- Email: [email protected]
Ocena apoptozy limfocytów krwi obwodowej u chorych leczonych z powodu raka krtani
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
27
Ocena apoptozy limfocytów krwi obwodowej u chorych leczonych z powodu raka krtani 7KHHYDOXDWLRQRIDSRSWRVLVLQSHULSKHUDOEORRGO\PSKRF\WHV LQODU\QJHDOFDQFHUSDWLHQWV Beata Piechnik13DXOLQD:GRZLDN 0DJGDOHQD:DVLDN 6HEDVWLDQ5DGHM3, Agnieszka Lasota4-DQXV].ODWND1 SUMMARY 7KHODU\QJHDOFDQFHULVWKHPRVWRIWHQFDQFHUDPRQJRWKHUVLQKHDGDQG QHFNUHJLRQ,WRFFXUVPRVWO\DPRQJDQG ,WVGHYHORSPHQW GHSHQGV RQLPPXQRORJLFDOVWDWHRIWKHERG\9LWDOLW\RIWKHLPPXQRORJLFDOV\VWHP FHOOVZDVFRQVLGHUHGGXHWRJURZWKWUHDWPHQWVHQVLWLYLW\DQGSURJQRVLVRI VRPHQHRSODVPV 7KHDLPRIWKLVZRUNZHUHHVWLPDWLRQDQGFRPSDULVRQWKHSKHQRPHQRQRI O\PSKRF\WHV7DQG%DSRSWRVLVLQODU\QJHDOFDQFHUSDWLHQWVWUHDWHGZLWK VXUJHU\DQGUDGLRWKHUDS\ Material and methods:7KHPDWHULDOZHUHSDWLHQWVKRVSLWDOL]HGLQ7KH 'HSDUWPHQWRI2WRODU\QJRORJ\0HGLFDO8QLYHUVLW\RI/XEOLQ7KH\DOOZHUH WUHDWHGZLWKVXUJHU\RUVXUJHU\DQGUDGLRWKHUDS\$SRSWRVLVZDVHVWLPDWHG RQGLIIHUHQWVWDJHVRIWKHWUHDWPHQWSURFHVV$OOVDPSOHVZHUHH[DPLQHGZLWK WKHĠRZF\WRPHWU\PHWKRG7KHFRQWUROJURXSZHUHSDWLHQWVKRVSLWDOL]HG EHFDXVHRIWKHVXVSLFLRQRIWKHDSQHDV\QGURPHZKLFKZDVQijWFRQğUPHG ZLWKSRO\VRPQRJUDSKLFH[DPLQDWLRQ Results:5HVXOWVRIWKLVVWXG\VKRZVLJQLğFDQWO\LQFUHDVLQJSHUFHQWDJHRI SHULSKHUDOEORRGDSRSWRWLF% &' FHOOVFDXVHGE\VXUJLFDOWUHDWPHQW7KH UHVXOWVFRQVLGHULQJUDGLRWKHUDS\VKRZHGGLIIHUHQWLQĠXHQFHRQWKHSKHQRPHQRQ RILPPXQRORJLFDOFHOOVDSRSWRVLVVWLOOWKRVHUHVXOWVZHUHQijWVLJQLğFDQW Conclusions:7KHVXUJLFDOWUHDWPHQWFDXVHVLQFUHDVHGDPRXQWRIDSRSWRWLF SHULSKHUDOEORRGO\PSKRF\WHV
©by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów ļ&KLUXUJöZ*ïRZ\L6]\L Otrzymano/Received: 02.08.2011 Zaakceptowano do druku/Accepted: 10.10.2011 1 Katedra i Klinika Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie 2 .DWHGUDL=DNïDG,PPXQRORJLL.OLQLF]QHM Uniwersytetu Medycznego w Lublinie 3 .DWHGUDL=DNïDG$QDWRPLL3UDZLGïRZHM &]ïRZLHND8QLZHUV\WHWX0HG\F]QHJRZ/XEOLQLH 4 .DWHGUDL=DNïDG2UWRSHGLL6]F]ÚNRZHM Uniwersytetu Medycznego w Lublinie :NïDGSUDF\DXWRUöZ/Authors contribution: :JNROHMQRĂFL Konflikt interesu/Conflicts of interest: $XWRU]\SUDF\QLH]JïDV]DMÈNRQIOLNWXLQWHUHVöZ Adres do korespondencji/ Address for correspondence: LPLÚLQD]ZLVNR Beata Piechnik adres pocztowy: Klinika Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej SPSK4 w Lublinie ul. Jaczewskiego 8, 20-954 Lublin e-mail [email protected]
+DVïDLQGHNVRZH UDNNUWDQLDSRSWR]D Key words:ODU\QJHDOFDQFHUDSRSWRVLV
:VWÚS Rak krtani jest najczęściej występującym nowotworem w obrębie głowy i szyi (ok. 40% wszystkich nowotworów tego rejonu) [1]. W Polsce średni roczny wzrost zachorowań na raka krtani w 2002 r. wyniósł około 2,8% [1]. Zdecydowanie częściej rak krtani występuje u mężczyzn, głównie pomiędzy 55. i 69. rokiem życia [1]. Wśród radykalnych metod leczenia raka krtani wyróżniamy: leczenie chirurgiczne (endoskopowe za pomocą lasera CO2, laryngektomię częściową z dojścia zewnętrznego, laryngektomię całkowitą) i radioterapię. Metody te są często kojarzone, zwłaszcza w stanach wysokozaawansowanych. Wskazania do poszczególnych metod leczenia rozważane są indywidualnie [2–6]. Układ odpornościowy, zwany układem immunologicznym, daje kręgowcom możliwość odróżnienia „swego” od „obcego”, dzięki temu organizm zwalcza infekcje, odrzuca przeszczepy, przeciwstawia się rozwojowi nowotworów. Najważniejszymi komórkami układu odpornościowego są limfocyty T, limfocyty B i komórki 2 W R O D U \ Q J R O R J L D 3 R O V N D W R P Q U V W \ F ] H ñ O X W \
prezentujące antygen limfocytom T; najważniejszymi cząsteczkami są immunoglobuliny i receptory limfocytów T wiążące antygen [15]. Śmierć komórek na drodze apoptozy, także komórek układu odpornościowego, jest rozpatrywana przez wielu autorów w kontekście patogenezy, wrażliwości na leczenie oraz rokowania niektórych nowotworów [11, 15]. Apoptoza jest jedną z form śmierci komórki. Jest to proces czynny, wymagający energii zawartej w ATP. Cały proces wiąże się z aktywacją odpowiednich genów i pojawia się w komórkach asynchronicznie [7–9]. Apoptoza i proliferacja są ściśle ze sobą powiązane i wspólne czynniki regulatorowe oddziałują na oba procesy w zależności od tego, na którym etapie swego cyklu aktualnie znajduje się badana komórka. Proces apoptozy może przebiegać kilkoma molekularnymi drogami: poprzez kaskadę kaspaz, szlakiem mitochondrialnym, poprzez aktywację kaspazy 2. Głównym białkiem regulującym cykl komórkowy jest białko p53.
Otolaryngol Pol 2012; 66 (1): 27-32
28
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Ryc. 1.=DOHĝQRĂFLGRW\F]ÈFHDSRSWRW\F]Q\FKOLPIRF\WöZ% &' SRGF]DVOHF]HQLDRSHUDF\MQHJR ZDUWRĂFLĂUHGQLH LbSU]HG]LDï\XIQRĂFL Fig. 1.'HSHQGLQJRQDSRSWRWLF%FHOOV &' GXULQJVXUJHU\ PHDQYDOXHVD QGFRQğGHQFHLQWHUYDOV
Ryc. 2.=DOHĝQRĂFLGRW\F]ÈFH]PLDQSURFHQWRZHMLORĂFLOLPIRF\WöZ% &' DSRSWRW\F]Q\FKXbSDFMHQWöZ]bUDNLHP NUWDQLRb]ïRĂOLZRĂFLKLVWRORJLF]QHM**SRGF]DVOHF]HQLD RSHUDF\MQHJR ZDUWRĂFLĂUHGQLHLbSU]HG]LDï\XIQRĂFL Fig. 2.'HSHQGLQJRQWKHSHUFHQWDJHRI%FHOOV &' DSR SWRWLFLQSDWLHQWVZLWKODU\QJHDOFDQFHUE\KLVWRORJLF** GXULQJVXUJHU\ PHDQYDOXHVD QGFRQğGHQFHLQWHUYDOV
Białko to może spełniać swoją funkcję dzięki wiązaniu swoistych sekwencji DNA. Gen p53 (i białko) dzięki swoim właściwościom umożliwiającym przerwanie cyklu komórkowego zyskał sobie miano „strażnika genomu” [10, 11]. W regulacji procesu apoptozy dużą rolę pełnią także białka z rodziny Bcl-2. Ze względu na funkcję podzielono je na antyapoptotyczne (Bcl-2, Bcl-x1, Mcl-1), proapoptotyczne (Bax, Bak, Bik, Bim, Bad, Bid). [12]. Należy wspomnieć, że w świetle najnowszych badań białka te mogą zmieniać swoje funkcje w zależności od rodzaju komórek czy obecności określonych czynników zewnętrznych [13, 14]. Celem niniejszej pracy było ocena nasilenia procesu apoptozy limfocytów T i B w trakcie całego procesu leczenia, począwszy od oznaczenia odsetka limfocytów apoptycznych w krwi obwodowej przed operacją, aż po oznaczenie odsetka apoptycznych limfocytów w krwi obwodowej po zakończeniu radioterapii. Zestawiono także nasilenie zjawiska apoptozy na poszczególnych etapach leczenia w zależności od podstawowych cech kliniczno-patologicznych (cecha T, G).
