- Email: [email protected]
Nouvelles perspectives pour le suivi biologique des sportifs 1. L'analyse métabolique par spectrométrie IR-TF
Science & Sports 2000 ; 15 : 95-7 © 2000 f~ditions scientifiques et m~dicales Elsevier SAS. Tous droits rdserv6s
Communication br~ve
Nouvelles perspectives pour le suivi biologique des sportifs 1. L'analyse m6tabolique par spectrom6trie IR-TF C. Petibois 1, 2, G. D616ris 1., G. Cazorla 2 / Equipe de chimie bio-organique, Inserm U 443, universitF Vic[or-Segalen, Bordeaux 2, [46, rue Ldo-Saignat, 33076 Bordeaux ; 2facult~ des sciences du sport et de l'Fducation physique, universitF Victor-Segalen Bordeaux 2, rue Camille-Julian, 33405 Talence, France
(Re~u le 10 mars 1999 ; accept6 le 15 ddcembre 1999)
Resume
Objectif. - La mise au point de techniques analytiques adaptees au suivi biologique des sportifs est devenue une necessite. Methodes. - Nous avons teste le potentiel analytique d'une technique emergente, la spectrometrie infrarouge ~.transform6e de Fourier, laquelle est sensible, precise, reproductible et surtout globale. Resultats et conclusions. - Nous averts obtenu la validation clinique de nouvelles m6thodes d'analyse du serum a partir de micro-6chantillons (50/~L de sang capillaire), ce qui permet d'envisager leur application pour le suM biologique des sportifs. © 2000 I~ditions scientifiques et rnedicales Elsevier SAS spectrom6trie IR-TF / s6rum / m6tabolisme / mdthodologie Summary - New perspectives in sportsmen biological investigations. Metabolic analysis using FT-IR spectrometry. Objectives. - The perfecting of analytical techniques adapted to biological sportsmen monitoring is more than ever become a necessity. Methods. - We have assessed the analytical potential of an emerging technique, fourier-transform infrared spectromet~ which is acurate, precise, reproducible and above all global. Results and conclusions. - We have obtained the clinical validation of new serum analytical methods, performed from microsamples (50 #L capillary blood), allowing to foresee their application for sportsmen biological monitoring. @ 2000 E-ditions scientifiques et m6dicales Elsevier SAS FT-IR spectrometry / serum / metabolism / methods
Les d 6 v e l o p p e m e n t s r6cents des besoins dans le d o m a i n e de la b i o l o g i e et de la m d d e c i n e du sport i m p o s e n t la m i s e en oeuvre de n o u v e l l e s m6thodes d ' a n a l y s e des 6chantillons biologiques. Ces mdthodes d e v r o n t r6pondre aux carences des pr6c6dentes, c'est-~-dire :
-
m a n q u e de certitude quant ~t la validit6 du r6sultat ; impossibilit6 de rdutiliser les donn6es analytiques ; cofit dlev6 d ' a n a l y s e ; inconfort du sportif soumis aux prdlOvements ; a p p r o c h e diagnostique non globale.
*Correspondance et tir~s &part : G. Dfildris, 6quipe de chimie bio-organique, Inserm U 443, universit6 Victor Segalen Bordeaux 2, 146, rue Ldo-Saignat,
33076 Bordeaux.
96
c. Petibois et al. 0,15
~!~i~~i~'~~!i!'i~
:i30
0 1300
~ 1203
1107
1011
914
Nombre d'ondes (em-1)
SYNTH]~SE DES FAITS
Dans le domaine microbiologique, il a 6t6 d6montr6 qu'une technique 6mergente, la spectrom6trie infrarouge transformde de Fourier (IR-TF), est sensible, prdcise, reproductible et surtout globale [3].
