- Email: [email protected]
Niveaux plasmatiques, vitesses de clairance métabolique, et vitesses de sécrétion de la testostérone et de l'oestradiol-17β chez l'anguille (Anguilla anguilla L.) argentée
GENERAL
AND
COMPARATIVE
59, 482-493 (1985)
ENDOCRINOLOGY
Niveaux plasmatiques, vitesses de clairance m&abolique, et vitesses de s&-&ion de la testost6rone et de I’oestradiol-l7P chez I’anguille (Anguilla anguilla L.) argent6e BRUNO Laboratoire
de Physiologie d’Endocrinologie
Q&RAT, gt’nPrale comparPe
ANNIE
HARDY,
ET JEANINE
et comparee da Muskurn associe’ au CNRS, 7 rue
LELOUP-HATEY
national d’Histoire Cuvier, 75231 Paris
naturelle, et Laborutoire CPdex 05, France
Accepted January 2, 1985 Testosterone (T) and 17P-estradiol (E,) plasma levels and metabolic clearance rates (MCR) were measured to investigate their ovarian production in immature silver eel. The dynamics of T and Ez metabolism were studied in catheterized eels using single injections of 0.2 to 0.5 pCi 3H-labeled steroid. The distribution volumes, biological half-life and MCR of nonconjugated tracers were calculated on the basis of a two-compartment model. At the end of the experiments, radioactivity was measured in different organs and tissues to localize the site of T and E, catabolism. The volume of the inner compartment was 3.4% for T and E,. The outer compartment was larger for T (6.4%) than that for E, (4.3%). The biological half-life was three to four times shorter for T (14.5 hr) than that for Ez (48.5 hr). The MCR for T (1.71 ml/kg body wt/hr) was higher than for EX (0.51 ml/kg body wtihr). Plasma levels were determined, using radioimmunoassay, on samples taken before injections of radiolabeled steroid. Free or protein-bound hormone levels were 0.12 and 0.31 ngl ml for T and E,, respectively. Conjugated T and E, levels were. respectively, 0.13 and 0.23 rig/ml. Production rates were determined as the product of the MCR and the plasma concentration of the nonconjugated hormone. No significant differences were observed between the production rates of T and E, (0.24 rig/kg body wtihr). The liver was the principal site of metabolism for both hormones. which were excreted via the enterohepatic route. Ez injection gave rise to no metabolite in the plasma whereas after T injection a metabolite was produced, the concentration of which increased as a function of time. Its chromatographic properties were different from that of Ez or androstenedione, suggesting that no significant peripheral aromatization or 17-oxidoreduction occurs in the immature silver eel.
C 1985 Academic
Press, Inc.
Le niveau circulant d’une hormone est souvent considere comme un indice valable pour apprecier la quantite d’hormone susceptible d’acceder a ses tissus cibles. Cette don&e n’est cependant pas suffisante pour connaitre I’intensite du fonctionnement de la glande endocrine qui secrete cette hormone. En effet, le niveau circulant d’une hormone a un instant donne depend bien de la vitesse de secretion de cette hormone dans la circulation, mais aussi de la vitesse de son elimination (excretion, metabolisme peripherique) ainsi que de son volume de repartition dans l’organisme. Peu de travaux ont CtC realist% concernant la mesure de ces parambtres pour les steroi’des se-
xuels chez les poissons. Une etude de la parition plasmatique et tissulaire de la testosterone a CtC realisee chez le Saumon coho (Fagerlund et McBride, 1978) et chez la Carpe (Lone et Marty, 1981). Cependant, du fait des techniques utilisees (administration orale prolongee de fortes doses d’hormone marquee), ces travaux ne permettaient pas de calculer la vitesse de clairance metabolique et done d’estimer les vitesses de secretion ou d’elimination de la testosterone endogene. Ces paramttres ont pu etre mesures chez deux espbces de poissons. Deux techniques ont CtC adoptees, utilisant des quantites traceuses d’hormone tritiee: la methode de perfusion continue de 482
0016-6480185 $1.50 Copyright 0 1985 by Academic Press. Inc. All rights of reproduction in any form reserved.
METABOLISME
DES STEROIDES
testosterone tritiee, chez la Raie mature (Fletcher et al., 1969) ou d’oestradiol-17p tritie, chez la truite aux divers stades de maturation ovarienne (Fostier et al., 1984) et la methode d’une injection unique de l’oestradiol-17B tritie, Cgalement chez la truite aux divers stades (Zohar, 1982); les deux methodes utilisees pour la meme hormone chez la truite avaient don& des resultats cornparables. Le but de notre etude Ctait d’apprecier l’intensite du fonctionnement de l’ovaire de l’anguille argentee par la mesure de la vitesse de clairance metabolique et du niveau plasmatique de deux hormones types synthetisees par l’ovaire: la testosterone et l’oestradiol-17B. En effet, des etudes in vitro avaient permis de montrer que l’ovaire de l’anguille argentee Ctait capable de produire en plus des progestagenes, des androgbnes (Colombo et Colombo-Belvedere, 1976; Querat, 1984) et des oestrogenes (Querat, 1984). Nous avons choisi pour cette etude d’utiliser la technique de l’injection unique d’une dose traceuse d’hormone tritiee, methode qui permet le calcul des demi-vies et des volumes de repartition des hormones dans l’organisme. MATERIEL
ET METHODES
Ste’roiites et re’actifs Wrofdes. Les stCroIdes utilists comme entraineurs ou comme substances de reference ont ete fournis par Sigma. Les steroi’des marques [l,2,6,7-3H]testosterone (activite specifique (AS): 107 Ci/mmol), [2,4,6,7-3H]oestradiol-1713 (AS: 104 Ci/mmol), [4i4C]testosterone (AS:51 mCi/mmol), et [4-i4C]oestradiol-17P (AS: 55 mCi/mmol) ont CtC foumis par the Radiochemical Center (Amersham, U.K.). Leur purete est regulitrement controlte par chromatographie sur couche mince. Rbactifs. Les solvants employ& (Merck, Darmstadt, RFA) sont generalement de qualite pour analyse, sauf l’isooctane et l’acetate d’ethyle, utilises pour la chromatographie des Cchantillons a doser dont la qualite est pour spectroscopic. Ether tthylique pour anesthesie (Gifrer); l3 Glucuronidase (type Hi, Sigma) partiellement purifiCe ii partir d’tielix Pomatia; Chromatolithe A (Biomerieux): ctlite impregnte de propylene glycol:&hylbne glycol, 1: 1;
SEXUELS
483
Charbon actif (Sigma), poudre non traitee (4: 250 a 300); Dextran T 70 (Pharmacia).
Mew-e
de la radioactivite’
La radioactivite (3H ou i4C) a ete mesurte au moyen d’un spectrophotomttre a scintillation liquide (Intertechnique SL 4000) apres addition de cocktail W Scintran (Merck-Clevenot) pour les solutions aqueuses, de Lipoluma (Kontron Roche Bioelectronique) pour les solutions organiques, ou d’un scintillant contenant 0.4% de 2,5-diphenyloxazole (PPO) et 0.25% de 1,4bis(4-mCthyl-5-phtnyl-2-oxazolyl)-benz8ne (dimethylPOPOP) dans le toluene pour les extraits de tissus.
Dosage radioimmunologique L’immunserum anti-oestradiol-17/3, foumi par le Dr. M. Terqui (Laboratoire de Physiologie de la reproduction, INRA, Nouzilly) est un serum de lapin (lot no. 4386) anti-oestradiol-6-CHO-strum albumine bovine. L’immunserum anti-testosterone, Cgalement fourni par le Dr. M. Terqui, est un serum de lapin (lot no. 19620) anti-testosterone-3-hydrazo-serum albumin bovine. Ces antiserums ont et6 utilises a une dilution telle que 40 a 50% du traceur soit lie en l’absence de ligand froid. Pour toutes les dilutions (tchantillons a doser, hormone tritiee, et antiserum), nous avons utilise, pour la testosterone, un tampon phosphate mono-dipotassique 0,l M a pH 7.4 contenant du NaCl (0.126 M), de l’azide de sodium (0.15 M) et de la gelatine (1 gilitre) et, pour l’oestradiol, un tampon phosphate mono-disodique contenant du NaCl (0,15 M) et de la gelatine (1 g/line). Extraction. Les steroldes ont Ctt extraits du plasma par 5 ml d’ether Cthylique, aprts addition dune dose traceuse de steroide a doser atin d’evaluer le rendement d’extraction et de purification. La phase aqueuse contenant les sttro’ides glucuroconjuguts a tte hydrolysee (48 hr a 37”) par 1300 unites Fishman de S-glucuronidase en milieu acide (tampon acetate, 0,l M pH 4.6). Les sttroi’des lib&es ont ete extraits comme cidessus. Purification des extraits. Une purification chromatographique des extraits a Ctt effect&e afin de les delipider, de &parer la testosterone et I’oestradiol-17P des stero’ides susceptibles d’interferer avec leurs immunserums et de doser, sur un meme Cchantillon, la testosterone et l’oestradiol-17S. Cette purification des extraits sets redissous dans l’isooctane, a ete realiste sur colonne de chromatolithe A (Tableau 1). Les fractions a doser (fr. III pour la testosterone et fr. IV pour l’oestradiol-17P) ont ttt Cvaporees a set et redissoutes dans 500 pl du tampon: le rendement des operations d’extraction et de purification a CtC tvalue sur 250 pl (4 ml Scintran) et le dosage a Ctt realise sur deux fractions de 100 pl. Dosage. Aux 100 pl de l’extrait purifie a doser ont
484
QURRAT,
HARDY,
= I I IGQQE I
ET LELOUP-HATEY CtC ajoutes 100 IJ.I de l’immunserum dilue (1: 15,000 pour la testosterone, 1:40,000 pour I’oestradiol-17P) et 100 ul du sterdide tritie correspondant (15,000 dpm). Apres 3 hr d’incubation a 4”, le stboide libre a et6 adsorb6 par 500 ~1 d’une solution contenant 500 mg de charbon et 50 mg de dextran T 70 pour 100 ml de tampon. Aprts 10 min de contact a 4”, le complexe charbon-steroide a CtC separe par centrifugation (10 min a 35,000 tours/mm a 4”). Le sumageant contenant les steroides lids a l’immuns&um a Ctt d&ante et la radioactivitt mesuree (4 ml Scintran). Constitution
des
series
d’e’chantillons
ri doser.
Tomes les determinations ont ete faites en double. Une gamme d’ttalonnage (0 a 250 pgkube) a et6 placee au debut et a la fin de chaque s&tie de determinations. La radioactivite totale et le taux d’adsorption du steroi’de tritie en I’absence d’immuns&rum ont et6 estimes en debut et en tin de drie experimentale. Afin d’tvaluer les interferences dues aux reactifs (“blanc”), un dosage complet a ttt realis sur l’extrait puritie par passage sur colonne de chromatolithe A d’une quantitt d’eau comparable a celles des prises d’essai. De plus, un plasma de reference (plasma d’anguille) a ete regulitrement dose dans chaque serie experimentale. Calcul des teneurs des extraits. Les resultats obtenus ont Ctt interpretes suivant la mtthode de Tovey et a/. (1974). La radioactivite like en l’absence de steroide stable (liaison maximale) &ant C,, celle mesuree en presence de sttroide stable &ant C,, le rapport C,/ C, croit lineairement en fonction de la quantite de steroide present dam le tube, dans les limites choisies pour la gamme d’ttalonnage. La gamme permet d’etablir la relation CJC, = ax (quantite de sttroyde en pg) + b ou “a” est la pente de la droite de regression et “b” l’ordonnte a I’origine (proche de 1). La quantitt de sttrdide presente dans chaque tube a CtC calculte a pattir de cette relation. La teneur en sttroi’de de la prise d’essai a CtC calculte en tenant compte du rendement de l’extraction et de la purification, et du volume de la prise d’essai. Les teneurs du plasma ont Cte exprimees en nanogrammes par millilitres de plasma. Analyse critique de la me’thode de dosage. La limite de detection (deux fois l’tcart type a la dose O), la dose requise pour diminuer de moitie la fraction IiCe (DSO) et le coefftcient de variation [CV = (&art type/moyenne) x 1001 interdosage ont et6 calcults a partir de plusieurs gammes d’ttalonnage faites dans des series experimentales differentes, selon la methode de Tovey et al. (1974).
