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Niveles de células progenitoras endoteliales circulantes en pacientes hipertensos tratados
Hipertens Riesgo Vasc. 2015;32(4):142---150
www.elsevier.es/hipertension
ORIGINAL
Niveles de células progenitoras endoteliales circulantes en pacientes hipertensos tratados C. Maroun-Eid a , A. Ortega-Hernández b , M. Abad a , J.A. García-Donaire a , A. Barbero a , L. Reinares c , N. Martell-Claros a y D. Gómez-Garre b,∗ a
Unidad de Hipertensión, Hospital Clínico San Carlos-Instituto de Investigación Sanitaria San Carlos (IdISSC), Madrid, Espa˜ na Laboratorio de Biología Vascular, Hospital Clínico San Carlos-IdISSC, Madrid, Espa˜ na c Unidad de Lípidos, Hospital Clínico San Carlos-IdISSC, Madrid, Espa˜ na b
Recibido el 29 de abril de 2015; aceptado el 13 de julio de 2015 Disponible en Internet el 20 de agosto de 2015
PALABRAS CLAVE Hipertensión; Tratamiento; Células progenitoras endoteliales; Riesgo cardiovascular residual
∗
Resumen Introducción: Muchos pacientes hipertensos óptimamente tratados de sus factores de riesgo cardiovascular (FRCV) siguen presentando complicaciones cardiovasculares. Las células progenitoras endoteliales (CPE) han demostrado ser fundamentales para la reparación del da˜ no endotelial en tejidos isquémicos. Por ello, hemos estudiado los niveles de CPE y del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en pacientes hipertensos en tratamiento con buen control de la presión arterial (PA). Material y métodos: Se recogió una muestra de sangre de pacientes hipertensos tratados que presentaban unas cifras de PA adecuadas para los objetivos individuales. Los niveles plasmáticos de CPE CD34+/KDR+ y CD34+/VE-cadherina+ se midieron mediante citometría de flujo. La concentración de VEGF se cuantificó mediante ELISA. Como controles se incluyó un grupo de sujetos sin FRCV tradicionales. Resultados: Hemos incluido 108 pacientes (61 ± 12 a˜ nos, 47,2% hombres), de los cuales un 82,4% presentaba PA < 140/90 mmHg, un 91,7% control de la diabetes (HbA1c < 7%), el 81,5% cLDL < 130 o 100 mg/dl y el 85,2% no fumaba, aunque el 45,4% presentaba obesidad (IMC ≥ 30 kg/m2 ). A pesar de que, en conjunto, sus parámetros bioquímicos no diferían de los del grupo control, los pacientes hipertensos presentaban una disminución significativa de los niveles plasmáticos de células CD34+/KDR+ y CD34+/VE-cadherina+, aunque la concentración plasmática de VEGF era significativamente mayor en los pacientes hipertensos que en los sujetos control. Conclusiones: Los pacientes hipertensos tratados muestran una disminución significativa de los niveles plasmáticos de CPE que podría ser responsable, al menos en parte, del riesgo residual que presentan estos pacientes, sugiriéndose que las CPE podrían ser una importante diana terapéutica. © 2015 SEHLELHA. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Todos los derechos reservados.
Autor para correspondencia. Correo electrónico: [email protected] (D. Gómez-Garre).
http://dx.doi.org/10.1016/j.hipert.2015.07.002 1889-1837/© 2015 SEHLELHA. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Todos los derechos reservados.
Niveles de células progenitoras endoteliales circulantes en pacientes hipertensos tratados
KEYWORDS Hypertension; Treatment; Endothelial progenitor cells; Residual cardiovascular risk
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Circulating endothelial progenitor cell levels in treated hypertensive patients Abstract Introduction: Most optimally treated hypertensive patients still have an around 50% increased risk of any cardiovascular event, suggesting the possible existence of unidentified risk factors. In the last years there has been evidence of the essential role of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) in the maintenance of endothelial integrity and function, increasing the interest in their involvement in cardiovascular disease. In this study, the circulating levels of EPCs and vascular endothelial growth factor (VEGF) are investigated in treated hypertensive patients with adequate control of blood pressure (BP). Material and methods: Blood samples were collected from treated hypertensive patients with controlled BP. Plasma levels of EPCs CD34+/KDR+ and CD34+/VE-cadherin+ were quantified by flow cytometry. Plasma concentration of VEGF was determined by ELISA. A group of healthy subjects without cardiovascular risk factors was included as controls. Results: A total of 108 hypertensive patients were included (61±12 years, 47.2% men) of which 82.4% showed BP < 140/90 mmHg, 91.7% and 81.5% controlled diabetes (HbA1c <7%) and cLDL (<130 or 100 mg/dL), respectively, and 85.2% were non-smokers. Around 45% of them were obese. Although patients had cardiovascular parameters within normal ranges, they showed significantly lower levels of CD34+/KDR+ and CD34+/VE-cadherin+ compared with healthy control group, although plasma VEGF concentration was higher in patients than in controls. Conclusions: Despite an optimal treatment, hypertensive patients show a decreased number of circulating EPCs that could be, at least in part, responsible for their residual cardiovascular risk, suggesting that these cells could be a therapeutic target. © 2015 SEHLELHA. Published by Elsevier España, S.L.U. All rights reserved.
Introducción La hipertensión arterial (HTA) generalmente se presenta en asociación con otros factores de riesgo cardiovascular (FRCV), por lo que las guías actuales apuntan al control tanto de la presión arterial (PA) como de los otros factores de riesgo con el objetivo de reducir el riesgo cardiovascular global1 . A pesar de ello, muchos pacientes correctamente tratados y con buen control de sus FRCV todavía presentan complicaciones cardiovasculares1,2 , lo que indica que detrás del proceso aterosclerótico que producen los FRCV tradicionales existen otros factores de riesgo no identificados. La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria sistémica caracterizada en estadios tempranos por la pérdida de la integridad del endotelio que tiene como resultado la disfunción endotelial, reconocida hoy día como uno de los eventos más tempranos del desarrollo de la placa de aterosclerosis3,4 . Por tanto, la regeneración y el mantenimiento de una capa de células endoteliales intacta son críticas para la reducción de complicaciones cardiovasculares5 . Desde su identificación, las células progenitoras endoteliales (CPE) circulantes provenientes de la médula ósea han ido adquiriendo una gran relevancia debido al papel crucial que parecen desempe˜ nar en el mantenimiento de la homeostasis del endotelio, siendo capaces de incorporarse al endotelio da˜ nado y diferenciarse hacia células endoteliales5,6 . Numerosos trabajos demuestran que los FRCV tradicionales como la HTA, el tabaquismo, la hiperlipidemia o la diabetes mellitus (DM) afectan a la cantidad
y a las propiedades de las CPE7-10 . Se ha demostrado que el número de CPE no solo es un mejor indicador de la disfunción endotelial que la puntuación de la escala de riesgo de Framingham7 , sino que se ha revelado como un biomarcador de la aparición de eventos cardiovasculares mayores, tanto en pacientes con enfermedad cardiovascular como en sujetos sanos11-13 . Además, algunas terapias para los FRCV son capaces de restaurar el número y/o la funcionalidad de las CPE10,14 , lo que indica que también podrían ser una herramienta para la medición de la eficacia terapéutica. Actualmente, se han identificado varios subtipos de CPE que pueden contribuir a la reparación endotelial, inicializando, facilitando y/o regulando la incorporación de las células al endotelio da˜ nado15 . Aunque hay cierta discrepancia, se acepta que existe una población de CPE circulantes que expresan marcadores como CD34, CD133 y KDR, que contribuyen a la vasculogénesis sintetizando gran cantidad de citocinas, como el factor de crecimiento endotelial vascular (vascular endotelial growth factor, VEGF) o el factor derivado de células estromales-1 (stromal-derived factor 1 [SDF-1) y células que además expresan abundantemente VEcadherina (CD144) y cuya contribución se debe a su gran capacidad de proliferación. En este trabajo, hemos investigado el número de CPE CD34+/KDR+ y CD34+/VE-cadherina+ en pacientes hipertensos tratados y con buen control de la PA, ya que una alteración de los niveles circulantes de células progenitoras supondría un fallo en los mecanismos de reparación del vaso que podría conducir al desarrollo de eventos.