Figure 1. Spectre infrarouge de s6rum pour la zone d'absorption 1 300900 cm -1. Le pic sp6cifique du glucose (Glc ~ 1 033 cm -1) permet sa quantification et la soustraction de son absorption dans le spectre global. La soustraction de l'absorption du lactate (La- a 1 127 cm -l) laisse appara~tre un pic sp6cifique du glyc6rol (IFP h 1 110 cm 2).
Utilisations de la spectrom~trie IR-TF
Le spectre IR-TF d'une moldcule donn6e, lorsqu'on fait varier la longueur d'onde du rayon infrarouge, est compos6 de l'ensemble des bandes d'absorption de ses liaisons atomiques, lesquelles vibrent sous l'influence du faisceau (tableau I). Le spectre d'un 6chantillon biologique complexe est donc la superposition des spectres de toutes les biomoldcules en pr6sence (aspect qualitatif), en fonction de leurs concentrations respectives (aspect quantitatif). Le dosage d'une mol6cule donn6e dans un 6chantillon est envisageable car, la structure d'une mol6cule 6tant par ddfinition unique, son spectre IR-TF l'est aussi. Toutes les mol6cules organiques absorbent dans le moyen infrarouge (4 000-500 cm -1) et sont donc potentiellement apparentes dans le spectre. Cependant, les dosages effectu6s jusqu'h pr6sent ont toujours eu recours h l'utilisation d'dtalons internes et/ou ~ certaines manipulations de l'6chantillon [1], lesquels demeuraient n6cessaires avant de pouvoir obtenir un r6sultat en accord avec celni d'une analyse clinique de r6f6rence. Nous avons pu r6duire les manipulations de l'6chantillon (sdrum) h une dilution dans de l'eau (1/4 ; v/v) et h sa dessiccation avant analyse [2]. Ceci permet d'analyser l'6chantillon sans alt6rer sa composition chimique. Un intdret majeur de cette technique est la sauvegarde des donn6es spectrales brutes, ce qui permet d'analyser ou de v6rifier des r6sultats d'analyse h tout moment, comme si le pr61bvement venait d'etre effectual. Le dosage de concentrations m~taboliques
AprSs acquisition des donndes spectrales brutes, la m6thode comporte les 6tapes suivantes : - mettre en lumiSre un pic spdcifique d'un m6tabolite donn6 ~ la surface du spectre ;
- calculer l'absorption de ce mdtabolite en solution ; - int6grer la surface du pic de ce mdtabolite darts le spectre de sdrum pour en d6terminer l'absorption ; - utiliser ces deux derniers r6sultats pour ddterminer la concentration du mdtabolite dans l'6chantillon analys6 [2]. Ensuite, on pourra soustraire l'absorption de ce m6tabolite au spectre global afin de laisser apparaitre d'6ventuelles nouvelles absorptions, lesquelles permettront la ddtermination de nouvelles concentrations. La figure 1 pr6sente la d6termination de la glyc6mie, puis celle de la lactat6mie. Un pic sp6cifique du glycdrol appara~t apr~s soustraction de 1' absorption du lactate. D6terminer les effets m6taboliques de l'exercice
Les spectres IR-TF sauvegardds peuvent etre soustraits pour d6terminer l'6volution des contenus d'un milieu biologique entre deux analyses, ce qui donne un spectre IRTF de diff6rences. Cela permet de s' affranchir des problbmes posds par l'absorption pr6ponddrante des prot6ines dans le spectre IR-TF de s6rum. En effets, les contenus prot6iques du s6rum ne sont pas sujets h des variations aussi rapides que pour d' autres biomol6cules (notamment 6nerg6tiques). Lafigure 2 pr6sente un spectre de diff6rences (exercice-repos). Suite ?~un exercice d'endurance, on notera la diminution de la glyc6mie, 1' augmentation de la lactat6mie, des triglycdrides, des acides gras libres et de l'albumine, vecteur de m6tabolites insolubles essentiels au m6tabolisme musculaire. Diffdrencier les sujets par un profil m6tabolique
Le traitement math6matique et statistique des spectres permet leur diff6renciation sur la base d'un calcul
Nouvelles perspectives pour le suivi biologique des sportifs
0,03
100
Alburnine
:
!