operacji 40% pacjentów skierowano na uzupełniające leczenie radioterapią, a pozostałych 60% poddano obserwacji i badaniom okresowym. Radioterapia polegała na napromienianiu pacjentów dawką 6000 cGy w 30 frakcjach po 2 Gy jednorazowo. Odsetek limfocytów apoptotycznych oznaczano przed rozpoczęciem radioterapii, po pierwszej dawce, w środku radioterapii (po 15 frakcjach, czyli po 3000 cGy) i na końcu radioterapii. Próbki oceniane były następnie za pomocą techniki cytometrii przepływowej. Oceniano limfocyty ze zmniejszonym potencjałem mitochondrialnym DC (apoptotyczne) w poszczególnych subpopulacjach. Uzyskane w powyżej opisany sposób dane, po zakodowaniu zostały poddane analizie statystycznej za pomocą pakietu statystycznego SPSS. Dla wszystkich parametrów sprawdzono zgodność ich rozkładu z rozkładem normalnym za pomocą testu W Shapiro-Wilka. Jako poziom istotności przyjęto a=0,05. Grupę kontrolną stanowiło 21 pacjentów hospitalizowanych z powodu podejrzenia zespołu bezdechów podczas snu, u których badanie polisomnograficzne nie potwierdziło tego schorzenia.
0DWHULDïLbPHWRGD
Wyniki
Grupę badaną stanowiło 30 pacjentów, mężczyzn leczonych w Klinice Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie z powodu raka krtani. Wszyscy pacjenci poddani byli leczeniu operacyjnemu lub leczeniu skojarzonemu: operacja i radioterapia. Leczenie operacyjne polegało na usunięciu krtani i najczęściej operacji węzłowej. Apoptozę w limfocytach krwi obwodowej badano przed zabiegiem, 2 godziny po zabiegu i 24 godziny po zabiegu. Po
Otrzymane wyniki wyjściowego nasilenia zjawiska apoptozy całości limfocytów krwi obwodowej u pacjentów chorych na raka krtani oczekujących na leczenie porównano z nasileniem apoptozy limfocytów krwi obwodowej w grupie kontrolnej. Okazało się, że zarówno średnie nasilenie zjawiska apoptozy, jak i odchylenie standardowe u chorych było większe, natomiast wyniki okazały się istotne statystycznie dla limfocytów B (p=0,003; p<0,05), limfocytów Th (CD3+/4+) (p=0,001; p<0,05). 2 W R O D U \ QJ R O R J L D3 R O V N DW R P Q UV W \ F ] H ñ O X W \
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Ryc. 3.=DOHĝQRĂFLGRW\F]ÈFH]PLDQSURFHQWRZHMLORĂFL OLPIRF\WöZ7K &' DSRSWRW\F]Q\FKXbSDFMHQWöZ ]bUDNLHPNUWDQLRb]ïRĂOLZRĂFLKLVWRORJLF]QHM**SRGF]DV OHF]HQLDRSHUDF\MQHJR ZDUWRĂFLĂUHGQLHLbSU]HG]LDï\XIQRĂFL
Ryc. 4.=DOHĝQRĂFLGRW\F]ÈFH]PLDQSURFHQWRZHMLORĂFL OLPIRF\WöZ7K &' DSRSWRW\F]Q\FKXbSDFMHQWöZ]bUDNLHPNUWDQLRb]DDZDQVRZDQLXPLHMVFRZ\P77SRGF]DV OHF]HQLDRSHUDF\MQHJR ZDUWRĂFLĂUHGQLHLbSU]HG]LDï\XIQRĂFL
Fig. 3.'HSHQGLQJRQWKHSHUFHQWDJHRI7KFHOOV &' DSRSWRWLFLQSDWLHQWVZLWKODU\QJHDOFDQFHUE\KLVWRORJLF** GXULQJVXUJHU\ PHDQYDOXHVD QGFRQğGHQFHLQWHUYDOV
Fig. 4.'HSHQGLQJRQWKHSHUFHQWDJHRI7KFHOOV &' DSRSWRWLFLQSDWLHQWVZLWKODU\QJHDOFDQFHUE\DGYDQFHPHQWRIORFDO 77GXULQJVXUJHU\ PHDQYDOXHVDQGFRQğGHQFHLQWHUYDOV
Ocena zawartości procentowej apoptotycznych limfocytów B (CD19+) w krwi obwodowej pacjentów z rakiem krtani wykazała istotny statystycznie wzrost (p=0,014; p<0,05) odsetka tych limfocytów na poszczególnych etapach badania podczas pobytu pacjentów w Klinice, gdzie byli leczeni operacyjnie. Dane dokumentujące tę zależność zilustrowano na rycinie pierwszej (Ryc. 1.). Analiza zawartości procentowej limfocytów T apoptotycznych w poszczególnych subpopulacjach wykazała wzrost ich odsetka zarówno w subpopulacji limfocytów T h(CD3+/4+) (p=0,127; p>0,05), jak i limfocytów Ts/c(CD3+/8+) (p=0,369; p>0,05), jednak wyniki te nie były istotne statystycznie. Podobnej analizie poddano wyniki badań dotyczące nasilenia zjawiska apoptozy w limfocytach krwi obwodowej pacjentów z rakiem krtani w trakcie radioterapii. Ilość apoptotycznych limfocytów B okazała się wykazywać tendencję wzrostową podczas kolejnych etapów leczenia radioterapią, jednak różnice okazały się nie być istotne statystycznie (p=0,160; p>0,05). Podobne rezultaty, tj. nieistotny statystycznie wzrost odsetka limfocytów apoptotycznych otrzymano w wyniku analizy nasilenia apoptozy w poszczególnych subpopulacjach limfocytów T, zarówno odnośnie do limfocytów T h (CD3+/4+) (p=0,288), jak i Ts/c (CD3+/8+) (p=0,833). Przeanalizowano również zjawisko apoptozy limfocytów krwi obwodowej u pacjentów leczonych operacyjnie z powodu raka krtani w zależności od stopnia złośliwości histologicznej guza (cecha G) oraz stanu zaawansowania miejscowego (cecha T). Grupę badaną podzielono na dwie podgrupy w zależności od występowania cechy G: pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G1 i G2 oraz pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G3. Analizując procentowy udział
apoptotycznych limfocytów w grupie pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G1 i G2 w czasie leczenia operacyjnego, otrzymano istotny statystycznie wzrost odsetka subpopulacji apoptotycznych limfocytów B (CD19+) (p=0,032; p<0,05) i limfocytów T h (CD3+/4+) (p=0,005; p<0,05). Dane opisujące te zależności zilustrowano na rycinie 2 i 3. Podobnej analizie poddano wyniki dotyczące pacjentów z rakiem krtani o stopniu złośliwości histologicznej określanym jako G3. Otrzymane wyniki dotyczące procentowego udziału zarówno apoptotycznych, jak i nieapoptotycznych limfocytów poszczególnych subpopulacji pokazały nieistotny statystyczne wzrost w nasileniu procesu apoptozy na poszczególnych etapach leczenia operacyjnego. Biorąc pod uwagę zaawansowanie miejscowe guza (cecha T), badaną grupę pacjentów podzielono na dwie podgrupy, pacjentów z zaawansowaniem miejscowym T2 i T3 i pacjentów z zaawansowaniem miejscowym T4. Analizując procentowy udział limfocytów apoptotycznych u pacjentów z rakiem krtani o wyjściowym zaawansowaniu T2 i T3 przed zabiegiem operacyjnym, stwierdzono istotny statystycznie większy odsetek apoptotycznych limfocytów T h (CD3+/4+) (p=0,044; p<0,05) w porównaniu z nasileniem zjawiska apoptozy w grupie chorych z rakiem krtani o miejscowym zaawansowaniu T4. Dane opisujące te zależności zilustrowano na rycinie 4. Biorąc pod uwagę nasilenie zjawiska apoptozy na poszczególnych etapach badania podczas leczenia operacyjnego pacjentów z zaawansowaniem miejscowym raka T4, otrzymano istotny statystycznie wzrost odsetka apoptotycznych limfocytów B (CD19+) (p=0,009; p<0,05) oraz limfocytów Ts/c (CD3+/8+) (p=0,048; p<0,05). Dane dokumentujące tę zależność przedstawiono na rycinach 5 i 6.
