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P150 Stratégie de génotypage pour détecter les recombinaisons non-spécifiques dans le système Cre-Lox: exemples des souches RIP-CRE et aP2-CRE
SFD
sensibilité à l’insuline, le profil inflammatoire/immunitaire au niveau systémique/tissulaire, chez des sujets obèses. Matériels et méthodes Mesure systémique et tissulaire (TA, TM) de la sensibilité à l’insuline, du profil inflammatoire/immunitaire chez 30 femmes ménopausées (10 sujets contrôles CT, IMC : 18,5-25 kg/m² et 20 sujets obèses IMC > 30 kg/m²) sans antécédent familiaux de diabète de type 2. Résultats Les volontaires obèses ont été classées comme obèses insulinosensibles (OIS) ou insulinorésistantes (OIR) selon leur HOMAIR et leur GIR (glucose infusion rate). Nos résultats montrent que : 1/ la production d’adipokines/ cytokines est identique entre les OIS et les OIR, au niveau systémique et tissulaire, 2/ la sensibilité à l’insuline dans le TA est identique entre les CT, OIS et OIR, 3/ la sensibilité à l’insuline dans le TM est significativement diminuée chez les OIR par rapport aux CT et OIS. Elle est associée à une activation de la voie TLR4/Myd88/NFκB et une inactivation de la voie TLR4/TLR3/TRIFF/ IRF3, conduisant à une diminution de l’expression de MnSOD. Conclusion Dans notre cohorte de sujets obèses, seul le TM est touché par l’IR. Cette IR musculaire se développe sans inflammation systémique ni tissulaire, mais est associée à une modification de la balance des voies de l’immunité innée Myd88/TRIF. Ces résultats mettent en exergue l’importance de l’immunité innée dans la régulation de la sensibilité à l’insuline. Déclaration d’intérêt Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêt direct ou indirect (financier ou en nature) avec un organisme privé, industriel ou commercial en relation avec le sujet présenté.
P148 Phénotypes variables de glucorégulation dans une insulinorésistance familiale liée à une mutation du récepteur à l’insuline J.-F. Brun*,1, C. Fédou1, S. Tadic1, O. Lascols2, E. Raynaud De Mauverger1, J. Mercier1 1 2
Physiologie clinique, INSERM U1046, Montpellier, France, Génétique moléculaire, Hôpital Saint-Antoine, Paris, France.
*Auteur correspondant : [email protected]
Introduction Nous présentons l’observation de trois membres d’une même famille porteurs de la même mutation du récepteur à l’insuline et qui malgré un même niveau d’insulinorésistance, présentent des phénotypes différents sur le plan de la glucorégulation. Patients et méthodes À l’issue d’un bilan pour hirsutisme et ovaires polykystiques la patiente AU, présentant un tableau d’insulinorésistance sévère, a fait l’objet d’un séquençage de l’ADN sur produits PCR par la technique de Sanger mettant en évidence une mutation hétérozygote (p.Gln1336ArgfsX28) retrouvée également chez sa sœur TI et son père A. Les trois patients ont été explorés par petit déjeuner test standardisé avec analyse mathématique de l’insulino-sensibilité (oral minimal model) et de l’insulino-sécrétion préhépatique reconstituée à partir du C-peptide avec le modèle de Van Cauter et Polonsky, ses composantes (première et deuxième phase Phi1 et Phi2) étant analysées à l’aide des modèles de Cobelli et de Mari. Résultats Bien que les trois sujets présentent le même degré d’insulinorésistance profonde (Insulino-sensibilité SI : A = 0,74 ; TI = 0,19 ; AU = 0,30 min-1/ ( μU/ml) × 10-4), seule TI présente un diabète sucré. Tous trois ont un hyperinsulinisme considérable (Insuline à jeun : A = 44 ; TI = 127 ; AU = 93 μU/ml) qui traduit une forte augmentation de l’insulinosécrétion et notamment de sa phase Phi2 mais si celle-ci maintient efficacement la glycémie chez A et AU, elle n’y parvient plus chez TI. Chez cette dernière on note une valeur basse de potentiation de la réponse au stimulus glucose (0,82 contre 1,51 chez A et 1,48 chez AU), et une clairance périphérique de l’insuline plus élevée (0,36 contre respectivement 0,21 et 0,20 min-1). Conclusion Ces observations montrent qu’une même anomalie génétique peut affecter la glucorégulation à des degrés divers selon l’adaptation de la fonction B-pancréatique qu’il est par ailleurs facile d’analyser avec précision avec les outils actuels d’analyse mathématique de la réponse de C-peptide. Déclaration d’intérêt Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêt direct ou indirect (financier ou en nature) avec un organisme privé, industriel ou commercial en relation avec le sujet présenté.