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Materiales y métodos Población de estudio En este trabajo hemos incluido de forma consecutiva a pacientes mayores de 18 a˜ nos con diagnóstico de HTA atendidos en la Unidad de Hipertensión (Servicio de Medicina Interna) del Hospital Clínico San Carlos de Madrid y que presentaban unas cifras de PA adecuadas para los objetivos individuales según los criterios de la guía de las Sociedades Europeas de Hipertensión (ESH) y cardiología (ESC) de 201316 : PA sistólica/diastólica < 140/90 mmHg excepto para pacientes diabéticos, en los que se consideró PA diastólica < 85 mmHg, y para pacientes mayores, en los que se permitieron cifras de PA sistólica entre 140 y 150 mmHg en función del estado de salud y de la tolerancia al tratamiento. Los criterios de exclusión fueron: mujeres embarazadas o en periodo de lactancia, haber presentado algún evento cardiovascular grave (ictus, infarto de miocardio o claudicación intermitente) en los 3 meses anteriores a su inclusión en este estudio, evidencia de enfermedad renal crónica, neoplasias o enfermedades autoinmunes, así como cualquier otra condición que pudiera interferir en la realización de este estudio a criterio del investigador. Además, se incluyó a 32 sujetos sanos sin FRCV tradicionales que sirvieron como grupo control. A todos los sujetos se les realizó un examen físico completo y se completó un cuestionario con datos como sexo, edad, medidas antropométricas (peso y altura), PA sistólica y diastólica, estatus de fumador, antecedentes familiares de enfermedad cardiovascular (definidos como ocurrencia de un evento cardiovascular importante en uno o más familiares de primer grado). Se calculó el índice de masa corporal (IMC) y se consideró obesidad cuando el IMC ≥ 30 kg/m2 . Además, se obtuvieron 2 muestras de sangre venosa en ayunas: una para las mediciones bioquímicas de rutina, que se realizaron en el Servicio de Análisis Clínicos del Hospital Clínico San Carlos, y otra para la cuantificación de CPE. El control del colesterol LDL (cLDL) se definió como < 130 mg/dl en pacientes con 2 o más factores de riesgo y < 100 mg/dl en paciente con enfermedad cardiovascular o DM17 y el de la DM como HbA1c < 7%18 . Se consideró control del tabaquismo si el paciente llevaba más de 6 meses sin fumar o era no fumador. El protocolo de este estudio cumple con los principios de la Declaración de Helsinki y ha sido aprobado por el Comité de Ética y de Investigación Clínica del Hospital Clínico San Carlos. El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes.
Determinación de los niveles circulantes de células progenitoras endoteliales La cuantificación de CPE en sangre periférica se realizó mediante estudios de citometría de flujo siguiendo un protocolo ya descrito previamente19 . Para cada sujeto se prepararon 2 tubos con 100 l de sangre-EDTA cada uno y se incubaron con los distintos anticuerpos específicos: anti-CD34-conjugado con ficoeritrina-cianina 7 (PC7) (IgG1 de ratón, Beckman Coulter INC, L’Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Espa˜ na), anti-CD3-conjugado con ficoeritrinarojo Texas (ECD) (IgG1 de ratón, Beckman Coulter),
C. Maroun-Eid et al. anti-KDR-conjugado con ficoeritrina (PE) (IgG1 de ratón, R&D Systems) y anti-VE-caderina (CD144)-conjugado con PE (IgG2b de ratón, R&D Systems, Abingdon, Reino Unido). Además, se preparó una tercera muestra de sangre que se incubó con los correspondientes controles isotípicos. Las muestras se incubaron durante 30 min en oscuridad a 4 ◦ C. Pasado el tiempo, a cada tubo se le a˜ nadieron 900 l de solución de lisis (BD FacsLysing solution, Beckton Dickinson, San Agustín de Guadalix, Madrid, Espa˜ na), dejándola actuar durante 10 min en oscuridad. A continuación, las muestras se centrifugaron a 1.500 rpm durante 10 min a 4 ◦ C, se retiró el sobrenadante y el precipitado se lavó con 1 ml de tampón fosfato salino (en inglés PBS) a 1.500 rpm durante 10 min a 4 ◦ C. Finalmente, las células se resuspendieron en 400 l de PBS y se analizaron en un citómetro de flujo (FC500, Beckman Coulter INC). Las CPE se identificaron como negativas para CD3 y como doble positivas para CD34/KDR y CD34/VE-cadherina. Los resultados se expresan como porcentaje de células positivas en la región limitada para las células mononucleares. La configuración del aparato se optimizó diariamente usando microesferas fluorescentes de poliestireno (FlowCheck PC7 770/488, Beckman Coulter INC). El análisis de todas las muestras lo realizó el mismo operador, el cual desconocía las características de los sujetos.
Determinación de los niveles de factor de crecimiento del endotelio vascular Los niveles plasmáticos de VEGF se cuantificaron con un ELISA comercial (Human VEGF Quantikine ELISA kit, cat. num DVE00, R&D Systems). El rango de medida del ensayo ha sido 31,2-2.000 pg/ml, con un coeficiente de variación interensayo inferior al 7,5% y un coeficiente de variación intraensayo inferior al 5,5%.
Análisis estadístico Las variables cualitativas se presentan con su distribución de frecuencias. El estudio de la normalidad de las variables cuantitativas se realizó mediante el test de bondad de ajuste de Kolmogorov-Smirnov. Las variables que presentaban una distribución normal se muestran como su media ± desviación estándar (DE) y se analizaron mediante test paramétricos (t de Student y ANOVA) para comparar 2 o más grupos, respectivamente. Las variables con distribuciones asimétricas se presentan con mediana y su rango intercuartílico y se analizaron mediante los test no paramétricos de Kruskal-Wallis o Mann-Whitney. La asociación entre variables cualitativas se evaluó con el test de la 2 . En todos los contrastes de hipótesis se rechazó la hipótesis nula con un error de tipo i o error menor a 0,05. El procesamiento y el análisis de los datos se realizaron mediante el paquete estadístico SPSS 17.0.
Resultados Características de los pacientes En este estudio hemos incluido 108 pacientes, con una edad media ± DE de 61 ± 12 a˜ nos. La distribución por sexos fue
Niveles de células progenitoras endoteliales circulantes en pacientes hipertensos tratados
excluyendo a los pacientes con DM. Los niveles de CPE circulantes se mantuvieron significativamente disminuidos en los pacientes con respecto a los controles (CD34+/KDR+: 0,01 [0,01-0,03]% vs. 0,01 [0,05-0,024]%; CD34+/VE-cadherina+: 0,05 [0,02-0,09]% vs. 0,07 [0,02-0,15]%, p < 0,05) e independientemente del número de FRCV presentes (tabla 2).