Animaux Les anguilles argentees femelles sexuellement immatures pesant de 200 a 300 g et de rapport gonado-
MBTABOLISME
DES STtiROPDES
somatique (RGS) compris entre 1.2 et 2.2% ont ttt capturkes en eau douce dans les etangs de PCronne (Somme). Elles ont et6 gard6es au Laboratoire, dans des bassins exttrieurs aliment&s en eau deuce courante a&e jusqu’8 leur mise en expdrience dans des bassins individuels, quelques semaines plus tard.
Etude du mktabolisme de la testostkrone et de l’oestradiol 17p Protocole exptrimental. Les caracteristiques du mttabolisme des stCroIdes sexuels ont Ctt dttermintes en appliquant la mCthode classique utilisCe chez les mammifkres (Tait et Burnstein, 1964). Une telle m&hode est applicable & l’anguille cathCtCrisCe dans les conditions d&rites par Leloup-H&tey (1976). Au moins 8 jours apr&s la pose de cathtter (Clay Adams PE 50) dans l’artkre pneumatique, un premier prkltvement de sang (300 pl environ) a cte effect& par le catheter. Le plasma a &e consew? g - 20” pour doser les stCroides et les htmaties ont &C remises en suspension dans 300 pl de NaCl (%a) contenant 0.2 g 0.5 &i du traceur radioactif et r6injectCes. En ce qui concerne les etudes cinCtiques rCalisCes pour le calcul des param&res du metabolisme, 32 anguilles ont btC injecttes avec du traceur triti6. Pour faciliter la recherche de la nature des mCtabolites circulants de la testostCrone, 4 anguilles ont &6 injectees dans des conditions semblables, avec de la testosterone marquee au 14C (0.23 &i). RadioactivitP plasmatique. Cinquante ou 100 ~1 des plasmas pr&evts B differents intervalles de temps (15 min ?t 96 hr) aprts I’injection ont &! extraits par 5 ml d’tther tthylique. La phase organique a CtC dtcantee ap& congClation de la phase aqueuse et CvaporCe. La radioactivitd a Ctt mesurCe (2 ml Lipoluma) et exprimCe en pourcentage de la dose injectCe par ml de plasma. La phase aqueuse contenant les stCroi’des glucuroconjuguds a CtC hydrolyste comme indiquC prCcCdemment. La radioactivite extractible B I’ether de I’hydrolysat est exprimCe en pourcentage de la radioactivite totale de I’Cchantillon. Nature
de la radioactivitk
plasmatique
extractible.
Cette etude a et6 rtaliste sur Ies pr&vements de sang effectuCs aux differents intervalles de temps aprts injection, soit d’oestradiol-17P tritit, soit de testosterone tritiee, soit de testosttrone marquCe au 14C. Pour chaque temps et pour un stCro’ide donnt, plusieurs tchantillons de plasma ont CtC reunis. La fraction libre extraite g I’Cther a CtC passCe sur colonne de chromatolithe A (Tableau 1) apr&s addition du traceur correspondant, marque au 14Cquand le stCroIde inject6 Ctait marquC au 3H, et vice versa, pour &valuer le rendement de purification dans I’eluat correspondant. Le taux de transformation a CtC ainsi Ctabli pour les divers temps expCrimentaux et les courbes de dCcroissance plasmatique du traceur libre non-transform6 ont CtC tracCes.
485
SEXUELS
La nature des metabolites eventuels a &e recherchte en chromatographiant les tluats radioactifs en couche mince dans le systeme diisopropyl&her:chloroforme:hexane, 7:2: 1. Radioactivitk tissulaire. Quatre-vingt seize heures apr& l’injection d’oestradiol-17P tritit ou de [‘4CJtestostCrone, les animaux ont CtC sac&& et diff&ents organes ont Ctt p&levCs. Cent B 300 mg de tissu ont ttC dissous dans 1 ml de Solutne 100 (Packard) il 60” pendant 15 hr. La radioactivite contenue dans les tissus a CtC mesurCe apr&s addition de 50 )~l d’acide acCtique (pour dliminer la chimiluminescence) et de 10 ml de Scintillant PPO-dimethyl PoPoP (Fontaine, 1970). Le rapport de la radioactivitC d’un g de tissu & celle d’un ml de plasma a Ctt Btabli. Analyse compartimentale. La radioactivitt du traceur tritie libre non-transform6 a CtC exprimee en pour cent de la dose inject&e par millilitre de plasma (x). Si x est port6 en ordonndes logarithmiques en fonction du temps, la courbe obtenue prksente une allure biphasique. L’Cquation de x en fonction du temps peut &tre considtrke comme la somme de deux exponentielles x = Aear + Be-@ avec a > p oti A et B sont les ordonntes & l’origine des composantes rapides et lentes et (Y et p leurs pentes respectives. Une analyse compartimentale a ttC effectuCe selon Tait et al. (1961) alin d’obtenir un mod&le repondant au mieux aux exigences dCterminCes par les valeurs expCrimentales. Dans le modtile bicompartimental choisi, le compartiment interne correspond au compartiment oti l’hormone est rapidement Cchangeable avec le plasma. C’est dans ce compartiment que s’effectuent l’injection et les pr&&vements. Le calcul des diffkrents parametres du mCtabolisme a ttC effect& suivant les formules Ctablies par Tait et al. (1961) puis par Donaldson et Fagerlund (1968). Analyse statistique. Les diffbrents paramttres du mCtabolisme ont ttC calculCs ti partir des courbes individuelles de dCcroissance plasmatique du traceur et ont &e comparees par le test U des valeurs non-parametriques de Mann-Whitney. Les moyennes des paramttres sont reportCes avec leurs valeurs extr&mes.
RESULTATS 1. Teneurs testostbrone
plasmatiques en et oestradiol-17p
Analyse critique de la me’thode de dosage
Le rendement de l’extraction et de la purification est de 66.7 +- 1.9% (n = 28) pour la testostbrone et de 56.8 -+ 2.8% (n = 28) pour l’oestradiol-17P.
Q&RAT,
486
HARDY,
Nous avons precise dans chaque cas (Tableau 2) la sensibilite et la reproductibilite du dosage. Le volume de la prise d’essai a ete choisi de man&e a avoir dans chaque tube de dosage de 20 a.250 pg de testosterone ou 10 a 200 pg d’oestradiol-17p. Teneurs plasmatiques
Testosterone et oestradiol-17P sont presents dans le plasma, pour moitie sous forme glucuroconjuguee (Tableau 3). Les teneurs varient entre 0.05 et 0.50 ngl ml pour la testosterone (libre ou glucuroconjugde) et entre 0.02 et 1.44 rig/ml pour l’oestradiol-17P. 2. Mdtabolisme de la testostkrone et de I’oestradiol 17p A. Nature de la radioactivitk
plasmatique
Quatre-vingt seize heures apres l’injection des solutions traceuses de testosterone ou d’oestradiol-17P, respectivement, moins de 9 ou 12% de la radioactivite plasmatique se trouvent dans la phase aqueuse contenant la fraction glucuroconjuguee. La majeure partie de la radioactivite plasmatique se trouvant dans la phase Ctherosoluble, seule celle-ci a CtC prise en consideration.
ET LELOUP-H/iTEY
Quand le steroi’de injecte est l’oestradiol17p, plus de 95% de la radioactivite extractible a l’bther se comporte sur chromatolithe A, comme le traceur inject& quel que soit le temps Ccoule apt-es l’injection (Tableau 4). Nous avons done considere que la totalite de la radioactivite extractible nonconjuguee Ctait attribuable a l’oestradiol17p. Quand le steroi’de injecte est la testosterone, une partie settlement de la radioactivite extractible se comporte sur chromatolithe A, comme la testosterone: le pourcentage de radioactivite attribuable a ce steroi’de diminue en fonction du temps (Tableau 4). Ce taux de transformation de la testosterone injectee est pris en compte dans le calcul de la decroissance de la radioactivite plasmatique extractible en fonction du temps, afin de ne prendre en consideration que le traceur non-transforme. A chacun des temps consider-es, I’autre partie de la radioactivite est &lute apres la testosterone, par un melange isooctane:acetate d’ethyle, 60:40 (Tableau 1). La nature de cette fraction radioactive n’a pu etre determinee avec certitude, mais son comportement chromatographique sur couche mince permet de penser qu’elle ne contient qu’un seul metabolite et qu’il pour-
TABLEAU SENSIBILITY
ETREPRODUCTIBILITI?
2
Du DOSAGE RADIOIMMUNOLOGIQUE ET DE L'OESTRADIOL-17P
Testostkrone Limite de detection (pgitube) DSO (pgitube) “blanc” (pg) CV interdosage (gamme) CV interdosage (plasma)
Oestradiol-17P
IO 6.2 2s B 30 IS a25 5.0 2 4.7 (IS)u 4.7 k 2.3 (10) 20% 2.5% 19.1% 21% pour une teneurde 0.68 2 0.07 rig/ml (7)
CV intradosage (plasma)
(’ Moyenne 2 son erreur-standard
UE LA TESTOSTERONE
et ( ) nombre de dkterminations.
0.21 t 0.02 ngiml (4) 10% pour uneteneurde 1.06 k 0.04 rig/ml (6)
MkTABOLISME
DES
SThROiDES
TABLEAU
487
SEXUELS
3
TENEURS PLASMATIQUES DE LATESTOSTBRONE ET DE L'OESTRADIOL-I?'P TestostCrone Libres Glucuroconjugu& Totaux a Moyenne
Oestradioh17p
0.12 k 0.02 (19)” 0.13 0.26
-C son erreur-standard
r t
0.02 0.07
0.31 0.23 0.56
(8) (8)
2 O.lO(19) zt 0.07 + 0.21
(9) (8)
et ( ) nombre de determinations.
rait s’agir d’un androstanediol. Le taux d’apparition (y) de ce mCtabolite croit en fonction du temps (t) de faGon lindaire: la droite de rCgression calculCe est y = 0.26 r avec un coefficient de corrClation de 0.987. B. ParamPtres du mktabolisme Les courbes individuelles de dCcroissance des traceurs tritiCs montrent chez 30% environ des anguilles, une premi&-e phase d’augmentation ou un plateau, pendant l/2 hr B 1 hr. Apr& 1 hr, les courbes prCsentent pour les deux hormones, une allure biphasique dont le point de rupture se situe vers 5 B 6 hr. La dkcroissance du traceur est plus rapide dans le cas de la testostCrone que dans le cas de l’oestradiol17p (Fig. 1). Les volumes du compartiment interne sont de m$me grandeur pour la testostCrone (33.9 ml/kg) et l’oestradiol-17P (34 ml/kg) (Tableau 5). Le volume du compartiment externe est plus grand pour la testostCrone TABLEAU
(63.8 ml/kg) que pour l’oestradiol (43.2 ml/ kg) (P < 0.01). La demi-vie de la testostCrone (14.6 hr) est trois ?I quatre fois plus courte que celle de l’oestradiol-17P (48.6 hr) (P < 0.01). Les vitesses de clairance mktabolique sont trois B quatre fois plus rapides pour la testost&one (1.71 ml/kg/hr) que pour l’oestradiol17p (0.51 ml/kg/hr) (P < 0.01). Les vitesses de s&-&ion sont identiques pour les deux stkroi’des. C. Rkpartition radioactivitk
tissulaire de la
Quatre jours apr& l’injection, les seuls organes ayant une concentration de radioactivite supCrieure B celle du plasma sont ceux du systkme en&o-hCpatique (Tableau 6). L’urine ne contient que des traces de radioactivitk. Aucune concentration ou rCtention des traceurs n’est observCe dans les autres tissus CtudiCs (ovaire, cerveau, hypophyse, muscle, ou rate) au bout de ce 4
VARIATIONS EN FONCTION DU TEMPS DE LA RADIOACTIVITY PLASMATIQUE ~TH~ROSOLUBLE (RPE) AU TRACEUR INJECTOR
ATTRIBUABLE
Heures apres l’injection Traceur inject6
6
[3HIOestradiol-17f3 [3HlTestostCrone
97*
ou [14C]testosttrone* ’ ExprimC en pourcentage de la RPE.