P149 Pertinence de l’utilisation de différents index d’insulino-sensibilité dans la classification des individus obèses et métaboliquement sains : comparaison au clamp hyperinsulinémique euglycémique J.-P. Bastard*,1, B. Elisha2, R. Rabasa-Lhoret2 1
Service de biochimie et hormonologie et INSERM, Hôpital Tenon, UF bio-marqueurs inflammatoires et métaboliques, UMRS 938, CDR Saint-Antoine, AP-HP, Paris, France, 2 Institut de recherche clinique de Montréal, Université de Montréal, Montréal, Canada.
*Auteur correspondant : [email protected]
Introduction L’existence d’un phénotype de sujets obèses mais métaboliquement sains (MHO) avec une bonne sensibilité à l’insuline et des profils lipidiques et
A70
© 2015. Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
inflammatoires non altérés par opposition aux sujets obèses insulinorésistants (IRO) est maintenant bien admise. L’objectif de l’étude est de déterminer la performance d’index simples d’insuliorésistance (IR) utilisant la glycémie et l’insulinémie à jeun et/ou au cours d’une hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) dans la classification des MHO vs IRO comparée à celle du clamp hyperinsulinémique euglycémique (CHE) considéré comme la méthode de référence. Patients et méthodes Cent soixante-trois femmes post-ménopausées en surpoids ou obèses ont été analysées. Trois index d’IR hépatique (HOMA-IR 1985, Vangipurapu 2012 et Abdul-Ghani 2007), un index d’IR musculaire (Abdul-Ghani 2007) ainsi que deux index plus globaux (ISI-Matsuda 1999 et SIisOGTT 2007) ont été comparés. Les quartiles extrêmes selon chaque index ont été considérés comme IRO ou MHO (n = 41 par groupe). Résultats Selon les résultats du CHE et pour des IMC comparables (MHO 33,0 ± 4,6 kg/m² vs IRO 34,4 ± 4,2 kg/m², p = 0,16), les patientes IRO présentaient significativement plus de gras viscéral (222,7 ± 61,6 vs 181,8 ± 53,9 cm², p = 0,02) ainsi que des glycémies et insulinémies à jeun et à 2 heures, des concentrations circulantes de triglycérides, Apo-B, CRP-us et ALAT significativement plus élevées et un HDL-cholestérol plus bas (p < 0,05) que les MHO. Des résultats similaires étaient obtenus lorsque la classification était faite avec l’index d’IR musculaire et les index globaux ISI-Matsuda et SIisOGTT. En revanche, pour les index d’IR hépatique, l’IMC entre les deux groupes était significativement différent. Conclusion Les index d’IR musculaire et plus globaux dérivés de l’HGPO pourraient constituer une bonne alternative à l’utilisation du CHE pour la classification des patients MHO vs IRO. Déclaration d’intérêt Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêt direct ou indirect (financier ou en nature) avec un organisme privé, industriel ou commercial en relation avec le sujet présenté.
