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Phospholipides et oxydation des acides aminés chez Proteus mirabilis
BIOCHIMIE, 1973, 55, 1287-1297.
Phospholipides et oxydation des acides aminds chez Proteus mirabilis. G6rard ARLAUD, HGl~ne J o u v E et J e a n PELMONT. Laboratoire de Biochimie, C.E.R.M.O., Universit~ Scientffique et MEdicale de Grenoble, B.P. 53, 38041 Grenoble Cedex. (9-7-1973). Summarg. I L - a m i n o a c i d oxidase activities are f o u n d in envelopes isolated from P. mirabilis and are m e a s u r e d by reduction of d i c h l o r o p h e n o l i n d o p h e n o l (DCIP). Funct i o n a l i n t e r a c t i o n between these enzymes a n d p h o s p h o l i p i d s have been examined. Main p h o s p h o l i p i d c o m p o n e n t s of envelopes are f o u n d to be p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e (60-75 p. cent), phosphatidylglycerol (10-15 p.. cent) a n d c a r d i o l i p i n (10 p. cent) associated with significant a m o u n t s of lysoderivates. Main p h o s p h o l i p i d f a t t y acids are palmitic, octadecenoic a n d palmitoleic a c i d s ; two cyclopropanic f a t t y acids are present as well. Lowering the growth t e m p e r a t u r e of the bacteria leads to a significant rise of the u n s a t u rated f a t t y acid level of the envelopes as compared to t h e i r s a t u r a t e d homologs. A s h i f t t o w a r d the s t a t i o n a r y phase results in a n increase of cyclopropanie f a t t y acids related to a lower level of u n s a t u r a t e d compounds. The v a r i a t i o n s are paralleled w i t h shifts of the t h e r m a l t r a n s i t i o n seen on A r r h e n i u s plots of L - p h e n y l a l a n i n e - D C I P oxidoreductase and L-histidine-DCIP oxidoreductase activities. Increasing the u n s a t u r a t e d f a t t y acid level results in a drop of the t r a n s i t i o n point, avhereas a rise in the cyclopropanic f a t t y acid level h a s the opposite effect. Snake v e n o m p h o s p h o l i p a s e A destroys m o s t of the envelope phospholipids, except for c a r d i o l i p i n w h i c h persists at a c o m p a r a t i v e level w h i c h is s i m i l a r to the percentage of the r e m a i n i n g oxidoreductase activity. Energy of a c t i v a t i o n linked to t h e r m a l d e n a t u r a t i o n of the oxidoreductase specific for p h e n y l a l a n i n seems to be related to the f a t t y acid p a t t e r n induced by a lower t e m p e r a t u r e for growth.
INTRODUCTION. L e s b a c t G r i e s d u g e n r e Proteus e f f e c t u e n t la d G s a m i n a t i o n o x y d a t i v e d e la p l u p a r t d e s a c i d e s a m i n 6 s n a t u r e l s [1], et l a f o r m a t i o n d e p h 6 n y l p y r u v a t e ~ p a r t i r d e la L - p h G n y l a l a n i n e est fr6q u e m m e n t u t i l i s 6 e p o u r c a r a c t G r i s e r Proteus et Providencia [2]. U n e p r e m i b r e 6 r u d e effectuGe ~ l ' a i d e d ' e n v e loppes prGpar6es par lyse des sphGroplastes de
Abrdviations : DEGS DCIP DPG EDTA EGTA
: di~.thylGneglycol-suecinate. : dichloroph~nolindoph~nol. diphosphatidylglyc~rol. : 6thylGnediamine-t~traacdtate. : 6thy16ncglycol-bis-(2-aminoGthyl)N,N,N',N'-t~traacGtate. a GP : ct-glycGrophosphate. GPE : glycGrylpho s p h o r y l ~ t h a n o l a m i n e . GPG : glycGrylphosphorylglycGrol. GPGPG glycdrylphosphorylglycGrylphosphorylglycGrol. GPMME: glyc.Grylphosphoryl-N-monom~thylGthanolamine. LPE : lvsophosphatidyldthanolamine, LPG lx'sophosphatidylglye6rol. PA acide p h o s p h a t i d i q u e . PE : phosphatidyl~thanolamine. PG : phosphatidylglycGrol. PMME phosphatidyl-N-monomGthvl~thanolamine. PMS phGnazine mGthosulfate.
Proteus mirabilis h p H a l e a l i n e n p r G s e n c e d ' u n agent complexant des cations divalents a montr6 l'existence d'au moins deux systGmes oxydasiques d i f f G r e n t s [3], s e l o n q u e la r G a c t i o n p o r t e s u r les aminoacides apolaires h chalne latGrale aliphat i q u e o u a r o m a t i q u e , o u s u r les a c i d e s a m i n G s h c h a i n e l a t G r a l e c a t i o n i q u e . Ces o x y d a t i o n s c o n v e r g e n t v e r s l ' o x y g b n e p a r l ' i n t e r m G d i a i r e d e la chaine respiratoire mats peuvent 6tre mesurGes h l'aide du dichloroph6nolirrdoph6nol comme accept e u r d ' 6 1 e c t r o n s a r t i f i c i e l . L ' e f f e t - d e la p h o s p h o l i p a s e A d u v e n i n d e s e r p e n t s u r l a r G a c t i o n et les variations de celle-ci en fonction de la tempGral u r e s u g g G r e n t q u e l ' o x y d a t i o n d e la p h G n y l a l a n i n e est, a u m o i n s p a r t i e l l e m e n t , s o u s la dGpend a n c e d e s p h o s p h o l i p i d e s d e l ' e n v e l o p p e [3]. Ce t r a v a i l c o n s t i t u e l a p r e m i G r e p a r t i e d ' u n e 6 t u d e d o n t le b u t est l ' e x a m e n dGtaill6 d e s r e l a t i o n s e n t r e les a n a i n o a c i d e o x y d a s e s et les p h o s p h o l i p i d e s d e Proteus. L e s o b s e r v a t i o n s d G c r i t e s clans ce q u i s u i t m o n t r e n t n o t a m m e n t q u ' i l e x i s t e u n p a r a l l 6 1 i s m e e n t r e la c o m p o s i t i o n d e s p h o s p h o l i p i d e s e n a c i d e s g r a s et le c o m p o r t e m e n t d e s aminoacide oxydases h diverses tempGratures, en ce q u i c o n c e r n e l ' a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e e t l a stab i l i t 6 d u systGme.
G. Arlaud, H. J o u v e et J. P e l m o n t .
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M A T E R I E L ET METHODES.
Souche el milieux de culture. Proteus mirabilis, sans c a r a c t b r e s g6n6tiques p a r t i c u l i e r s , p r o v i e n t de la Collection de l ' I n s t i t u t Pasteur, Paris. La s o u c h e est e n t r e t e n u e sur g61ose n u t r i t i v e c o m m e p r 6 c 6 d e m m e n t d 6 c r i t [3]. Les cultures en m i l i e u l i q u i d e sont a6r6es p a r agitation dans nn m i l i e u c o n t e n a n t p o u r 1 1 : p e p tone (Prolabo) 20 g ; e x t r a i t de levure (M6rieux) 5 g ; glucose 4 g. Prdparalion des enveloppes. Nous avons utilis6 la m 6 t h o d e de la r6f6r e n c e [3] modifi6e c o m m e suit : les bact6ries cultiv6es en m i l i e u l i q u i d e (2 l, e n v i r o n 2.10 s cell./ml) sont centrifug6es 20 rain h 10 00~) g. Aprbs un lavage p a r c e n t r i f u g a t i o n dans le T r i s (2.10-2 M)malbate, s a c c h a r o s e 0,4 M, EDTA (Na) 10 -2 M (pH 7,5), les b a c t 6 r i e s sont s u s p e n d u e s d a n s 30 ml de ce t a m p o n et incub6es 5 rain h 30°C en prdsence d ' u n e forte dose de l y s o z y m e (100 ~ g / m l , Boehringer) : b i e n q u ' a y a n t peu d'effet s u r la p a r o i de Proteus [4] cette e n z y m e facilite cepend a n t la lyse ult6rieure des cellules. Aprbs a d d i t i o n d ' u n volume d ' E G T A (ou Chel-DE, f o u r n i p a r Sigma) 0,2 M h p H 10,5, le m61ange est agit6 h l ' a i d e d ' u n b a r r e a u magn6tique p e n d a n t au m o i n s 30 rain h 0°C, le p H 6tant m a i n t e n u h 10,5-10,7 p a r de petites a d d i t i o n s de KOH. Apr6s une centrifugation (20 rain h 30 000 g) suivie de deux lavages p a r c e n t r i f u g a t i o n dans le T r i s (2.10-2 M)-mal6ate (pH 7,5) les p a r t i c u l e s sont homog6n6is6es dans 10 ml de ce t a m p o n . Dans c e r t a i n s cas pr6cis6s plus loin la m 6 t h o d e de la r6f6rence [3] a 6t6 utilis6e int6gralement. Mesure de l'activit~ oxydasique par le dichlorophdnolindophdnol. Le m61ange test c o n t i e n t dans 1 m l : L-aminoa c i d e (Merck) 50 ~moles, MgCL 10 ~tmoles, T r i s (20 J~tmoles)-mal6ate, p H 7,5, DCIP (Fluka) 0,06 ~vmole, PMS ( S c h u c h a r d t ) 0,82 .umole. Le m6lange est form6 au d e r n i e r m o m e n t h l ' a b r i de la lumibre. Aprbs a d d i t i o n des p a r t i c u l e s (concent r a t i o n finale : 2 fi 50 .~g de p r o t 6 i n e s totales p a r ml), la d i m i n u t i o n de densit6 optique h 600 n m est enregistr6e h l ' a i d e d ' u n s p e c t r o p h o t o m b t r e Unic a m SP 500 m u n i d ' u n e cellule t h e r m o s t a t 6 e 30°C et d ' u n e n r e g i s t r e u r SP 22. Une v a r i a t i o n de densit6 o p t i q u e de 0,1 c o r r e s p o n d h la r6duction de 6,25 ~moles de DCIP. Dosage des prot~ines el du phosphore. Aprbs p r 6 c i p i t a t i o n p a r l ' a c i d e t r i c h l o r o a c 6 tique, on m e s u r e les p r o t 6 i n e s totales p a r la m6t h o d e de F o l i n - L o w r y modifi6e p a r Z a c k et
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55, n ° 10.