24
48
72
94.6 88 96 94*
94
97.5 96 97.9 83*
97.5 87.5*
96
61.5 83 77.6 69.9
QUkRAT,
488
HARDY,
ET LELOUP-HATEY
I I 0.5
; I)
24
II)
12
neures
96
FIG. 1. DCcroissance plasmatique du traceur non conjuguC en fonctioa du temps apr&s I’injection intra-arterielle de testostkrone et d’oestradioi-17s tritiCs chez des anguilles cathttCristes (tempkrature: 11.5 k 0.X). -1es flkches reprksentent I’erreur standard de la moyenne. --le nombre d’anguilles injecttes est entre parenth&ses.
delai. Le foie et la bile contiennent alors, respectivement, 6.9 et 36% de la radioactivite totale apt-es injection de testosterone marquee et 8.5 et 26.5% de la radioactivite totale apres injection d’oestradiol marque. La presence de radioactivite en forte concentration dans le contenu intestinal montre qu’une par-tie de la radioactivite est en tours d’excretion ou a deja CtC excretee. DISCUSSION 1. Teneurs plasmatiques de la testostbrone et de I’oestradiol-17p Les teneurs plasmatiques de la testosterone et de l’oestradiol-17l3 ne sont pas differentes de celles trouvees pour ces memes steroi’des chez les truites Salmo gairdneri
P : selon les auteurs, l’oestradiol-17P est en concentration inferieure a 0.4 rig/ml chez les truitelles d’un an (20-25 g) (Idler et Campbell, 1980)) inferieure a 0.3 rig/ml chez les truites de 2 ans (Whithead et al., 1983) et de I’ordre de 0.5 rig/ml chez les truites de 2 ans et demi (Schulz, 1984). Chez cette espece, la testosterone libre est en concentration inferieure a 0.2 &ml chez les “juveniles” dont le stade ou l’age n’est pas precise (Ng et Idler, 1980). Chez l’anguille, la fraction glucuroconjuguee represente environ 50% de l’hormone circulante. Une par-tie au moins des glucuroconjuguts est d’origine ovarienne puisque 10 a 20% environ des steroi’des synthetises par l’ovaire irz vitro sont hydrosolubles (Querat , 1984).
MfiTABOLISME
DES STtiROjiDES TABLEAU
MBTABOLISME
SEXUELS
489
5
DE LA TESTOSTERONE ET DE L’OESTRADIOL-17P CHEZ L’ANGUILLE:PARAMBTRES SELON UN MODULE i\ 2 COMPART~MENTS
Sttroi’de
Testosttrone
TempCrature (“) Nombre d’animaux Poids (g) RGS (%) Volume du compartiment inteme (ml/kg) Volume du compartiment exteme (ml/kg) Demi-vie (hr) Vitesse de clairance mktabolique (mVkg/hr) Teneur plasmatique hihnl) Vitesse de s&r&ion (ng/kg/hr)
CALCULUS Oestradiol- 17p
11.5 f 1” 17 241 26 1.79 2 0.06
257 ” 8 1.76 -+ 0.07
33.9 [15.5-52.01 6.38 [31.3-100.21 14.6 [5.4-30.11 1.71 [0.78-2.661
34.0 113.2-55.61 43.2* [19.4-91.01 48.6* [30.1-81.81 0.51* [0.21-0.821
11.5
2 15
0.14 + 0.02
(8)
0.34 -t 0.05
(4)
0.24 [O.12-0.451
(8)
0.24 [0.20-0.651
(4)
(1Moyenne 2 son erreur standard ou avec [ ] les valeurs extremes. Le nombre de dkterminations ( ) quand celui-ci est diff&ent du nombre total d’animaux. * Difference significative (P < 0.01 avec les valeurs de la testosttrone).
2. M6tabolisme de la testostthone et de I’oestradioLl7p
Validation de la me’thode utilise’e pour cette e’tude (A)
TABLEAU
exprimt en
Poids (g) RGS (%) Nombre d’anguilles Foie Bile Intestin Contenu intestinal Urine a Moyenne
Hormone
d’une hormone
exogbze.
exogbne,
f son erreur standard
L’utilisation pour 1’Ctude des
6
DE LA RADIOACTIVITY? DANS DIFFBRENTS TISSUS, % HEURES APRBS L’INJECTION DE TESTOSTERONE ou ~0wr~~r1~0L-17P MARQUE.
St&aide Dose (PCi)
est indique
1’unitC de temps chez un animal en Ctat d’Cquilibre physiologique.
La vitesse de clairance mktabolique reprksente, par dkfinition, le volume de plasma CpurC totalement et irreversiblement de la substance considkrke pendant RETENTION
1
INTRAART~RIELLE
dpm par g de tissu dpm par ml de plasma
[‘4C]TestostCrone 0.23 342 ? 20” 1.3 2 0.1 4 2.4 of: 1.1 133 k 36 1.05 2 0.1 21 f 15 0.04 2 0.02
[3H]Oestradiol-17P 0.50 276 ? 20 1.8 k 0.2 4 1.0 k 0.8 53 211 0.5 -+ 0.1 5.2 rt 2.0 co.02
490
QUkRAT,
HARDY,
vitesses de clairance metabolique, necessite qu’un certain nombre de conditions soient respectees (Tait et Burnstein, 1964): (a) l’hormone exogene doit etre identique a l’hormone endogene; (b) l’hormone exogene ne doit pas interferer avec le metabolisme de l’hormone endogbne; (c) l’equilibre physiologique ne doit pas Ctre perturb6 pendant la duree de l’experimentation. Ces conditions ont CtC respectees puisque: a. L’identite et la purete des steroi’des traceurs utilises a CtC verifiee avant leur utilisation par des chromatographies dans plusieurs systemes de solvants. b. L’apport d’hormone exogene a ete tel qu’il ne modifiait pas de facon importante la quantite d’hormone a metaboliser. En effet, la quantite de traceur tritie injectee a toujours CtC inferieure a 1.8 ng de steroi’de. Ainsi, l’augmentation de la concentration plasmatique consecutive a l’injection pourrait etre estimee, au temps 0 et pour une anguille de 250 g a moins de 0.4 rig/ml. Ajoutee a l’hormone endogene circulante sous forme non conjuguee, la teneur obtenue reste dans les valeurs extremes observees pour la testosterone et I’oestradiol17B chez l’anguille. Dans le plasma, le melange homogene entre le traceur et l’hormone endogene (libre ou lice aux proteines plasmatiques) doit Ctre realise: en effet, nous avons montre par dialyse B I’equilibre de plasma d’anguille que le traceur pouvait Ctre lie au systeme plasmatique de transport et que cette liaison pouvait etre deplacee par l’hormone froide (Querat et al., 1983). c. En ce qui concerne le maintien de l’equilibre physiologique, il a CtC montre par une etude de la fonction interrenalienne que les animaux ne sont plus en phase primaire de stress au moment de l’experience (Leloup-Hritey, 1976): la cortisolemie, Clevee apres la catheterisation revient a son niveau basal 3 ou 4 jours apres I’operation, soit 3 ou 4 jours avant l’injection du traceur, et reste stable durant toute la periode d’ex-
ET
LELOUP-HATEY
perimentation. L’incision est le plus souvent cicatrisee ou en voie de cicatrisation. (B) Injection du traceur. L’utilisation de la methode d’une injection unique du traceur necessite que la repartition dans l’organisme de celui-ci se realise en un temps court, comparativement a la vitesse des phenombnes observes. Chez l’anguille, les courbes de decroissance plasmatique du traceur montrent une augmentation (10% des cas) ou une stabilisation transitoire du traceur (20% des cas) pendant une periode d’environ l/2 hr. Cette phase correspond au temps necessaire a l’equilibre du traceur avec l’hormone endogene. Chez la truite, l’equilibre est atteint en 2 a 4 min (Zohar, 1982). La lenteur relative du phenomene chez l’anguille peut s’exphquer par les particularites anatomiques de son systeme circulatoire. En effet, chez l’anguille, les systemes portes, hepatique et renal, comportent des anastomoses dont le nombre et l’importance varient d’un animal a I’autre (Mott, 1949). Le renouvellement complet du sang au niveau des tissus peut done, dans certains cas, Ctre prolonge de facon importante. Neanmoins, la duke du phenom&e est relativement courte en comparaison avec celle des autres processus impliques dans le mdtabolisme des deux stero’ides . Apt-es cette premiere phase d’une demiheure, le traceur chute d’abord brusquement jusqu’a 6 hr apt-es l’injection, refletant le transfert de l’hormone du compartiment interne vers le compartiment externe. Une fois l’equilibre des deux compartiments atteint, la chute du traceur est plus progressive et correspond a la disparition irreversible de l’hormone du compartiment interne. ParumPtres du me’tabolisme Les volumes du compartiment interne sont voisins pour les deux hormones. 11s representent 1.3 a 5.5% du poids du corps. Ces volumes sont le plus souvent superieurs au volume plasmatique moyen des
MtiTABOLISME
DES
poissons Teleosteens (1.8% du poids du corps) mais inferieurs au volume du liquide extracellulaire moyen chez ces memes poissons (14% du poids du corps) (Thorson, 1961). Si ces don&es sont applicables a l’anguille, le volume du compartiment interne pour ces deux stero’ides correspondrait au volume plasmatique augment6 d’une partie du volume des liquides extracellulaires. Ces resultats sont cornparables a ceux obtenus chez la truite au debut de la recrudescence ovarienne ou le volume du compartiment interne de l’oestradiol represente 3.1 a 6% du poids du corps (Zohar, 1982). Les volumes du compartiment externe sont de 6.4 et 4.3% du poids du corps, respectivement, pour la testosterone et l’oestradiol-17B, ce qui donne un volume apparent de distribution total proche de 10% pour la testosterone et de 7.7% pour l’oestradiol-17B. La demi-vie de la testosterone (14 hr 30) est 3 a 4 fois plus courte que celle de l’oestradiol (48 hr 30). Inversement, la vitesse de clairance metabolique de la testosterone (0.8 a 2.7 ml/kg/hr) est 3 a 4 fois plus Clevee que celle de l’oestradiol (0.2 a 0.8 ml/kg/ hr). Chez un Selacien, la raie 0 mature, la vitesse de clairance metabolique de la testosterone a 5” (Fletcher et al., 1969) est 5 fois plus Clevee que chez l’anguille 0 sexuellement immature a 12”. Chez la truite 0, au debut de la recrudescence ovarienne, celle de l’oestradiol a 10” (Zohar, 1982; Fostier et al., 1984) est 40 a 50 fois plus Clevee que chez l’anguille. Comme nous l’avons suggere plus haut, le temps de renouvellement complet du sang est plus lent chez l’anguille que chez la truite. Cette lenteur pourrait etre a l’origine des differences observees en ce qui concerne les vitesses de clairance metabolique de l’oestradiol-17B entre ces deux esp&es. En effet, la vitesse de clairance metabolique est directement proportionnelle au flux de sang traversant le foie, organe principal du metabolisme des stbroi’des (Tait et Burnstein, 1964).