2 W R O D U \ Q J R O R J L D 3 R O V N D W R P Q U V W \ F ] H ñ O X W \
29
30
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Ryc. 5.=DOHĝQRĂFLGRW\F]ÈFH]PLDQSURFHQWRZHMLORĂFLOLPIRF\WöZ% &' DSRSWRW\F]Q\FKXbSDFMHQWöZ]bUDNLHP NUWDQLRb]DDZDQVRZDQLXPLHMVFRZ\P7SRGF]DVOHF]HQLD RSHUDF\MQHJR ZDUWRĂFLĂUHGQLHLbSU]HG]LDï\XIQRĂFL
Ryc. 6.=DOHĝQRĂFLGRW\F]ÈFH]PLDQSURFHQWRZHMLORĂFL OLPIRF\WöZ7VF &' DSRSWRW\F]Q\FKXbSDFMHQWöZ ]bUDNLHPNUWDQLRb]DDZDQVRZDQLXPLHMVFRZ\P7SRGF]DV OHF]HQLDRSHUDF\MQHJR ZDUWRĂFLĂUHGQLHLbSU]HG]LDï\XIQRĂFL
Fig. 5.'HSHQGLQJRQWKHSHUFHQWDJHRI%FHOOV &' DSRSWRWLF LQSDWLHQWVZLWKODU\QJHDOFDQFHUE\DGYDQFHPHQWRIORFDO7 GXULQJVXUJHU\ PHDQYDOXHVD QGFRQğGHQFHLQWHUYDOV
Fig. 6.'HSHQGLQJRQWKHSHUFHQWDJHRI7VFFHOOV &' DSR SWRWLFLQSDWLHQWVZLWKODU\QJHDOFDQFHUE\DGYDQFHPHQWRIORFDO 7GXULQJVXUJHU\ PHDQYDOXHVDQGFRQğGHQFHLQWHUYDOV
Nasilenie zjawiska apoptozy porównano także w poszczególnych grupach pacjentów z określonym stopniem złośliwości histologicznej guza na kolejnych etapach leczenia operacyjnego. Statystycznie istotnie większy okazał się odsetek apoptotycznych limfocytów Th (CD3+/4+) (p=0,044; p<0,05) badany w 2 godziny po operacji w grupie pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G3 w porównaniu z grupą pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G1 i G2. Analizując zmiany odsetka apoptotycznych limfocytów Ts/c (CD3+/8+) w 24 godziny po operacji, stwierdzono statystycznie istotne większe (p=0,043; p<0,05) nasilenie zjawiska apoptozy pośród pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G3 w porównaniu z grupą pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G1 i G2. Zmiany nasilenia zjawiska apoptozy w poszczególnych subpopulacjach limfocytów krwi obwodowej w grupach pacjentów z różnym stopniem złośliwości histologicznej na określonych etapach leczenia operacyjnego nie były istotne statystycznie (poza opisaną powyżej), choć rysuje się wyraźna tendencja większego nasilenia zjawiska apoptozy w grupie chorych ze stopniem złośliwości G3. Porównanie odsetka apoptotycznych limfocytów B (CD19+) przed zabiegiem w obu badanych grupach złośliwości histologicznej wykazało nieznacznie większe nasilenie zjawiska apoptozy w grupie pacjentów ze stopniem złośliwości G1 i G2. Bardzo zbliżone wartości otrzymano, analizując nasilenie zjawiska apoptozy limfocytów Ts/c (CD3+/8+) z nieznaczną przewagą na korzyść apoptozy w grupie pacjentów ze złośliwością G1 i G2.
limfocytów krwi obwodowej. Okres pomiędzy operacją a radioterapią wynosił średnio 57,9 dnia. Czas ten miał wpływ nie tylko na pełne wygojenie rany, ale także na regenerację układu odpornościowego. Różnice w ilości żywych i umierających limfocytów wynikają z ogólnej równowagi pomiędzy immunosupresją i pobudzeniem odpowiedzi immunologicznej w wyniku rozwijającego się procesu nowotworowego. Odpowiedź przeciwnowotworowa obejmuje zarówno wytwarzanie przeciwciał, jak i mechanizmy komórkowe. [15]. Opisano także wiele mechanizmów immunosupesji wobec komórek guza. Jednym z takich zjawisk jest immunoselekcja prowadząca do niepełnego zniszczenia komórek nowotworowych. Innym jest immunomodulacja polegająca na okresowym zmniejszeniu antygenowości komórek nowotworu. Poza tym mamy także do czynienia z blokowaniem limfocytów efektorowych poprzez wolne antygeny nowotworowe i fragmenty błon komórkowych. Ponadto obserwowano zmniejszenie lub brak ekspresji cząsteczek MHC klasy I (prezentujących antygen limfocytom Tc); dotyczy to szczególnie nowotworów typu nabłonkowego [15]. Wyniki przeprowadzonych badań pokazują wzrost odsetka limfocytów apoptotycznych we krwi obwodowej pod wpływem leczenia operacyjnego w odniesieniu do limfocytów B i subpopulacji limfocytów T (CD3+/4+). Wynikać może to z faktu, że limfocyty CD3+/4+ (pomocnicze) regulują nasilenie odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego (zależną od limfocytów CD19+), stąd otrzymano podobne wyniki badań dotyczące tych populacji limfocytów. Większy odsetek limfocytów B apoptotycznych po 24 godzinach w porównaniu z ich poziomem w 2 godziny po operacji wynika prawdopodobnie z intensywnej aktywacji odpowiedzi immunologicznej humo-
Omówienie Analizując wyniki badań, uwzględniono wpływ leczenia operacyjnego i wpływ radioterapii na zjawisko apoptozy
2 W R O D U \ QJ R O R J L D3 R O V N DW R P Q UV W \ F ] H ñ O X W \
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS ralnej, swoistej, zastępującej systematycznie odpowiedź nieswoistą, szybszą, która zależna jest od limfocytów Tc (CD3+/8+) [25]. W grupie pacjentów z zaawansowaniem miejscowym guza T2/T3 zaobserwowano stopniowy wzrost odsetka limfocytów apoptotycznych w trakcie leczenia operacyjnego, z istotnością statystyczną dotyczącą limfocytów CD3+/4+. W stopniu zaawansowania T4 większe nasilenie zjawiska apoptozy obserwowano po 24 h po operacji i zmiany te były istotne statystycznie dla limfocytów B (CD19+) i limfocytów Ts/c (CD3+/8+). Duża aktywność tych populacji limfocytów wynikać może z pobudzenia przez nie odpowiedzi nieswoistej, związanej z lizą komórek (kompleksy antygen–przeciwciało–dopełniacz) charakterystyczną dla stopnia zaawansowania T4 [15]. Odsetek limfocytów apoptotycznych CD3+/8+ (cytotoksycznych) systematycznie rósł po 2 godzinach po operacji, jak i dalej po 24 godzinach po operacji. Limfocyty CD3+/8+ odpowiadające za nasilenie odpowiedzi komórkowej (niszczącej komórki nieswoiście) ulegają aktywacji pod wpływem operacji, jednocześnie więcej z nich wchodzi na drogę apoptozy. Porównując ze sobą stopień nasilenia zjawiska apoptozy w 2 godziny po operacji w grupach pacjentów chorych na raka o stopniu złośliwości histologicznej G1 i G2 oraz G3, otrzymano wyniki obrazujące większy odsetek limfocytów apoptotycznych w grupie pacjentów o złośliwości G3. Dotyczy to populacji limfocytów CD19+, CD3+/4+. Porównanie zjawiska apoptozy po 24 godzinach w grupach G1 i G2 oraz G3 ukazało większy odsetek limfocytów apoptotycznych w subpopulacji CD3+/CD8+ w grupie pacjentów z rakiem o złośliwości G3. Może to być związane z małym zróżnicowaniem komórek nowotworu, małą ich antygenowością, ale jednocześnie z pobudzeniem odpowiedzi immunologicznej nieswoistej, zależnej od limfocytów Tc/s. Teoretycznie po operacji raka krtani limfocyty Tc (CD3+/8+) powinny wyeliminować pozostałe komórki nowotworowe. Klatka i wsp. [16] obserwowali w swych badaniach wzrost ekspresji bcl-2 na komórkach CD3+/8+ (Ts/c), co prawdopodobnie zapobiega apoptozie tych komórek, stąd biorą one udział w obronie przeciwnowotworowej. Porównując odsetek limfocytów apoptotycznych w grupach o różnym zaawansowaniu miejscowym guza, otrzymano wyniki mówiące o większym nasileniu zjawiska apoptozy w grupie o zaawansowaniu miejscowym określanym jako T2 i T3. Wyniki te dotyczyły limfocytów B (CD19+), limfocytów T h (CD3+/4+), limfocytów Ts/c (CD3+/8+). W 2 godziny po leczeniu operacyjnym uzyskano większe nasilenie zjawiska apoptozy w grupie pacjentów o zaawansowaniu miejscowym T3 w subpopulacji limfocytów T h (CD3+/4+), natomiast w 24 godziny po zabiegu większy odsetek limfocytów apoptotycznych zaobserwowano w grupie pacjentów o zaawansowaniu miejscowym T2+T3. Apoptotycznych limfocytów B więcej było po 24 godzinach po operacji w grupie pacjentów o zaawansowaniu T4. 2 W R O D U \ Q J R O R J L D 3 R O V N D W R P Q U V W \ F ] H ñ O X W \
