer la puret6 des p r 6 p a r a t i o n s nucl6aires [42] et qui peut 6tre c o n s i d 6 r a b l e m e n t influenc6 p a r la t e c h n i q u e d'isolement choisie. Ce r a p p o r t augmente en p a r t i c u l i e r lors des c o n t a m i n a t i o n s p a r des microsomes c o n t e n a n t des quantit6s appr6ciables de RNA et par de faibles quantit6s de DNA [33, 4.3]. Le r a p p o r t p h o s p h o l i p i d e s / D N A , ici 6gal h 0,062 permet de m e s u r e r selon L e m a r c h a l et B o r n e n s
1270
C. Souillard el G. Soula.
[44], l ' i n t 6 g r i t 6 d e la m e m b r a n e n u c t 6 a i r e p u i s q u e s e l o n K l e i n i g [45] les p h o s p h o l i p i d e s n u c l 6 a i r e s s o n t l o c a l i s 6 s e n g r a n d e p a r t i e au n i v e a u de la membrane nucl+aire.
cl6aire. U n e forte t e n e u r en l y s o p h o s p h a t i d y l c h o -
Le r a p p o r t c h o l e s t 6 r o l / p h o s p h o l i p i d e s est lui a u s s i cit6 c o m m e i n d i c a t e u r d e s t r u c t u r e d e s m e m b r a n e s n u c l 6 a i r e s [45] ; n o t r e v a l e u r de 0,23 c o r r e s p o n d h celle de Zentgraf.
Ces donn6es raises en place, notre but est d ' a b o r d e r l'6tude m6tabolique des p h o s p h o l i p i d e s nucl6aires et de pr6ciser le r6te du n o y a u dans le cadre des processus de biosynth6se des phospholipides.
De n o m b r e u x t r a v a u x [27, 28, 44] o n t a b o r d 6 l ' 6 t u d e d e s p h o s p h o l i p i d e s d e n o y a u x de d i v e r s
tissus et m o n t r e n t d'assez i m p o r t a n t e s v a r i a t i o n s selon la t e c h n i q u e d'isolement, la n a t u r e de Forgane e t l e s m6thodes choisies p o u r la s6paration des phospholipidcs. P h o s p h a t i d y l c h o l i n e s et p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e s sont toujours c e p e n d a n t les p h o s p h o l i p i d e s les plus a b o n d a n t s alors que les sphingomy61ines s o n t ~ des c o n c e n t r a t i o n s tr6s faibles (5,7 p. cent) c o m p a r a t i v e m e n t ~ leur taux dans les globules r o u g e s [26]. S e u l s q u e l q u e s t r a v a u x [46, 47, 48] d ~ n o t e n t la p r 6 s e n c e d e d i p h o s p h a t i d y l g l y c 6 r o l , ce p h o s p h o -
lipide 6rant consid6r+ comme u n i n d i c a t e u r mitoc h o n d r i a l [27, 49J. La faible activit6 c y t o c h r o m e c oxydase m o u t r e l'absence de m i t o c h o n d r i e s donc PG et DPG d6cel6s p a r nos t e c h n i q u e s sont b i e n d ' o r i g i n e nucl6aire. Dans la p l u p a r t des cas, le taux des lysophosp h a t i d y l c h o l i n e s nucl6aires est faible, compris entre 1 et 2,3 p. cent. Nos valeurs sont plus 61ev6es, en accord avec celle de L e m a r c h a l et Bornens [44] qui t r o u v e n t darts le n o y a u h6patique quatre fois plus de ce p h o s p h o l i p i d e que dans le tissu entier. Bien que notre t e c h n i q u e d'isolement des n o y a u x d6rive de celle de Kleinig [45~ nous notons quelques diff6rences au niveau des phosp h o l i p i d e s choliniques et de l ' e n s e m b l e phosphatidylglyc6rol et cardiolipide. P a r contre, les pourcentages de phosphatidyls6.rines et p h o s p h a t i d y l inositols sont tr6s voisins. Les diff6rences not6es dans la c o m p o s i t i o n p h o s p h o l i p i d i q u e des h6maties et des n o y a u x sont assez p r o n o n c 6 e s p o u r les p h o s p h a t i d y l s 6 r i n e s , les sphingomy61ines e t l e s l y s o p h o s p h a t i d y l c h o l i n e s . Les taux faibles de p h o s p h a t i d y l s 6 r i n e s et de sphingomy61ines nucl6aires sont en faveur de la forte t e n e u r de ces p h o s p h o l i p i d e s darts les memb r a n e s plasmiques ESO] ; p a r contre, le taux 61ev6 des l y s o p h o s p h a t i d y l c h o l i u e s darts la fraction nucl6aire pose le probl6me de leur localisation an n i v e a u de la c h r o m a t i n e ou de la m e m b r a n e nuBIOCHIMIE, 1976, 58, n o 10.