P150 Stratégie de génotypage pour détecter les recombinaisons non-spécifiques dans le système Cre-Lox : exemples des souches RIP-CRE et aP2-CRE A. Tailleux*,1,2,3,4, V. Spinelli1,2,3,4, C. Martin1,2,3,4, E. Dorchies1,2,3,4, E. Vallez1,2,3,4, H. Dehondt1,2,3,4, M.-S. Trabelsi1,2,3,4, S. Caron1,2,3,4, B. Staels1,2,3,4 1
European genomic institute for diabetes (EGID), FR 3508, Lille, France, INSERM UMR1011, Lille, France, 3 Univ Lille 2, Lille, France, 4 Institut Pasteur de Lille, Lille, France. 2
*Auteur correspondant : [email protected]
Introduction L’invalidation conditionnelle in vivo par la stratégie Cre-Lox est un outil puissant pour identifier la fonction d’un gène/d’une protéine spécifiquement dans un tissu ou un type cellulaire donné. Le choix du promoteur guidant l’expression de la recombinase Cre est fondamental pour déterminer la spécificité tissulaire de l’invalidation génique. Cependant, le choix d’un promoteur approprié ne permet pas d’empêcher les recombinaisons non-spécifiques dues au phénomène d’activation non-spécifique du gène codant la Cre dans les tissus non ciblés. Matériels et méthodes Un même gène d’intérêt a été invalidé dans 2 types cellulaires différents (cellule bêta pancréatique et adipocyte) en croisant une souche de souris floxée pour le gène d’intérêt avec respectivement une souche transgénique RIP (Rat Insulin Promoter) -Cre (Tg (Ins2-Cre) 23Herr) et une souche transgénique aP2 (adipocyte protein 2) -Cre (aP2-CreSI). Pour détecter une potentielle recombinaison non-spécifique, une recherche systématique de l’allèle « nul » (allèle floxé et recombiné par la l’enzyme Cre-recombinase) en plus de l’allèle floxé et de l’allèle sauvage a été réalisée par PCR sur l’ADN extrait de biopsie caudale et des principaux tissus métaboliques dans les souris issues des deux élevages. Résultats 1) L’utilisation systématique d’une simple PCR permet de détecter les recombinaisons non-spécifiques dans le génotypage sur biopsie caudale, et ainsi d’éliminer les souris problématiques de l’élevage. 2) Le taux de recombinaison non-spécifique est dépendant de la souche Cre, allant de 5 % (RIPCre, la souche est alors utilisable pour générer les souris invalidées pour le gène d’intérêt) à 100 % (aP2-Cre, rendant la souche inutilisable). 3) L’analyse de l’ADN de différents tissus métabolique (foie, pancréas, tissus adipeux) par la même procédure de PCR montre que lorsque la recombinaison non-spécifique est présente dans l’ADN caudal, elle est retrouvée aussi dans les autres organes analysés. Conclusion Une recherche systématique de recombinaison non-spécifique devrait être mise en œuvre par simple PCR au cours du génotypage dans toutes les souches murines obtenues par ce système. Déclaration d’intérêt Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêt direct ou indirect (financier ou en nature) avec un organisme privé, industriel ou commercial en relation avec le sujet présenté.
sensibilité à l’insuline, le profil inflammatoire/immunitaire au niveau systémique/tissulaire, chez des sujets obèses. Matériels et méthodes Mesure systémique et tissulaire (TA, TM) de la sensibilité à l’insuline, du profil inflammatoire/immunitaire chez 30 femmes ménopausées (10 sujets contrôles CT, IMC : 18,5-25 kg/m² et 20 sujets obèses IMC > 30 kg/m²) sans antécédent familiaux de diabète de type 2. Résultats Les volontaires obèses ont été classées comme obèses insulinosensibles (OIS) ou insulinorésistantes (OIR) selon leur HOMAIR et leur GIR (glucose infusion rate). Nos résultats montrent que : 1/ la production d’adipokines/ cytokines est identique entre les OIS et les OIR, au niveau systémique et tissulaire, 2/ la sensibilité à l’insuline dans le TA est identique entre les CT, OIS et OIR, 3/ la sensibilité à l’insuline dans le TM est significativement diminuée chez les OIR par rapport aux CT et OIS. Elle est associée à une activation de la voie TLR4/Myd88/NFκB et une inactivation de la voie TLR4/TLR3/TRIFF/ IRF3, conduisant à une diminution de l’expression de MnSOD. Conclusion Dans notre cohorte de sujets obèses, seul le TM est touché par l’IR. Cette IR musculaire se développe sans inflammation systémique ni tissulaire, mais est associée à une modification de la balance des voies de l’immunité innée Myd88/TRIF. Ces résultats mettent en exergue l’importance de l’immunité innée dans la régulation de la sensibilité à l’insuline. Déclaration d’intérêt Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêt direct ou indirect (financier ou en nature) avec un organisme privé, industriel ou commercial en relation avec le sujet présenté.
P148 Phénotypes variables de glucorégulation dans une insulinorésistance familiale liée à une mutation du récepteur à l’insuline J.-F. Brun*,1, C. Fédou1, S. Tadic1, O. Lascols2, E. Raynaud De Mauverger1, J. Mercier1 1 2
Physiologie clinique, INSERM U1046, Montpellier, France, Génétique moléculaire, Hôpital Saint-Antoine, Paris, France.