O,O2 TG; AGL
[
97
75
La
o oc-
50
o
= 25
-0,01
4000 3518 3035 2553 2071 1589 1107
625
Nombre d'ondes (cm "1) Figure 2. Spectre IR-TF de diff6rences (spectre de repos soustrait au spectre d'exercice) laissant apparahre les absorptions spdcifiques des triglyc6rides (TG) et des acides gras fibres (AGL) ainsi que celles d6j?~ analysables sur spectres initiaux (La et Glc). Un pic sp6cifique de l'albumine apparait ~t 1 353.6 cm-1.
d'h6t6rogdndit6, selon la m6thode de W a r d [4]. L ' a l g o rithme utilis6 considSre l ' e n s e m b l e des points d ' u n spectre I R - T F (3 630 entre 4 000 et 500 c m -1) c o m m e des variables d6pendantes, faisant ainsi du spectre u n individu. I1 tentera de regrouper les spectres prdsentant la plus grande homog6n6it6 tout en constituant ces groupes de telle manibre q u ' i l s pr6sentent la plus grande h6t6rogdn6it6 entre eux. Ceci peut 8tre rdalis6 sur le spectre global ou sur l ' a b s o r b a n c e majeure d ' u n e liaison c h i m i q u e sp6cifique de certaines families de biomoldcules (tableau I). Un profil m6tabolique c o m p r e n a n t plusieurs r6gions spectrales pourra 8tre construit de telle manibre que l ' o n puisse diff6rencier plus f i n e m e n t plusieurs populations de sujets. La figure 3 p r 6 s e n t e le c l a s s e m e n t des spectres I R - T F du s6rum de repos pour trois populations (diab6tiques, sportifs, contr61es). Le profil m6tabolique utilis6 comprenait la c o m b i n a i s o n des r6gions spectrales suivantes : = CH, CH3, C = O ( A m i d e I) et C-O. CONCLUSION L ' a p p l i c a t i o n de ces m6thodes dans le d o m a i n e sportif est rendue possible car elle ne n6cessite que des micropr61b-
0
Figure 3. Classification des spectres IR-TF du sdrum de repos de 32 patients diabdtiques (*), 32 sujets sains (o) et 32 sportifs entra~n6sen endurance (~). Combinaison des bandes d'absorption des = CH, CH3, C = O (Amide 1) et C-O.
v e m e n t s (50 p L de sang capillaire), c'est-~-dire q u ' e l l e est peu invasive et q u ' e l l e respecte au m i e u x le confort de l'athl~te. U n e analyse m 6 t a b o l i q u e peut 8tre effectu6e avec la possibilit6 d ' u n e classification des groupes de sujets tout en conservant les donndes analytiques brutes en vue de nouvelles analyses ou comparaisons. I1 apparait que cette technique est ~tmSme de r6pondre aux exigences de la biologie du sport, n o t a m m e n t pour la pr6vention du surentra~nement, la nutrition et le contr61e de sant6 des athl6tes. RI~F£RENCES
1 Budinova G, Salva J, Volka K. Application of moiecular spectroscopy in the mid-infrared region to the determination of glucose and cholesterol in whole blood and in blood serum. Appl Spectroscopy 1997 ; 51 : 631-5. 2 Petibois C, Rigalleau V, Melin AM, Perromat A, Cazorla G, Gin H, et al. Determination of glucose in dried serum samples by Fouriertransform infrared spectroscopy. Clin Chem 1999 ; 45 : 1530-5. 3 Sockalingum GD, Bouhedia W, Pina R Allouch R Bloy C, Manfait M. FT-IR spectroscopy as an emerging method for rapid caracterization of microorganisms. Cell Mol Biol 1998 ; 44 : 261-9. 4 Ward JH. Hierarchical grouping to optimize an objective function. J Am Statist Assoc 1963 ; 58 : 236-44.