Cohen [5] en u t i l i s a n t la s 6 r u m - a l b u m i n e b o v i n e c o m m e prot6ine-6talon. Le p h o s p h o r e p h o s p h o l i p i d i q u e est dos6 p a r la m 6 t h o d e de Bartlett [6] aprbs m i n 6 r a l i s a t i o n h u m i d e de l ' 6 c h a n t i l l o n (45 m i n h 250°C cn pr6sence de H2SO4) compl6t6e p a r un chauffage de 10 m i n fi 250 ° aprbs a d d i t i o n de quelques gouttes de H20 2 ~ 30 volumes. Darts les c o n d i t i o n s utilis6es 3 i~g de p h o s p h o r e c o r r e s p o n d e n t h une densit6 o p t i q u e de 0,49 h 830 rim. La p l u p a r t des d 6 t e r m i n a t i o n s q u a n t i t a t i v e s ont 6t6 effectu6es h p a r t i r d ' e n v e l o p p e s marqu6es p a r le phosphore-32, aprbs i n c o r p o r a t i o n de H~PO4 [32p] au m i l i e u de c u l t u r e (1 "h 10 mC/1). L'activit6 sp6cifique n n i f o r m e v a r i a i t selon les p r 6 p a r a t i o n s de 5.10 '3 h 5.104 dpm/txg de p h o s p h o r e . La r a d i o activit6 est mesur6e p a r c o m p t a g e en s c i n t i l l a t i o n l i q u i d e dans le l i q u i d e de B r a y [7! h l ' a i d e d ' u n a p p a r e i l I n t e r t e c h n i q u e SL 30.
Analyse des phospholipides el des acides 9ras. Les p h o s p h o l i p i d e s ont 6t6 e x t r a i t s p a r la m6t h o d e de F o l c h et coll. [8] aprbs s u s p e n s i o n des 6chantillons dans le c h l o r o f o r m e - i n 6 t h a n o l (2/1, v/v). a) c h r o m a t o g r a p h i e sur colonne d ' a c i d e silicique : p o u r 1 mg de p h o s p h o r e l i p i d i q u e , 2 g d ' a c i d e silicique (Mallinckrodt) et 1 g de Celile 545 (Prolabo) sont pr6activ6s p e n d a n t une nuit /l 120°C, s u s p e n d u s darts un volume de c h l o r o f o r m e suffisant p o u r f o r m e r une bouillie homog6ne, qui est d6pos6e u n i f o r m 6 m e n t dans une c o l o n n e de v e r r e et lav6e a b o n d a m m e n t p a r le c h l o r o f o r m e . L ' 6 c h a n t i l l o n l i p i d i q u e est d6pos6 au s o m m e t du gel clans une solution c h l o r o f o r m i q u e de 1 ~ 5 ml. Le c h l o r o f o r m e (15 h 20 ml p a r mg de p h o s p h o r e l i p i d i q u e d6pos6) e n t r a i n e les l i p i d e s neutres. Les p h o s p h o l i p i d e s sont 61u6s p a r le m6thanol (20 25 ml p a r mg de p h o s p h o r e ) ou p a r des m61anges chloroforme-m6~hanol en p r o p o r t i o n s v a r i a b l e s (voir r6sultats) dans le but de s 6 p a r e r les phospholipides individuels. b) c h r o m a t o g r a p h i e sur eouche m i n c e : on utilise des p l a q u e s de gel de silice G (Merck) 20 × 20 cm, d ' 6 p a i s s e u r 0,5 mm, activ6es p e n d a n t une h e u r e 30 fi 100°C. La c h r o m a t o g r a p h i e est r6alis6e d a n s le solvant c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l / e a u (65/25/ 4, v / v ) ou d a n s un syst6me b i d i m e n s i o n n e l [9] avec le c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l / a m m o n i a q u e 7N (~6/36,4 /5 v / v ) dans la p r e m i 6 r e dimen,sion, et le c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l / a c i d e a c 6 t i q u e / e a u (90/ 14/6, 3/1 v / v ) dans la s e c o n d e d i m e n s i o n . On localise les p h o s p h o l i p i d e s p a r les v a p e u r s d'iode, p u l v 6 r i s a t i o n de n i n h y d r i n e et a u t o r a d i o g r a p h i e ( K o d a k Regulix).
M d t a b o l i s m e i n t e r m d d i a i r e el d n e r g d t i q u e - M e m b r a n e s . c) h y d r o | y s e e n z y m a t i q u e des p h o s p h o l i p i d e s : la p h o s p h o l i p a s e A (EC 3.1.1.4) de venin de Crotale, et la p h o s p h o l i p a s e D du c h o u x (EC 3.1.4.4.) ont 6t6 utilisOes dans les c o n d i t i o n s suivantes : la solution p h o s p h o l i p i d i q u e est 6vapor6e ~ sec sous azote h 30°C et r e p r i s e dans 1,0 ml d'Other 6thylique. On y ajoute le m i l i e u r e a c t i o n n e l (2,0 ml) contenant, dans le p r e m i e r c a s : p h o s p h o l i p a s e A (Boehringer) 10 :ag, t a m p o n g l y c y l g l y c i n e 20 ~moles, CaCI 2 10 ~moles, MgCI~ 1 ~mole dOsoxycholate de s o d i u m 10 ,~inoles, (pH = 8,9) ; d a n s le s e c o n d cas : p h o s p h o l i p a s e D (Boehringer) 2 mg d ' e x t r a i t lyophilisO, t a m p o n acOtate de s o d i u m 200 ~moles, CaC12 40 ~moles (pH = 5,6). Apr~s i n c u b a t i o n h 30°C et 6vaporation du r e l i q u a t d'Other, on ajoute 4,4 ml de c h l o r o f o r m e / m O t h a nol (2/1, v / v ) . Le mOlange homogOnOis6 et c e n t r i fug6 se sOpare en deux phases ; la c o u c h e infOr i e u r e c h l o r o f o r m i q u e c o n t i e n t Ies p h o s p h o l i p i d e s et leurs p r o d u i i s de dOgradation qui sont analysOs p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur c o u c h e m i n c e . d) dOsacylation des p h o s p h o l i p i d e s : la mOthode utilisOe est celle de W h i t e [9], modifi6e c o m m e s u i t : le mOlange p h o s p h o l i p i d i q u e est dissout dans un v o l u m e de mOthanol/tolubne (1/1, v / v ) .
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FRACTIONS
Flo. 2. - - Chromatographie des phospholipides sur colonne d'acide silieique. Adsorbant : acide silicique 5 g A- c6lite 545 : 2,5 g ; colonne 15 X 1,1 cm ; dlution par les mOlanges de chloroforme-mdthanol (v/v) : 95/5, 80 m l ; 90/10, 26 ml ; 80/20, 125 ml. D6bit moyen : 0,7 m l / m i n ; volume des fractions : 3,3 ml. La radioactivit6 to.tale de chaque fraction est dOterminde par com4atage en scintillation liquide. AbrOviations : voir liste au bas de la premiOre page. Le deuxiOme pic de DPG est un artefact cans6 par le changement d'61uant.