Ilość apoptotycznych limfocytów Ts/c (CD3+/8+) po 24 godzinach po operacji była porównywalna w każdym zaawansowaniu miejscowym guza. Może to wskazywać na podobne nasilenie odpowiedzi komórkowej, nieswoistej, niezależnie od stopnia zaawansowania miejscowego guza [15]. Analizując wyniki badań nasilenia zjawiska apoptozy w grupie pacjentów poddanych radioterapii, stwierdzono, że apoptoza limfocytów krwi obwodowej u chorych na raka krtani wykazywała tendencję wzrostową wraz ze wzrostem dawki promieniowania. Według Tomaszewskiego [17], kolejne dawki radioterapii wywołują w organizmie i w miejscu działania stan zapalny charakteryzujący się nieswoistym wzrostem liczby krwinek białych (w tym limfocytów) i mobilizacją limfocytów z puli komórek spoczynkowych. Wiadomo więc, że wzrost ilości limfocytów krążących powoduje jednoczesny względny spadek ilości limfocytów apoptotycznych. Dotyczy to limfocytów B (CD19+) i regulujących ich działanie limfocytów T h (CD3+/4+). Każda kolejna dawka promieniowania wywołuje wzrost apoptozy krążących na obwodzie komórek aż do ustalenia stanu równowagi, tak że kolejne dawki promieniowania nie powodują już zwiększenia umieralności komórek ani nie ma też możliwości mobilizacji nowych komórek (ograniczone zasoby puli limfocytów spoczynkowych i możliwości ich powstawania de novo). [15]. Wyniki przeprowadzonych badań pokazują stały, systematyczny wzrost odsetka apoptotycznych komórek Tc (CD3+/8+) w czasie napromieniania danej okolicy ciała. Radioterapia powoduje nie tylko masywny stan zapalny, ale także bezpośredni rozpad komórek nowotworowych. W ten sposób do krążenia systemowego dostaje się wiele antygenów komórkowych, fragmentów komórek rozpoznawanych jako obce. Pobudzają one odpowiedź typu komórkowego, czyli cytotoksyczne limfocyty T (CD3+/8+) [15, 18]. Analizując otrzymane wyniki – ciągły wzrost odsetka limfocytów T (CD3+/8+) apoptotycznych i utrzymanie apoptozy limfocytów T (CD3+/4+) na zbliżonym poziomie począwszy od połowy cyklu radioterapii (od ok 30. dnia) do końca, można przyjąć, że dawka promieniowania powyżej 3000 cGy osłabia odpowiedź immunologiczną. Wymaga to jednak dalszych badań. Podobne wyniki badań otrzymali Taghavi-Dehaghani i wsp. [19]. Badali oni wpływ radioterapii na limfocyty krwi obwodowej u chorych na raka piersi. Według ich badań, apoptoza wczesna niewiele zmieniła się w stosunku do wyjściowej, ale systematycznie rosła wraz ze wzrostem dawki promieniowania. Do podobnych wniosków doszli również Ciu i wsp. Badaniom poddane były limfocyty obwodowe mysie w określonym czasie po naświetleniu całego ciała pojedynczą dawką promieniowania. Naukowcy zaobser-
31
32
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS wowali zależność polegającą na tym, że im większa dawka promieniowania była zastosowana, tym więcej obserwowano apoptotycznych limfocytów [20]. Wiele badań dotyczy zależności pomiędzy nasileniem zjawiska apoptozy a dawką promieniowania i sposobu jej podania. Badania prowadzone przez Meyn i wsp. pokazały, że pięć kolejnych dziennych dawek promieniowania w wysokości 2,5 Gy powoduje większą apoptozę niż dwie dawki promieniowania w wysokości 12,5 Gy podane w ciągu pięciu dni czy też pojedyncza dawka 25 Gy [21]. Badania te sugerują, że radioterapia kumuluje śmierć komórki przez apoptozę proporcjonalnie do ilości frakcji [22]. Zjawiska z pogranicza immunologii i genetyki zachodzące w organizmie pod wpływem rozwoju nowotworu stanowią ciągle ogromne wyzwanie dla naukowców i lekarzy. Konieczne są dalsze badania, które określą nowe możliwości diagnostyki, leczenia czy prognozowania w stosunku do pacjentów chorych na nowotwór.
5.
Janczewski G. (red.). Otolaryngologia praktyczna, t. II, ViaMedica, Gdańsk 2005, s. 507–517.
6.
Jassem J, Kawecki A, Krajewski R, Krzakowski M. Nowotwory nabłonkowe narządów głowy i szyi. W: Krzakowski M. (red.) Zalecenia postępowania diagnostyczno-terapeutycznego w nowotworach złośliwych u dorosłych, Warszawa, 2003, s. 11–35.
7.
Cummings MC, Winterford CM, Walker NI. Apoptosis. Am J Surg Pathol, 1997;21:88–101.
8.
Góra-Tybor J, Robak T. Apoptoza – zaprogramowana śmierć komórki. Post Hig Med Dośw, 1994;48:209–225.
9.
Vaux DL, Strasser A. The Molecular Biology of Apoptosis. Review. Proc Natl Acad Sci, 1996;93:2239–2244.
10. Klatka J. Ocena wartości prognostycznej antygenów p53, bcl2 i syndekanu-1 w raku krtani oraz ich przydatności w charakterystyce odpowiedzi pierwotnych hodowli komórkowych raka krtani na cis-platynę. Rozprawa habilitacyjna. Klinika Otolaryngologii Akademii Medycznej w Lublinie. Lublin 2002. 11. Horst A. Działanie produktów genów przeciwnowotworowych w aspekcie cyklu komórkowego. Postępy Biol Komór-
Wnioski Wydaje się, że zabieg operacyjny powoduje nasilenie zjawiska apoptozy wśród limfocytów krwi obwodowej u chorych leczonych z powodu raka krtani. Leczenie operacyjne nasila zjawisko apoptozy limfocytów T h i Tc/s (CD4+ i CD8+), szczególnie istotne po 24 godzinach po operacji. Wpływ radioterapii na limfocyty krwi obwodowej jest różny w zależności od badanej subpopulacji. Okazało się, że największa ilość limfocytów apoptotycznych w poszczególnych subpopulacjach była w okresie połowy trwania cyklu radioterapii, a następnie utrzymywała się na zbliżonym poziomie. Znaczenie tego zjawiska dla procesu leczenia i regresji nowotworu wymaga dalszych badań. Nasilenie zjawiska apoptozy istotnie rośnie w porównaniu kolejnych etapów leczenia operacyjnego w grupie pacjentów z rakiem o niższym stopniu złośliwości (G1 i G2) i mniejszym zaawansowaniu miejscowym guza (T2 i T3). Nie zaobserwowano tego typu zależności w grupie pacjentów z rakiem krtani o stopniu złośliwości G3 i zaawansowaniu miejscowym T4.
ki, 1993;20:311–329. 12. Qi-Ling L, Abel P, Foster CS, El-Nasir L. Bcl-2: Role in Epithelial Differentiation and Oncogenesis. Hum Pathol, 1996;27:102–110. 13. Rupniewska Z, Bojarska-Junak A. Apoptoza: Przepuszczalność błony mitochondrialnej i rola pelniona przez białka z rodziny Bcl-2. Postępy Hig Med Dośw, 2004;58:538–547. 14. Subramanian T, Chinnadurai G. Pro-apoptotic activity of transiently expressed BCL-2 occurs independent of BAX and BAK. J Cell Biochem. 2003;89:1102–1114. 15. Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek W, Stokłosa W. Immunologia. Nowe wydanie. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2008. 16. Klatka J, Roliński J, Kupisz K, Klonowski S, Skomra D. Expression of bcl-2 Protein in Lymphocytes in Patients with Laryngeal Carcinoma. Eur Arch Otorhinolaryngol, 1999;256:299–302. 17. Tomaszewski JJ. Diagnostyka laboratoryjna. Podręcznik dla studentów medycyny. Wyd. lekarskie PZWL, wyd. III popr. Warszawa 2001. 18. Reed JC. Dysregulation of apoptosis in cancer. J Clin Onkol, 1999;17:2941–2953. 19. Taqhavi-Dehaghani M, Mohammadi S, Ziafazeli T, SardariKermani M. A Study on Differences between Radiation – induced Microniclei and Apoptosis of Lymphocytes in
3,¥0,(11,&7:2 1.
2.
Marchand JL, Luce D, Leclerc A. i wsp. Laryngeal and hypo-
4.
2005;60:938–942.
pharyngeal cancer and occupational exposure to asbestos
20. Cui YF, Gao YB, Yang H, Xiong CQ, Xia GW, Wang DW.
and man-made vitreous fibers: results of a case – control
Apoptosis of Circulating Lymphocytes Induced by Whole
study. Am J Ind Med, 2000;37:581–589.
Body Gamma – irradiation and its Mechanism. J Environ
Becker W, Naumann H, Pflatz R. Choroby uszu nosa i gardła. Bel Corp, Warszawa 1999.
3.
Breast Cancer patients after Radiotherapy. Z. Naturforsch,
Pathol Toxicol Oncol, 1999;18:185–189. 21. Meyn RE, Stephens LC, Hunter NR, Ang KK, Milas L. Re-
Janczewski G, Osuch-Wójcikiewicz E. Rak krtani i gardła
emergence of Apoptotic Cells between Fractionated Doses
dolnego. Medica Press, Bielsko Biała 2002.
in Irradiated Murine Tumors. Int J Radiat Oncol Biol Phys,
Kruk-Zagajewska A, Wierzbicka M, Leszczyńska M, Kordylewska M, Szyfter W. Rozpoznawanie i leczenie raka krtani. Postępy w chirurgii głowy i szyi, 2006;1:5–15.