100
Pacientes controlados (%)
80
60
Relación entre células progenitoras endoteliales y la proteína C reactiva
40
20
0
145
HTA
DM
c-LDL
Tabaquismo Obesidad
Figura 1 Porcentaje de pacientes hipertensos con control de la hipertensión arterial (HTA), la diabetes mellitus (DM), el colesterol LDL (cLDL), el tabaquismo y la obesidad.
de 51 hombres (47,2%) y 57 mujeres (52,8%). El 52,8% de los pacientes presentaban menos de 10 a˜ nos de diagnóstico de HTA en el momento de su inclusión en el estudio. En cuanto a la presencia de otros FRCV, 96 pacientes (88,9%) presentaban algún otro FRCV además de HTA, siendo el más frecuente la dislipidemia (67,6%), seguida de la obesidad (54,6%), la DM (31,5%) y el tabaquismo (14,8%). En cuanto al grado de control de los FRCV, la mayoría de los pacientes tenían niveles de PA < 140/90 mmHg, HbAc1 < 7%, cLDL < 130 o 100 mg/dl y/o no fumaban en el momento de su inclusión en el estudio (fig. 1). Sin embargo, el 45,4% de los pacientes presentaban obesidad (IMC ≥ 30 kg/m2 ), aunque otro 45,4% presentaba sobrepeso (IMC 2529,9 kg/m2 ), lo que reduce a tan solo el 9,2% el grupo de pacientes que tenían un IMC en los límites de la normalidad (IMC < 25 kg/m2 ) (fig. 1). Respecto a los FRCV no tradicionales, los pacientes mostraron mayores concentraciones de proteína C reactiva (PCR) (tabla 1), el marcador de inflamación que más se ha asociado con el desarrollo de eventos cardiovasculares20 . Las variables bioquímicas de los pacientes y de los sujetos controles sin FRCV se detallan en la tabla 1.
Niveles circulantes de células progenitoras endoteliales A pesar de que las variables bioquímicas de los pacientes se encontraban dentro de los rangos normales y no se diferenciaban de los valores de los sujetos controles, a excepción del IMC, la cantidad de CPE CD34+/KDR+ y CD34+/VEcadherina+ circulantes era significativamente menor en los pacientes (fig. 2 A y B). Esta alteración en los niveles de células progenitoras no se asoció al número de FRCV que presentaban los pacientes; los pacientes hipertensos sin más FRCV ya presentaban menos cantidad de células CD34+/KDR+ y CD34+/VE-cadherina+ que los controles y estos niveles apenas variaron en los pacientes con 2, 3 y 4 FRCV (fig. 3 A y B). Puesto que la DM es una causa bien demostrada de reducción en los niveles de CPE circulantes, realizamos un análisis de sensibilidad de los resultados observados
Puesto que la aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria3,4 , nuestro siguiente objetivo fue estudiar si existía alguna relación entre los niveles plasmáticos de PCR y los de CPE. Para ello se separó a la población de pacientes en 2 grupos: aquellos que presentaban niveles de PCR por encima o iguales a 0,3 mg/dl y los que mostraban niveles por debajo de 0,3 mg/dl. Los pacientes con valores altos de PCR tenían niveles de células CD34+/KDR+ significativamente menores que los pacientes con PCR baja (fig. 4 A). No se observó ninguna diferencia en los niveles de células CD34+/VE-cadherina+ en función de la concentración de PCR (fig. 4 B).
Concentración plasmática de factor de crecimiento del endotelio vascular Numerosos estudios han demostrado que citocinas quimioatractantes como VEGF inducen la movilización de las CPE desde la médula ósea y estimulan su proliferación y diferenciación en los sitios de lesión vascular21 . En comparación con el grupo control, la concentración plasmática de VEGF en los pacientes hipertensos estaba aumentada casi 2 veces (fig. 5).
Discusión Numerosos estudios han demostrado que las CPE circulantes se encuentran reducidas en presencia de FRCV clásicos, independientemente de la existencia de enfermedad cardiovascular establecida9,11,12 . Además, la concentración de CPE también se ha asociado al desarrollo de eventos cardiovasculares futuros9,11,12 . Nuestros resultados demuestran que los pacientes hipertensos en tratamiento estable, a pesar de tener unas cifras de PA adecuadas para los objetivos individuales y un buen control en general de sus otros FRCV16-18 , presentaban menor concentración de CPE CD34+/KDR+ y CD34+/VEcadherina+ en comparación con sujetos sanos sin ningún FRCV. Imanishi et al.22 han demostrado que la senescencia de las CPE se acelera tanto en ratas hipertensas como en pacientes con HTA, hipotetizando que la senescencia de las CPE inducida por HTA podría afectar al proceso de remodelación vascular. Por otra parte, la concentración de CPE se reduce significativamente en pacientes con hipertensión refractaria en comparación con sujetos sanos23 . En voluntarios sanos, se ha descrito una correlación inversa entre la PA y el número y capacidad de formación de colonias de las CPE7 . Sin embargo, Delva et al.24 , en un estudio realizado con 36 pacientes con HTA esencial, no observaron ninguna alteración ni en el número de células ni en su
146 Tabla 1
C. Maroun-Eid et al. Parámetros clínicos y bioquímicos de los sujetos controles y de los pacientes hipertensos
Edad, a˜ nos Hombres, n (%) IMC, kg/m2 PAS, mmHg Glucosa, mg/dl HbA1c, % Colesterol total, mg/dl cHDL, mg/dl cLDL, mg/dl Triglicéridos, mg/dl Creatinina, mg/dl Aclaramiento creatinina, ml/min PCR, mg/dl Tratamiento, n (%) IECA/ARA-II Estatinas/fibratos Calcio antagonistas Diuréticos Bloqueadores beta ADO/insulina AA/ACO Bloqueadores alfa Nitratos
Controles sanos (n = 32)
Pacientes hipertensos (n = 108)
45 ± 10 17 (53,0) 23,8 ± 2,4 115 ± 7 90 ± 10 5,82 ± 0,52 179 ± 15 57 ± 18 112 ± 20 97 (57-137) 0,95 ± 0,15 85 ± 37 0,19 (0,14-0,54)
62 ± 12 51 (47,2) 30,0 ± 4,7* 129 ± 18* 111 ± 24* 6,11 ± 0,71 184 ± 35 56 ± 15 102 ± 29 115 (91-156)* 0,98 ± 0,19 106 ± 33 0,37 (0,24-0,65)*
-------------------
87 (80,6) 71 (65,7) 63 (58,3) 57 (52,8) 34 (31,5) 31 (28,7) 25 (23,1) 8 (7,4) 2 (1,9)
Los datos se expresan como la media ± DE o la mediana (rango intercuartílico). IMC: índice de masa corporal; PAS: presión arterial sistólica; PAD: presión arterial diastólica; PCR: proteína C reactiva; IECA: inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina; ARA-II: antagonista de los receptores de la angiotensina II; AA: anti-agregantes; ACO: anti-coagulantes. * p < 0,05 vs. controles sanos.
0,35
0,35
B
Células CD34+/KDR+ (%)
0,25 0,20 0,15 0,10
*
0,05 0
Controles
Pacientes
Células CD34+/VE-cadherina+ (%)
A 0,30
0,30 0,25 0,20 0,15
*
0,10 0,05 0
Controles
Pacientes
Figura 2 Niveles plasmáticos de células progenitoras endoteliales CD34+/KDR+ (A) y CD34+/VE-cadherina+ (B) en sujetos controles sin factores de riesgo cardiovascular y en pacientes hipertensos. * p < 0,05 vs. controles.
capacidad migratoria, mientras que en pacientes hipertensos con enfermedad arterial coronaria no se han observado niveles reducidos de CPE, aunque sí disminución de su capacidad migratoria25 . Estas discrepancias podrían ser debidas, al menos en parte, a las diferencias entre las cohortes de
pacientes estudiadas y/o a la metodología empleada15,26 . Hasta el momento, existen 2 abordajes para aislar y/o identificar las CPE. Por un lado, su cultivo a partir de una muestra de sangre, lo cual permite expandir las células para obtener una mayor cantidad y así poder estudiar su actividad,
Niveles de células progenitoras endoteliales circulantes en pacientes hipertensos tratados
B
0,30
0,20
0,10
*
*
*
*
0 0
1
2
3
4
FRCV (nº)
Células CD34+/VE-cadherina+ (%)
Células CD34+/KDR+ (%)
A 0,40
147
0,30
0,20
* * *
*
3
4
0,10
0 0
1
2
FRCV (nº)
Figura 3 Niveles de células progenitoras endoteliales CD34+/KDR+ (A) y CD34+/VE-cadherina+ (B) en función del número de factores de riesgo cardiovascular (FRCV) presentes. Los FRCV considerados fueron: hipertensión arterial, cLDL, diabetes mellitus, obesidad y tabaquismo. Los sujetos controles sanos se muestran como 0 FRCV y los pacientes hipertensos de 1 a 4 FRCV. Ninguno de los pacientes de nuestro estudio presentó 5 FRCV. * p < 0,05 vs. 0 FRCV (controles sanos).