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FIG. 1. - - Chromatographie bidimensionnelle des phospholipides extraits des enoeloppes de P. mirabilis. Les enveloppes on t 6t6 prOpar~es par la mOthode de la rOfOrence (3) non modifide. PremiOre dimension (sens horizontal): chloroforme-mOthanol-ammoniaque 7 N (66/36,4/5, v/v) ; deuxiOme dimension (sens vertical) : chloroforme-mOthanol-acide acOtique-eau (90/14/6,3/1, v/v). Les phospholipides sont rOvOlOs par autoradiographie et les lipides neutres par les vapeurs d'iode. Autres conditions expOrimentales : voir MatOriel et MOthodes. N I : compos6 non identifi6 ; L N : lipides neutres ; autres symboles : voir liste des abrOviations au has de la premiOre page.
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61imin6e p a r c e n t r i f u g a t i o n , puis lavOe p a r 2 ml de m O t h a n o l / e a u (3/1, v / v ) et 2 ml d'eau. Les acides gras sont extraits p a r 3 fois 2 ml d'6ther de pOtrole et concentrOs p a r 6vaporation sons azote 30°C. La phase aqueuse c o n t e n a n t les esters g l y c 6 r o p h o s p h o r i q u e s est 6vapor6e h sec sous v i d e en p r 6 s e n c e d ' a n h y d r i d e p h o s p h o r i q u e . e) c h r o m a t o g r a p h i e des p h o s p h o l i p i d e s d6sacy16s: les esters g l y c 6 r o p h o s p h o r i q u e s lib6r6s p a r d6sacylation des p h o s p h o l i p i d e s sont c h r o m a t o graphi6s sur c o u c h e m i n c e de cellulose MN 300 (Macherey, Nagel & Co). Avant emploi, les plaques (20 X 20 cm, 6paisseur 0,25 ram) sont s6ch6es p e n d a n t une nuit /t t e m p 6 r a t u r e ambiante. Nous avons utilis6 dans la p r e m i b r e d i m e n s i o n : NHgOH
G. Arlaud, H. Jouve et J. P e l m o n t .
1290
9.10-2 M, EDTA (Na) 3,8.10-a M, b i c a r b o n a t e d ' a m m o n i u m 0,7 M, en solution dans l'6thanol 67 p. cent (v/v) ; d a n s la deuxi6me : acide isobut y r i q u e / e a u / N H 4 O H (66/33/1, v/v) [10]. E n t r e les deux d i m e n s i o n s , les plaques sont s6ch6es p e n d a n t une n u i t h t e m p 6 r a t u r e a m b i a n t e ; la dur6e de chaque m i g r a t i o n varie de 4 h 6 heures. f) analyse des acides gras : les acides gras obtenus p a r d6sacylation des p h o s p h o l i p i d e s sont m6thyl6s p a r la m6thode de Lorette et B r o w n [11] et analys6s p a r c h r o m a t o g r a p h i c en phase gazeuse. Les analyses ont 6t6 effectu6es h l'aide d ' u n chrom a t o g r a p h e Girdel 75 C D / P T 6quip6 d ' u n d6tecteur h i o n i s a t i o n de flamme. Deux colonnes ont 6t6 utilis6es, l ' u n e du type polaire (DEGS 4 p. cent (p/p) sur c h r o m o s o r b G-DMCS (80-100 mesh), l o n g u e u r 3 m, diam6tre 1/8", la seconde de type apolaire (Apiezon L 10 p. cent p / p ) sur chromosorb P-NAW (60-80 mesh), l o n g u e u r 2 m, diam~tre 1/8"). Le n o m b r e de plateaux th6oriques (mesur6 p o u r l'acide p a l m i t i q u e ) variait de 1 500 h 2 000. A l'aide d'acides gras s t a n d a r d s satur6s et monoinsatur6s, nous avons 6tabli des courbes d'6talonnage r e p r 6 s e n t a n t les v a r i a t i o n s lin6aires du logarithme du temps de r 6 t e n t i o n en fonction du n o m b r e de c a r b o n e s de l ' a c i d e gras, selon la m6thode de James [12]. Ces analyses, effectu6es diff6rentes temp6ratures, et l ' u t i l i s a t i o n de deux colonnes caract6ris6es p a r u n e r6tention diff6rente des acides gras insatur6s p a r r a p p o r t h ]curs homologues satur6s, ont p e r m i s d'identifier les p r i n c i p a u x acides gras des enveloppes de Proteus
mirabilis. RESULTATS.
Phospholipides des enveloppes de Proteus m i r a -
(EC.3.1.1.4.) g6n6ratrice des lysod6riv6s correspondants. L'action de cette enzyme sur la cardiol i p i n e se caract6rise p a r la f o r m a t i o n de deux lysod6riv6s s6parables sur couche m i n c e dans le chloroforme-m6thanol-eau (66/25/4, v/v). En outre le PG se caract6rise p a r la f o r m a t i o n d ' a c i d e p h o s p h a t i d i q u e (PA) en pr6sence de phospholipase D (EC.3.1.4.4.). La PE et ses p r o d u i t s de d6gradation sont facilement localis6s p a r leur r6ac-
GPGPG
O
GPE
.
,
-
~:
.~:
I
"
t,
O
FI6. 3. - - Chromatographic bidimensionnelle des ~hospholipides ddsacylds. Adsorbant : cellulose MN 300.
remi6re dimension (sens vertical) NH~OH 9.10 2 M, EDTA(Na) 3,8.10-3 M, NH~CO~H 0,7 M, en solution dans l'6thanol 67 p. cent (v/v). Deuxi6me dimension (sens horizontal) : acide isobutyrique-NH~OH 14 N-eau (66/ 133, v/v). Les phospholipides d6sacyl6s sont r~v616s par autoradiographie. NI : compos6 non identifi6 ; autres symboles : voir liste des abrdviafions au bas de la premi6re page.
bilis. L'analyse
qualitative
des
phospholipides
de
Proteus mirabilis, r6alis6e h l'aide de diff6rentes t e c h n i q u e s (cf. m6thodes) r6vble une r 6 p a r t i t i o n c o m p a r a b l e h celle qui a 6t6 d6crite p o u r d ' a u t r e s bact6ries Gram-n6gatives [13-15]. Les p r i n c i p a l e s fractions p h o s p h o l i p i d i q u e s des enveloppes isol6es, obtenues p a r c h r o m a t o g r a p h i c sur couche m i n c e (fig. 1) ou sur c o l o n n e d ' a c i d e siliciqne (fig. 2), sont la p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e (PE), le p h o s p h a t i d y l g l y c 6 r o l (PG) et la cardiolip i n e ou d i p h o s p h a t i d y l g l y c 6 r o l (DPG). Elles r e p r 6 s e n t e n t r e s p e c t i v e m e n t 60-75 p. cent, 10-15 p. cent et 10 p. 100 du p h o s p h o r e p h o s p h o l i p i d i q u e total. Ces c o n s t i t u a n t s ont 6t6 identifi6s : 1) p a r leurs p r o d u i t s de d6sacylation complbte, qui sont respective m e n t la GPE, le GPG et le GPGPG, isol6s sur couche m i n c e de cellulose (fig. 3) ; 2) p a r Faction de la p h o s p h o l i p a s e A de v e n i n
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 10.
tion avec la n i n h y d r i n e . E n f i a la n a t u r e de ces constituants a 6t6 v6rifi6e p a r leur c o m p o r t e m e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e compar6 h des t6moins ou aux donn6es de litt6rature [16, 17]. Un c o n s t i t u a n t m i a e u r pr6sent p a r m i les phospholipides d6sacyl6s (fig. 3) p o u r r a i t correspondre fi la p h o s p h o r y l , N - m o n o m 6 t h y l 6 t h a n o l a m i n e (GPMME) p a r r6f6rence aux r6sultats d ' a u t r e s auteurs [10]. Ce compos6 est le p r o d u i t de d6sacylation de la p h o s p h a t i d y l - N - m o n o m 6 t h y l 6 t h a n o l a m i n e (PMME), n o n s6par6e de la PE dans les syst6mes de solvants utilis6s ; la PMME, qui repr~sente chez P. vulgaris u n e fraction phospho]ipidique i m p o r t a n t e (12 p. cent) [14], n'est pas d6cel6e chez E. colt [13]. L'identification de l'(t-glyc6rophosphate (~ GP) i n d i q u 6 h l'6tat de traces sur la figure 3 reste 6galement h confirmer.
M~tabolisme interm~diaire et dnergdtiqlte-Membranes.
1291
une d i m i n u t i o n du taux de PE au sein des enveloppes, ainsi que l ' a p p a r i t i o n de lysoddriv6s tels que la L P E et le LPG (fig. 1 et tableau I). Le total PE + L P E des e n v e l o p p e s est r e l a t i v e m e n t
Les rdsultats du tableau I montrent des diff6r e n c e s s i g n i f i c a t i v e s e n t r e la c o m p o s i t i o n e n p h o s p h o l i p i d e s d e s e n v e l o p p e s c e l l u l a i r e s et d e s b a c tdries dont elles sont issues: on peut constater
TABLEAU I.