*Auteur correspondant : [email protected]
Introduction Nous présentons l’observation de trois membres d’une même famille porteurs de la même mutation du récepteur à l’insuline et qui malgré un même niveau d’insulinorésistance, présentent des phénotypes différents sur le plan de la glucorégulation. Patients et méthodes À l’issue d’un bilan pour hirsutisme et ovaires polykystiques la patiente AU, présentant un tableau d’insulinorésistance sévère, a fait l’objet d’un séquençage de l’ADN sur produits PCR par la technique de Sanger mettant en évidence une mutation hétérozygote (p.Gln1336ArgfsX28) retrouvée également chez sa sœur TI et son père A. Les trois patients ont été explorés par petit déjeuner test standardisé avec analyse mathématique de l’insulino-sensibilité (oral minimal model) et de l’insulino-sécrétion préhépatique reconstituée à partir du C-peptide avec le modèle de Van Cauter et Polonsky, ses composantes (première et deuxième phase Phi1 et Phi2) étant analysées à l’aide des modèles de Cobelli et de Mari. Résultats Bien que les trois sujets présentent le même degré d’insulinorésistance profonde (Insulino-sensibilité SI : A = 0,74 ; TI = 0,19 ; AU = 0,30 min-1/ ( μU/ml) × 10-4), seule TI présente un diabète sucré. Tous trois ont un hyperinsulinisme considérable (Insuline à jeun : A = 44 ; TI = 127 ; AU = 93 μU/ml) qui traduit une forte augmentation de l’insulinosécrétion et notamment de sa phase Phi2 mais si celle-ci maintient efficacement la glycémie chez A et AU, elle n’y parvient plus chez TI. Chez cette dernière on note une valeur basse de potentiation de la réponse au stimulus glucose (0,82 contre 1,51 chez A et 1,48 chez AU), et une clairance périphérique de l’insuline plus élevée (0,36 contre respectivement 0,21 et 0,20 min-1). Conclusion Ces observations montrent qu’une même anomalie génétique peut affecter la glucorégulation à des degrés divers selon l’adaptation de la fonction B-pancréatique qu’il est par ailleurs facile d’analyser avec précision avec les outils actuels d’analyse mathématique de la réponse de C-peptide. Déclaration d’intérêt Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêt direct ou indirect (financier ou en nature) avec un organisme privé, industriel ou commercial en relation avec le sujet présenté.
P149 Pertinence de l’utilisation de différents index d’insulino-sensibilité dans la classification des individus obèses et métaboliquement sains : comparaison au clamp hyperinsulinémique euglycémique J.-P. Bastard*,1, B. Elisha2, R. Rabasa-Lhoret2 1
Service de biochimie et hormonologie et INSERM, Hôpital Tenon, UF bio-marqueurs inflammatoires et métaboliques, UMRS 938, CDR Saint-Antoine, AP-HP, Paris, France, 2 Institut de recherche clinique de Montréal, Université de Montréal, Montréal, Canada.
*Auteur correspondant : [email protected]
Introduction L’existence d’un phénotype de sujets obèses mais métaboliquement sains (MHO) avec une bonne sensibilité à l’insuline et des profils lipidiques et
A70
© 2015. Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
inflammatoires non altérés par opposition aux sujets obèses insulinorésistants (IRO) est maintenant bien admise. L’objectif de l’étude est de déterminer la performance d’index simples d’insuliorésistance (IR) utilisant la glycémie et l’insulinémie à jeun et/ou au cours d’une hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) dans la classification des MHO vs IRO comparée à celle du clamp hyperinsulinémique euglycémique (CHE) considéré comme la méthode de référence. Patients et méthodes Cent soixante-trois femmes post-ménopausées en surpoids ou obèses ont été analysées. Trois index d’IR hépatique (HOMA-IR 1985, Vangipurapu 2012 et Abdul-Ghani 2007), un index d’IR musculaire (Abdul-Ghani 2007) ainsi que deux index plus globaux (ISI-Matsuda 1999 et SIisOGTT 2007) ont été comparés. Les quartiles extrêmes selon chaque index ont été considérés comme IRO ou MHO (n = 41 par groupe). Résultats Selon les résultats du CHE et pour des IMC comparables (MHO 33,0 ± 4,6 kg/m² vs IRO 34,4 ± 4,2 kg/m², p = 0,16), les patientes IRO présentaient significativement plus de gras viscéral (222,7 ± 61,6 vs 181,8 ± 53,9 cm², p = 0,02) ainsi que des glycémies et insulinémies à jeun et à 2 heures, des concentrations circulantes de triglycérides, Apo-B, CRP-us et ALAT significativement plus élevées et un HDL-cholestérol plus bas (p < 0,05) que les MHO. Des résultats similaires étaient obtenus lorsque la classification était faite avec l’index d’IR musculaire et les index globaux ISI-Matsuda et SIisOGTT. En revanche, pour les index d’IR hépatique, l’IMC entre les deux groupes était significativement différent. Conclusion Les index d’IR musculaire et plus globaux dérivés de l’HGPO pourraient constituer une bonne alternative à l’utilisation du CHE pour la classification des patients MHO vs IRO. Déclaration d’intérêt Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêt direct ou indirect (financier ou en nature) avec un organisme privé, industriel ou commercial en relation avec le sujet présenté.