ST6ROiDES
491
SEXUELS
Par ailleurs, il est a noter que le stade de developpement ovarien de l’anguille argentee sexuellement immature est encore tres Cloigne de celui atteint chez les truites matures (c’est-a-dire ayant pondu au moins une fois) en debut de recrudescence ovarienne. Chez l’anguille, la vitellogenine n’est presente en quantite notable ni dans le plasma, ni dans l’ovocyte (BurzawaGerard, 1982) alors que chez ces truites, la vitellogenbse exogbne a debut& Or, il a CtC montre chez la truite mature, que la vitesse de clairance metabolique de l’oestradiol17B augmente pendant la periode de recrudescence ovarienne pour atteindre un niveau deux a trois fois plus &levC au moment de la migration de la vesicule germinative (Zohar, 1982; Fostier et al., 1984), indiquant ainsi que I’intensite du catabolisme des steroi’des sexuels pouvait varier au tours du cycle. De plus, une differentiation sexuelle des activites enzymatiques du catabolisme hepatique des stero’ides sexuels, consecutive a la premiere maturation sexuelle a CtC d&rite chez la truite (Hansson et Gustafsson, 1981) suggerant que des modifications des vitesses du catabolisme puissent Cgalement intervenir. Les vitesses de secretion de la testosterone et de l’oestradiol-17B sont identiques (0.24 ng/kg/hr). Les teneurs plasmatiques observees chez l’anguille pour ces deux hormones, sont nettement plus faibles que celles observees chez la raie mature pour la testosterone (38 rig/ml) (Fletcher et al., 1969) ou chez la truite au debut de la recrudescence ovarienne pour I’oestradiol (environ 1 a 2 &ml) (Zohar, 1982). Du fait de ces faibles teneurs plasmatiques et des faibles vitesses de clairance metabolique, les vitesses de secretion apparaissent chez l’anguille 1000 fois plus faible pour la testosterone que chez la raie mature et pres de 100 fois plus faible pour l’oestradiol que chez la truite au debut de la recrudescence ovarienne . Organes et nature du mPtabolisme
L’etude
de la repartition
tissulaire de la
492
Q&RAT,
HARDY,
ET LELOUP-HATEY
radioactivite indique que 96 hr apt-es l’in- peut avoir des consequences importantes, jection de testosterone ou d’oestradiol-17B chez les Mammiferes, sur les teneurs plasmarques, la majeure pat-tie de la radioacmatiques de ces hormones (Franz et Longtivite est retrouvee dans la bile. Des resul- cope, 1979). Cette 17-d&hydrogenation est tats comparables sont obtenus apres diffeindecelable chez l’anguille argentee. rents types d’administration de testosPar ailleurs, l’aromatisation des androterone marquee chez la truite (Schreck, genes au niveau du systtme nerveux central 1973), chez le Saumon coho (Fagerlund et et notamment de l’hypophyse, mise en eviMcBride, 1978) et chez la carpe (Lone et dence chez les poissons TelCostCens (CalMatty, 1981) ou d’oestradiol marque, chez lard et al., 1981) joue un role important dans le retrocontrole de la fonction gonaHemichromis bimaculatus (Myers et Avila, 1980). L’urine ne contient alors que des dotrope par les steroi’des sexuels (Peter, traces de radioactivite, ce qui semble indi1983). L’incapacite de la testosterone a inquer que le rein ne joue qu’un role mineur duire, comme l’oestradiol, la synthese hydans l’excretion des stero’ides sexuels chez pophysaire d’hormone gonadotrope chez l’anguille . l’anguille 0 semblait indiquer qu’une telle D’autres tissus (peau, muscle, etc.) sont aromatisation de la testosterone n’avait pas lieu (Dufour et al., 1983). Ces resultats sont susceptibles de mttaboliser les sttroi’des sexuels chez les poissons Teleosteens (Hay en accord avec le fait qu’aucune trace et al., 1976). Chez l’anguille, aucune con- d’oestradiol marque ne soit d&eke dans le centration ou retention importante de la ra- plasma quel que soit le temps apt-es injecdioactivite n’est observee dans les divers tion de testosterone marquee. tissus Ctudies, hormis ceux du tractus gastrointestinal, indiquant que leur participaREMERCIEMENTS tion au metabolisme de la testosterone et Ce travail a beneficie de l’aide financiere de I’Acde l’oestradiol-17B est quantitativement tion Thematique Programmee: Bases Biologiques de peu importante. Ce resultat est confirm6 1’Aquaculture (CNRS et CNEXO). Nous sommes par la faible quantite de metabolites mar- vivement reconnaissants au Dr. M. Terqui (Laboratoire de Physiologie de la Reproduction, INRA, Nouques, glucuroconjugues ou non, trouves dans le plasma durant l’experience. En zilly) qui nous a gracieusement fourni les immunNous remercions F. Lieron et P Lafay pour effet, seuls 8 et 12%, respectivement, de la strums. leur assistance technique a la preparation du manuradioactivite plasmatique se trouvent sous suit. forme glucuroconjuguee 96 hr apres l’injecRt?FiRENCES tion de testosterone ou d’oestradiol. De plus, le metabolite de la testosterone ne Burzawa-Gerard, E. (1982). Existe-t-i1 plusieurs gonadotropines (GTH) chez les poissons? Donnees represente alors que 25% environ de la rabiochimiques et vitellogenese exogene. In “Redioactivite libre circulante tandis qu’aucun productive Physiology of Fish” (C. J. J. Richter metabolite de l’oestradiol n’est decele dans et H. J. Th. Goos, eds.), pp. 19-22. Comp. la fraction libre du plasma, quel que soit Ie Pudoc , Wageningen , Netherlands. temps apres l’injection du traceur. Callard, G. V., Petro, Z., et Ryan, K. J. (1981) Biochemical evidence for aromatization of androgen Le comportement chromatographique to estrogen in the pituitary. Gen. Camp. &do(sur colonne ou en couche mince) du mecrinol. 44, 359-361. tabolite de la testosterone indique qu’il Colombo, L., et Colombo-Belvedere, P (1976). Stes’agit probablement d’un androstanediol. roid biosynthesis by the ovary of the European En tout cas, il ne s’agit ni d’oestradiol ou eel, at the silver stage. Gen. Comp. Endocrinol. 28, 371-385. d’oestrone ni de ll-oxotestosterone ou Donaldson, E. M., et Fagerlund, LJ. H. M. (1968). d’androstenedione. Changes in the cortisol dynamics of Sockeye La formation peripherique d’androsteneSalmon (Uncorhynchus nerka) resulting from dione et d’oestrone, a partir, respectivesexual maturation. Gen. Comp. Endocrinol. 11, ment de la testosterone et de l’oestradiol, 552-561.
METABOLISME
DES STEROIDES
Dufour, S., Delerue-Le Belle, N., et Fontaine, Y. A. (1983). Effects of steroid hormones on pituitary immunoreactive gonadotropin in European freshwater eel, Anguilla anguilla L. Gen. Comp. Endocrinol. 52, 190-197. Fagerlund, U. H. M., et McBride, J. R. (1978). Distribution and disappearance of radioactivity in blood and tissues of Coho Salmon (Oncorhynchus kisutch) after oral administration of 3H-testosterone. J. Fish. Res. Board Canad. 35, 893-900. Fletcher, G. L., Hardy, D. C., et Idler, D. R. (1969). Testosterone production and metabolic clearance rates in sexually mature male and female skate (Raja
radiata).
Endocrinology
85, 552-560.
Fontaine, Y. A. (1970). Biosynthese et purification de I’hormone thyreotrope tritiee de rat. Sa distribution chez le rat apres injection intraveineuse. J. Physiol.
(Paris)
62, 489-504.
Fostier, A., Baroillier, J. F., et Mones, A. (1984). “Niveaux plasmatiques et intraovariens des sterofdes sexuels chez la truite arc-en-ciel durant la periode periovulatoire et leurs regulations.” Resume de la reunion de Physiologie des Poissons, 1984. Paimpont. Franz, C., et Longcope, C. (1979). Androgen and estrogen metabolism in male Rhesus monkeys. Endocrinology 105, 869-874. Hanson, T., et Gustafsson, J. A. (1981). Sex differences in the hepatic in vitro metabolism of 4-androstene-3,17-dione in rainbow trout, Salmo gairdneri. Gen. Camp. Endocrinol. 44, 181-188. Hay, J. B., Hodgins, M. B., et Roberts, R. J. (1976). Androgen metabolism in skin and skeletal muscle of the rainbow trout (Salmo gairdnerii) and in accessory sexual organs of the spur dogfish (Squalus
acanthias).
Gen.
Comp.
Endocrinol.
29,
402-413. Idler, D. R., et Campbell, C. M. (1980). Gonadotropin stimulation of estrogen and yolk precursor synthesis in juvenile rainbow trout. Gen. Comp. Endocrinol. 41, 384-391. Leloup-Hatey, J. (1976). Methodes de mesure des vitesses d’tpuration metabolique et de secretion du cortisol chez l’anguille (Anguilla anguilla L.). Canad.
J. Physiol.
Pharmacol.
54, 262-276.
Lone, K. P., et Matty, A. J. (1981). Uptake and disappearance of radioactivity in blood and tissues of carp (Cyprinus carpio) after feeding )H-testosterone. Aquaculture 24, 315-326. Mott, S. C. (1949). The gross anatomy of the blood vascular system of the eel (Anguilla anguilla). Proc. 2001. Sot. London 120, 503-518. Myers, S. F., et Avila, V. L. (1980). Tritiated 17p-estradiol uptake by brain and other tissues of the
493
SEXUELS
cichlid jewel fish, Hemichromis
bimaculatus.
203-211. Ng, T. B., et Idler, D. R. (1980). Gonadotropic regulation of androgen production in flounder and salmonids. Gen. Comp. Endocrinol. 42, 25-38. Peter, R. E. (1983). The brain and neurohormones in teleost reproduction. In “Fish Physiology” (W. S. Hoar, D. J. Randall, et E. M. Donaldson, eds.), Vol. 9A, pp. 97-135. Academic Press, New York. Qutrat, B. (1984). “Biosynthese et metabolisme des sttro’ides ovariens chez I’anguille (Anguilla anguilla L.) argentee.” These Doctorat 3bme cycle, Univ. Paris VI. Querat, B., Hardy, A., et Leloup-Hltey, J. (1983). Etude de la liaison plasmatique des sttrdides sexuels et du cortisol chez I’anguille argentee femelle (Anguilla anguilla L.). C. R. Acad. Sci. Ser. ZZZ 297, 119-122. Schreck, C. B. (1973). Uptake of [3H]testosterone and influence of an antiandrogen in tissues of rainbow trout (Salmo gairdneri). Gen. Comp. Endocrinol. 21, 60-68. Schulz, R. (1984). Serum levels of 1 I-oxotestosterone in male and 17B-oestradiol in female rainbow trout (Salmo gairdneri) during the first reproductive cycle. Gen. Comp. Endocrinol. 56, 111-120. Tait, J. F., et Burnstein, S. (1964). In vivo studies of steroid dynamics in man. In “The Hormones” (G. Pincus, K. V. Thimann, et E. B. Astwood, eds.), Vol. 5, pp. 441-557. Academic Press, New York. Tait, J. F., Tait, S. A. S., Little, B., et Laumas, K. R. (1961). The disappearance of 7-3H-d-aldosterone in the plasma of normal subjects. J. Clin. Invest. 40, 72-80. Thorson, T. (1961). Partitioning of the body water in Osteichthyes: Phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol. Bull. 120, 238-254. Tovey, R. C., Oldham, K. G., et Whelan, J. A. M. (1974). A simple direct assay for cyclic AMP in plasma and other biological samples using an improved competitive protein binding technique. Clin. Chim. Acta 56, 221-234. Whitehead, D., Bromage, N. R., et Breton, B. (1983). Changes in serum levels of gonadotropin, oestradial-17S and vitellogenin during the first and subsequent reproductive cycles of female rainbow trout. Aquaculture 34, 317-326. Zohar, Y. (1982). “L’tvolution de la puberte et des cycles nycthemeraux de la secretion gonadotrope chez la truite arc-en-ciel femelle, en relation avec le cycle sexuel annuel et par rapport 9 I’activite steroidogene de l’ovaire.” These Doct. Etat Sci. Nat., Univ. Paris VI. Gen.