1994;30:619–624. 22. Verheij M, Bartelink H. Radiation-induced Apoptosis. Cell Tissue Res, 2000;301:133–142. 2 W R O D U \ QJ R O R J L D3 R O V N DW R P Q UV W \ F ] H ñ O X W \
27
Ocena apoptozy limfocytów krwi obwodowej u chorych leczonych z powodu raka krtani 7KHHYDOXDWLRQRIDSRSWRVLVLQSHULSKHUDOEORRGO\PSKRF\WHV LQODU\QJHDOFDQFHUSDWLHQWV Beata Piechnik13DXOLQD:GRZLDN 0DJGDOHQD:DVLDN 6HEDVWLDQ5DGHM3, Agnieszka Lasota4-DQXV].ODWND1 SUMMARY 7KHODU\QJHDOFDQFHULVWKHPRVWRIWHQFDQFHUDPRQJRWKHUVLQKHDGDQG QHFNUHJLRQ,WRFFXUVPRVWO\DPRQJDQG ,WVGHYHORSPHQW GHSHQGV RQLPPXQRORJLFDOVWDWHRIWKHERG\9LWDOLW\RIWKHLPPXQRORJLFDOV\VWHP FHOOVZDVFRQVLGHUHGGXHWRJURZWKWUHDWPHQWVHQVLWLYLW\DQGSURJQRVLVRI VRPHQHRSODVPV 7KHDLPRIWKLVZRUNZHUHHVWLPDWLRQDQGFRPSDULVRQWKHSKHQRPHQRQRI O\PSKRF\WHV7DQG%DSRSWRVLVLQODU\QJHDOFDQFHUSDWLHQWVWUHDWHGZLWK VXUJHU\DQGUDGLRWKHUDS\ Material and methods:7KHPDWHULDOZHUHSDWLHQWVKRVSLWDOL]HGLQ7KH 'HSDUWPHQWRI2WRODU\QJRORJ\0HGLFDO8QLYHUVLW\RI/XEOLQ7KH\DOOZHUH WUHDWHGZLWKVXUJHU\RUVXUJHU\DQGUDGLRWKHUDS\$SRSWRVLVZDVHVWLPDWHG RQGLIIHUHQWVWDJHVRIWKHWUHDWPHQWSURFHVV$OOVDPSOHVZHUHH[DPLQHGZLWK WKHĠRZF\WRPHWU\PHWKRG7KHFRQWUROJURXSZHUHSDWLHQWVKRVSLWDOL]HG EHFDXVHRIWKHVXVSLFLRQRIWKHDSQHDV\QGURPHZKLFKZDVQijWFRQğUPHG ZLWKSRO\VRPQRJUDSKLFH[DPLQDWLRQ Results:5HVXOWVRIWKLVVWXG\VKRZVLJQLğFDQWO\LQFUHDVLQJSHUFHQWDJHRI SHULSKHUDOEORRGDSRSWRWLF% &' FHOOVFDXVHGE\VXUJLFDOWUHDWPHQW7KH UHVXOWVFRQVLGHULQJUDGLRWKHUDS\VKRZHGGLIIHUHQWLQĠXHQFHRQWKHSKHQRPHQRQ RILPPXQRORJLFDOFHOOVDSRSWRVLVVWLOOWKRVHUHVXOWVZHUHQijWVLJQLğFDQW Conclusions:7KHVXUJLFDOWUHDWPHQWFDXVHVLQFUHDVHGDPRXQWRIDSRSWRWLF SHULSKHUDOEORRGO\PSKRF\WHV
©by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów ļ&KLUXUJöZ*ïRZ\L6]\L Otrzymano/Received: 02.08.2011 Zaakceptowano do druku/Accepted: 10.10.2011 1 Katedra i Klinika Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie 2 .DWHGUDL=DNïDG,PPXQRORJLL.OLQLF]QHM Uniwersytetu Medycznego w Lublinie 3 .DWHGUDL=DNïDG$QDWRPLL3UDZLGïRZHM &]ïRZLHND8QLZHUV\WHWX0HG\F]QHJRZ/XEOLQLH 4 .DWHGUDL=DNïDG2UWRSHGLL6]F]ÚNRZHM Uniwersytetu Medycznego w Lublinie :NïDGSUDF\DXWRUöZ/Authors contribution: :JNROHMQRĂFL Konflikt interesu/Conflicts of interest: $XWRU]\SUDF\QLH]JïDV]DMÈNRQIOLNWXLQWHUHVöZ Adres do korespondencji/ Address for correspondence: LPLÚLQD]ZLVNR Beata Piechnik adres pocztowy: Klinika Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej SPSK4 w Lublinie ul. Jaczewskiego 8, 20-954 Lublin e-mail [email protected]
+DVïDLQGHNVRZH UDNNUWDQLDSRSWR]D Key words:ODU\QJHDOFDQFHUDSRSWRVLV
:VWÚS Rak krtani jest najczęściej występującym nowotworem w obrębie głowy i szyi (ok. 40% wszystkich nowotworów tego rejonu) [1]. W Polsce średni roczny wzrost zachorowań na raka krtani w 2002 r. wyniósł około 2,8% [1]. Zdecydowanie częściej rak krtani występuje u mężczyzn, głównie pomiędzy 55. i 69. rokiem życia [1]. Wśród radykalnych metod leczenia raka krtani wyróżniamy: leczenie chirurgiczne (endoskopowe za pomocą lasera CO2, laryngektomię częściową z dojścia zewnętrznego, laryngektomię całkowitą) i radioterapię. Metody te są często kojarzone, zwłaszcza w stanach wysokozaawansowanych. Wskazania do poszczególnych metod leczenia rozważane są indywidualnie [2–6]. Układ odpornościowy, zwany układem immunologicznym, daje kręgowcom możliwość odróżnienia „swego” od „obcego”, dzięki temu organizm zwalcza infekcje, odrzuca przeszczepy, przeciwstawia się rozwojowi nowotworów. Najważniejszymi komórkami układu odpornościowego są limfocyty T, limfocyty B i komórki 2 W R O D U \ Q J R O R J L D 3 R O V N D W R P Q U V W \ F ] H ñ O X W \
prezentujące antygen limfocytom T; najważniejszymi cząsteczkami są immunoglobuliny i receptory limfocytów T wiążące antygen [15]. Śmierć komórek na drodze apoptozy, także komórek układu odpornościowego, jest rozpatrywana przez wielu autorów w kontekście patogenezy, wrażliwości na leczenie oraz rokowania niektórych nowotworów [11, 15]. Apoptoza jest jedną z form śmierci komórki. Jest to proces czynny, wymagający energii zawartej w ATP. Cały proces wiąże się z aktywacją odpowiednich genów i pojawia się w komórkach asynchronicznie [7–9]. Apoptoza i proliferacja są ściśle ze sobą powiązane i wspólne czynniki regulatorowe oddziałują na oba procesy w zależności od tego, na którym etapie swego cyklu aktualnie znajduje się badana komórka. Proces apoptozy może przebiegać kilkoma molekularnymi drogami: poprzez kaskadę kaspaz, szlakiem mitochondrialnym, poprzez aktywację kaspazy 2. Głównym białkiem regulującym cykl komórkowy jest białko p53.
Otolaryngol Pol 2012; 66 (1): 27-32
28
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Ryc. 1.=DOHĝQRĂFLGRW\F]ÈFHDSRSWRW\F]Q\FKOLPIRF\WöZ% &' SRGF]DVOHF]HQLDRSHUDF\MQHJR ZDUWRĂFLĂUHGQLH LbSU]HG]LDï\XIQRĂFL Fig. 1.'HSHQGLQJRQDSRSWRWLF%FHOOV &' GXULQJVXUJHU\ PHDQYDOXHVD QGFRQğGHQFHLQWHUYDOV
Ryc. 2.=DOHĝQRĂFLGRW\F]ÈFH]PLDQSURFHQWRZHMLORĂFLOLPIRF\WöZ% &' DSRSWRW\F]Q\FKXbSDFMHQWöZ]bUDNLHP NUWDQLRb]ïRĂOLZRĂFLKLVWRORJLF]QHM**SRGF]DVOHF]HQLD RSHUDF\MQHJR ZDUWRĂFLĂUHGQLHLbSU]HG]LDï\XIQRĂFL Fig. 2.'HSHQGLQJRQWKHSHUFHQWDJHRI%FHOOV &' DSR SWRWLFLQSDWLHQWVZLWKODU\QJHDOFDQFHUE\KLVWRORJLF** GXULQJVXUJHU\ PHDQYDOXHVD QGFRQğGHQFHLQWHUYDOV
Białko to może spełniać swoją funkcję dzięki wiązaniu swoistych sekwencji DNA. Gen p53 (i białko) dzięki swoim właściwościom umożliwiającym przerwanie cyklu komórkowego zyskał sobie miano „strażnika genomu” [10, 11]. W regulacji procesu apoptozy dużą rolę pełnią także białka z rodziny Bcl-2. Ze względu na funkcję podzielono je na antyapoptotyczne (Bcl-2, Bcl-x1, Mcl-1), proapoptotyczne (Bax, Bak, Bik, Bim, Bad, Bid). [12]. Należy wspomnieć, że w świetle najnowszych badań białka te mogą zmieniać swoje funkcje w zależności od rodzaju komórek czy obecności określonych czynników zewnętrznych [13, 14]. Celem niniejszej pracy było ocena nasilenia procesu apoptozy limfocytów T i B w trakcie całego procesu leczenia, począwszy od oznaczenia odsetka limfocytów apoptycznych w krwi obwodowej przed operacją, aż po oznaczenie odsetka apoptycznych limfocytów w krwi obwodowej po zakończeniu radioterapii. Zestawiono także nasilenie zjawiska apoptozy na poszczególnych etapach leczenia w zależności od podstawowych cech kliniczno-patologicznych (cecha T, G).