Analyse des phospholipides de P r o t e u s m i r a b i l i s . Echantillons
cP E pe.
Bact~ries enti~res
cPG ep.
74,8
DPGp.centLPE p.cea!
9,9
LPG p.cent PE + LPE p. cent
7,9
74,8 ~ 1 1 ~ - , 5
Enveloppes (')
1
72,9
La c o m p o s i t i o n en p h o s p h o l i p i d e s est d o n n d e en p o u r c e n t a g e d u p h o s p h o r e l i p i d i q u e total. (*) Les e n v e l o p p e s utilisdes o n t 6td p r d p a r d e s p a r la m d t h o d e de rdfdrence [3] n o n modifide. TABLEAU II.
Variations de la composition en acides gras des enveloppes de P r o t e u s m i r a b i l i s en [onction de la temperature et de la phase de croissance. Phase stati0nnaire
Phase exp0nentielle
~°C
t4' C
1 30"C
38 °C
~40C
T
l
I
i
.~12 : 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I
,Z13 : 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38oC
T 0,9
,
T
T
T
T
0,7
1,2
0,6
T
T T
213 : 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
T
T
T
T
T
?,14 : 0.
1,7
1,9
1,6
1,6
1,4
2,7
214 : 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
T
T
T
T
T
T
215 : 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
T
T
T
T
T
T
215 : 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
T
T
T
T
T
T 5i,3
216 : 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33,8
39,2
43.6
51,0
29,2
C16 : 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19,3
20,8
15,4
11,3
14,7
4,6
C17 : 0.
T
T
T
T
T
T
(:,17 A C ) . -
2,3
1,8
4,4
4,1
9,9
21,0
4,8
3,5
1,3
33,8
8,8
C18 : 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3,0
3,7
4,0
C18 : 1
35,0
28,2
22,7
21,5
Ni (*').
1,6
1,6
1,9
1,8
T
T
C19 A (') . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1,3
0,5
1,9
1,8
7,4
9,5
Cyclopropaniques . . . . . . . . . . .
3,6
2,4
6,3
5,9
17,3
30,5 55,3 13,4
Saturds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39,4
45,5
50,4
58,0
34,1
Insaturds
54,3
49,0
38,1
32,8
48,5
Insaturds/saturds ...........
!
1,38
1,08
0,76
Le p o u r c e n t a g e de e h a q u e acide gras est e x p r i m d en poids. (*) Acides gras c y c l o p r o p a n i q u e s . (**) C o m p o s d n o n identifid. T : t r a c e s ( q u a n t i t d s i n f d r i e u r e s /, 0,5 p. cent).
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 10.
0,57
1,42
0,24
1292
G. A r l a u d , H. Jottve et J. P e l m o n t .
c o n s t a n t et c o r r e s p o n d h la quantit6 de PE des bact6ries de d6part (75 p. cent e n v i r o n ) . I1 est v r a i s e m b l a b l e que la LPE soit lib6r6e p a r d6gradation e n z y m a t i q u e de la P E au cours de la pr6p a r a t i o n des enveloppes, comme c'est le cas chez E. colt, oft la t r a n s f o r m a t i o n des bact6ries en sph6roplastes s ' a c c o m p a g n e d ' u n e a u g m e n t a t i o n du taux de LPE [18]. Des essais i n d 6 p e n d a n t s nous out p e r m i s de d6tecter darts les enveloppes au moths deux activit6s p h o s p h o l i p a s i q u e s dont l ' u n e c o r r e s p o n d h une p h o s p h o l i p a s e A [19].
sultats analogues out 6t6 obtenus chez E. colt [13, 23]. Ce p h 6 n o m 6 n e de d 6 s a t u r a t i o n des acides gras de l'enveloppe en r6ponse h u n a b a i s s e m e n t de t e m p 6 r a t u r e du m i l i e u c o n s t i t u e r a i t u n e adaptation de la bact6rie en r u e de m a i n t e n i r u n degr6 de fluidit6 c o n v e n a b l e de la m e m b r a n e . Cette hypoth6se laisserait supposer qu'~ basse temp6rature la bact6rie doive conserver un laux suffisant d'acides gras insatnr6s, et cela quelle que soft la T (°C)
40
Analyse des acides gras phospholipidiqzzes des enveloppes de P. mirabilis. Les acides gras de type satur6 repr6sentent, selon les c o n d i t i o n s de culture, 34 /~ 58 p. cent des acides gras p h o s p h o l i p i d i q u e s (tableau II). Le plus i m p o r t a n t est l'acide p a l m i t i q u e (C16:0) accompagn6 d ' a c i d e st6arique (C18:0) et d ' a c i d e m y r i s t i q u e (C14:0). L'acide palmitol6ique (C16:1) et u n acide octad6cbnoique (C18:1) sont les p r i n cipaux acides gras monoinsatur6s. Ce d e r n i e r p o u r r a i t 6tre, comme chez E. colt [20], l'acide vacc6nique (11-octad6c6no:ique). Les p r 6 p a r a t i o n s c o n t i e n n e n t 6galement deux compos6s qui out 6t6 identifi~s comme des acides gras c y c l o p r o p a n i q u e s : les acides cis-9,10-m6thy16nehexad6canoique (C17 A) et cis-ll,12-m6thy16neoctad6canoique (C19 A). Ces deux acides gras, pr6sents chez P. morganii [21] et E. colt [13,22], sont synth6tis~s p a r m 6 t h y l a t i o n des acides gras insatur6s c o r r e s p o n d a n t s (C16:1 et C18:1 [13]). Plusieurs analyses out m o n t r 6 que la composition en acides gras des enveloppes de P. mirabilis est 6troitement li6e aux c o n d i t i o n s de croissance des bact~ries (tableau II). Le passage de la phase e x p o n e n t i e l l e ~ la phase s t a t i o n n a i r e a 38°C s ' a c c o m p a g n e d ' u n e d i m i n u t i o n du taux des acides gras insatur6s (C16:1 et C18:1) au profit des acides gras c y c l o p r o p a n i q u e s (C17t~ et C19t,), qui atteignent au total e n v i r o n 30 p. cent des acides gras de l ' e n v e l o p p e ; ce c h a n gement a 6t6 observ6 chez E. colt [13] et son r61e physiologique reste encore obscnr. A n c u n e modification de la composition en acides gras n'est observ6e au cours de la phase e x p o n e n t i e l l e ou au cours de la phase stationnaire. D'autres modifications significatives apparaissent en fonction de la t e m p e r a t u r e de croissance des bact6ries (tableau II) : le r e f r o i d i s s e m e n t du m i l i e u de culture de 38°C fi 14°C provoque u n e a u g m e n t a t i o n i m p o r t a n t e du taux des acides gras insatur6s due aux acides palmitol6ique et octad6c6noique ; les acides gras c y c l o p r o p a n i q u e s ne subissent pas de v a r i a t i o n s significatives. Des r6BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° lO.
i
30
20
10
|
1,4i
1,0
0
--J
0,6
\ \ \
0,2
b
0 I
3 3 34 3,5 3,6 1 / T . 1 0 3 (°K'I) Fro. 4. - - Graphiques d'Arrh~nius de l' activitd L-aminoacide-DCIP oxydordductase dans les enveloppes prdpardes dt partir de bactdries cnltiods dt 38°C. La vitesse de r~duction du DCIP est mesurde h diff6rentes temperatures en presence de L-ph~nylalanine (cercles noirs), L-leucine (cercles blancs), L-histidine (triangles noirs), L-lysine (triangles blancs). Concentration en prot6ines totales : environ 50 Ixg/ml. Les courbes sont plac~es arbitrairement darts l'dchelle verticale ; vitesses r~elles h 30°C (nanomoles de DCIP r~duit/min) : Phe 16,2 ; Leu 14,2 ; His 14,1 ; Lys 7,3. 3,2
phase de croissance. A. 14°C, on constate effectiv e m e n t que l ' a u g m e n t a t i o n des acides gras cyclop r o p a n i q u e s h l ' a v 6 n e m e n t de la phase stationn a i r e ne s ' a c c o m p a g n e pas d ' u n e d i m i n u t i o n notable des acides gras insatur6s. Transition thermique du systbme Le g r a p h i q u e d ' A r r h 6 n i u s de la nine-DCIP oxydor6ductase met en p h 6 n o m 6 n e biphasique, comme il
oxydasiqae. L-ph6nylala6vidence un a 6t6 signal6
Mdtabolisme
intermddiaire
a n t 6 r i e u r e m e n t [3]. B i e n q u e ]es o x y d a t i o n s d e s a m i n o a c i d e s d e t y p e a p o l a i r e et d e s a m i n o a c i d e s b a s i q u e s s o i e n t s o u s l a d 6 p e n d a n c e d e d e u x systbmcs oxydasiques d i s t i n c t s , elles p a r a i s s e n t donner lieu h la m6me transition thermique dans les e n v e l o p p e s d e b a c t 6 r i e s c u l t i v 6 e s e n p h a s e e x p a n e n t i e l l e ~ 38°C : la f i g u r e 4 m o n t r e e n effet q u ' u n e t r a n s i t i o n c o m m u n e s ' o b s e r v e ~ 18°C e n v i r o n d a n s le c a s d e l a p h 6 n y l a l a n i n e et d e la leuc i n e c o m m e d a n s c e l u i d e l ' h i s t i d i n e et d e l a lysine.