Comp.
Endocrinol.
42,
AND
COMPARATIVE
59, 482-493 (1985)
ENDOCRINOLOGY
Niveaux plasmatiques, vitesses de clairance m&abolique, et vitesses de s&-&ion de la testost6rone et de I’oestradiol-l7P chez I’anguille (Anguilla anguilla L.) argent6e BRUNO Laboratoire
de Physiologie d’Endocrinologie
Q&RAT, gt’nPrale comparPe
ANNIE
HARDY,
ET JEANINE
et comparee da Muskurn associe’ au CNRS, 7 rue
LELOUP-HATEY
national d’Histoire Cuvier, 75231 Paris
naturelle, et Laborutoire CPdex 05, France
Accepted January 2, 1985 Testosterone (T) and 17P-estradiol (E,) plasma levels and metabolic clearance rates (MCR) were measured to investigate their ovarian production in immature silver eel. The dynamics of T and Ez metabolism were studied in catheterized eels using single injections of 0.2 to 0.5 pCi 3H-labeled steroid. The distribution volumes, biological half-life and MCR of nonconjugated tracers were calculated on the basis of a two-compartment model. At the end of the experiments, radioactivity was measured in different organs and tissues to localize the site of T and E, catabolism. The volume of the inner compartment was 3.4% for T and E,. The outer compartment was larger for T (6.4%) than that for E, (4.3%). The biological half-life was three to four times shorter for T (14.5 hr) than that for Ez (48.5 hr). The MCR for T (1.71 ml/kg body wt/hr) was higher than for EX (0.51 ml/kg body wtihr). Plasma levels were determined, using radioimmunoassay, on samples taken before injections of radiolabeled steroid. Free or protein-bound hormone levels were 0.12 and 0.31 ngl ml for T and E,, respectively. Conjugated T and E, levels were. respectively, 0.13 and 0.23 rig/ml. Production rates were determined as the product of the MCR and the plasma concentration of the nonconjugated hormone. No significant differences were observed between the production rates of T and E, (0.24 rig/kg body wtihr). The liver was the principal site of metabolism for both hormones. which were excreted via the enterohepatic route. Ez injection gave rise to no metabolite in the plasma whereas after T injection a metabolite was produced, the concentration of which increased as a function of time. Its chromatographic properties were different from that of Ez or androstenedione, suggesting that no significant peripheral aromatization or 17-oxidoreduction occurs in the immature silver eel.
C 1985 Academic
Press, Inc.
Le niveau circulant d’une hormone est souvent considere comme un indice valable pour apprecier la quantite d’hormone susceptible d’acceder a ses tissus cibles. Cette don&e n’est cependant pas suffisante pour connaitre I’intensite du fonctionnement de la glande endocrine qui secrete cette hormone. En effet, le niveau circulant d’une hormone a un instant donne depend bien de la vitesse de secretion de cette hormone dans la circulation, mais aussi de la vitesse de son elimination (excretion, metabolisme peripherique) ainsi que de son volume de repartition dans l’organisme. Peu de travaux ont CtC realist% concernant la mesure de ces parambtres pour les steroi’des se-
xuels chez les poissons. Une etude de la parition plasmatique et tissulaire de la testosterone a CtC realisee chez le Saumon coho (Fagerlund et McBride, 1978) et chez la Carpe (Lone et Marty, 1981). Cependant, du fait des techniques utilisees (administration orale prolongee de fortes doses d’hormone marquee), ces travaux ne permettaient pas de calculer la vitesse de clairance metabolique et done d’estimer les vitesses de secretion ou d’elimination de la testosterone endogene. Ces paramttres ont pu etre mesures chez deux espbces de poissons. Deux techniques ont CtC adoptees, utilisant des quantites traceuses d’hormone tritiee: la methode de perfusion continue de 482
0016-6480185 $1.50 Copyright 0 1985 by Academic Press. Inc. All rights of reproduction in any form reserved.
METABOLISME
DES STEROIDES
testosterone tritiee, chez la Raie mature (Fletcher et al., 1969) ou d’oestradiol-17p tritie, chez la truite aux divers stades de maturation ovarienne (Fostier et al., 1984) et la methode d’une injection unique de l’oestradiol-17B tritie, Cgalement chez la truite aux divers stades (Zohar, 1982); les deux methodes utilisees pour la meme hormone chez la truite avaient don& des resultats cornparables. Le but de notre etude Ctait d’apprecier l’intensite du fonctionnement de l’ovaire de l’anguille argentee par la mesure de la vitesse de clairance metabolique et du niveau plasmatique de deux hormones types synthetisees par l’ovaire: la testosterone et l’oestradiol-17B. En effet, des etudes in vitro avaient permis de montrer que l’ovaire de l’anguille argentee Ctait capable de produire en plus des progestagenes, des androgbnes (Colombo et Colombo-Belvedere, 1976; Querat, 1984) et des oestrogenes (Querat, 1984). Nous avons choisi pour cette etude d’utiliser la technique de l’injection unique d’une dose traceuse d’hormone tritiee, methode qui permet le calcul des demi-vies et des volumes de repartition des hormones dans l’organisme. MATERIEL
ET METHODES
Ste’roiites et re’actifs Wrofdes. Les stCroIdes utilists comme entraineurs ou comme substances de reference ont ete fournis par Sigma. Les steroi’des marques [l,2,6,7-3H]testosterone (activite specifique (AS): 107 Ci/mmol), [2,4,6,7-3H]oestradiol-1713 (AS: 104 Ci/mmol), [4i4C]testosterone (AS:51 mCi/mmol), et [4-i4C]oestradiol-17P (AS: 55 mCi/mmol) ont CtC foumis par the Radiochemical Center (Amersham, U.K.). Leur purete est regulitrement controlte par chromatographie sur couche mince. Rbactifs. Les solvants employ& (Merck, Darmstadt, RFA) sont generalement de qualite pour analyse, sauf l’isooctane et l’acetate d’ethyle, utilises pour la chromatographie des Cchantillons a doser dont la qualite est pour spectroscopic. Ether tthylique pour anesthesie (Gifrer); l3 Glucuronidase (type Hi, Sigma) partiellement purifiCe ii partir d’tielix Pomatia; Chromatolithe A (Biomerieux): ctlite impregnte de propylene glycol:&hylbne glycol, 1: 1;
SEXUELS
483
Charbon actif (Sigma), poudre non traitee (4: 250 a 300); Dextran T 70 (Pharmacia).
Mew-e
de la radioactivite’
La radioactivite (3H ou i4C) a ete mesurte au moyen d’un spectrophotomttre a scintillation liquide (Intertechnique SL 4000) apres addition de cocktail W Scintran (Merck-Clevenot) pour les solutions aqueuses, de Lipoluma (Kontron Roche Bioelectronique) pour les solutions organiques, ou d’un scintillant contenant 0.4% de 2,5-diphenyloxazole (PPO) et 0.25% de 1,4bis(4-mCthyl-5-phtnyl-2-oxazolyl)-benz8ne (dimethylPOPOP) dans le toluene pour les extraits de tissus.
Dosage radioimmunologique L’immunserum anti-oestradiol-17/3, foumi par le Dr. M. Terqui (Laboratoire de Physiologie de la reproduction, INRA, Nouzilly) est un serum de lapin (lot no. 4386) anti-oestradiol-6-CHO-strum albumine bovine. L’immunserum anti-testosterone, Cgalement fourni par le Dr. M. Terqui, est un serum de lapin (lot no. 19620) anti-testosterone-3-hydrazo-serum albumin bovine. Ces antiserums ont et6 utilises a une dilution telle que 40 a 50% du traceur soit lie en l’absence de ligand froid. Pour toutes les dilutions (tchantillons a doser, hormone tritiee, et antiserum), nous avons utilise, pour la testosterone, un tampon phosphate mono-dipotassique 0,l M a pH 7.4 contenant du NaCl (0.126 M), de l’azide de sodium (0.15 M) et de la gelatine (1 gilitre) et, pour l’oestradiol, un tampon phosphate mono-disodique contenant du NaCl (0,15 M) et de la gelatine (1 g/line). Extraction. Les steroldes ont Ctt extraits du plasma par 5 ml d’ether Cthylique, aprts addition dune dose traceuse de steroide a doser atin d’evaluer le rendement d’extraction et de purification. La phase aqueuse contenant les sttro’ides glucuroconjuguts a tte hydrolysee (48 hr a 37”) par 1300 unites Fishman de S-glucuronidase en milieu acide (tampon acetate, 0,l M pH 4.6). Les sttroi’des lib&es ont ete extraits comme cidessus. Purification des extraits. Une purification chromatographique des extraits a Ctt effect&e afin de les delipider, de &parer la testosterone et I’oestradiol-17P des stero’ides susceptibles d’interferer avec leurs immunserums et de doser, sur un meme Cchantillon, la testosterone et l’oestradiol-17S. Cette purification des extraits sets redissous dans l’isooctane, a ete realiste sur colonne de chromatolithe A (Tableau 1). Les fractions a doser (fr. III pour la testosterone et fr. IV pour l’oestradiol-17P) ont ttt Cvaporees a set et redissoutes dans 500 pl du tampon: le rendement des operations d’extraction et de purification a CtC tvalue sur 250 pl (4 ml Scintran) et le dosage a Ctt realise sur deux fractions de 100 pl. Dosage. Aux 100 pl de l’extrait purifie a doser ont
484
QURRAT,
HARDY,
= I I IGQQE I
ET LELOUP-HATEY CtC ajoutes 100 IJ.I de l’immunserum dilue (1: 15,000 pour la testosterone, 1:40,000 pour I’oestradiol-17P) et 100 ul du sterdide tritie correspondant (15,000 dpm). Apres 3 hr d’incubation a 4”, le stboide libre a et6 adsorb6 par 500 ~1 d’une solution contenant 500 mg de charbon et 50 mg de dextran T 70 pour 100 ml de tampon. Aprts 10 min de contact a 4”, le complexe charbon-steroide a CtC separe par centrifugation (10 min a 35,000 tours/mm a 4”). Le sumageant contenant les steroides lids a l’immuns&um a Ctt d&ante et la radioactivitt mesuree (4 ml Scintran). Constitution
des
series
d’e’chantillons
ri doser.
Tomes les determinations ont ete faites en double. Une gamme d’ttalonnage (0 a 250 pgkube) a et6 placee au debut et a la fin de chaque s&tie de determinations. La radioactivite totale et le taux d’adsorption du steroi’de tritie en I’absence d’immuns&rum ont et6 estimes en debut et en tin de drie experimentale. Afin d’tvaluer les interferences dues aux reactifs (“blanc”), un dosage complet a ttt realis sur l’extrait puritie par passage sur colonne de chromatolithe A d’une quantitt d’eau comparable a celles des prises d’essai. De plus, un plasma de reference (plasma d’anguille) a ete regulitrement dose dans chaque serie experimentale. Calcul des teneurs des extraits. Les resultats obtenus ont Ctt interpretes suivant la mtthode de Tovey et a/. (1974). La radioactivite like en l’absence de steroide stable (liaison maximale) &ant C,, celle mesuree en presence de sttroide stable &ant C,, le rapport C,/ C, croit lineairement en fonction de la quantite de steroide present dam le tube, dans les limites choisies pour la gamme d’ttalonnage. La gamme permet d’etablir la relation CJC, = ax (quantite de sttroyde en pg) + b ou “a” est la pente de la droite de regression et “b” l’ordonnte a I’origine (proche de 1). La quantitt de sttrdide presente dans chaque tube a CtC calculte a pattir de cette relation. La teneur en sttroi’de de la prise d’essai a CtC calculte en tenant compte du rendement de l’extraction et de la purification, et du volume de la prise d’essai. Les teneurs du plasma ont Cte exprimees en nanogrammes par millilitres de plasma. Analyse critique de la me’thode de dosage. La limite de detection (deux fois l’tcart type a la dose O), la dose requise pour diminuer de moitie la fraction IiCe (DSO) et le coefftcient de variation [CV = (&art type/moyenne) x 1001 interdosage ont et6 calcults a partir de plusieurs gammes d’ttalonnage faites dans des series experimentales differentes, selon la methode de Tovey et al. (1974).
