O3-9 Transfert de gènes dans les cellules CD34+ à l'aide de vecteurs non viraux de type phosphonolipides

Session 3 - Th6rapies cellulaires : pr6paration, assurance de la qualit6 des produits et grands domaines d'application au chromosome X est une pathologie ,~ m o d b l e , pour le d6veloppement de cette nouvelle th6rapeutique, mais c'est aussi un exemple important d'6tude de la diff6renciation lymphoide du syst6me h6matopoi6tique humain. I1 se caract6rise par un d6ficit de diff6renciation des lymphocytes T et Natural Killer (NK) et nous avons r6cemment d6montr6 la possibilit6 in vitro de restaurer la diff6renciation de ces deux lign6es absentes par transfert du gbne responsable (chaine yc du r6cepteur de l'IL-2) dans les cellules CD34+ grace ~ un r6trovirus d6fectif. ,~ partir de ces r~sultats, nous avons essay6 de mettre au point un protocole clinique en exploitant comme g6ne reporteur, la mol6cule CD2 murine. l'issue de trois cycles d'infection et en pr6sence du surnageant r6troviral, 35 % des cellules CD34 expriment le transg~ne ~ leur surface. Ces cellules ont 6t~ 6tudi6es ~ long terme en milieu liquide pendant 4 ~ 6 semaines et dans les trois syst6mes de diff6renciation lymphoides T, B e t NK. Apr6s 2 mois de culture in vitro, nous avons obtenu la diff6renciation des cellules CD34 en cellules T et NK qui expriment le transg6ne m CD2. I1 serait int6ressant de savoir si ces cellules lymphoides pr~sentent la m~me insertion clonale du transg6ne. Cette 6tude est en cours de v6rification.

63S

topo~6tiques d'origine hurnaine (K562 et TF1). Nous avons utilis6 un plasmide pCMV Luc codant la prot6ine lucif~rase et l'efficacit6 de la transfection a 6t6 d6termin6e par dosage de la lucif6rase par chimiluminescence. Les cellules ont 6t6 analys6es 48 heures et 7 jours apr6s ta transfection. Nous rapportons ici les r6sultats que nous avons observ6s sur des cellules CD34+ obtenues/~ partir de pr616vement de cellules souches p6riph6riques. Deux de nos compos6s ont une ef o ficacit6 de transfert significativement sup6rieure ~ celle obtenue sur ce type de cellules avec des compos6s commerciaux. Bien que l ' u t i l i s a t i o n des vecteurs de synth6se comme agent de transfert conduise a une expression transitoire du gbne transfect6, ces vecteurs peuvent ~tre des outils int6ressants dans des protocoles de th6rapie g~nique visant/t transfecter des cellules CD34+ avec le g6ne MDR1.

P3-1

Comparaison de deux techniques de ddcongdlation des cetlules souches hdmatopoi~tiques sanguines C Boccaccio, L Lino, N Azar, JJ F o u r n e l

03-9

Transfert de g~nes dans les cellules CD34 ÷ I'aide de vecteurs non viraux de type phosphonolipides V Floch 1-3, S Loisel ~, G Le Bolc'h 2, MP Audr6zeG JJ Y a o u a n c 2, JC C16ment 2, H d e s A b b a y e s 2, B M e r c i e r 1, JF A b g r a l P , C F6rec 1 1ETSBO, 46 rue Fdix-Le-Dantec, 29275 Brest ; 2UMR CNRS 6521, UFR Sciences, Brest ; 3service d'hdmatologie, CHU Morvan, Brest L'expression d ' u n e nouvelle information g6n6tique dans les cellules du tissu h6matopo'i6tique, notamment dans les cellules souches CD34+, est l'un des enjeux majeurs de la th6rapie g6nique. Pluripotence et autorenouvellement sont deux propri6t6s de la cellule souche qui font d'elle la cible de choix pour les diff6rentes tentatives de transfert de gbnes en h6matologie. Bien que les vecteurs r6troviraux restent actuellement les plus utilis6s pour le transfert de nouveaux g~nes dans les cellules h6matopoi6tiques, les lipides cationiques demeurent des vecteurs de synthbse int4ressants pour ce type de cellules du fait de leur faible immunog6nicit6. Nous avons d6velopp6 une nouvelle famille de lipides cationiques appel6s phosphonolipides ; 24 mol6cules ont 6t6 synth6tis6es et leur efficacit6 de transfection a, dans un premier temps, 6t6 6tudi6e sur des lign6es cellulaires h6ma-

Transfus Clin Bio11998 ; 5 (Suppl 1)

ETS AP-HP, site transfusionnel Pitid-Salp~tri~re, 47, boulevard de l'h6pital, 75013 Paris Les cellules souches du sang p6riph(~rique (CSP) permettent la reconstitution h6matopoi6tique apr6s traitement my61oablatif chez les patients atteints d'h6mopathie maligne ou de tumeur solide. Les CSP sont pr61ev~es par cytaph6r6se, puis congel6es/~ l'aide d ' u n cryoconservateur (DMSO) et stock6es dans de l'azote liquide. Eltes sont d6congel6es le jour de la greffe, puis, le plus souvent, lav6es pour 61iminer le DMSO. En g6n6ral, la d6cong61ation se fait au bain-marie, mais des contaminations bact6riennes ont 6t6 d6crites au cours de la d6cong61ation du fait de 16sions de la poche de cong61ation, malgr6 une d6sinfection ad6quate d u bain-marie. Pour 6viter cette source de contamination, nous avons compar6 en termes de viabilit6 cellulaire les r6sultats obtenus avec Une d6cong61ation en bain-marie ~ classique ~ et les r6sultats obtenus avec une d6cong61ation en bain-marie sec : d6cong61ateur/~ plasma, Instacool, Thermogenesis. Matdriel et mdthodes : dix produits de cytaph6r~se r6partis en deux poches congel6es et provenant de dix patients diff6rents ont 6t6 d6congel6s. Chacune des deux poches correspondant/~ un m~me produit ont 6t6 d6congel6es en parall6le selon les deux techniques. On a compar6 les r6sultats en termes de viabilit6 (Bleu Trypan), r6cup6ration des cellules nuc166es, r6cup6ration des CFU-GM.