Tabla 2 Niveles de células progenitoras endoteliales CD34+/KDR+ y CD34+/VE-cadherina+ en los sujetos controles y en los pacientes hipertensos sin diabetes mellitus en función del número de factores de riesgo cardiovascular (FRCV) presentes
Controles sanos Pacientes hipertensos 1 FRCV 2 FRCV 3 FRCV 4 FRCV
CD34+/KDR+ (%)
CD34+/VEcadherina+ (%)
0,01 (0,05-0,24)
0,06 (0,02-0,15)
0,02 0,01 0,02 0,03
(0,01-0,06)* (0,01-0,02)* (0,01-0,03)* (0,02-0,07)*
0,06 0,05 0,05 0,06
(0,02-0,08) (0,02-0,09) (0,04-0,10) (0,01-0,17)
Los datos se expresan como la mediana (rango intercuartílico). Los FRCV considerados fueron: hipertensión arterial, cLDL, obesidad y tabaquismo. Los sujetos controles sanos no tenían ningún FRCV. * p < 0,05 vs. controles sanos.
aunque no se sabe cómo se afectan su fenotipo y su funcionalidad. Por otro, el método empleado en este trabajo que es su identificación mediante citometría de flujo, sin manipulaciones ex vivo, basándose en la expresión de marcadores celulares. Sin embargo, actualmente no existe un consenso en la comunidad científica sobre qué marcadores identifican mejor a las CPE, ya que los más comúnmente usados (CD34, KDR, CD14, ␣-SMA) también pueden expresarse en células mesenquimales o hematopoyéticas15 . Nuestros pacientes hipertensos presentaban una disminución del número de células CD34+/KDR+ y CD34+/VEcadherina+, aunque estaban siendo tratados para sus FRCV. Aunque con algunas variaciones, la mayoría de los estudios han demostrado que fármacos antihipertensivos como los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina ii,
bloqueadores de los receptores de la angiotensina ii y antagonistas de los canales de calcio pueden inducir mejoras en el número y la función de las CPE, y que estos efectos son independientes del descenso de la PA14 . Del mismo modo, estatinas y fármacos antidiabéticos, como las tiazolidinedionas, la metformina o los inhibidores de dipeptidil peptidasa 4, pueden afectar directamente a las CPE10,14 . Diversos mecanismos podrían ser responsables de la disminución en el número de CPE observada en nuestros pacientes. Por un lado, la enfermedad cardiovascular se asocia con un estado crónico de inflamación que inhibiría la liberación de CPE y su funcionalidad4,5 . A pesar del tratamiento farmacológico, nuestros pacientes hipertensos mostraban una mayor concentración plasmática de PCR que se asoció con una menor cantidad de células CD34+/KDR+. La PCR es la proteína proinflamatoria que más se ha asociado con el riesgo cardiovascular20 . No obstante, su relación con los niveles y/o la funcionalidad de las CPE es aún controvertida. Algunos autores han demostrado que la PCR, a concentraciones conocidas para predecir eventos cardiovasculares, inhibe directamente la expresión de óxido nítrico sintasa endotelial y disminuye la producción de óxido nítrico, induciendo la alteración de la funcionalidad de las CPE y promoviendo su apoptosis27 . Sin embargo, otros autores no han encontrado una asociación entre los niveles plasmáticos de PCR y el deterioro en la función de las CPE, sugiriendo que esta disfuncionalidad no puede desempe˜ nar un papel en el riesgo cardiovascular relacionado con la PCR27 . Por otro lado, algunos estudios indican que la exposición crónica a los FRCV y la presencia de enfermedad cardiovascular subyacente acentuarían la lesión endotelial, de forma que la sustitución continua de las células endoteliales da˜ nadas podría conducir a la disminución de la reserva de CPE movilizadas desde la médula ósea. En este sentido, Fadini et al.28 han sugerido la posibilidad del agotamiento de la médula ósea después de observar que el número de células CD34+/KDR+ en pacientes con más de 20 a˜ nos de diagnóstico de DM tipo 2 es significativamente
148
C. Maroun-Eid et al. 0,08
B
0,06
0,04
* 0,02
Células CD34+/VE-cadherina+ (%)
Células CD34+/KDR+ (%)
A
0,15
0,10
0,05
0
0 < 0,3 mg/dL
≥ 0,3 mg/dL
< 0,3 mg/dL
PCR
≥ 0,3 mg/dL
PCR
Figura 4 Niveles de células progenitoras endoteliales CD34+/KDR+ (A) y CD34+/VE-cadherina+ (B) en los pacientes hipertensos en función de los niveles de proteína C reactiva (PCR). * p < 0,05 vs. pacientes con PCR < 0,3 mg/dl.
500
400
VEGF (pg/mL)
inferior al detectado en pacientes diabéticos recién diagnosticados. En modelos experimentales, se ha demostrado que la pérdida progresiva de células progenitoras puede contribuir al desarrollo de la aterosclerosis29 . Sin embargo, nuestros resultados muestran que la concentración plasmática de VEGF de nuestros pacientes era casi el doble de la que presentaban los sujetos controles. El VEGF se une a su receptor VEGFR2 expresado en las células de la médula ósea e induce su movilización a través de la activación de la vía del PI-3K/Akt. En el contexto de la clínica, se ha demostrado que en las CPE de la médula ósea de pacientes con enfermedad coronaria crónica existe un desacoplamiento en las se˜ nales de traducción de los receptores de esta citocina impidiendo su correcta movilización30 . Además, se ha demostrado que las CPE son altamente sensibles al aumento de los niveles de estrés oxidativo, claramente asociado a la presencia de FRCV, el cual induce la senescencia de las células pudiendo crear un disbalance entre los mecanismos de progresión y reparación vascular31 . Por tanto, aumentar su número podría ser una nueva terapia para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. En este sentido, se ha demostrado que la administración de CPE disminuye la hiperplasia neointimal inducida por balón o que inhibe la remodelación cardiaca después del infarto32,33 . Actualmente, este es un campo de enorme interés en el área cardiovascular34 . En resumen, los pacientes hipertensos en tratamiento estable, a pesar de un buen control en general de sus FRCV, muestran una disminución del número de CPE circulantes, lo que indica un posible mecanismo por el cual, al menos en parte, estos pacientes podrían presentar todavía un considerable riesgo cardiovascular residual. Es posible que, en un futuro, sea necesario enfocar el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares hacia terapias basadas en las CPE.
*
300
200
100
Controles
Pacientes
Figura 5 Concentración plasmática del factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) en sujetos controles sin factores de riesgo cardiovascular y en los pacientes.* p < 0,05 vs. controles sanos.
Responsabilidades éticas Protección de personas y animales. Los autores declaran que los procedimientos seguidos se conformaron a las normas éticas del comité de experimentación humana responsable y de acuerdo con la Asociación Médica Mundial y la Declaración de Helsinki. Confidencialidad de los datos. Los autores declaran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicación de datos de pacientes.
Niveles de células progenitoras endoteliales circulantes en pacientes hipertensos tratados Derecho a la privacidad y consentimiento informado. Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes y/o sujetos referidos en el artículo. Este documento obra en poder del autor de correspondencia.
Conflicto de intereses Ninguno.
Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado parcialmente con ayudas del Fondo de Investigación Sanitaria (PI14/1856), la Red de Investigación Cardiovascular (RIC; RD12/0042/0036) y el Fondo de Desarrollo Regional Europeo (FEDER). Una comunicación referente a esta línea de trabajo titulada «Movilización de células progenitoras endoteliales en pacientes hipertensos. Papel del factor de crecimiento del endotelio vascular» se presentó en la 20.a Reunión Nacional de la SEH-LELHA en la sesión de pósteres moderados y fue elegida mejor presentación.