art c o u r s d e l ' 6 1 6 v a t i o n d e t e m p 6 r a t u r e , h y p o t h 6 s e confirm6e notamment par des mesures physiques [30, 31] et p a r l ' e m p l o i d e m u t a n t s a u x o t r o p h e s l ' 6 g a r d d e s a c i d e s g r a s i n s a t u r 6 s [26, 27!. C o m p t e - t e n u d e s v a r i a t i o n s d e la c o m p o s i t i o n e n a c i d e s g r a s c o n s t a t 6 e s c h e z P. m i r a b i l i s e n fonction des conditions de croissance, on peut
40
D i v e r s a u t e u r s o n t m i s en 6 v i d e n c e chez E. colt l'existence d'une transition similaire affectant n o t a m m e n t d e s m 6 c a n i s m e s d e t r a n s p o r t [24-28]
\.
1,4
T (°C) 20
30
40
10
1293
et dnergdtique-Membranes.
T (°C) 20 |
30
10
0
1,4
0
1,0 38 o >
~k- f.-14 °
0 0
,,--1
0,6
1,0 > 0
..1
0,2 • 0,6
,
3,2
;
33
,
,
3,4
1/T.103 0,2
*
3t
3
i
i
3,4
!
!
3,5
3,6
1 / T . 10 3 (°K "1) 5.
3,5
,
3,6
(°K -1)
Fro. 6. - - G r a p h i q u e s d ' A r r h d n i u s de l'actioit~ L - p h ~ n ! t l a l a n i n e - D C I P o x y d o r ~ d u c t a s e des e n v e l o p p e s p r ~ p a r d e s & p a r t i r de bact~ries c u l t i v ~ e s en p h a s e stat i o n n a i r e ~ 1~ ° et 38°C. Enveloppes 14 ° : cercles 32
FIG.
, _ ,
G r a p h i q u e s d ' A r r h ~ n i u s de l'activitd L - p h ~ n g l a l a n i n e - D C I P o x y d o r ~ d u c t a s e des e n v e l o p p e s pr~par~es ~ p a r t i r d e s bact~ries c u l t i v ~ e s ~ 1~ °, 22 °, 30 °" et 38 ° . 14°C: triangles b l a n c s ; 22°C: triangles -
blancs ; enveloppes 3 8 ° : cercles noirs. C o n c e n t r a t i o n en prot6ines totales : e n v i r o n 50 ~tg/ml. Les courbes sont localis6es a r b i t r a i r e m e n t d a n s l'~chelle verticale. Vitesses rfelles h 30°C (nanomoles de DCIP r ~ d u i t / rain) : enveloppes 38°C 7,7 ; enveloppes 14°C 9,5.
-
no]rs ; 30°C : cercles blancs ; 38°C : cercles noirs. C o n c e n t r a t i o n en prot6ines totales : e n v i r o n 50 ttg/mL Les courbes sont plac6es a r b i t r a i r e m e n t dans l'6chelle verticale. Vitesses r6elles h 30 ° (nanomoles de DCIP r 6 d u i t / m i n ) : enveloppes 14 ° 18,7 ; enveloppes 22 ~ 12,9 ; enveloppes 30 ° 7,5 ; enveloppes 38 ° 9,0.
et l a s u c c i n a t e - D C I P o x y d o r 6 d u c t a s e [29]. O n i n t e r p r ~ t e g 6 n 6 r a l e m e n t ce p h 6 n o m ~ n e c o m m e le r6sultat d'une modification physique, comparable h une fusion de la phase lipidique membranaire B I O C H I M I E , 1973, 55, n ° 10.
done s'attendre h des modifications corr61atives de la transition thermique observ6e. La figure 5 m o n t r e q u e l ' a b a i s s e m e n t d e la t e m p 6 r a t u r e d u milieu de culture coincide effectivement avec de p r o f o n d e s m o d i f i c a t i o n s : la t r a n s i t i o n v i s i b l e e n t r e 16°C et 18°C c h e z les b a c t 6 r i e s c u l t i v 6 e s h 30 et 38°C se r e t r o u v e c h e z les b a c t 6 r i e s c u l t i v 6 e s 14 et 22°C ~ u n e t e m p 6 r a t u r e b e a u c o u p p l u s b a s s e (4 h 5oC). Ce c h a n g e m e n t p o u r r a i t d o n e 6tre c o n s i d 6 r 6 c o m m e le r 6 s u l t a t d ' u n e a u g m e n t a t i o n d e la f l u i d i t 6 d e l a p h a s e l i p i d i q u e li6e ~ l ' 6 1 6 v a -
G. Arlaud, H. Jouve et J. Pelmont.
1294
t i o n d u t a u x des a c i d e s g r a s i n s a t u r 6 s . I.a m 6 t h y l a t i o n p a r t i e l l e de ces c o m p o s 6 s h l ' a v 6 n e m e n t de la p h a s e s t a t i o n n a i r e s ' a c c o m p a g n e de la r 6 a p p a r i t i o n d ' u n e t r a n s i t i o n n e t t e h des t e m p 6 r a t u r e s de l ' o r d r e de 20-24°C (fig. 6). D a n s l ' h y p o t h 6 s e d ' u n e c o r r 6 1 a t i o n d i r e e t e e n t r e la t e m p 6 r a t u r e de t r a n s i t i o n e t l a c o m p o s i t i o n en a c i d e s g r a s des e n v e l o p p e s , l ' a u g m e n t a t i o n des a c i d e s gras c y c l o p r o p a n i q u e s c a r a c t 6 r i s t i q u e s de la p h a s e s t a t i o n naire apparait donc comme un facteur susceptible de r e n d r e la m e m b r a n e m o i n s f l u i d e q u ' a u c o u r s d e l a p h a s e e x p o n e n t i e l l e . I1 est doric p r o b a b l e cet 6 g a r d que les a c i d e s g r a s c y c l o p r o p a n i q u e s se c o m p o r t e n t e s s e n t i e l l e m e n t , au p o i n t de v u e de l'6tat p h y s i q u e de la m e m b r a n e , c o m m e des a c i d e s g r a s satur6s o r d i n a i r e s .
de c r o t a l e ( B o e h r i n g e r ) [3]. L a figure 7 m o n t r e l ' h y d r o l y s e des p r i n c i p a u x p h o s p h o l i p i d e s de l ' e n v e l o p p e a u c o u r s d ' u n e i n c u b a t i o n en p r 6 s e n c e de p h o s p h o l i p a s e A et d ' i o n s c a l c i u m : les f r a c t i o n s P E et P G s o n t f o r t e m e n t d 6 g r a d 6 e s (90 p. cen~ en u n e h e u r e e n v i r o n ) , a l o r s q u e la c a r d i o l i p i n e (DPG) r6siste en p a r t i e h l ' h y d r o l y s e . L'inactivation du pouvoir oxydasique reste part i e l l e d a n s les m S m e s c o n d i t i o n s (fig. 7). La supT (°C) 55 •
Le s y s t 6 m e L - a m i n o a c i d e o x y d a s i q u e des e n v e l o p p e s de P. m i r a b i / i s est p a r t i e l l e m e n t i n a c t i v 6 p a r u n e d o s e 61ev6e de p h o s p h o l i p a s e A de v e n i n
0,5
de
venin
50 •
•
m
•,
1,0
A
•
|
|
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•
|
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•
2,0
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A c t i o n de la p h o s p h o l i p a s e s e r p e n t s u r les e n v e l o p p e s .
•
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0,1
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PHE 14°
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310
I
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.