Animaux Les anguilles argentees femelles sexuellement immatures pesant de 200 a 300 g et de rapport gonado-
MBTABOLISME
DES STtiROPDES
somatique (RGS) compris entre 1.2 et 2.2% ont ttt capturkes en eau douce dans les etangs de PCronne (Somme). Elles ont et6 gard6es au Laboratoire, dans des bassins exttrieurs aliment&s en eau deuce courante a&e jusqu’8 leur mise en expdrience dans des bassins individuels, quelques semaines plus tard.
Etude du mktabolisme de la testostkrone et de l’oestradiol 17p Protocole exptrimental. Les caracteristiques du mttabolisme des stCroIdes sexuels ont Ctt dttermintes en appliquant la mCthode classique utilisCe chez les mammifkres (Tait et Burnstein, 1964). Une telle m&hode est applicable & l’anguille cathCtCrisCe dans les conditions d&rites par Leloup-H&tey (1976). Au moins 8 jours apr&s la pose de cathtter (Clay Adams PE 50) dans l’artkre pneumatique, un premier prkltvement de sang (300 pl environ) a cte effect& par le catheter. Le plasma a &e consew? g - 20” pour doser les stCroides et les htmaties ont &C remises en suspension dans 300 pl de NaCl (%a) contenant 0.2 g 0.5 &i du traceur radioactif et r6injectCes. En ce qui concerne les etudes cinCtiques rCalisCes pour le calcul des param&res du metabolisme, 32 anguilles ont btC injecttes avec du traceur triti6. Pour faciliter la recherche de la nature des mCtabolites circulants de la testostCrone, 4 anguilles ont &6 injectees dans des conditions semblables, avec de la testosterone marquee au 14C (0.23 &i). RadioactivitP plasmatique. Cinquante ou 100 ~1 des plasmas pr&evts B differents intervalles de temps (15 min ?t 96 hr) aprts I’injection ont &! extraits par 5 ml d’tther tthylique. La phase organique a CtC dtcantee ap& congClation de la phase aqueuse et CvaporCe. La radioactivitd a Ctt mesurCe (2 ml Lipoluma) et exprimCe en pourcentage de la dose injectCe par ml de plasma. La phase aqueuse contenant les stCroi’des glucuroconjuguds a CtC hydrolyste comme indiquC prCcCdemment. La radioactivite extractible B I’ether de I’hydrolysat est exprimCe en pourcentage de la radioactivite totale de I’Cchantillon. Nature
de la radioactivitk
plasmatique
extractible.
Cette etude a et6 rtaliste sur Ies pr&vements de sang effectuCs aux differents intervalles de temps aprts injection, soit d’oestradiol-17P tritit, soit de testosterone tritiee, soit de testosttrone marquCe au 14C. Pour chaque temps et pour un stCro’ide donnt, plusieurs tchantillons de plasma ont CtC reunis. La fraction libre extraite g I’Cther a CtC passCe sur colonne de chromatolithe A (Tableau 1) apr&s addition du traceur correspondant, marque au 14Cquand le stCroIde inject6 Ctait marquC au 3H, et vice versa, pour &valuer le rendement de purification dans I’eluat correspondant. Le taux de transformation a CtC ainsi Ctabli pour les divers temps expCrimentaux et les courbes de dCcroissance plasmatique du traceur libre non-transform6 ont CtC tracCes.
485
SEXUELS
La nature des metabolites eventuels a &e recherchte en chromatographiant les tluats radioactifs en couche mince dans le systeme diisopropyl&her:chloroforme:hexane, 7:2: 1. Radioactivitk tissulaire. Quatre-vingt seize heures apr& l’injection d’oestradiol-17P tritit ou de [‘4CJtestostCrone, les animaux ont CtC sac&& et diff&ents organes ont Ctt p&levCs. Cent B 300 mg de tissu ont ttC dissous dans 1 ml de Solutne 100 (Packard) il 60” pendant 15 hr. La radioactivite contenue dans les tissus a CtC mesurCe apr&s addition de 50 )~l d’acide acCtique (pour dliminer la chimiluminescence) et de 10 ml de Scintillant PPO-dimethyl PoPoP (Fontaine, 1970). Le rapport de la radioactivitC d’un g de tissu & celle d’un ml de plasma a Ctt Btabli. Analyse compartimentale. La radioactivitt du traceur tritie libre non-transform6 a CtC exprimee en pour cent de la dose inject&e par millilitre de plasma (x). Si x est port6 en ordonndes logarithmiques en fonction du temps, la courbe obtenue prksente une allure biphasique. L’Cquation de x en fonction du temps peut &tre considtrke comme la somme de deux exponentielles x = Aear + Be-@ avec a > p oti A et B sont les ordonntes & l’origine des composantes rapides et lentes et (Y et p leurs pentes respectives. Une analyse compartimentale a ttC effectuCe selon Tait et al. (1961) alin d’obtenir un mod&le repondant au mieux aux exigences dCterminCes par les valeurs expCrimentales. Dans le modtile bicompartimental choisi, le compartiment interne correspond au compartiment oti l’hormone est rapidement Cchangeable avec le plasma. C’est dans ce compartiment que s’effectuent l’injection et les pr&&vements. Le calcul des diffkrents parametres du mCtabolisme a ttC effect& suivant les formules Ctablies par Tait et al. (1961) puis par Donaldson et Fagerlund (1968). Analyse statistique. Les diffbrents paramttres du mCtabolisme ont ttC calculCs ti partir des courbes individuelles de dCcroissance plasmatique du traceur et ont &e comparees par le test U des valeurs non-parametriques de Mann-Whitney. Les moyennes des paramttres sont reportCes avec leurs valeurs extr&mes.
RESULTATS 1. Teneurs testostbrone
plasmatiques en et oestradiol-17p
Analyse critique de la me’thode de dosage
Le rendement de l’extraction et de la purification est de 66.7 +- 1.9% (n = 28) pour la testostbrone et de 56.8 -+ 2.8% (n = 28) pour l’oestradiol-17P.
Q&RAT,
486
HARDY,
Nous avons precise dans chaque cas (Tableau 2) la sensibilite et la reproductibilite du dosage. Le volume de la prise d’essai a ete choisi de man&e a avoir dans chaque tube de dosage de 20 a.250 pg de testosterone ou 10 a 200 pg d’oestradiol-17p. Teneurs plasmatiques
Testosterone et oestradiol-17P sont presents dans le plasma, pour moitie sous forme glucuroconjuguee (Tableau 3). Les teneurs varient entre 0.05 et 0.50 ngl ml pour la testosterone (libre ou glucuroconjugde) et entre 0.02 et 1.44 rig/ml pour l’oestradiol-17P. 2. Mdtabolisme de la testostkrone et de I’oestradiol 17p A. Nature de la radioactivitk
plasmatique
Quatre-vingt seize heures apres l’injection des solutions traceuses de testosterone ou d’oestradiol-17P, respectivement, moins de 9 ou 12% de la radioactivite plasmatique se trouvent dans la phase aqueuse contenant la fraction glucuroconjuguee. La majeure partie de la radioactivite plasmatique se trouvant dans la phase Ctherosoluble, seule celle-ci a CtC prise en consideration.
ET LELOUP-H/iTEY
Quand le steroi’de injecte est l’oestradiol17p, plus de 95% de la radioactivite extractible a l’bther se comporte sur chromatolithe A, comme le traceur inject& quel que soit le temps Ccoule apt-es l’injection (Tableau 4). Nous avons done considere que la totalite de la radioactivite extractible nonconjuguee Ctait attribuable a l’oestradiol17p. Quand le steroi’de injecte est la testosterone, une partie settlement de la radioactivite extractible se comporte sur chromatolithe A, comme la testosterone: le pourcentage de radioactivite attribuable a ce steroi’de diminue en fonction du temps (Tableau 4). Ce taux de transformation de la testosterone injectee est pris en compte dans le calcul de la decroissance de la radioactivite plasmatique extractible en fonction du temps, afin de ne prendre en consideration que le traceur non-transforme. A chacun des temps consider-es, I’autre partie de la radioactivite est &lute apres la testosterone, par un melange isooctane:acetate d’ethyle, 60:40 (Tableau 1). La nature de cette fraction radioactive n’a pu etre determinee avec certitude, mais son comportement chromatographique sur couche mince permet de penser qu’elle ne contient qu’un seul metabolite et qu’il pour-
TABLEAU SENSIBILITY
ETREPRODUCTIBILITI?
2
Du DOSAGE RADIOIMMUNOLOGIQUE ET DE L'OESTRADIOL-17P
Testostkrone Limite de detection (pgitube) DSO (pgitube) “blanc” (pg) CV interdosage (gamme) CV interdosage (plasma)
Oestradiol-17P
IO 6.2 2s B 30 IS a25 5.0 2 4.7 (IS)u 4.7 k 2.3 (10) 20% 2.5% 19.1% 21% pour une teneurde 0.68 2 0.07 rig/ml (7)
CV intradosage (plasma)
(’ Moyenne 2 son erreur-standard
UE LA TESTOSTERONE
et ( ) nombre de dkterminations.
0.21 t 0.02 ngiml (4) 10% pour uneteneurde 1.06 k 0.04 rig/ml (6)
MkTABOLISME
DES
SThROiDES
TABLEAU
487
SEXUELS
3
TENEURS PLASMATIQUES DE LATESTOSTBRONE ET DE L'OESTRADIOL-I?'P TestostCrone Libres Glucuroconjugu& Totaux a Moyenne
Oestradioh17p
0.12 k 0.02 (19)” 0.13 0.26
-C son erreur-standard
r t
0.02 0.07
0.31 0.23 0.56
(8) (8)
2 O.lO(19) zt 0.07 + 0.21
(9) (8)
et ( ) nombre de determinations.
rait s’agir d’un androstanediol. Le taux d’apparition (y) de ce mCtabolite croit en fonction du temps (t) de faGon lindaire: la droite de rCgression calculCe est y = 0.26 r avec un coefficient de corrClation de 0.987. B. ParamPtres du mktabolisme Les courbes individuelles de dCcroissance des traceurs tritiCs montrent chez 30% environ des anguilles, une premi&-e phase d’augmentation ou un plateau, pendant l/2 hr B 1 hr. Apr& 1 hr, les courbes prCsentent pour les deux hormones, une allure biphasique dont le point de rupture se situe vers 5 B 6 hr. La dkcroissance du traceur est plus rapide dans le cas de la testostCrone que dans le cas de l’oestradiol17p (Fig. 1). Les volumes du compartiment interne sont de m$me grandeur pour la testostCrone (33.9 ml/kg) et l’oestradiol-17P (34 ml/kg) (Tableau 5). Le volume du compartiment externe est plus grand pour la testostCrone TABLEAU
(63.8 ml/kg) que pour l’oestradiol (43.2 ml/ kg) (P < 0.01). La demi-vie de la testostCrone (14.6 hr) est trois ?I quatre fois plus courte que celle de l’oestradiol-17P (48.6 hr) (P < 0.01). Les vitesses de clairance mktabolique sont trois B quatre fois plus rapides pour la testost&one (1.71 ml/kg/hr) que pour l’oestradiol17p (0.51 ml/kg/hr) (P < 0.01). Les vitesses de s&-&ion sont identiques pour les deux stkroi’des. C. Rkpartition radioactivitk
tissulaire de la
Quatre jours apr& l’injection, les seuls organes ayant une concentration de radioactivite supCrieure B celle du plasma sont ceux du systkme en&o-hCpatique (Tableau 6). L’urine ne contient que des traces de radioactivitk. Aucune concentration ou rCtention des traceurs n’est observCe dans les autres tissus CtudiCs (ovaire, cerveau, hypophyse, muscle, ou rate) au bout de ce 4
VARIATIONS EN FONCTION DU TEMPS DE LA RADIOACTIVITY PLASMATIQUE ~TH~ROSOLUBLE (RPE) AU TRACEUR INJECTOR
ATTRIBUABLE
Heures apres l’injection Traceur inject6
6
[3HIOestradiol-17f3 [3HlTestostCrone
97*
ou [14C]testosttrone* ’ ExprimC en pourcentage de la RPE.