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www.elsevier.es/hipertension
ORIGINAL
Niveles de células progenitoras endoteliales circulantes en pacientes hipertensos tratados C. Maroun-Eid a , A. Ortega-Hernández b , M. Abad a , J.A. García-Donaire a , A. Barbero a , L. Reinares c , N. Martell-Claros a y D. Gómez-Garre b,∗ a
Unidad de Hipertensión, Hospital Clínico San Carlos-Instituto de Investigación Sanitaria San Carlos (IdISSC), Madrid, Espa˜ na Laboratorio de Biología Vascular, Hospital Clínico San Carlos-IdISSC, Madrid, Espa˜ na c Unidad de Lípidos, Hospital Clínico San Carlos-IdISSC, Madrid, Espa˜ na b
Recibido el 29 de abril de 2015; aceptado el 13 de julio de 2015 Disponible en Internet el 20 de agosto de 2015
PALABRAS CLAVE Hipertensión; Tratamiento; Células progenitoras endoteliales; Riesgo cardiovascular residual
∗
Resumen Introducción: Muchos pacientes hipertensos óptimamente tratados de sus factores de riesgo cardiovascular (FRCV) siguen presentando complicaciones cardiovasculares. Las células progenitoras endoteliales (CPE) han demostrado ser fundamentales para la reparación del da˜ no endotelial en tejidos isquémicos. Por ello, hemos estudiado los niveles de CPE y del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) en pacientes hipertensos en tratamiento con buen control de la presión arterial (PA). Material y métodos: Se recogió una muestra de sangre de pacientes hipertensos tratados que presentaban unas cifras de PA adecuadas para los objetivos individuales. Los niveles plasmáticos de CPE CD34+/KDR+ y CD34+/VE-cadherina+ se midieron mediante citometría de flujo. La concentración de VEGF se cuantificó mediante ELISA. Como controles se incluyó un grupo de sujetos sin FRCV tradicionales. Resultados: Hemos incluido 108 pacientes (61 ± 12 a˜ nos, 47,2% hombres), de los cuales un 82,4% presentaba PA < 140/90 mmHg, un 91,7% control de la diabetes (HbA1c < 7%), el 81,5% cLDL < 130 o 100 mg/dl y el 85,2% no fumaba, aunque el 45,4% presentaba obesidad (IMC ≥ 30 kg/m2 ). A pesar de que, en conjunto, sus parámetros bioquímicos no diferían de los del grupo control, los pacientes hipertensos presentaban una disminución significativa de los niveles plasmáticos de células CD34+/KDR+ y CD34+/VE-cadherina+, aunque la concentración plasmática de VEGF era significativamente mayor en los pacientes hipertensos que en los sujetos control. Conclusiones: Los pacientes hipertensos tratados muestran una disminución significativa de los niveles plasmáticos de CPE que podría ser responsable, al menos en parte, del riesgo residual que presentan estos pacientes, sugiriéndose que las CPE podrían ser una importante diana terapéutica. © 2015 SEHLELHA. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Todos los derechos reservados.
Autor para correspondencia. Correo electrónico: [email protected] (D. Gómez-Garre).
http://dx.doi.org/10.1016/j.hipert.2015.07.002 1889-1837/© 2015 SEHLELHA. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Todos los derechos reservados.
Niveles de células progenitoras endoteliales circulantes en pacientes hipertensos tratados
KEYWORDS Hypertension; Treatment; Endothelial progenitor cells; Residual cardiovascular risk
143
Circulating endothelial progenitor cell levels in treated hypertensive patients Abstract Introduction: Most optimally treated hypertensive patients still have an around 50% increased risk of any cardiovascular event, suggesting the possible existence of unidentified risk factors. In the last years there has been evidence of the essential role of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) in the maintenance of endothelial integrity and function, increasing the interest in their involvement in cardiovascular disease. In this study, the circulating levels of EPCs and vascular endothelial growth factor (VEGF) are investigated in treated hypertensive patients with adequate control of blood pressure (BP). Material and methods: Blood samples were collected from treated hypertensive patients with controlled BP. Plasma levels of EPCs CD34+/KDR+ and CD34+/VE-cadherin+ were quantified by flow cytometry. Plasma concentration of VEGF was determined by ELISA. A group of healthy subjects without cardiovascular risk factors was included as controls. Results: A total of 108 hypertensive patients were included (61±12 years, 47.2% men) of which 82.4% showed BP < 140/90 mmHg, 91.7% and 81.5% controlled diabetes (HbA1c <7%) and cLDL (<130 or 100 mg/dL), respectively, and 85.2% were non-smokers. Around 45% of them were obese. Although patients had cardiovascular parameters within normal ranges, they showed significantly lower levels of CD34+/KDR+ and CD34+/VE-cadherin+ compared with healthy control group, although plasma VEGF concentration was higher in patients than in controls. Conclusions: Despite an optimal treatment, hypertensive patients show a decreased number of circulating EPCs that could be, at least in part, responsible for their residual cardiovascular risk, suggesting that these cells could be a therapeutic target. © 2015 SEHLELHA. Published by Elsevier España, S.L.U. All rights reserved.
Introducción La hipertensión arterial (HTA) generalmente se presenta en asociación con otros factores de riesgo cardiovascular (FRCV), por lo que las guías actuales apuntan al control tanto de la presión arterial (PA) como de los otros factores de riesgo con el objetivo de reducir el riesgo cardiovascular global1 . A pesar de ello, muchos pacientes correctamente tratados y con buen control de sus FRCV todavía presentan complicaciones cardiovasculares1,2 , lo que indica que detrás del proceso aterosclerótico que producen los FRCV tradicionales existen otros factores de riesgo no identificados. La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria sistémica caracterizada en estadios tempranos por la pérdida de la integridad del endotelio que tiene como resultado la disfunción endotelial, reconocida hoy día como uno de los eventos más tempranos del desarrollo de la placa de aterosclerosis3,4 . Por tanto, la regeneración y el mantenimiento de una capa de células endoteliales intacta son críticas para la reducción de complicaciones cardiovasculares5 . Desde su identificación, las células progenitoras endoteliales (CPE) circulantes provenientes de la médula ósea han ido adquiriendo una gran relevancia debido al papel crucial que parecen desempe˜ nar en el mantenimiento de la homeostasis del endotelio, siendo capaces de incorporarse al endotelio da˜ nado y diferenciarse hacia células endoteliales5,6 . Numerosos trabajos demuestran que los FRCV tradicionales como la HTA, el tabaquismo, la hiperlipidemia o la diabetes mellitus (DM) afectan a la cantidad
y a las propiedades de las CPE7-10 . Se ha demostrado que el número de CPE no solo es un mejor indicador de la disfunción endotelial que la puntuación de la escala de riesgo de Framingham7 , sino que se ha revelado como un biomarcador de la aparición de eventos cardiovasculares mayores, tanto en pacientes con enfermedad cardiovascular como en sujetos sanos11-13 . Además, algunas terapias para los FRCV son capaces de restaurar el número y/o la funcionalidad de las CPE10,14 , lo que indica que también podrían ser una herramienta para la medición de la eficacia terapéutica. Actualmente, se han identificado varios subtipos de CPE que pueden contribuir a la reparación endotelial, inicializando, facilitando y/o regulando la incorporación de las células al endotelio da˜ nado15 . Aunque hay cierta discrepancia, se acepta que existe una población de CPE circulantes que expresan marcadores como CD34, CD133 y KDR, que contribuyen a la vasculogénesis sintetizando gran cantidad de citocinas, como el factor de crecimiento endotelial vascular (vascular endotelial growth factor, VEGF) o el factor derivado de células estromales-1 (stromal-derived factor 1 [SDF-1) y células que además expresan abundantemente VEcadherina (CD144) y cuya contribución se debe a su gran capacidad de proliferación. En este trabajo, hemos investigado el número de CPE CD34+/KDR+ y CD34+/VE-cadherina+ en pacientes hipertensos tratados y con buen control de la PA, ya que una alteración de los niveles circulantes de células progenitoras supondría un fallo en los mecanismos de reparación del vaso que podría conducir al desarrollo de eventos.