Communication br~ve
Nouvelles perspectives pour le suivi biologique des sportifs 1. L'analyse m6tabolique par spectrom6trie IR-TF C. Petibois 1, 2, G. D616ris 1., G. Cazorla 2 / Equipe de chimie bio-organique, Inserm U 443, universitF Vic[or-Segalen, Bordeaux 2, [46, rue Ldo-Saignat, 33076 Bordeaux ; 2facult~ des sciences du sport et de l'Fducation physique, universitF Victor-Segalen Bordeaux 2, rue Camille-Julian, 33405 Talence, France
(Re~u le 10 mars 1999 ; accept6 le 15 ddcembre 1999)
Resume
Objectif. - La mise au point de techniques analytiques adaptees au suivi biologique des sportifs est devenue une necessite. Methodes. - Nous avons teste le potentiel analytique d'une technique emergente, la spectrometrie infrarouge ~.transform6e de Fourier, laquelle est sensible, precise, reproductible et surtout globale. Resultats et conclusions. - Nous averts obtenu la validation clinique de nouvelles m6thodes d'analyse du serum a partir de micro-6chantillons (50/~L de sang capillaire), ce qui permet d'envisager leur application pour le suM biologique des sportifs. © 2000 I~ditions scientifiques et rnedicales Elsevier SAS spectrom6trie IR-TF / s6rum / m6tabolisme / mdthodologie Summary - New perspectives in sportsmen biological investigations. Metabolic analysis using FT-IR spectrometry. Objectives. - The perfecting of analytical techniques adapted to biological sportsmen monitoring is more than ever become a necessity. Methods. - We have assessed the analytical potential of an emerging technique, fourier-transform infrared spectromet~ which is acurate, precise, reproducible and above all global. Results and conclusions. - We have obtained the clinical validation of new serum analytical methods, performed from microsamples (50 #L capillary blood), allowing to foresee their application for sportsmen biological monitoring. @ 2000 E-ditions scientifiques et m6dicales Elsevier SAS FT-IR spectrometry / serum / metabolism / methods
Les d 6 v e l o p p e m e n t s r6cents des besoins dans le d o m a i n e de la b i o l o g i e et de la m d d e c i n e du sport i m p o s e n t la m i s e en oeuvre de n o u v e l l e s m6thodes d ' a n a l y s e des 6chantillons biologiques. Ces mdthodes d e v r o n t r6pondre aux carences des pr6c6dentes, c'est-~-dire :
-
m a n q u e de certitude quant ~t la validit6 du r6sultat ; impossibilit6 de rdutiliser les donn6es analytiques ; cofit dlev6 d ' a n a l y s e ; inconfort du sportif soumis aux prdlOvements ; a p p r o c h e diagnostique non globale.
*Correspondance et tir~s &part : G. Dfildris, 6quipe de chimie bio-organique, Inserm U 443, universit6 Victor Segalen Bordeaux 2, 146, rue Ldo-Saignat,
33076 Bordeaux.
96
c. Petibois et al. 0,15
~!~i~~i~'~~!i!'i~
:i30
0 1300
~ 1203
1107
1011
914
Nombre d'ondes (em-1)
SYNTH]~SE DES FAITS
Dans le domaine microbiologique, il a 6t6 d6montr6 qu'une technique 6mergente, la spectrom6trie infrarouge transformde de Fourier (IR-TF), est sensible, prdcise, reproductible et surtout globale [3].
Figure 1. Spectre infrarouge de s6rum pour la zone d'absorption 1 300900 cm -1. Le pic sp6cifique du glucose (Glc ~ 1 033 cm -1) permet sa quantification et la soustraction de son absorption dans le spectre global. La soustraction de l'absorption du lactate (La- a 1 127 cm -l) laisse appara~tre un pic sp6cifique du glyc6rol (IFP h 1 110 cm 2).