24
48
72
94.6 88 96 94*
94
97.5 96 97.9 83*
97.5 87.5*
96
61.5 83 77.6 69.9
QUkRAT,
488
HARDY,
ET LELOUP-HATEY
I I 0.5
; I)
24
II)
12
neures
96
FIG. 1. DCcroissance plasmatique du traceur non conjuguC en fonctioa du temps apr&s I’injection intra-arterielle de testostkrone et d’oestradioi-17s tritiCs chez des anguilles cathttCristes (tempkrature: 11.5 k 0.X). -1es flkches reprksentent I’erreur standard de la moyenne. --le nombre d’anguilles injecttes est entre parenth&ses.
delai. Le foie et la bile contiennent alors, respectivement, 6.9 et 36% de la radioactivite totale apt-es injection de testosterone marquee et 8.5 et 26.5% de la radioactivite totale apres injection d’oestradiol marque. La presence de radioactivite en forte concentration dans le contenu intestinal montre qu’une par-tie de la radioactivite est en tours d’excretion ou a deja CtC excretee. DISCUSSION 1. Teneurs plasmatiques de la testostbrone et de I’oestradiol-17p Les teneurs plasmatiques de la testosterone et de l’oestradiol-17l3 ne sont pas differentes de celles trouvees pour ces memes steroi’des chez les truites Salmo gairdneri
P : selon les auteurs, l’oestradiol-17P est en concentration inferieure a 0.4 rig/ml chez les truitelles d’un an (20-25 g) (Idler et Campbell, 1980)) inferieure a 0.3 rig/ml chez les truites de 2 ans (Whithead et al., 1983) et de I’ordre de 0.5 rig/ml chez les truites de 2 ans et demi (Schulz, 1984). Chez cette espece, la testosterone libre est en concentration inferieure a 0.2 &ml chez les “juveniles” dont le stade ou l’age n’est pas precise (Ng et Idler, 1980). Chez l’anguille, la fraction glucuroconjuguee represente environ 50% de l’hormone circulante. Une par-tie au moins des glucuroconjuguts est d’origine ovarienne puisque 10 a 20% environ des steroi’des synthetises par l’ovaire irz vitro sont hydrosolubles (Querat , 1984).
MfiTABOLISME
DES STtiROjiDES TABLEAU
MBTABOLISME
SEXUELS
489
5
DE LA TESTOSTERONE ET DE L’OESTRADIOL-17P CHEZ L’ANGUILLE:PARAMBTRES SELON UN MODULE i\ 2 COMPART~MENTS
Sttroi’de
Testosttrone
TempCrature (“) Nombre d’animaux Poids (g) RGS (%) Volume du compartiment inteme (ml/kg) Volume du compartiment exteme (ml/kg) Demi-vie (hr) Vitesse de clairance mktabolique (mVkg/hr) Teneur plasmatique hihnl) Vitesse de s&r&ion (ng/kg/hr)
CALCULUS Oestradiol- 17p
11.5 f 1” 17 241 26 1.79 2 0.06
257 ” 8 1.76 -+ 0.07
33.9 [15.5-52.01 6.38 [31.3-100.21 14.6 [5.4-30.11 1.71 [0.78-2.661
34.0 113.2-55.61 43.2* [19.4-91.01 48.6* [30.1-81.81 0.51* [0.21-0.821
11.5
2 15
0.14 + 0.02
(8)
0.34 -t 0.05
(4)
0.24 [O.12-0.451
(8)
0.24 [0.20-0.651
(4)
(1Moyenne 2 son erreur standard ou avec [ ] les valeurs extremes. Le nombre de dkterminations ( ) quand celui-ci est diff&ent du nombre total d’animaux. * Difference significative (P < 0.01 avec les valeurs de la testosttrone).
2. M6tabolisme de la testostthone et de I’oestradioLl7p
Validation de la me’thode utilise’e pour cette e’tude (A)
TABLEAU
exprimt en
Poids (g) RGS (%) Nombre d’anguilles Foie Bile Intestin Contenu intestinal Urine a Moyenne
Hormone
d’une hormone
exogbze.
exogbne,
f son erreur standard
L’utilisation pour 1’Ctude des
6
DE LA RADIOACTIVITY? DANS DIFFBRENTS TISSUS, % HEURES APRBS L’INJECTION DE TESTOSTERONE ou ~0wr~~r1~0L-17P MARQUE.
St&aide Dose (PCi)
est indique
1’unitC de temps chez un animal en Ctat d’Cquilibre physiologique.
La vitesse de clairance mktabolique reprksente, par dkfinition, le volume de plasma CpurC totalement et irreversiblement de la substance considkrke pendant RETENTION
1
INTRAART~RIELLE
dpm par g de tissu dpm par ml de plasma
[‘4C]TestostCrone 0.23 342 ? 20” 1.3 2 0.1 4 2.4 of: 1.1 133 k 36 1.05 2 0.1 21 f 15 0.04 2 0.02
[3H]Oestradiol-17P 0.50 276 ? 20 1.8 k 0.2 4 1.0 k 0.8 53 211 0.5 -+ 0.1 5.2 rt 2.0 co.02
490
QUkRAT,
HARDY,
vitesses de clairance metabolique, necessite qu’un certain nombre de conditions soient respectees (Tait et Burnstein, 1964): (a) l’hormone exogene doit etre identique a l’hormone endogene; (b) l’hormone exogene ne doit pas interferer avec le metabolisme de l’hormone endogbne; (c) l’equilibre physiologique ne doit pas Ctre perturb6 pendant la duree de l’experimentation. Ces conditions ont CtC respectees puisque: a. L’identite et la purete des steroi’des traceurs utilises a CtC verifiee avant leur utilisation par des chromatographies dans plusieurs systemes de solvants. b. L’apport d’hormone exogene a ete tel qu’il ne modifiait pas de facon importante la quantite d’hormone a metaboliser. En effet, la quantite de traceur tritie injectee a toujours CtC inferieure a 1.8 ng de steroi’de. Ainsi, l’augmentation de la concentration plasmatique consecutive a l’injection pourrait etre estimee, au temps 0 et pour une anguille de 250 g a moins de 0.4 rig/ml. Ajoutee a l’hormone endogene circulante sous forme non conjuguee, la teneur obtenue reste dans les valeurs extremes observees pour la testosterone et I’oestradiol17B chez l’anguille. Dans le plasma, le melange homogene entre le traceur et l’hormone endogene (libre ou lice aux proteines plasmatiques) doit Ctre realise: en effet, nous avons montre par dialyse B I’equilibre de plasma d’anguille que le traceur pouvait Ctre lie au systeme plasmatique de transport et que cette liaison pouvait etre deplacee par l’hormone froide (Querat et al., 1983). c. En ce qui concerne le maintien de l’equilibre physiologique, il a CtC montre par une etude de la fonction interrenalienne que les animaux ne sont plus en phase primaire de stress au moment de l’experience (Leloup-Hritey, 1976): la cortisolemie, Clevee apres la catheterisation revient a son niveau basal 3 ou 4 jours apres I’operation, soit 3 ou 4 jours avant l’injection du traceur, et reste stable durant toute la periode d’ex-
ET
LELOUP-HATEY
perimentation. L’incision est le plus souvent cicatrisee ou en voie de cicatrisation. (B) Injection du traceur. L’utilisation de la methode d’une injection unique du traceur necessite que la repartition dans l’organisme de celui-ci se realise en un temps court, comparativement a la vitesse des phenombnes observes. Chez l’anguille, les courbes de decroissance plasmatique du traceur montrent une augmentation (10% des cas) ou une stabilisation transitoire du traceur (20% des cas) pendant une periode d’environ l/2 hr. Cette phase correspond au temps necessaire a l’equilibre du traceur avec l’hormone endogene. Chez la truite, l’equilibre est atteint en 2 a 4 min (Zohar, 1982). La lenteur relative du phenomene chez l’anguille peut s’exphquer par les particularites anatomiques de son systeme circulatoire. En effet, chez l’anguille, les systemes portes, hepatique et renal, comportent des anastomoses dont le nombre et l’importance varient d’un animal a I’autre (Mott, 1949). Le renouvellement complet du sang au niveau des tissus peut done, dans certains cas, Ctre prolonge de facon importante. Neanmoins, la duke du phenom&e est relativement courte en comparaison avec celle des autres processus impliques dans le mdtabolisme des deux stero’ides . Apt-es cette premiere phase d’une demiheure, le traceur chute d’abord brusquement jusqu’a 6 hr apt-es l’injection, refletant le transfert de l’hormone du compartiment interne vers le compartiment externe. Une fois l’equilibre des deux compartiments atteint, la chute du traceur est plus progressive et correspond a la disparition irreversible de l’hormone du compartiment interne. ParumPtres du me’tabolisme Les volumes du compartiment interne sont voisins pour les deux hormones. 11s representent 1.3 a 5.5% du poids du corps. Ces volumes sont le plus souvent superieurs au volume plasmatique moyen des
MtiTABOLISME
DES
poissons Teleosteens (1.8% du poids du corps) mais inferieurs au volume du liquide extracellulaire moyen chez ces memes poissons (14% du poids du corps) (Thorson, 1961). Si ces don&es sont applicables a l’anguille, le volume du compartiment interne pour ces deux stero’ides correspondrait au volume plasmatique augment6 d’une partie du volume des liquides extracellulaires. Ces resultats sont cornparables a ceux obtenus chez la truite au debut de la recrudescence ovarienne ou le volume du compartiment interne de l’oestradiol represente 3.1 a 6% du poids du corps (Zohar, 1982). Les volumes du compartiment externe sont de 6.4 et 4.3% du poids du corps, respectivement, pour la testosterone et l’oestradiol-17B, ce qui donne un volume apparent de distribution total proche de 10% pour la testosterone et de 7.7% pour l’oestradiol-17B. La demi-vie de la testosterone (14 hr 30) est 3 a 4 fois plus courte que celle de l’oestradiol (48 hr 30). Inversement, la vitesse de clairance metabolique de la testosterone (0.8 a 2.7 ml/kg/hr) est 3 a 4 fois plus Clevee que celle de l’oestradiol (0.2 a 0.8 ml/kg/ hr). Chez un Selacien, la raie 0 mature, la vitesse de clairance metabolique de la testosterone a 5” (Fletcher et al., 1969) est 5 fois plus Clevee que chez l’anguille 0 sexuellement immature a 12”. Chez la truite 0, au debut de la recrudescence ovarienne, celle de l’oestradiol a 10” (Zohar, 1982; Fostier et al., 1984) est 40 a 50 fois plus Clevee que chez l’anguille. Comme nous l’avons suggere plus haut, le temps de renouvellement complet du sang est plus lent chez l’anguille que chez la truite. Cette lenteur pourrait etre a l’origine des differences observees en ce qui concerne les vitesses de clairance metabolique de l’oestradiol-17B entre ces deux esp&es. En effet, la vitesse de clairance metabolique est directement proportionnelle au flux de sang traversant le foie, organe principal du metabolisme des stbroi’des (Tait et Burnstein, 1964).