144
Materiales y métodos Población de estudio En este trabajo hemos incluido de forma consecutiva a pacientes mayores de 18 a˜ nos con diagnóstico de HTA atendidos en la Unidad de Hipertensión (Servicio de Medicina Interna) del Hospital Clínico San Carlos de Madrid y que presentaban unas cifras de PA adecuadas para los objetivos individuales según los criterios de la guía de las Sociedades Europeas de Hipertensión (ESH) y cardiología (ESC) de 201316 : PA sistólica/diastólica < 140/90 mmHg excepto para pacientes diabéticos, en los que se consideró PA diastólica < 85 mmHg, y para pacientes mayores, en los que se permitieron cifras de PA sistólica entre 140 y 150 mmHg en función del estado de salud y de la tolerancia al tratamiento. Los criterios de exclusión fueron: mujeres embarazadas o en periodo de lactancia, haber presentado algún evento cardiovascular grave (ictus, infarto de miocardio o claudicación intermitente) en los 3 meses anteriores a su inclusión en este estudio, evidencia de enfermedad renal crónica, neoplasias o enfermedades autoinmunes, así como cualquier otra condición que pudiera interferir en la realización de este estudio a criterio del investigador. Además, se incluyó a 32 sujetos sanos sin FRCV tradicionales que sirvieron como grupo control. A todos los sujetos se les realizó un examen físico completo y se completó un cuestionario con datos como sexo, edad, medidas antropométricas (peso y altura), PA sistólica y diastólica, estatus de fumador, antecedentes familiares de enfermedad cardiovascular (definidos como ocurrencia de un evento cardiovascular importante en uno o más familiares de primer grado). Se calculó el índice de masa corporal (IMC) y se consideró obesidad cuando el IMC ≥ 30 kg/m2 . Además, se obtuvieron 2 muestras de sangre venosa en ayunas: una para las mediciones bioquímicas de rutina, que se realizaron en el Servicio de Análisis Clínicos del Hospital Clínico San Carlos, y otra para la cuantificación de CPE. El control del colesterol LDL (cLDL) se definió como < 130 mg/dl en pacientes con 2 o más factores de riesgo y < 100 mg/dl en paciente con enfermedad cardiovascular o DM17 y el de la DM como HbA1c < 7%18 . Se consideró control del tabaquismo si el paciente llevaba más de 6 meses sin fumar o era no fumador. El protocolo de este estudio cumple con los principios de la Declaración de Helsinki y ha sido aprobado por el Comité de Ética y de Investigación Clínica del Hospital Clínico San Carlos. El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes.
Determinación de los niveles circulantes de células progenitoras endoteliales La cuantificación de CPE en sangre periférica se realizó mediante estudios de citometría de flujo siguiendo un protocolo ya descrito previamente19 . Para cada sujeto se prepararon 2 tubos con 100 l de sangre-EDTA cada uno y se incubaron con los distintos anticuerpos específicos: anti-CD34-conjugado con ficoeritrina-cianina 7 (PC7) (IgG1 de ratón, Beckman Coulter INC, L’Hospitalet de Llobregat, Barcelona, Espa˜ na), anti-CD3-conjugado con ficoeritrinarojo Texas (ECD) (IgG1 de ratón, Beckman Coulter),
C. Maroun-Eid et al. anti-KDR-conjugado con ficoeritrina (PE) (IgG1 de ratón, R&D Systems) y anti-VE-caderina (CD144)-conjugado con PE (IgG2b de ratón, R&D Systems, Abingdon, Reino Unido). Además, se preparó una tercera muestra de sangre que se incubó con los correspondientes controles isotípicos. Las muestras se incubaron durante 30 min en oscuridad a 4 ◦ C. Pasado el tiempo, a cada tubo se le a˜ nadieron 900 l de solución de lisis (BD FacsLysing solution, Beckton Dickinson, San Agustín de Guadalix, Madrid, Espa˜ na), dejándola actuar durante 10 min en oscuridad. A continuación, las muestras se centrifugaron a 1.500 rpm durante 10 min a 4 ◦ C, se retiró el sobrenadante y el precipitado se lavó con 1 ml de tampón fosfato salino (en inglés PBS) a 1.500 rpm durante 10 min a 4 ◦ C. Finalmente, las células se resuspendieron en 400 l de PBS y se analizaron en un citómetro de flujo (FC500, Beckman Coulter INC). Las CPE se identificaron como negativas para CD3 y como doble positivas para CD34/KDR y CD34/VE-cadherina. Los resultados se expresan como porcentaje de células positivas en la región limitada para las células mononucleares. La configuración del aparato se optimizó diariamente usando microesferas fluorescentes de poliestireno (FlowCheck PC7 770/488, Beckman Coulter INC). El análisis de todas las muestras lo realizó el mismo operador, el cual desconocía las características de los sujetos.
Determinación de los niveles de factor de crecimiento del endotelio vascular Los niveles plasmáticos de VEGF se cuantificaron con un ELISA comercial (Human VEGF Quantikine ELISA kit, cat. num DVE00, R&D Systems). El rango de medida del ensayo ha sido 31,2-2.000 pg/ml, con un coeficiente de variación interensayo inferior al 7,5% y un coeficiente de variación intraensayo inferior al 5,5%.
Análisis estadístico Las variables cualitativas se presentan con su distribución de frecuencias. El estudio de la normalidad de las variables cuantitativas se realizó mediante el test de bondad de ajuste de Kolmogorov-Smirnov. Las variables que presentaban una distribución normal se muestran como su media ± desviación estándar (DE) y se analizaron mediante test paramétricos (t de Student y ANOVA) para comparar 2 o más grupos, respectivamente. Las variables con distribuciones asimétricas se presentan con mediana y su rango intercuartílico y se analizaron mediante los test no paramétricos de Kruskal-Wallis o Mann-Whitney. La asociación entre variables cualitativas se evaluó con el test de la 2 . En todos los contrastes de hipótesis se rechazó la hipótesis nula con un error de tipo i o error menor a 0,05. El procesamiento y el análisis de los datos se realizaron mediante el paquete estadístico SPSS 17.0.
Resultados Características de los pacientes En este estudio hemos incluido 108 pacientes, con una edad media ± DE de 61 ± 12 a˜ nos. La distribución por sexos fue
Niveles de células progenitoras endoteliales circulantes en pacientes hipertensos tratados
excluyendo a los pacientes con DM. Los niveles de CPE circulantes se mantuvieron significativamente disminuidos en los pacientes con respecto a los controles (CD34+/KDR+: 0,01 [0,01-0,03]% vs. 0,01 [0,05-0,024]%; CD34+/VE-cadherina+: 0,05 [0,02-0,09]% vs. 0,07 [0,02-0,15]%, p < 0,05) e independientemente del número de FRCV presentes (tabla 2).
100
Pacientes controlados (%)
80
60
Relación entre células progenitoras endoteliales y la proteína C reactiva
40
20
0
145
HTA
DM
c-LDL
Tabaquismo Obesidad
Figura 1 Porcentaje de pacientes hipertensos con control de la hipertensión arterial (HTA), la diabetes mellitus (DM), el colesterol LDL (cLDL), el tabaquismo y la obesidad.
de 51 hombres (47,2%) y 57 mujeres (52,8%). El 52,8% de los pacientes presentaban menos de 10 a˜ nos de diagnóstico de HTA en el momento de su inclusión en el estudio. En cuanto a la presencia de otros FRCV, 96 pacientes (88,9%) presentaban algún otro FRCV además de HTA, siendo el más frecuente la dislipidemia (67,6%), seguida de la obesidad (54,6%), la DM (31,5%) y el tabaquismo (14,8%). En cuanto al grado de control de los FRCV, la mayoría de los pacientes tenían niveles de PA < 140/90 mmHg, HbAc1 < 7%, cLDL < 130 o 100 mg/dl y/o no fumaban en el momento de su inclusión en el estudio (fig. 1). Sin embargo, el 45,4% de los pacientes presentaban obesidad (IMC ≥ 30 kg/m2 ), aunque otro 45,4% presentaba sobrepeso (IMC 2529,9 kg/m2 ), lo que reduce a tan solo el 9,2% el grupo de pacientes que tenían un IMC en los límites de la normalidad (IMC < 25 kg/m2 ) (fig. 1). Respecto a los FRCV no tradicionales, los pacientes mostraron mayores concentraciones de proteína C reactiva (PCR) (tabla 1), el marcador de inflamación que más se ha asociado con el desarrollo de eventos cardiovasculares20 . Las variables bioquímicas de los pacientes y de los sujetos controles sin FRCV se detallan en la tabla 1.