operacji 40% pacjentów skierowano na uzupełniające leczenie radioterapią, a pozostałych 60% poddano obserwacji i badaniom okresowym. Radioterapia polegała na napromienianiu pacjentów dawką 6000 cGy w 30 frakcjach po 2 Gy jednorazowo. Odsetek limfocytów apoptotycznych oznaczano przed rozpoczęciem radioterapii, po pierwszej dawce, w środku radioterapii (po 15 frakcjach, czyli po 3000 cGy) i na końcu radioterapii. Próbki oceniane były następnie za pomocą techniki cytometrii przepływowej. Oceniano limfocyty ze zmniejszonym potencjałem mitochondrialnym DC (apoptotyczne) w poszczególnych subpopulacjach. Uzyskane w powyżej opisany sposób dane, po zakodowaniu zostały poddane analizie statystycznej za pomocą pakietu statystycznego SPSS. Dla wszystkich parametrów sprawdzono zgodność ich rozkładu z rozkładem normalnym za pomocą testu W Shapiro-Wilka. Jako poziom istotności przyjęto a=0,05. Grupę kontrolną stanowiło 21 pacjentów hospitalizowanych z powodu podejrzenia zespołu bezdechów podczas snu, u których badanie polisomnograficzne nie potwierdziło tego schorzenia.
0DWHULDïLbPHWRGD
Wyniki
Grupę badaną stanowiło 30 pacjentów, mężczyzn leczonych w Klinice Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie z powodu raka krtani. Wszyscy pacjenci poddani byli leczeniu operacyjnemu lub leczeniu skojarzonemu: operacja i radioterapia. Leczenie operacyjne polegało na usunięciu krtani i najczęściej operacji węzłowej. Apoptozę w limfocytach krwi obwodowej badano przed zabiegiem, 2 godziny po zabiegu i 24 godziny po zabiegu. Po
Otrzymane wyniki wyjściowego nasilenia zjawiska apoptozy całości limfocytów krwi obwodowej u pacjentów chorych na raka krtani oczekujących na leczenie porównano z nasileniem apoptozy limfocytów krwi obwodowej w grupie kontrolnej. Okazało się, że zarówno średnie nasilenie zjawiska apoptozy, jak i odchylenie standardowe u chorych było większe, natomiast wyniki okazały się istotne statystycznie dla limfocytów B (p=0,003; p<0,05), limfocytów Th (CD3+/4+) (p=0,001; p<0,05). 2 W R O D U \ QJ R O R J L D3 R O V N DW R P Q UV W \ F ] H ñ O X W \
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Ryc. 3.=DOHĝQRĂFLGRW\F]ÈFH]PLDQSURFHQWRZHMLORĂFL OLPIRF\WöZ7K &' DSRSWRW\F]Q\FKXbSDFMHQWöZ ]bUDNLHPNUWDQLRb]ïRĂOLZRĂFLKLVWRORJLF]QHM**SRGF]DV OHF]HQLDRSHUDF\MQHJR ZDUWRĂFLĂUHGQLHLbSU]HG]LDï\XIQRĂFL
Ryc. 4.=DOHĝQRĂFLGRW\F]ÈFH]PLDQSURFHQWRZHMLORĂFL OLPIRF\WöZ7K &' DSRSWRW\F]Q\FKXbSDFMHQWöZ]bUDNLHPNUWDQLRb]DDZDQVRZDQLXPLHMVFRZ\P77SRGF]DV OHF]HQLDRSHUDF\MQHJR ZDUWRĂFLĂUHGQLHLbSU]HG]LDï\XIQRĂFL
Fig. 3.'HSHQGLQJRQWKHSHUFHQWDJHRI7KFHOOV &' DSRSWRWLFLQSDWLHQWVZLWKODU\QJHDOFDQFHUE\KLVWRORJLF** GXULQJVXUJHU\ PHDQYDOXHVD QGFRQğGHQFHLQWHUYDOV
Fig. 4.'HSHQGLQJRQWKHSHUFHQWDJHRI7KFHOOV &' DSRSWRWLFLQSDWLHQWVZLWKODU\QJHDOFDQFHUE\DGYDQFHPHQWRIORFDO 77GXULQJVXUJHU\ PHDQYDOXHVDQGFRQğGHQFHLQWHUYDOV
Ocena zawartości procentowej apoptotycznych limfocytów B (CD19+) w krwi obwodowej pacjentów z rakiem krtani wykazała istotny statystycznie wzrost (p=0,014; p<0,05) odsetka tych limfocytów na poszczególnych etapach badania podczas pobytu pacjentów w Klinice, gdzie byli leczeni operacyjnie. Dane dokumentujące tę zależność zilustrowano na rycinie pierwszej (Ryc. 1.). Analiza zawartości procentowej limfocytów T apoptotycznych w poszczególnych subpopulacjach wykazała wzrost ich odsetka zarówno w subpopulacji limfocytów T h(CD3+/4+) (p=0,127; p>0,05), jak i limfocytów Ts/c(CD3+/8+) (p=0,369; p>0,05), jednak wyniki te nie były istotne statystycznie. Podobnej analizie poddano wyniki badań dotyczące nasilenia zjawiska apoptozy w limfocytach krwi obwodowej pacjentów z rakiem krtani w trakcie radioterapii. Ilość apoptotycznych limfocytów B okazała się wykazywać tendencję wzrostową podczas kolejnych etapów leczenia radioterapią, jednak różnice okazały się nie być istotne statystycznie (p=0,160; p>0,05). Podobne rezultaty, tj. nieistotny statystycznie wzrost odsetka limfocytów apoptotycznych otrzymano w wyniku analizy nasilenia apoptozy w poszczególnych subpopulacjach limfocytów T, zarówno odnośnie do limfocytów T h (CD3+/4+) (p=0,288), jak i Ts/c (CD3+/8+) (p=0,833). Przeanalizowano również zjawisko apoptozy limfocytów krwi obwodowej u pacjentów leczonych operacyjnie z powodu raka krtani w zależności od stopnia złośliwości histologicznej guza (cecha G) oraz stanu zaawansowania miejscowego (cecha T). Grupę badaną podzielono na dwie podgrupy w zależności od występowania cechy G: pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G1 i G2 oraz pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G3. Analizując procentowy udział
apoptotycznych limfocytów w grupie pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G1 i G2 w czasie leczenia operacyjnego, otrzymano istotny statystycznie wzrost odsetka subpopulacji apoptotycznych limfocytów B (CD19+) (p=0,032; p<0,05) i limfocytów T h (CD3+/4+) (p=0,005; p<0,05). Dane opisujące te zależności zilustrowano na rycinie 2 i 3. Podobnej analizie poddano wyniki dotyczące pacjentów z rakiem krtani o stopniu złośliwości histologicznej określanym jako G3. Otrzymane wyniki dotyczące procentowego udziału zarówno apoptotycznych, jak i nieapoptotycznych limfocytów poszczególnych subpopulacji pokazały nieistotny statystyczne wzrost w nasileniu procesu apoptozy na poszczególnych etapach leczenia operacyjnego. Biorąc pod uwagę zaawansowanie miejscowe guza (cecha T), badaną grupę pacjentów podzielono na dwie podgrupy, pacjentów z zaawansowaniem miejscowym T2 i T3 i pacjentów z zaawansowaniem miejscowym T4. Analizując procentowy udział limfocytów apoptotycznych u pacjentów z rakiem krtani o wyjściowym zaawansowaniu T2 i T3 przed zabiegiem operacyjnym, stwierdzono istotny statystycznie większy odsetek apoptotycznych limfocytów T h (CD3+/4+) (p=0,044; p<0,05) w porównaniu z nasileniem zjawiska apoptozy w grupie chorych z rakiem krtani o miejscowym zaawansowaniu T4. Dane opisujące te zależności zilustrowano na rycinie 4. Biorąc pod uwagę nasilenie zjawiska apoptozy na poszczególnych etapach badania podczas leczenia operacyjnego pacjentów z zaawansowaniem miejscowym raka T4, otrzymano istotny statystycznie wzrost odsetka apoptotycznych limfocytów B (CD19+) (p=0,009; p<0,05) oraz limfocytów Ts/c (CD3+/8+) (p=0,048; p<0,05). Dane dokumentujące tę zależność przedstawiono na rycinach 5 i 6.