ST6ROiDES
491
SEXUELS
Par ailleurs, il est a noter que le stade de developpement ovarien de l’anguille argentee sexuellement immature est encore tres Cloigne de celui atteint chez les truites matures (c’est-a-dire ayant pondu au moins une fois) en debut de recrudescence ovarienne. Chez l’anguille, la vitellogenine n’est presente en quantite notable ni dans le plasma, ni dans l’ovocyte (BurzawaGerard, 1982) alors que chez ces truites, la vitellogenbse exogbne a debut& Or, il a CtC montre chez la truite mature, que la vitesse de clairance metabolique de l’oestradiol17B augmente pendant la periode de recrudescence ovarienne pour atteindre un niveau deux a trois fois plus &levC au moment de la migration de la vesicule germinative (Zohar, 1982; Fostier et al., 1984), indiquant ainsi que I’intensite du catabolisme des steroi’des sexuels pouvait varier au tours du cycle. De plus, une differentiation sexuelle des activites enzymatiques du catabolisme hepatique des stero’ides sexuels, consecutive a la premiere maturation sexuelle a CtC d&rite chez la truite (Hansson et Gustafsson, 1981) suggerant que des modifications des vitesses du catabolisme puissent Cgalement intervenir. Les vitesses de secretion de la testosterone et de l’oestradiol-17B sont identiques (0.24 ng/kg/hr). Les teneurs plasmatiques observees chez l’anguille pour ces deux hormones, sont nettement plus faibles que celles observees chez la raie mature pour la testosterone (38 rig/ml) (Fletcher et al., 1969) ou chez la truite au debut de la recrudescence ovarienne pour I’oestradiol (environ 1 a 2 &ml) (Zohar, 1982). Du fait de ces faibles teneurs plasmatiques et des faibles vitesses de clairance metabolique, les vitesses de secretion apparaissent chez l’anguille 1000 fois plus faible pour la testosterone que chez la raie mature et pres de 100 fois plus faible pour l’oestradiol que chez la truite au debut de la recrudescence ovarienne . Organes et nature du mPtabolisme
L’etude
de la repartition
tissulaire de la
492
Q&RAT,
HARDY,
ET LELOUP-HATEY
radioactivite indique que 96 hr apt-es l’in- peut avoir des consequences importantes, jection de testosterone ou d’oestradiol-17B chez les Mammiferes, sur les teneurs plasmarques, la majeure pat-tie de la radioacmatiques de ces hormones (Franz et Longtivite est retrouvee dans la bile. Des resul- cope, 1979). Cette 17-d&hydrogenation est tats comparables sont obtenus apres diffeindecelable chez l’anguille argentee. rents types d’administration de testosPar ailleurs, l’aromatisation des androterone marquee chez la truite (Schreck, genes au niveau du systtme nerveux central 1973), chez le Saumon coho (Fagerlund et et notamment de l’hypophyse, mise en eviMcBride, 1978) et chez la carpe (Lone et dence chez les poissons TelCostCens (CalMatty, 1981) ou d’oestradiol marque, chez lard et al., 1981) joue un role important dans le retrocontrole de la fonction gonaHemichromis bimaculatus (Myers et Avila, 1980). L’urine ne contient alors que des dotrope par les steroi’des sexuels (Peter, traces de radioactivite, ce qui semble indi1983). L’incapacite de la testosterone a inquer que le rein ne joue qu’un role mineur duire, comme l’oestradiol, la synthese hydans l’excretion des stero’ides sexuels chez pophysaire d’hormone gonadotrope chez l’anguille . l’anguille 0 semblait indiquer qu’une telle D’autres tissus (peau, muscle, etc.) sont aromatisation de la testosterone n’avait pas lieu (Dufour et al., 1983). Ces resultats sont susceptibles de mttaboliser les sttroi’des sexuels chez les poissons Teleosteens (Hay en accord avec le fait qu’aucune trace et al., 1976). Chez l’anguille, aucune con- d’oestradiol marque ne soit d&eke dans le centration ou retention importante de la ra- plasma quel que soit le temps apt-es injecdioactivite n’est observee dans les divers tion de testosterone marquee. tissus Ctudies, hormis ceux du tractus gastrointestinal, indiquant que leur participaREMERCIEMENTS tion au metabolisme de la testosterone et Ce travail a beneficie de l’aide financiere de I’Acde l’oestradiol-17B est quantitativement tion Thematique Programmee: Bases Biologiques de peu importante. Ce resultat est confirm6 1’Aquaculture (CNRS et CNEXO). Nous sommes par la faible quantite de metabolites mar- vivement reconnaissants au Dr. M. Terqui (Laboratoire de Physiologie de la Reproduction, INRA, Nouques, glucuroconjugues ou non, trouves dans le plasma durant l’experience. En zilly) qui nous a gracieusement fourni les immunNous remercions F. Lieron et P Lafay pour effet, seuls 8 et 12%, respectivement, de la strums. leur assistance technique a la preparation du manuradioactivite plasmatique se trouvent sous suit. forme glucuroconjuguee 96 hr apres l’injecRt?FiRENCES tion de testosterone ou d’oestradiol. De plus, le metabolite de la testosterone ne Burzawa-Gerard, E. (1982). Existe-t-i1 plusieurs gonadotropines (GTH) chez les poissons? Donnees represente alors que 25% environ de la rabiochimiques et vitellogenese exogene. In “Redioactivite libre circulante tandis qu’aucun productive Physiology of Fish” (C. J. J. Richter metabolite de l’oestradiol n’est decele dans et H. J. Th. Goos, eds.), pp. 19-22. Comp. la fraction libre du plasma, quel que soit Ie Pudoc , Wageningen , Netherlands. temps apres l’injection du traceur. Callard, G. V., Petro, Z., et Ryan, K. J. (1981) Biochemical evidence for aromatization of androgen Le comportement chromatographique to estrogen in the pituitary. Gen. Camp. &do(sur colonne ou en couche mince) du mecrinol. 44, 359-361. tabolite de la testosterone indique qu’il Colombo, L., et Colombo-Belvedere, P (1976). Stes’agit probablement d’un androstanediol. roid biosynthesis by the ovary of the European En tout cas, il ne s’agit ni d’oestradiol ou eel, at the silver stage. Gen. Comp. Endocrinol. 28, 371-385. d’oestrone ni de ll-oxotestosterone ou Donaldson, E. M., et Fagerlund, LJ. H. M. (1968). d’androstenedione. Changes in the cortisol dynamics of Sockeye La formation peripherique d’androsteneSalmon (Uncorhynchus nerka) resulting from dione et d’oestrone, a partir, respectivesexual maturation. Gen. Comp. Endocrinol. 11, ment de la testosterone et de l’oestradiol, 552-561.
METABOLISME
DES STEROIDES
Dufour, S., Delerue-Le Belle, N., et Fontaine, Y. A. (1983). Effects of steroid hormones on pituitary immunoreactive gonadotropin in European freshwater eel, Anguilla anguilla L. Gen. Comp. Endocrinol. 52, 190-197. Fagerlund, U. H. M., et McBride, J. R. (1978). Distribution and disappearance of radioactivity in blood and tissues of Coho Salmon (Oncorhynchus kisutch) after oral administration of 3H-testosterone. J. Fish. Res. Board Canad. 35, 893-900. Fletcher, G. L., Hardy, D. C., et Idler, D. R. (1969). Testosterone production and metabolic clearance rates in sexually mature male and female skate (Raja
radiata).
Endocrinology
85, 552-560.
Fontaine, Y. A. (1970). Biosynthese et purification de I’hormone thyreotrope tritiee de rat. Sa distribution chez le rat apres injection intraveineuse. J. Physiol.
(Paris)
62, 489-504.
Fostier, A., Baroillier, J. F., et Mones, A. (1984). “Niveaux plasmatiques et intraovariens des sterofdes sexuels chez la truite arc-en-ciel durant la periode periovulatoire et leurs regulations.” Resume de la reunion de Physiologie des Poissons, 1984. Paimpont. Franz, C., et Longcope, C. (1979). Androgen and estrogen metabolism in male Rhesus monkeys. Endocrinology 105, 869-874. Hanson, T., et Gustafsson, J. A. (1981). Sex differences in the hepatic in vitro metabolism of 4-androstene-3,17-dione in rainbow trout, Salmo gairdneri. Gen. Camp. Endocrinol. 44, 181-188. Hay, J. B., Hodgins, M. B., et Roberts, R. J. (1976). Androgen metabolism in skin and skeletal muscle of the rainbow trout (Salmo gairdnerii) and in accessory sexual organs of the spur dogfish (Squalus
acanthias).
Gen.
Comp.
Endocrinol.
29,
402-413. Idler, D. R., et Campbell, C. M. (1980). Gonadotropin stimulation of estrogen and yolk precursor synthesis in juvenile rainbow trout. Gen. Comp. Endocrinol. 41, 384-391. Leloup-Hatey, J. (1976). Methodes de mesure des vitesses d’tpuration metabolique et de secretion du cortisol chez l’anguille (Anguilla anguilla L.). Canad.
J. Physiol.
Pharmacol.
54, 262-276.
Lone, K. P., et Matty, A. J. (1981). Uptake and disappearance of radioactivity in blood and tissues of carp (Cyprinus carpio) after feeding )H-testosterone. Aquaculture 24, 315-326. Mott, S. C. (1949). The gross anatomy of the blood vascular system of the eel (Anguilla anguilla). Proc. 2001. Sot. London 120, 503-518. Myers, S. F., et Avila, V. L. (1980). Tritiated 17p-estradiol uptake by brain and other tissues of the
493
SEXUELS
cichlid jewel fish, Hemichromis
bimaculatus.
203-211. Ng, T. B., et Idler, D. R. (1980). Gonadotropic regulation of androgen production in flounder and salmonids. Gen. Comp. Endocrinol. 42, 25-38. Peter, R. E. (1983). The brain and neurohormones in teleost reproduction. In “Fish Physiology” (W. S. Hoar, D. J. Randall, et E. M. Donaldson, eds.), Vol. 9A, pp. 97-135. Academic Press, New York. Qutrat, B. (1984). “Biosynthese et metabolisme des sttro’ides ovariens chez I’anguille (Anguilla anguilla L.) argentee.” These Doctorat 3bme cycle, Univ. Paris VI. Querat, B., Hardy, A., et Leloup-Hltey, J. (1983). Etude de la liaison plasmatique des sttrdides sexuels et du cortisol chez I’anguille argentee femelle (Anguilla anguilla L.). C. R. Acad. Sci. Ser. ZZZ 297, 119-122. Schreck, C. B. (1973). Uptake of [3H]testosterone and influence of an antiandrogen in tissues of rainbow trout (Salmo gairdneri). Gen. Comp. Endocrinol. 21, 60-68. Schulz, R. (1984). Serum levels of 1 I-oxotestosterone in male and 17B-oestradiol in female rainbow trout (Salmo gairdneri) during the first reproductive cycle. Gen. Comp. Endocrinol. 56, 111-120. Tait, J. F., et Burnstein, S. (1964). In vivo studies of steroid dynamics in man. In “The Hormones” (G. Pincus, K. V. Thimann, et E. B. Astwood, eds.), Vol. 5, pp. 441-557. Academic Press, New York. Tait, J. F., Tait, S. A. S., Little, B., et Laumas, K. R. (1961). The disappearance of 7-3H-d-aldosterone in the plasma of normal subjects. J. Clin. Invest. 40, 72-80. Thorson, T. (1961). Partitioning of the body water in Osteichthyes: Phylogenetic and ecological implications in aquatic vertebrates. Biol. Bull. 120, 238-254. Tovey, R. C., Oldham, K. G., et Whelan, J. A. M. (1974). A simple direct assay for cyclic AMP in plasma and other biological samples using an improved competitive protein binding technique. Clin. Chim. Acta 56, 221-234. Whitehead, D., Bromage, N. R., et Breton, B. (1983). Changes in serum levels of gonadotropin, oestradial-17S and vitellogenin during the first and subsequent reproductive cycles of female rainbow trout. Aquaculture 34, 317-326. Zohar, Y. (1982). “L’tvolution de la puberte et des cycles nycthemeraux de la secretion gonadotrope chez la truite arc-en-ciel femelle, en relation avec le cycle sexuel annuel et par rapport 9 I’activite steroidogene de l’ovaire.” These Doct. Etat Sci. Nat., Univ. Paris VI. Gen.
Comp.
Endocrinol.
42,