315
50
1/T. lo 5 (°K~) Fro. 8. - - Inactivation des DCIP oxydor~ductases de la phdnylalanine et de l'histidine it diverses temperalures. Les enveloppes (100 Ivg de prot6ines totales envi-
•
ffl
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305
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40
60
TEMPS (minutes) Fro. 7. - - E f f e t de la phospholipase A de venin de crotale sur les phospholipides el sur l'acHvit~ L-phdnlllalanine-DClP oxydordductase des enveloppes. Phos-
p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e : eereles n o i r s ; phosphatidylglye6rol : triangles noirs ; diphosphatidylglye6rol : earr6s noirs ; activit6 L-ph6nylalanine-DCIP oxydor~duetase : cerctes blancs. Les enveloppes (prot6ines totales 200 ~xg/ml) sont ineub6es en presence de Tris (2.10-2 1Vf)-mal6ate, CaC12 5.10-z M, phospholipase A 25 ilxg/ml (pH 7,5). La quantit6 de chaque phospholipide ainsi que l'activit6 de l'oxydor6ductase sont exprim6es en pourcentage des valeurs mesur6es dans l'6ehantillon t6moin (sans CaCI~ ni phospholipase A, non ineub6 h 30°). BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 10.
ron) sont chauff~es aux temperatures indiqu~es pendant un temps fixe de 5 minutes, dans 0,25 ml de Tris (2.10-2 M)-mal~ate, MgCI_o 10-2 M, pH 7,5. Le test est effeetu~ ~t 30 ° apr6s addition des autres ingredients (voir m~thodes) dans un volume final de 1 ml. k : eonstante de vitesse de la r~aetion d'inactivation ; t : temps fixe de chauffage. En appelant a le r a p p o r t : activit~ enzymatique avant chauffage/aetivit6 enzymatique apr6s 5 rain de ehauffage, on a : log a = ~t/2,31. Oxydation de la ph~nylalanine : enveloppes provenant de bact~ries eulh'v~es h 38°C (cereles noirs), eultiv~es h 14°C (eercles blancs). Oxydation de l'histidine : enveloppes provenant de bact~ries eultiv~es h 38°C (triangles noirs), eultiv~es h 14°C (triangles blancs). p r e s s i o n des i o n s c a l c i u m e n t r a i n e u n e d i m i n u t i o n des effets c o n s t a t 6 s s u r l ' a c t i v i t 6 des e n v e l o p p e s et s u r les p h o s p h o l i p i d e s , n o l a m m e n t en ee q u i c o n c e r n e la c a r d i o l i p i n e . D a n s la m e s u r e off les p h o s p h o l i p i d e s s e r a i e n t e n t i ~ r e m e n t n6cess a i r e s h l ' a c t i v i t 6 o x y d a s i q u e on p o u r r a i t e x p l i q u e r la r 6 s i s t a n c e p a r t i e l l e de celle-ci h la p h o s -
M~tabolisme intermddiaire et dnergdlique-Membranes. pholipase A en a d m e t t a n t soit u n m a n q u e d'accessibilit6 de certains p h o s p h o l i p i d e s associ6s h l'oxydor6ductase, soil une association pr6f6rentielle de cette enzyme avec la c a r d i o l i p i n e . Une lroisi~me hypoth6se consiste h envisager la possibilit6 p o u r les lysod6riv6s d ' e x e r c e r sur le systbme 6tudi6 le m~me r61e f o n c t i o n n e l que Ies phospholipides intacts. Sachant que la p h o s p h o l i p a s e de v e n i n de crotale d6sacyle la position 2 d,u subslral l i p i d i q u e que l'on consid6re comme occup6e pr6f6rentiellement p a r des acides gras insatur6s ~13, 32], la t r a n s f o r m a t i o n des p h o s p h o l i p i d e s activateurs en lysod6riv6s devrait s ' a c c o m p a g n e r d ' u n e a u g m e n t a t i o n de la temp6rature de t r a n s i t i o n du syst6me mesur6. Nous avons effectivement observ6 une telle variation, de l ' o r d r e de 2 h 4°C. Cette a u g m e n t a t i o n est n 6 a n m o i n s assez faible et ne permet gu6re de t r a n c h e r entre ces diff6rentes bypothbses.
Stabilit~ thermique des enzymes oxydant la ph~nylalanine el l'histidine. L ' i n a c t i v a t i o n fi 51°C de l'activit6 oxydasique des enveloppes fi l'6gard des acides amin6s ob6it ,i • une cin6tique du p r e m i e r ordre ; elle est plus rapide p o u r l ' h i s t i d i n e que pour la p h 6 n y l a l a n i n e [3]. Au cours d,e ce travail nous avons constat6 que la p h 6 n y l a l a n i n e - D C I P oxydor6ductase des enveloppes 6tail 16g6remen! plus thermolabi!e 51°C q u a n d les baet6ries a v a i e n t 6t6 eultiv6es "~ 14 ° au lieu de 38 °. Nous avons done mesur6 h diff6rentes temp6ratures la vitesse de d6naturation de l'enzyme p r o v e n a n t , soit de bact6ries eultiv6es ~ 14 ° , soil de bact6ries cultiv6es ~ 38 ° . La figure 8 m o n t r e les graphiques d ' A r r h 6 n i u s de ces vitesses de d6naturation. P o u r l'oxydation de la p h 6 n y l a l a n i n e , la d 6 n a t u r a t i o n corr e s p o n d h une 6nergie d ' a c t i v a t i o n qui est plus forte dans le p r e m i e r eas (enveloppes-14 °) que dans le second. Les 6nergies d ' a c t i v a t i o n ealcul6es sont r e s p e c t i v e m e n t de 68 000 et 33 000 calories par mole e n v i r o n . On voit 6galement que l'aetivit6 est plus t h e r m o l a b i l e dans le p r e m i e r eas h condition que la t e m p 6 r a t u r e atteigne une certaine valeur (plus de 50°C dans l ' e x p 6 r i e n c e de la figure 8). Notons enfin q u ' o n ne retrouve pas ce p h 6 n o m 6 n e si on e x a m i n e l ' o x y d a t i o n de l'histidine. II est t e n t a n t de supposer que les changements constat6s au n i v e a u de l ' e n z y m e sp6cifique de la p h 6 n y l a l a n i n e refl6tent les v a r i a t i o n s du mode d'association e n t r e la p r o t 6 i n e et les phosp h o l i p i d e s qui l ' e n t o u r e n t et d 6 p e n d e n t ainsi de la n a t u r e des acides gras pr6sents. D'autre part le e o m p o r t e m e n t diff6rent des enveloppes selon que le substrat utilis6 est la p h 6 n y l a l a n i n e ou l'histidine confirme que l ' o x y d a t i o n de ces deux acides amin6s est exerc6e p a r deux prot6ines distinctes.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 10.
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DISCUSSION ET CONCLUSION. Les r6sultats pr6sent6s dans la p r e m i 6 r e partie de ce travail m o n t r e n t que la c o m p o s i t i o n en p h o s p h o l i p i d e s des enveloppes isol~es de P. mirabilis pr6sente de profondes analogies avec les donn6es obtenues ehez d'autres ent6robaet6ries el n o t a m m e n t E. colt [13]. Le e o n s t i t u a n t m a j e u r est la p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e qui repr6sente plus des deux tiers du p h o s p h o r e l i p i d i q u e extrait p a r la m6thode de F o l e h et coll. [8]. Le p h o s p h a ! i d y l glye6rol e t l a e a r d i o l i p i n e sont 6galement pr6sents en quantit6s notables. I1 est p r o b a b l e que les lysod6riv6s d6cel6s dans les enveloppes p r o v i e n n e n t d ' u n e h y d r o l y s e e n z y m a t i q u e au eours de la pr6p a r a t i o n . L'aetivit6 oxydasique des enveloppes est g6n6ralement tr~s stable au cours d ' u n stockage prolong6 h 0°C : d a n s u n e p u b l i c a t i o n a n t 6 r i e u r e [3] nous avons suppos6 que cette stabilit6 6tail due h l ' i n a c t i v a t i o n des phospholipases endogbnes p a r le t r a i t e m e n t alcalin des cellules et la prbsence d ' u n agent c o m p l e x a n t des cations divalents. Des essais n o n d6crits dans cet article nous ont en fait montr6 que les enveloppes ainsi obtenues c o n s e r v e n t une activit6 p h o s p h o l i p a s i q u e de type A ainsi q u ' u n e deuxibme activit6 a t t r i b u a b l e ~t une lysophospholipase, mats que ces enzymes ne d6gradent n o t a b l e m e n t les lipides in silu q u ' e n pr6sence d ' u n d6tergenl (Triton X 100) ou d'6thanol. L ' h y d r o l y s e consid6rable q u ' o n peut o b t e n i r dans la fraction l i p i d i q u e des enveloppes p a r l ' a d d i t i o n d ' u n e p h o s p h o l i p a s e exogbne (de v e n i n de crotale) n ' e n l r a i n e q u ' u n e i n a c t i v a t i o n partielle du systbme oxydasique, c o n f i r m a n t ainsi les observations ant6rieures [3]. Cette action 6pargne u n e grande partie de la c a r d i o l i p i n e qui persiste dans un r a p p o r t c o m p a r a b l e h celui de l'activit6 enzym a t i q u e mesur6e en u t i l i s a n t la p h 6 n y l a l a n i n e comme substrat. Si les p h o s p h o l i p i d e s sont n6cessaires h l ' o x y d a t i o n e n z y m a t i q u e de cet acide a m i n 6 par les enveloppes on peut supposer que la c a r d i o l i p i n e joue dans cette association u n r61e privil6gi6. Cette hypothbse est h r a p p r o c h e r d ' u n e observation de Kilo et coll. [33] sur le t r a n s p o r t de ~-galactoside chez E. colt. La r6sistance partielle de l'activit6 oxydasique peut c e p e n d a n t recevoir d'autres explications. Tout d ' a b o r d il est possible que les relations f o n c t i o n n e l l e s prol6ineslipides ne c o n c e r n e n t q u ' u n e fraction trbs limit6e des p h o s p h o l i p i d e s m e m b r a n a i r e s : certains constituants p o u r r a i e n t c o n t r a c t e r avee l ' e n z y m e u n e association 6troite plus ou m o i n s p e r m a n e n t e off ils seraient fortement prot6g6s de Faction des phospholipases exog6nes. D ' a u t r e part on ne peut exclure a priori que les lysoddriv6s p u i s s e n t lenir, au m o i n s en partie, le m6me r61e f o n c t i o n n e l 84