2 W R O D U \ Q J R O R J L D 3 R O V N D W R P Q U V W \ F ] H ñ O X W \
29
30
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Ryc. 5.=DOHĝQRĂFLGRW\F]ÈFH]PLDQSURFHQWRZHMLORĂFLOLPIRF\WöZ% &' DSRSWRW\F]Q\FKXbSDFMHQWöZ]bUDNLHP NUWDQLRb]DDZDQVRZDQLXPLHMVFRZ\P7SRGF]DVOHF]HQLD RSHUDF\MQHJR ZDUWRĂFLĂUHGQLHLbSU]HG]LDï\XIQRĂFL
Ryc. 6.=DOHĝQRĂFLGRW\F]ÈFH]PLDQSURFHQWRZHMLORĂFL OLPIRF\WöZ7VF &' DSRSWRW\F]Q\FKXbSDFMHQWöZ ]bUDNLHPNUWDQLRb]DDZDQVRZDQLXPLHMVFRZ\P7SRGF]DV OHF]HQLDRSHUDF\MQHJR ZDUWRĂFLĂUHGQLHLbSU]HG]LDï\XIQRĂFL
Fig. 5.'HSHQGLQJRQWKHSHUFHQWDJHRI%FHOOV &' DSRSWRWLF LQSDWLHQWVZLWKODU\QJHDOFDQFHUE\DGYDQFHPHQWRIORFDO7 GXULQJVXUJHU\ PHDQYDOXHVD QGFRQğGHQFHLQWHUYDOV
Fig. 6.'HSHQGLQJRQWKHSHUFHQWDJHRI7VFFHOOV &' DSR SWRWLFLQSDWLHQWVZLWKODU\QJHDOFDQFHUE\DGYDQFHPHQWRIORFDO 7GXULQJVXUJHU\ PHDQYDOXHVDQGFRQğGHQFHLQWHUYDOV
Nasilenie zjawiska apoptozy porównano także w poszczególnych grupach pacjentów z określonym stopniem złośliwości histologicznej guza na kolejnych etapach leczenia operacyjnego. Statystycznie istotnie większy okazał się odsetek apoptotycznych limfocytów Th (CD3+/4+) (p=0,044; p<0,05) badany w 2 godziny po operacji w grupie pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G3 w porównaniu z grupą pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G1 i G2. Analizując zmiany odsetka apoptotycznych limfocytów Ts/c (CD3+/8+) w 24 godziny po operacji, stwierdzono statystycznie istotne większe (p=0,043; p<0,05) nasilenie zjawiska apoptozy pośród pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G3 w porównaniu z grupą pacjentów z rakiem o stopniu złośliwości G1 i G2. Zmiany nasilenia zjawiska apoptozy w poszczególnych subpopulacjach limfocytów krwi obwodowej w grupach pacjentów z różnym stopniem złośliwości histologicznej na określonych etapach leczenia operacyjnego nie były istotne statystycznie (poza opisaną powyżej), choć rysuje się wyraźna tendencja większego nasilenia zjawiska apoptozy w grupie chorych ze stopniem złośliwości G3. Porównanie odsetka apoptotycznych limfocytów B (CD19+) przed zabiegiem w obu badanych grupach złośliwości histologicznej wykazało nieznacznie większe nasilenie zjawiska apoptozy w grupie pacjentów ze stopniem złośliwości G1 i G2. Bardzo zbliżone wartości otrzymano, analizując nasilenie zjawiska apoptozy limfocytów Ts/c (CD3+/8+) z nieznaczną przewagą na korzyść apoptozy w grupie pacjentów ze złośliwością G1 i G2.
limfocytów krwi obwodowej. Okres pomiędzy operacją a radioterapią wynosił średnio 57,9 dnia. Czas ten miał wpływ nie tylko na pełne wygojenie rany, ale także na regenerację układu odpornościowego. Różnice w ilości żywych i umierających limfocytów wynikają z ogólnej równowagi pomiędzy immunosupresją i pobudzeniem odpowiedzi immunologicznej w wyniku rozwijającego się procesu nowotworowego. Odpowiedź przeciwnowotworowa obejmuje zarówno wytwarzanie przeciwciał, jak i mechanizmy komórkowe. [15]. Opisano także wiele mechanizmów immunosupesji wobec komórek guza. Jednym z takich zjawisk jest immunoselekcja prowadząca do niepełnego zniszczenia komórek nowotworowych. Innym jest immunomodulacja polegająca na okresowym zmniejszeniu antygenowości komórek nowotworu. Poza tym mamy także do czynienia z blokowaniem limfocytów efektorowych poprzez wolne antygeny nowotworowe i fragmenty błon komórkowych. Ponadto obserwowano zmniejszenie lub brak ekspresji cząsteczek MHC klasy I (prezentujących antygen limfocytom Tc); dotyczy to szczególnie nowotworów typu nabłonkowego [15]. Wyniki przeprowadzonych badań pokazują wzrost odsetka limfocytów apoptotycznych we krwi obwodowej pod wpływem leczenia operacyjnego w odniesieniu do limfocytów B i subpopulacji limfocytów T (CD3+/4+). Wynikać może to z faktu, że limfocyty CD3+/4+ (pomocnicze) regulują nasilenie odpowiedzi immunologicznej typu humoralnego (zależną od limfocytów CD19+), stąd otrzymano podobne wyniki badań dotyczące tych populacji limfocytów. Większy odsetek limfocytów B apoptotycznych po 24 godzinach w porównaniu z ich poziomem w 2 godziny po operacji wynika prawdopodobnie z intensywnej aktywacji odpowiedzi immunologicznej humo-
Omówienie Analizując wyniki badań, uwzględniono wpływ leczenia operacyjnego i wpływ radioterapii na zjawisko apoptozy
2 W R O D U \ QJ R O R J L D3 R O V N DW R P Q UV W \ F ] H ñ O X W \
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS ralnej, swoistej, zastępującej systematycznie odpowiedź nieswoistą, szybszą, która zależna jest od limfocytów Tc (CD3+/8+) [25]. W grupie pacjentów z zaawansowaniem miejscowym guza T2/T3 zaobserwowano stopniowy wzrost odsetka limfocytów apoptotycznych w trakcie leczenia operacyjnego, z istotnością statystyczną dotyczącą limfocytów CD3+/4+. W stopniu zaawansowania T4 większe nasilenie zjawiska apoptozy obserwowano po 24 h po operacji i zmiany te były istotne statystycznie dla limfocytów B (CD19+) i limfocytów Ts/c (CD3+/8+). Duża aktywność tych populacji limfocytów wynikać może z pobudzenia przez nie odpowiedzi nieswoistej, związanej z lizą komórek (kompleksy antygen–przeciwciało–dopełniacz) charakterystyczną dla stopnia zaawansowania T4 [15]. Odsetek limfocytów apoptotycznych CD3+/8+ (cytotoksycznych) systematycznie rósł po 2 godzinach po operacji, jak i dalej po 24 godzinach po operacji. Limfocyty CD3+/8+ odpowiadające za nasilenie odpowiedzi komórkowej (niszczącej komórki nieswoiście) ulegają aktywacji pod wpływem operacji, jednocześnie więcej z nich wchodzi na drogę apoptozy. Porównując ze sobą stopień nasilenia zjawiska apoptozy w 2 godziny po operacji w grupach pacjentów chorych na raka o stopniu złośliwości histologicznej G1 i G2 oraz G3, otrzymano wyniki obrazujące większy odsetek limfocytów apoptotycznych w grupie pacjentów o złośliwości G3. Dotyczy to populacji limfocytów CD19+, CD3+/4+. Porównanie zjawiska apoptozy po 24 godzinach w grupach G1 i G2 oraz G3 ukazało większy odsetek limfocytów apoptotycznych w subpopulacji CD3+/CD8+ w grupie pacjentów z rakiem o złośliwości G3. Może to być związane z małym zróżnicowaniem komórek nowotworu, małą ich antygenowością, ale jednocześnie z pobudzeniem odpowiedzi immunologicznej nieswoistej, zależnej od limfocytów Tc/s. Teoretycznie po operacji raka krtani limfocyty Tc (CD3+/8+) powinny wyeliminować pozostałe komórki nowotworowe. Klatka i wsp. [16] obserwowali w swych badaniach wzrost ekspresji bcl-2 na komórkach CD3+/8+ (Ts/c), co prawdopodobnie zapobiega apoptozie tych komórek, stąd biorą one udział w obronie przeciwnowotworowej. Porównując odsetek limfocytów apoptotycznych w grupach o różnym zaawansowaniu miejscowym guza, otrzymano wyniki mówiące o większym nasileniu zjawiska apoptozy w grupie o zaawansowaniu miejscowym określanym jako T2 i T3. Wyniki te dotyczyły limfocytów B (CD19+), limfocytów T h (CD3+/4+), limfocytów Ts/c (CD3+/8+). W 2 godziny po leczeniu operacyjnym uzyskano większe nasilenie zjawiska apoptozy w grupie pacjentów o zaawansowaniu miejscowym T3 w subpopulacji limfocytów T h (CD3+/4+), natomiast w 24 godziny po zabiegu większy odsetek limfocytów apoptotycznych zaobserwowano w grupie pacjentów o zaawansowaniu miejscowym T2+T3. Apoptotycznych limfocytów B więcej było po 24 godzinach po operacji w grupie pacjentów o zaawansowaniu T4. 2 W R O D U \ Q J R O R J L D 3 R O V N D W R P Q U V W \ F ] H ñ O X W \