P150 Stratégie de génotypage pour détecter les recombinaisons non-spécifiques dans le système Cre-Lox : exemples des souches RIP-CRE et aP2-CRE A. Tailleux*,1,2,3,4, V. Spinelli1,2,3,4, C. Martin1,2,3,4, E. Dorchies1,2,3,4, E. Vallez1,2,3,4, H. Dehondt1,2,3,4, M.-S. Trabelsi1,2,3,4, S. Caron1,2,3,4, B. Staels1,2,3,4 1
European genomic institute for diabetes (EGID), FR 3508, Lille, France, INSERM UMR1011, Lille, France, 3 Univ Lille 2, Lille, France, 4 Institut Pasteur de Lille, Lille, France. 2
*Auteur correspondant : [email protected]
Introduction L’invalidation conditionnelle in vivo par la stratégie Cre-Lox est un outil puissant pour identifier la fonction d’un gène/d’une protéine spécifiquement dans un tissu ou un type cellulaire donné. Le choix du promoteur guidant l’expression de la recombinase Cre est fondamental pour déterminer la spécificité tissulaire de l’invalidation génique. Cependant, le choix d’un promoteur approprié ne permet pas d’empêcher les recombinaisons non-spécifiques dues au phénomène d’activation non-spécifique du gène codant la Cre dans les tissus non ciblés. Matériels et méthodes Un même gène d’intérêt a été invalidé dans 2 types cellulaires différents (cellule bêta pancréatique et adipocyte) en croisant une souche de souris floxée pour le gène d’intérêt avec respectivement une souche transgénique RIP (Rat Insulin Promoter) -Cre (Tg (Ins2-Cre) 23Herr) et une souche transgénique aP2 (adipocyte protein 2) -Cre (aP2-CreSI). Pour détecter une potentielle recombinaison non-spécifique, une recherche systématique de l’allèle « nul » (allèle floxé et recombiné par la l’enzyme Cre-recombinase) en plus de l’allèle floxé et de l’allèle sauvage a été réalisée par PCR sur l’ADN extrait de biopsie caudale et des principaux tissus métaboliques dans les souris issues des deux élevages. Résultats 1) L’utilisation systématique d’une simple PCR permet de détecter les recombinaisons non-spécifiques dans le génotypage sur biopsie caudale, et ainsi d’éliminer les souris problématiques de l’élevage. 2) Le taux de recombinaison non-spécifique est dépendant de la souche Cre, allant de 5 % (RIPCre, la souche est alors utilisable pour générer les souris invalidées pour le gène d’intérêt) à 100 % (aP2-Cre, rendant la souche inutilisable). 3) L’analyse de l’ADN de différents tissus métabolique (foie, pancréas, tissus adipeux) par la même procédure de PCR montre que lorsque la recombinaison non-spécifique est présente dans l’ADN caudal, elle est retrouvée aussi dans les autres organes analysés. Conclusion Une recherche systématique de recombinaison non-spécifique devrait être mise en œuvre par simple PCR au cours du génotypage dans toutes les souches murines obtenues par ce système. Déclaration d’intérêt Les auteurs déclarent ne pas avoir d’intérêt direct ou indirect (financier ou en nature) avec un organisme privé, industriel ou commercial en relation avec le sujet présenté.