lines au n i v e a u des m e m b r a n e s nucl6.aires serait en accord avec leur i m p o r t a n t e activit6 acyltransf6rasique signal6e p a r Stadler et F r a n k e [51].
R~svM~. Alors que de n o m b r e u x travaux ont d6crit la composition lipidique des noyaux cellulaires, s u r t o u t ceux du foie, peu &entre eux se r a p p o r t e n t aux noyaux d%rythrocytes d'oiseaux. P o u r ees derniers des r6sultats tr6s diseordants sont dus h des m6thodes de pr6p.aration tr+s diff6rentes. Dans la m~thode de prdparation que nous avons adopt6e une bonne reproductibilit~ est obtenue, contrSlde h la fois par microscopie ~leetronique, par le dosage des activit~s e n z y m a t i q u e s sp6eifiques et p a r la d~termination des prot6ines, du RNA et du DNA. La t e n e u r en lipides totaux e t l a r 6 p a r t i t i o n des phospholipides sont d~termin~s, montrant, en accord aver les travaux ant6rieurs, la pr6dominance des p h o s p h a t i d y l e h o l i n e s et des p h o s p h a t i dyl6thanolamines. P a r eontre, la fraction nuel6aire est pauvre en sphingomy61ines, ces phospholipides 6rant plut6t loealis~s au niveau de la m e m b r a n e ptasmique. BIBLIOGRAPHIE. 1. Rees, K. R., Rowland, G. F. & Vareoe, J. S. (1963) Biochem. J., 86, 130-136. 2. Gahan, P. B. (1965) Exptl. Cell Res., 39, 136-144. 3. Donner, A. L. (1943) J. Biol. Chem., 151, 221-223. 4. Biezenski, J. J. & Spaet, T. H. (1961) Biochim. Biophys. Acta, 51, 221-226. 5. Harth, S., Borkowski, T., Mardell, R. & Mandel, P. (1'962) Exp. Cell Res., 26, 587-590. 6. Altmann, B. P., Hampson, S. E. & Chayen, R. (1964) Nature, 202, 1215-1216. 7. Gurr, M. I., Finean, J. B. & Hawthorne, J. N. (1963) Bioehim. Biophys. Aela, 70, 406-416. 8. Rose, H. G. ~ Frenster, S. H. (1965) Bioehim. Biophys. Aeta, 108, 577-591. 9. Dounee, A. L. & Holan, T. (1943) Science, 97, 584585. 10. Villela, G. G. (1947) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 66, 398-401. 11. Laskows~i, M. (1942) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 49, 354-356. 12. Zentgraff, H., Deumling, B. & Franke, W. ~V. (1969) Exp. Cell Res., $6, 333-337. 13. Reynolds, E. S. (1963) J. Cell. Biol., 17, 208-212. 14. Zentgraff, H., Deumling, B., Jarash, D. & Franl~e, V¢. W. (19'71) J. Biol. Chem., 246, 2986-2995. 15. Chen, P. S., Toribara, T. Y. & Warner, H. (1958) Anal. Chem., 28, 1756-1758. 16. Kornberg, A. (1950) J. Biol. Chem., 182, 779-793. 17. Kato, T. & Kuroka'wa, M. (1967) J. Cell. Biol., 32, 650-662. 18. Rose, H. G..& Oklander, M. (i965) J. L i p i d Res., 6, 428-431. 19. Soula, G. (1972) Bioehimie, 54, 14~3-1486. 20. Clarc~, B. R., Rnbin, T. R. a Arthur, R. J. (1968) A n a l Biochem., 24, 27-33. 21. Lowry, O. H., Rosebronch, N. J., Farr, A. I. & Randall, R. J. (1951) Y. Biol. Chem., 193, 265-275. 22. Moule, Y. (1953) Arch. Sci. Physiol., 7, 161-197. 23. Fleck, A. ,& Munro, H. (1962) Bioehim. Biophgs. Acta) 55, 571-583.
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