Niveles circulantes de células progenitoras endoteliales A pesar de que las variables bioquímicas de los pacientes se encontraban dentro de los rangos normales y no se diferenciaban de los valores de los sujetos controles, a excepción del IMC, la cantidad de CPE CD34+/KDR+ y CD34+/VEcadherina+ circulantes era significativamente menor en los pacientes (fig. 2 A y B). Esta alteración en los niveles de células progenitoras no se asoció al número de FRCV que presentaban los pacientes; los pacientes hipertensos sin más FRCV ya presentaban menos cantidad de células CD34+/KDR+ y CD34+/VE-cadherina+ que los controles y estos niveles apenas variaron en los pacientes con 2, 3 y 4 FRCV (fig. 3 A y B). Puesto que la DM es una causa bien demostrada de reducción en los niveles de CPE circulantes, realizamos un análisis de sensibilidad de los resultados observados
Puesto que la aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria3,4 , nuestro siguiente objetivo fue estudiar si existía alguna relación entre los niveles plasmáticos de PCR y los de CPE. Para ello se separó a la población de pacientes en 2 grupos: aquellos que presentaban niveles de PCR por encima o iguales a 0,3 mg/dl y los que mostraban niveles por debajo de 0,3 mg/dl. Los pacientes con valores altos de PCR tenían niveles de células CD34+/KDR+ significativamente menores que los pacientes con PCR baja (fig. 4 A). No se observó ninguna diferencia en los niveles de células CD34+/VE-cadherina+ en función de la concentración de PCR (fig. 4 B).
Concentración plasmática de factor de crecimiento del endotelio vascular Numerosos estudios han demostrado que citocinas quimioatractantes como VEGF inducen la movilización de las CPE desde la médula ósea y estimulan su proliferación y diferenciación en los sitios de lesión vascular21 . En comparación con el grupo control, la concentración plasmática de VEGF en los pacientes hipertensos estaba aumentada casi 2 veces (fig. 5).
Discusión Numerosos estudios han demostrado que las CPE circulantes se encuentran reducidas en presencia de FRCV clásicos, independientemente de la existencia de enfermedad cardiovascular establecida9,11,12 . Además, la concentración de CPE también se ha asociado al desarrollo de eventos cardiovasculares futuros9,11,12 . Nuestros resultados demuestran que los pacientes hipertensos en tratamiento estable, a pesar de tener unas cifras de PA adecuadas para los objetivos individuales y un buen control en general de sus otros FRCV16-18 , presentaban menor concentración de CPE CD34+/KDR+ y CD34+/VEcadherina+ en comparación con sujetos sanos sin ningún FRCV. Imanishi et al.22 han demostrado que la senescencia de las CPE se acelera tanto en ratas hipertensas como en pacientes con HTA, hipotetizando que la senescencia de las CPE inducida por HTA podría afectar al proceso de remodelación vascular. Por otra parte, la concentración de CPE se reduce significativamente en pacientes con hipertensión refractaria en comparación con sujetos sanos23 . En voluntarios sanos, se ha descrito una correlación inversa entre la PA y el número y capacidad de formación de colonias de las CPE7 . Sin embargo, Delva et al.24 , en un estudio realizado con 36 pacientes con HTA esencial, no observaron ninguna alteración ni en el número de células ni en su
146 Tabla 1
C. Maroun-Eid et al. Parámetros clínicos y bioquímicos de los sujetos controles y de los pacientes hipertensos
Edad, a˜ nos Hombres, n (%) IMC, kg/m2 PAS, mmHg Glucosa, mg/dl HbA1c, % Colesterol total, mg/dl cHDL, mg/dl cLDL, mg/dl Triglicéridos, mg/dl Creatinina, mg/dl Aclaramiento creatinina, ml/min PCR, mg/dl Tratamiento, n (%) IECA/ARA-II Estatinas/fibratos Calcio antagonistas Diuréticos Bloqueadores beta ADO/insulina AA/ACO Bloqueadores alfa Nitratos
Controles sanos (n = 32)
Pacientes hipertensos (n = 108)
45 ± 10 17 (53,0) 23,8 ± 2,4 115 ± 7 90 ± 10 5,82 ± 0,52 179 ± 15 57 ± 18 112 ± 20 97 (57-137) 0,95 ± 0,15 85 ± 37 0,19 (0,14-0,54)
62 ± 12 51 (47,2) 30,0 ± 4,7* 129 ± 18* 111 ± 24* 6,11 ± 0,71 184 ± 35 56 ± 15 102 ± 29 115 (91-156)* 0,98 ± 0,19 106 ± 33 0,37 (0,24-0,65)*
-------------------
87 (80,6) 71 (65,7) 63 (58,3) 57 (52,8) 34 (31,5) 31 (28,7) 25 (23,1) 8 (7,4) 2 (1,9)
Los datos se expresan como la media ± DE o la mediana (rango intercuartílico). IMC: índice de masa corporal; PAS: presión arterial sistólica; PAD: presión arterial diastólica; PCR: proteína C reactiva; IECA: inhibidor de la enzima convertidora de la angiotensina; ARA-II: antagonista de los receptores de la angiotensina II; AA: anti-agregantes; ACO: anti-coagulantes. * p < 0,05 vs. controles sanos.
0,35
0,35
B
Células CD34+/KDR+ (%)
0,25 0,20 0,15 0,10
*
0,05 0
Controles
Pacientes
Células CD34+/VE-cadherina+ (%)
A 0,30
0,30 0,25 0,20 0,15
*
0,10 0,05 0
Controles
Pacientes
Figura 2 Niveles plasmáticos de células progenitoras endoteliales CD34+/KDR+ (A) y CD34+/VE-cadherina+ (B) en sujetos controles sin factores de riesgo cardiovascular y en pacientes hipertensos. * p < 0,05 vs. controles.
capacidad migratoria, mientras que en pacientes hipertensos con enfermedad arterial coronaria no se han observado niveles reducidos de CPE, aunque sí disminución de su capacidad migratoria25 . Estas discrepancias podrían ser debidas, al menos en parte, a las diferencias entre las cohortes de
pacientes estudiadas y/o a la metodología empleada15,26 . Hasta el momento, existen 2 abordajes para aislar y/o identificar las CPE. Por un lado, su cultivo a partir de una muestra de sangre, lo cual permite expandir las células para obtener una mayor cantidad y así poder estudiar su actividad,
Niveles de células progenitoras endoteliales circulantes en pacientes hipertensos tratados
B
0,30
0,20
0,10
*
*
*
*
0 0
1
2
3
4
FRCV (nº)
Células CD34+/VE-cadherina+ (%)
Células CD34+/KDR+ (%)
A 0,40
147
0,30
0,20
* * *
*
3
4
0,10
0 0
1
2
FRCV (nº)
Figura 3 Niveles de células progenitoras endoteliales CD34+/KDR+ (A) y CD34+/VE-cadherina+ (B) en función del número de factores de riesgo cardiovascular (FRCV) presentes. Los FRCV considerados fueron: hipertensión arterial, cLDL, diabetes mellitus, obesidad y tabaquismo. Los sujetos controles sanos se muestran como 0 FRCV y los pacientes hipertensos de 1 a 4 FRCV. Ninguno de los pacientes de nuestro estudio presentó 5 FRCV. * p < 0,05 vs. 0 FRCV (controles sanos).