1296
G. A r l a u d , H. J o u v e et J. P e l m o n t .
auprbs de l ' o x y d o r 6 d u c l a s e que les p h o s p h o l i p i d e s intacts. Cette discussion pose le p r o b l b m e de l'homog6n6it6 de la p h a s e l i p i d i q u e des e n v e l o p p e s au p o i n t de r u e f o n c t i o n n e l . La cassure visible sur les g r a p h i q u e s d ' A r r h 6 n i u s pr6sent6s au cours de ce t r a v a i l semble m e t t r e en l u m i b r e l ' i n t e r v e n t i o n de la p o r t i o n l i p i d i q u e des e n v e l o p p e s sur les o x y d o r ~ d u c t a s e s 6ludi6es. Est elle due ~ une m o d i f i c a t i o n d ' e n s e m b l e de l'6tat p h y s i q u e des lipides, e o m m e il est g6n~ralement admis, ou est elle like h u n e h a n g e m e n t local de l ' a s s o c i a t i o n enzyme-lipide ? La c o m p o s i t i o n en acides gras des p h o s p h o l i p i d e s dans les e n v e l o p p e s de P. mirabilis est sujette h des v a r i a t i o n s i m p o r t a n t e s en f o n c t i o n de la t e m p 6 r a t u r e et de la p h a s e de eroissance. L ' a b a i s s e m e n t de la t e m p 6 r a t u r e de c r o i s s a n c e de 38 ° h 14°C s'accompagn.e d'un r e l ~ v e m e n t du r a p p o r t acides gras i n s a t u r 6 s / a c i d e s gras satur6s de 0,57 h 1,38. Cette t r a n s f o r m a t i o n c o i n c i d e avee une p r o f o n d e d i m i n u t i o n de la t e m p 6 r a t u r e de transition. Dans le eas du t r a n s p o r t des 8-galactosides ehez E. coli les v a r i a t i o n s de c o m p o s i t i o n en acides gras constat~s p a r Kito et coll. [33] a p p a r a i s s e n t comparativemen.t p e u i m p o r t a n t s , ce qui p o u r r a i t e x p l i q u e r l ' a b s e n c e d ' u n dSplacem e n t net de la t r a n s i t i o n constat6e p a r ces auteurs. D ' a u t r e p a r t le passage des bact6ries h la p h a s e s t a t i o n n a i r e s ' a c c o m p a g n e du r e m p l a c e m e n t p a r t i e l des acides gras insatur6s p a r des acides gras c y c l o p r o p a n i q u e s et entraine, h 14 ° et 36"C, un r e l 6 v e m e n t m a r q u 6 de la t e m p e r a t u r e de t r a n s i t i o n qui d~passe dans les d e u x cas la v a l e u r trouv~e p o u r les bact6ries cultiv~es en p h a s e e x p o n e n t i e l l e h 38 °. Les aeides gras cyclop r o p a n i q u e s c o n t r i b u e n t d o n e h r e n d r e ]a m e m b r a n e plus rigide. On peut s ' i n t e r r o g e r sur la signification p h y s i o l o g i q u e de ces c h a n g e m e n t s d'~tat au sein de la m e m b r a n e et s u p p o s e r p a r e x e m p l e q u ' u n e mobilit~ a c c r u e de l ' e n s e m b l e des mol6cules l i p i d i q u e s f a v o r i s e c e r t a i n e s f o n c t i o n s m e m b r a n a i r e s i m p o r t a n t e s . Cette question, plusieurs fois discut6e ~13, '24=28], reste obscure. On r e m a r q u e que P. mirabilis cultiv6 h des temp6ratures sup6rieures h 22-25°C m a i n t i e n t sa m e m b r a n e h l'6tat fluide, m6me apr~s arr6t de la croissance, alors q u ' i l n ' e n est pas de mSme p o u r ces bact6ries cultiv6es h basse t e m p 6 r a t u r e l o r s q u ' e l l e s atteignent la p h a s e s t a t i o n n a i r e . Le c h a n g e m e n t p h y s i o l o g i q u e qui en r6sulte est peut-6tre plus i m p o r t a n t et m 6 r i t e r a i t sans doute un e x a m e n d6taill6. Les diff6rences de c o m p o s i t i o n en acides gras des p h o s p h o l i p i d e s s e m b l e n t 6galement s ' a c c o m -
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p a g n e r d'un effet int6ressant sur l ' 6 n e r g i e d'activation raise en jeu p a r la d 6 n a t u r a t i o n darts le cas de la p h 6 n y l a l a n i n e - D C I P o x y d o r 6 d u c t a s e . II est t e n t a n t de s u p p o s e r que cette 6nergie d'activation d6pend de l ' e n v i r o n n e m e n t l i p i d i q u e imm6diat de la prot6ine. La pr6sence de doubles liaisons port6es p a r les acides gras p o u r r a i t cr6er des a t t r a c t i o n s s u p p l 6 m e n t a i r e s entre les l i p i d e s et certains groupes polaires de la prot6ine, qui s e r a i e n t n6cessaires h l'activit6 en.zymatique. L ' h i s t i d i n e - D C I P o x y d o r 6 d u c t a s e est plus t h e r m o labile. I1 se peut que cette e n z y m e pr6sente le m6me p h 6 n o m b n e qui serait masqu6 p a r la rupture d ' a u t r e s liaisons i n t e r v e n a n t h une temp6r a t u r e plus basse. I1 est d o n c tout h fair possible que le c o m p o r t e m e n t de ces enzymes soit r6gl6 non s e u l e m e n t p a r l'6tat p h y s i q u e de l ' e n s e m b l e de la m e m b r a n e mats aussi p a r des r e l a t i o n s tr6s localis6es avec c e r t a i n s c o n s t i t u a n t s p h o s p h o l i p i d i q u e s . Cette question ne p o u r r a 6tre analys6e en d6tail qu'h 1'aide d ' e x p 6 r i e n c e s de r e c o n s t i t u tio.n entre divers p h o s p h o l i p i d e s et les oxydor6ductases p r 6 a l a b l e m e n t isol6es de la m e m b r a n e et purifi6es.
Remerciements. Ce travail a b6n6fiei4 d'nne Aide Individuelle du Centre National de la Recherche Scientifique, Section de Biologic Cellulaire. R~suM~. Les enveloppes de Proteus mirabilis renferment des activit4s L-aminoacide oxydasiques, mesur~es par r~duction du dichloroph4nolindoph~nol (DCIP). Les relations fonctionnelles de ces enzymes avec les phospholipides out ~t~ abord~es. La phosphatidyl~thanolamine (60-75 p. cent), le phosphatidylglyc~rol (10-15 p. cent) et la cardiolipiue (10 p. cent) sont les eonstituants phospholipidiques majeurs des enveloppes, qui renferment en outre des quantit~s notables de lysod~riv~s. Les acides gras phospholipidiques principaux sont ]'acide palmitique, un acide oetad~c6noique, l'acide palmitol6ique et deux acides gras cyclopropaniques. L'abaissement de la temp6rature du milieu de culture entraine une augmentation importante du taux des acides gras insatur6s dans les enveloppes par rapport h leurs homologues satur~s. Le passage h la phase statiunnaire s'acco.mpagne d'une augmentation des aeides gras cyc.lopropaniques au d~triment des insatur4s. Ces variations coincident avec des modifications de la transition thermique observde sur les graphiques d'Arrh6nius de la L-ph6nylalanine-DCIP oxydordductase et de la L-histidine-DCIP oxydor6ductase. Une augmentation des aeides gras insatur~s abaisse la tempSrature de transition et celle des acides gras cyclopropaniques l'dl6ve. La phospholipase A de venin de serpent d6trnit la majeure partie des phospholipides h l'exception de la cardiolipine qui persiste h un taux 61ev6 comparable h l'aetivit6 r~siduelle de l'oxydor6ductase. L'6nergie d'activation de la d6naturation thermique des oxydorSduetases semb]e li6e, en ce qui concerne l'oxydation de la phdnylalanine, aux modifications de la composition en acides gras consdcutive h l'abaissement de la temperature de culture.