Utilisations de la spectrom~trie IR-TF
Le spectre IR-TF d'une moldcule donn6e, lorsqu'on fait varier la longueur d'onde du rayon infrarouge, est compos6 de l'ensemble des bandes d'absorption de ses liaisons atomiques, lesquelles vibrent sous l'influence du faisceau (tableau I). Le spectre d'un 6chantillon biologique complexe est donc la superposition des spectres de toutes les biomoldcules en pr6sence (aspect qualitatif), en fonction de leurs concentrations respectives (aspect quantitatif). Le dosage d'une mol6cule donn6e dans un 6chantillon est envisageable car, la structure d'une mol6cule 6tant par ddfinition unique, son spectre IR-TF l'est aussi. Toutes les mol6cules organiques absorbent dans le moyen infrarouge (4 000-500 cm -1) et sont donc potentiellement apparentes dans le spectre. Cependant, les dosages effectu6s jusqu'h pr6sent ont toujours eu recours h l'utilisation d'dtalons internes et/ou ~ certaines manipulations de l'6chantillon [1], lesquels demeuraient n6cessaires avant de pouvoir obtenir un r6sultat en accord avec celni d'une analyse clinique de r6f6rence. Nous avons pu r6duire les manipulations de l'6chantillon (sdrum) h une dilution dans de l'eau (1/4 ; v/v) et h sa dessiccation avant analyse [2]. Ceci permet d'analyser l'6chantillon sans alt6rer sa composition chimique. Un intdret majeur de cette technique est la sauvegarde des donn6es spectrales brutes, ce qui permet d'analyser ou de v6rifier des r6sultats d'analyse h tout moment, comme si le pr61bvement venait d'etre effectual. Le dosage de concentrations m~taboliques
AprSs acquisition des donndes spectrales brutes, la m6thode comporte les 6tapes suivantes : - mettre en lumiSre un pic spdcifique d'un m6tabolite donn6 ~ la surface du spectre ;
- calculer l'absorption de ce mdtabolite en solution ; - int6grer la surface du pic de ce mdtabolite darts le spectre de sdrum pour en d6terminer l'absorption ; - utiliser ces deux derniers r6sultats pour ddterminer la concentration du mdtabolite dans l'6chantillon analys6 [2]. Ensuite, on pourra soustraire l'absorption de ce m6tabolite au spectre global afin de laisser apparaitre d'6ventuelles nouvelles absorptions, lesquelles permettront la ddtermination de nouvelles concentrations. La figure 1 pr6sente la d6termination de la glyc6mie, puis celle de la lactat6mie. Un pic sp6cifique du glycdrol appara~t apr~s soustraction de 1' absorption du lactate. D6terminer les effets m6taboliques de l'exercice
Les spectres IR-TF sauvegardds peuvent etre soustraits pour d6terminer l'6volution des contenus d'un milieu biologique entre deux analyses, ce qui donne un spectre IRTF de diff6rences. Cela permet de s' affranchir des problbmes posds par l'absorption pr6ponddrante des prot6ines dans le spectre IR-TF de s6rum. En effets, les contenus prot6iques du s6rum ne sont pas sujets h des variations aussi rapides que pour d' autres biomol6cules (notamment 6nerg6tiques). Lafigure 2 pr6sente un spectre de diff6rences (exercice-repos). Suite ?~un exercice d'endurance, on notera la diminution de la glyc6mie, 1' augmentation de la lactat6mie, des triglycdrides, des acides gras libres et de l'albumine, vecteur de m6tabolites insolubles essentiels au m6tabolisme musculaire. Diffdrencier les sujets par un profil m6tabolique
Le traitement math6matique et statistique des spectres permet leur diff6renciation sur la base d'un calcul
Nouvelles perspectives pour le suivi biologique des sportifs
0,03
100
Alburnine
:
!