Ilość apoptotycznych limfocytów Ts/c (CD3+/8+) po 24 godzinach po operacji była porównywalna w każdym zaawansowaniu miejscowym guza. Może to wskazywać na podobne nasilenie odpowiedzi komórkowej, nieswoistej, niezależnie od stopnia zaawansowania miejscowego guza [15]. Analizując wyniki badań nasilenia zjawiska apoptozy w grupie pacjentów poddanych radioterapii, stwierdzono, że apoptoza limfocytów krwi obwodowej u chorych na raka krtani wykazywała tendencję wzrostową wraz ze wzrostem dawki promieniowania. Według Tomaszewskiego [17], kolejne dawki radioterapii wywołują w organizmie i w miejscu działania stan zapalny charakteryzujący się nieswoistym wzrostem liczby krwinek białych (w tym limfocytów) i mobilizacją limfocytów z puli komórek spoczynkowych. Wiadomo więc, że wzrost ilości limfocytów krążących powoduje jednoczesny względny spadek ilości limfocytów apoptotycznych. Dotyczy to limfocytów B (CD19+) i regulujących ich działanie limfocytów T h (CD3+/4+). Każda kolejna dawka promieniowania wywołuje wzrost apoptozy krążących na obwodzie komórek aż do ustalenia stanu równowagi, tak że kolejne dawki promieniowania nie powodują już zwiększenia umieralności komórek ani nie ma też możliwości mobilizacji nowych komórek (ograniczone zasoby puli limfocytów spoczynkowych i możliwości ich powstawania de novo). [15]. Wyniki przeprowadzonych badań pokazują stały, systematyczny wzrost odsetka apoptotycznych komórek Tc (CD3+/8+) w czasie napromieniania danej okolicy ciała. Radioterapia powoduje nie tylko masywny stan zapalny, ale także bezpośredni rozpad komórek nowotworowych. W ten sposób do krążenia systemowego dostaje się wiele antygenów komórkowych, fragmentów komórek rozpoznawanych jako obce. Pobudzają one odpowiedź typu komórkowego, czyli cytotoksyczne limfocyty T (CD3+/8+) [15, 18]. Analizując otrzymane wyniki – ciągły wzrost odsetka limfocytów T (CD3+/8+) apoptotycznych i utrzymanie apoptozy limfocytów T (CD3+/4+) na zbliżonym poziomie począwszy od połowy cyklu radioterapii (od ok 30. dnia) do końca, można przyjąć, że dawka promieniowania powyżej 3000 cGy osłabia odpowiedź immunologiczną. Wymaga to jednak dalszych badań. Podobne wyniki badań otrzymali Taghavi-Dehaghani i wsp. [19]. Badali oni wpływ radioterapii na limfocyty krwi obwodowej u chorych na raka piersi. Według ich badań, apoptoza wczesna niewiele zmieniła się w stosunku do wyjściowej, ale systematycznie rosła wraz ze wzrostem dawki promieniowania. Do podobnych wniosków doszli również Ciu i wsp. Badaniom poddane były limfocyty obwodowe mysie w określonym czasie po naświetleniu całego ciała pojedynczą dawką promieniowania. Naukowcy zaobser-
31
32
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS wowali zależność polegającą na tym, że im większa dawka promieniowania była zastosowana, tym więcej obserwowano apoptotycznych limfocytów [20]. Wiele badań dotyczy zależności pomiędzy nasileniem zjawiska apoptozy a dawką promieniowania i sposobu jej podania. Badania prowadzone przez Meyn i wsp. pokazały, że pięć kolejnych dziennych dawek promieniowania w wysokości 2,5 Gy powoduje większą apoptozę niż dwie dawki promieniowania w wysokości 12,5 Gy podane w ciągu pięciu dni czy też pojedyncza dawka 25 Gy [21]. Badania te sugerują, że radioterapia kumuluje śmierć komórki przez apoptozę proporcjonalnie do ilości frakcji [22]. Zjawiska z pogranicza immunologii i genetyki zachodzące w organizmie pod wpływem rozwoju nowotworu stanowią ciągle ogromne wyzwanie dla naukowców i lekarzy. Konieczne są dalsze badania, które określą nowe możliwości diagnostyki, leczenia czy prognozowania w stosunku do pacjentów chorych na nowotwór.
5.
Janczewski G. (red.). Otolaryngologia praktyczna, t. II, ViaMedica, Gdańsk 2005, s. 507–517.
6.
Jassem J, Kawecki A, Krajewski R, Krzakowski M. Nowotwory nabłonkowe narządów głowy i szyi. W: Krzakowski M. (red.) Zalecenia postępowania diagnostyczno-terapeutycznego w nowotworach złośliwych u dorosłych, Warszawa, 2003, s. 11–35.
7.
Cummings MC, Winterford CM, Walker NI. Apoptosis. Am J Surg Pathol, 1997;21:88–101.
8.
Góra-Tybor J, Robak T. Apoptoza – zaprogramowana śmierć komórki. Post Hig Med Dośw, 1994;48:209–225.
9.
Vaux DL, Strasser A. The Molecular Biology of Apoptosis. Review. Proc Natl Acad Sci, 1996;93:2239–2244.
10. Klatka J. Ocena wartości prognostycznej antygenów p53, bcl2 i syndekanu-1 w raku krtani oraz ich przydatności w charakterystyce odpowiedzi pierwotnych hodowli komórkowych raka krtani na cis-platynę. Rozprawa habilitacyjna. Klinika Otolaryngologii Akademii Medycznej w Lublinie. Lublin 2002. 11. Horst A. Działanie produktów genów przeciwnowotworowych w aspekcie cyklu komórkowego. Postępy Biol Komór-
Wnioski Wydaje się, że zabieg operacyjny powoduje nasilenie zjawiska apoptozy wśród limfocytów krwi obwodowej u chorych leczonych z powodu raka krtani. Leczenie operacyjne nasila zjawisko apoptozy limfocytów T h i Tc/s (CD4+ i CD8+), szczególnie istotne po 24 godzinach po operacji. Wpływ radioterapii na limfocyty krwi obwodowej jest różny w zależności od badanej subpopulacji. Okazało się, że największa ilość limfocytów apoptotycznych w poszczególnych subpopulacjach była w okresie połowy trwania cyklu radioterapii, a następnie utrzymywała się na zbliżonym poziomie. Znaczenie tego zjawiska dla procesu leczenia i regresji nowotworu wymaga dalszych badań. Nasilenie zjawiska apoptozy istotnie rośnie w porównaniu kolejnych etapów leczenia operacyjnego w grupie pacjentów z rakiem o niższym stopniu złośliwości (G1 i G2) i mniejszym zaawansowaniu miejscowym guza (T2 i T3). Nie zaobserwowano tego typu zależności w grupie pacjentów z rakiem krtani o stopniu złośliwości G3 i zaawansowaniu miejscowym T4.
ki, 1993;20:311–329. 12. Qi-Ling L, Abel P, Foster CS, El-Nasir L. Bcl-2: Role in Epithelial Differentiation and Oncogenesis. Hum Pathol, 1996;27:102–110. 13. Rupniewska Z, Bojarska-Junak A. Apoptoza: Przepuszczalność błony mitochondrialnej i rola pelniona przez białka z rodziny Bcl-2. Postępy Hig Med Dośw, 2004;58:538–547. 14. Subramanian T, Chinnadurai G. Pro-apoptotic activity of transiently expressed BCL-2 occurs independent of BAX and BAK. J Cell Biochem. 2003;89:1102–1114. 15. Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek W, Stokłosa W. Immunologia. Nowe wydanie. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2008. 16. Klatka J, Roliński J, Kupisz K, Klonowski S, Skomra D. Expression of bcl-2 Protein in Lymphocytes in Patients with Laryngeal Carcinoma. Eur Arch Otorhinolaryngol, 1999;256:299–302. 17. Tomaszewski JJ. Diagnostyka laboratoryjna. Podręcznik dla studentów medycyny. Wyd. lekarskie PZWL, wyd. III popr. Warszawa 2001. 18. Reed JC. Dysregulation of apoptosis in cancer. J Clin Onkol, 1999;17:2941–2953. 19. Taqhavi-Dehaghani M, Mohammadi S, Ziafazeli T, SardariKermani M. A Study on Differences between Radiation – induced Microniclei and Apoptosis of Lymphocytes in
3,¥0,(11,&7:2 1.
2.
Marchand JL, Luce D, Leclerc A. i wsp. Laryngeal and hypo-
4.
2005;60:938–942.
pharyngeal cancer and occupational exposure to asbestos
20. Cui YF, Gao YB, Yang H, Xiong CQ, Xia GW, Wang DW.
and man-made vitreous fibers: results of a case – control
Apoptosis of Circulating Lymphocytes Induced by Whole
study. Am J Ind Med, 2000;37:581–589.
Body Gamma – irradiation and its Mechanism. J Environ
Becker W, Naumann H, Pflatz R. Choroby uszu nosa i gardła. Bel Corp, Warszawa 1999.
3.
Breast Cancer patients after Radiotherapy. Z. Naturforsch,
Pathol Toxicol Oncol, 1999;18:185–189. 21. Meyn RE, Stephens LC, Hunter NR, Ang KK, Milas L. Re-
Janczewski G, Osuch-Wójcikiewicz E. Rak krtani i gardła
emergence of Apoptotic Cells between Fractionated Doses
dolnego. Medica Press, Bielsko Biała 2002.
in Irradiated Murine Tumors. Int J Radiat Oncol Biol Phys,
Kruk-Zagajewska A, Wierzbicka M, Leszczyńska M, Kordylewska M, Szyfter W. Rozpoznawanie i leczenie raka krtani. Postępy w chirurgii głowy i szyi, 2006;1:5–15.
1994;30:619–624. 22. Verheij M, Bartelink H. Radiation-induced Apoptosis. Cell Tissue Res, 2000;301:133–142. 2 W R O D U \ QJ R O R J L D3 R O V N DW R P Q UV W \ F ] H ñ O X W \