Tabla 2 Niveles de células progenitoras endoteliales CD34+/KDR+ y CD34+/VE-cadherina+ en los sujetos controles y en los pacientes hipertensos sin diabetes mellitus en función del número de factores de riesgo cardiovascular (FRCV) presentes
Controles sanos Pacientes hipertensos 1 FRCV 2 FRCV 3 FRCV 4 FRCV
CD34+/KDR+ (%)
CD34+/VEcadherina+ (%)
0,01 (0,05-0,24)
0,06 (0,02-0,15)
0,02 0,01 0,02 0,03
(0,01-0,06)* (0,01-0,02)* (0,01-0,03)* (0,02-0,07)*
0,06 0,05 0,05 0,06
(0,02-0,08) (0,02-0,09) (0,04-0,10) (0,01-0,17)
Los datos se expresan como la mediana (rango intercuartílico). Los FRCV considerados fueron: hipertensión arterial, cLDL, obesidad y tabaquismo. Los sujetos controles sanos no tenían ningún FRCV. * p < 0,05 vs. controles sanos.
aunque no se sabe cómo se afectan su fenotipo y su funcionalidad. Por otro, el método empleado en este trabajo que es su identificación mediante citometría de flujo, sin manipulaciones ex vivo, basándose en la expresión de marcadores celulares. Sin embargo, actualmente no existe un consenso en la comunidad científica sobre qué marcadores identifican mejor a las CPE, ya que los más comúnmente usados (CD34, KDR, CD14, ␣-SMA) también pueden expresarse en células mesenquimales o hematopoyéticas15 . Nuestros pacientes hipertensos presentaban una disminución del número de células CD34+/KDR+ y CD34+/VEcadherina+, aunque estaban siendo tratados para sus FRCV. Aunque con algunas variaciones, la mayoría de los estudios han demostrado que fármacos antihipertensivos como los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina ii,
bloqueadores de los receptores de la angiotensina ii y antagonistas de los canales de calcio pueden inducir mejoras en el número y la función de las CPE, y que estos efectos son independientes del descenso de la PA14 . Del mismo modo, estatinas y fármacos antidiabéticos, como las tiazolidinedionas, la metformina o los inhibidores de dipeptidil peptidasa 4, pueden afectar directamente a las CPE10,14 . Diversos mecanismos podrían ser responsables de la disminución en el número de CPE observada en nuestros pacientes. Por un lado, la enfermedad cardiovascular se asocia con un estado crónico de inflamación que inhibiría la liberación de CPE y su funcionalidad4,5 . A pesar del tratamiento farmacológico, nuestros pacientes hipertensos mostraban una mayor concentración plasmática de PCR que se asoció con una menor cantidad de células CD34+/KDR+. La PCR es la proteína proinflamatoria que más se ha asociado con el riesgo cardiovascular20 . No obstante, su relación con los niveles y/o la funcionalidad de las CPE es aún controvertida. Algunos autores han demostrado que la PCR, a concentraciones conocidas para predecir eventos cardiovasculares, inhibe directamente la expresión de óxido nítrico sintasa endotelial y disminuye la producción de óxido nítrico, induciendo la alteración de la funcionalidad de las CPE y promoviendo su apoptosis27 . Sin embargo, otros autores no han encontrado una asociación entre los niveles plasmáticos de PCR y el deterioro en la función de las CPE, sugiriendo que esta disfuncionalidad no puede desempe˜ nar un papel en el riesgo cardiovascular relacionado con la PCR27 . Por otro lado, algunos estudios indican que la exposición crónica a los FRCV y la presencia de enfermedad cardiovascular subyacente acentuarían la lesión endotelial, de forma que la sustitución continua de las células endoteliales da˜ nadas podría conducir a la disminución de la reserva de CPE movilizadas desde la médula ósea. En este sentido, Fadini et al.28 han sugerido la posibilidad del agotamiento de la médula ósea después de observar que el número de células CD34+/KDR+ en pacientes con más de 20 a˜ nos de diagnóstico de DM tipo 2 es significativamente
148
C. Maroun-Eid et al. 0,08
B
0,06
0,04
* 0,02
Células CD34+/VE-cadherina+ (%)
Células CD34+/KDR+ (%)
A
0,15
0,10
0,05
0
0 < 0,3 mg/dL
≥ 0,3 mg/dL
< 0,3 mg/dL
PCR
≥ 0,3 mg/dL
PCR
Figura 4 Niveles de células progenitoras endoteliales CD34+/KDR+ (A) y CD34+/VE-cadherina+ (B) en los pacientes hipertensos en función de los niveles de proteína C reactiva (PCR). * p < 0,05 vs. pacientes con PCR < 0,3 mg/dl.
500
400
VEGF (pg/mL)
inferior al detectado en pacientes diabéticos recién diagnosticados. En modelos experimentales, se ha demostrado que la pérdida progresiva de células progenitoras puede contribuir al desarrollo de la aterosclerosis29 . Sin embargo, nuestros resultados muestran que la concentración plasmática de VEGF de nuestros pacientes era casi el doble de la que presentaban los sujetos controles. El VEGF se une a su receptor VEGFR2 expresado en las células de la médula ósea e induce su movilización a través de la activación de la vía del PI-3K/Akt. En el contexto de la clínica, se ha demostrado que en las CPE de la médula ósea de pacientes con enfermedad coronaria crónica existe un desacoplamiento en las se˜ nales de traducción de los receptores de esta citocina impidiendo su correcta movilización30 . Además, se ha demostrado que las CPE son altamente sensibles al aumento de los niveles de estrés oxidativo, claramente asociado a la presencia de FRCV, el cual induce la senescencia de las células pudiendo crear un disbalance entre los mecanismos de progresión y reparación vascular31 . Por tanto, aumentar su número podría ser una nueva terapia para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. En este sentido, se ha demostrado que la administración de CPE disminuye la hiperplasia neointimal inducida por balón o que inhibe la remodelación cardiaca después del infarto32,33 . Actualmente, este es un campo de enorme interés en el área cardiovascular34 . En resumen, los pacientes hipertensos en tratamiento estable, a pesar de un buen control en general de sus FRCV, muestran una disminución del número de CPE circulantes, lo que indica un posible mecanismo por el cual, al menos en parte, estos pacientes podrían presentar todavía un considerable riesgo cardiovascular residual. Es posible que, en un futuro, sea necesario enfocar el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares hacia terapias basadas en las CPE.
*
300
200
100
Controles
Pacientes
Figura 5 Concentración plasmática del factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) en sujetos controles sin factores de riesgo cardiovascular y en los pacientes.* p < 0,05 vs. controles sanos.
Responsabilidades éticas Protección de personas y animales. Los autores declaran que los procedimientos seguidos se conformaron a las normas éticas del comité de experimentación humana responsable y de acuerdo con la Asociación Médica Mundial y la Declaración de Helsinki. Confidencialidad de los datos. Los autores declaran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicación de datos de pacientes.
Niveles de células progenitoras endoteliales circulantes en pacientes hipertensos tratados Derecho a la privacidad y consentimiento informado. Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes y/o sujetos referidos en el artículo. Este documento obra en poder del autor de correspondencia.
Conflicto de intereses Ninguno.
Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado parcialmente con ayudas del Fondo de Investigación Sanitaria (PI14/1856), la Red de Investigación Cardiovascular (RIC; RD12/0042/0036) y el Fondo de Desarrollo Regional Europeo (FEDER). Una comunicación referente a esta línea de trabajo titulada «Movilización de células progenitoras endoteliales en pacientes hipertensos. Papel del factor de crecimiento del endotelio vascular» se presentó en la 20.a Reunión Nacional de la SEH-LELHA en la sesión de pósteres moderados y fue elegida mejor presentación.
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