O,O2 TG; AGL
[
97
75
La
o oc-
50
o
= 25
-0,01
4000 3518 3035 2553 2071 1589 1107
625
Nombre d'ondes (cm "1) Figure 2. Spectre IR-TF de diff6rences (spectre de repos soustrait au spectre d'exercice) laissant apparahre les absorptions spdcifiques des triglyc6rides (TG) et des acides gras fibres (AGL) ainsi que celles d6j?~ analysables sur spectres initiaux (La et Glc). Un pic sp6cifique de l'albumine apparait ~t 1 353.6 cm-1.
d'h6t6rogdndit6, selon la m6thode de W a r d [4]. L ' a l g o rithme utilis6 considSre l ' e n s e m b l e des points d ' u n spectre I R - T F (3 630 entre 4 000 et 500 c m -1) c o m m e des variables d6pendantes, faisant ainsi du spectre u n individu. I1 tentera de regrouper les spectres prdsentant la plus grande homog6n6it6 tout en constituant ces groupes de telle manibre q u ' i l s pr6sentent la plus grande h6t6rogdn6it6 entre eux. Ceci peut 8tre rdalis6 sur le spectre global ou sur l ' a b s o r b a n c e majeure d ' u n e liaison c h i m i q u e sp6cifique de certaines families de biomoldcules (tableau I). Un profil m6tabolique c o m p r e n a n t plusieurs r6gions spectrales pourra 8tre construit de telle manibre que l ' o n puisse diff6rencier plus f i n e m e n t plusieurs populations de sujets. La figure 3 p r 6 s e n t e le c l a s s e m e n t des spectres I R - T F du s6rum de repos pour trois populations (diab6tiques, sportifs, contr61es). Le profil m6tabolique utilis6 comprenait la c o m b i n a i s o n des r6gions spectrales suivantes : = CH, CH3, C = O ( A m i d e I) et C-O. CONCLUSION L ' a p p l i c a t i o n de ces m6thodes dans le d o m a i n e sportif est rendue possible car elle ne n6cessite que des micropr61b-
0
Figure 3. Classification des spectres IR-TF du sdrum de repos de 32 patients diabdtiques (*), 32 sujets sains (o) et 32 sportifs entra~n6sen endurance (~). Combinaison des bandes d'absorption des = CH, CH3, C = O (Amide 1) et C-O.
v e m e n t s (50 p L de sang capillaire), c'est-~-dire q u ' e l l e est peu invasive et q u ' e l l e respecte au m i e u x le confort de l'athl~te. U n e analyse m 6 t a b o l i q u e peut 8tre effectu6e avec la possibilit6 d ' u n e classification des groupes de sujets tout en conservant les donndes analytiques brutes en vue de nouvelles analyses ou comparaisons. I1 apparait que cette technique est ~tmSme de r6pondre aux exigences de la biologie du sport, n o t a m m e n t pour la pr6vention du surentra~nement, la nutrition et le contr61e de sant6 des athl6tes. RI~F£RENCES
1 Budinova G, Salva J, Volka K. Application of moiecular spectroscopy in the mid-infrared region to the determination of glucose and cholesterol in whole blood and in blood serum. Appl Spectroscopy 1997 ; 51 : 631-5. 2 Petibois C, Rigalleau V, Melin AM, Perromat A, Cazorla G, Gin H, et al. Determination of glucose in dried serum samples by Fouriertransform infrared spectroscopy. Clin Chem 1999 ; 45 : 1530-5. 3 Sockalingum GD, Bouhedia W, Pina R Allouch R Bloy C, Manfait M. FT-IR spectroscopy as an emerging method for rapid caracterization of microorganisms. Cell Mol Biol 1998 ; 44 : 261-9. 4 Ward JH. Hierarchical grouping to optimize an objective function. J Am Statist Assoc 1963 ; 58 : 236-44.