Mdtabolisme
intermddiaire
BIBLIOGRAPHIE. 1. Stumpf, P. K. ~, Green, D. E. (1944) J. Biol. Chem., 153, 387-403. 2. Henriksen, S. D. (1950) J. Baelerinl., 60, 225-231. 3. Pelmont, J., Arlaud, G. ,~ Rossat, A. M. (1972) Binchimie, 54, 1359-1374. 4. Katz, "W., Berger, D. ~, Martin, H. H. (1971) Biochim. Binphys. Acta, 244, 47-57. 5. Zack, B. & Cohen, J. (1961) Clin. Chim. Acta, 6, 665670. 6. Bartlett, G. R. (1959) J. Biol. Chem., 234, 466-468. 7. Bray, G. A. (1960) Anal. Biochem., 1, 279-285. 8. Folch, J., Lees, M. & Sloane-Stanley, G. H. (1957) J. Biol. Chem., 226, 497-509. 9. White, D. C. (1968) J. Baeleriol., 96, 1159-1170. 10. Short, S. A., ~ h i t e , D. C. a Aleem, M. I. H. (19691 J. Bacterinl., 99, 142-150. 11. Lorette, N. B. a Brt~wn, 3. H. (1959) J. Org. Chem., 24, 261-262. 12. James, A. T. (1960) Methnds Biochem. Anal., 8, 1-59.
13. Cronan, J. E. a Vagelos, P. R. (1972) Binchim. Binphys. Acta, 265, 25-60. 14. Randle, C. L., Alhro, P. W. a Dittmer, J. C. (1969) Biochim. Binphys. Acta, 187, 214-220. 15. Kanemasa, Y., Akamatsu, Y. a Nojima, S. (1967) Biochim. Biophgs. Acta, 144, 382-390. 16. Ono, Y. ~ Nojima, S. (1969) Biochim. Biophys. Acta, 176, 111-119. 17. Cunningham, C. C. a Hater, L. P. (1971) J. Biol. Chem., 246, 1575-1582.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 10.
et dnergdtique-Membranes.
1297
18. Simmler, M. C. a Barbu, M. E. (1970) Ann. Inst. Pasteur, Paris, 119, 289-301. 19. Arlaud, G. (1973) Th6se Doetorat 3" Cycle, Universit6 de Grenoble I. 20. Gronan, J. E. (1967) Binchim. Biophys. Acta, 144, 695-697. 21. Kremhel, J. (1964) Bull. Soc. Chim. Biol., 46, 503508. 22. Gronan, J. E. (1968) J. Bacleriol., 95, 2054-2061. ,'23. Sinensky, M. (1971) J. BacterinL, 106, 449-454. 24. Shairer, H. U. a Overath, P. (1969) J. Mol. Biol., 44, 209-214. 25. Wilson, G., Rose, S. P. ~ Fox, C. F. (1970) Biochem. Biophys. Res. Comm., 38, 617-623. 26. Wilson, G. a Fox, C. F. (1971) J. Mnl. Biol., 55, 4960. 27. Overath, P., Hill, F. F. ,~ Lamneck-Hirsch, I. (1971) Nature Ne,w Biol., 234, 264-267. 28. Gramer, W. A., Phillips, S. K. • Keenan, T. W. (1973) Biochemistry, 12, 1177-1181. 29. Esfahani, M., Crowfoot, P. D. ,~ Wakil, S. J. (1972) J. Biol. Chem., 247, 7251-7256. 30. Esfahani, M., Limbriek, A. R., Knutton, S. a Wakil, S. J. (1971) Fed. Proe., 30, 1120. 31. Schechter, E., Gulik-Krzywieki, T. ,t Kaback, H. R. (1972) Biochim. Biophys. Acta, 274, 466-477. 32. Long, C., Odavic, R. 8, Sargent, E. J. (1963) Binchem. J., 87, 13P. 33. Kito, M., Aibara, S., Kato, M., Ishinaga, M. a Hata, T . (1973) Binchim. Binphys. Aela, 298, 69-74.
Phospholipides et oxydation des acides aminds chez Proteus mirabilis. G6rard ARLAUD, HGl~ne J o u v E et J e a n PELMONT. Laboratoire de Biochimie, C.E.R.M.O., Universit~ Scientffique et MEdicale de Grenoble, B.P. 53, 38041 Grenoble Cedex. (9-7-1973). Summarg. I L - a m i n o a c i d oxidase activities are f o u n d in envelopes isolated from P. mirabilis and are m e a s u r e d by reduction of d i c h l o r o p h e n o l i n d o p h e n o l (DCIP). Funct i o n a l i n t e r a c t i o n between these enzymes a n d p h o s p h o l i p i d s have been examined. Main p h o s p h o l i p i d c o m p o n e n t s of envelopes are f o u n d to be p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e (60-75 p. cent), phosphatidylglycerol (10-15 p.. cent) a n d c a r d i o l i p i n (10 p. cent) associated with significant a m o u n t s of lysoderivates. Main p h o s p h o l i p i d f a t t y acids are palmitic, octadecenoic a n d palmitoleic a c i d s ; two cyclopropanic f a t t y acids are present as well. Lowering the growth t e m p e r a t u r e of the bacteria leads to a significant rise of the u n s a t u rated f a t t y acid level of the envelopes as compared to t h e i r s a t u r a t e d homologs. A s h i f t t o w a r d the s t a t i o n a r y phase results in a n increase of cyclopropanie f a t t y acids related to a lower level of u n s a t u r a t e d compounds. The v a r i a t i o n s are paralleled w i t h shifts of the t h e r m a l t r a n s i t i o n seen on A r r h e n i u s plots of L - p h e n y l a l a n i n e - D C I P oxidoreductase and L-histidine-DCIP oxidoreductase activities. Increasing the u n s a t u r a t e d f a t t y acid level results in a drop of the t r a n s i t i o n point, avhereas a rise in the cyclopropanic f a t t y acid level h a s the opposite effect. Snake v e n o m p h o s p h o l i p a s e A destroys m o s t of the envelope phospholipids, except for c a r d i o l i p i n w h i c h persists at a c o m p a r a t i v e level w h i c h is s i m i l a r to the percentage of the r e m a i n i n g oxidoreductase activity. Energy of a c t i v a t i o n linked to t h e r m a l d e n a t u r a t i o n of the oxidoreductase specific for p h e n y l a l a n i n seems to be related to the f a t t y acid p a t t e r n induced by a lower t e m p e r a t u r e for growth.
INTRODUCTION. L e s b a c t G r i e s d u g e n r e Proteus e f f e c t u e n t la d G s a m i n a t i o n o x y d a t i v e d e la p l u p a r t d e s a c i d e s a m i n 6 s n a t u r e l s [1], et l a f o r m a t i o n d e p h 6 n y l p y r u v a t e ~ p a r t i r d e la L - p h G n y l a l a n i n e est fr6q u e m m e n t u t i l i s 6 e p o u r c a r a c t G r i s e r Proteus et Providencia [2]. U n e p r e m i b r e 6 r u d e effectuGe ~ l ' a i d e d ' e n v e loppes prGpar6es par lyse des sphGroplastes de
Abrdviations : DEGS DCIP DPG EDTA EGTA
: di~.thylGneglycol-suecinate. : dichloroph~nolindoph~nol. diphosphatidylglyc~rol. : 6thylGnediamine-t~traacdtate. : 6thy16ncglycol-bis-(2-aminoGthyl)N,N,N',N'-t~traacGtate. a GP : ct-glycGrophosphate. GPE : glycGrylpho s p h o r y l ~ t h a n o l a m i n e . GPG : glycGrylphosphorylglycGrol. GPGPG glycdrylphosphorylglycGrylphosphorylglycGrol. GPMME: glyc.Grylphosphoryl-N-monom~thylGthanolamine. LPE : lvsophosphatidyldthanolamine, LPG lx'sophosphatidylglye6rol. PA acide p h o s p h a t i d i q u e . PE : phosphatidyl~thanolamine. PG : phosphatidylglycGrol. PMME phosphatidyl-N-monomGthvl~thanolamine. PMS phGnazine mGthosulfate.
Proteus mirabilis h p H a l e a l i n e n p r G s e n c e d ' u n agent complexant des cations divalents a montr6 l'existence d'au moins deux systGmes oxydasiques d i f f G r e n t s [3], s e l o n q u e la r G a c t i o n p o r t e s u r les aminoacides apolaires h chalne latGrale aliphat i q u e o u a r o m a t i q u e , o u s u r les a c i d e s a m i n G s h c h a i n e l a t G r a l e c a t i o n i q u e . Ces o x y d a t i o n s c o n v e r g e n t v e r s l ' o x y g b n e p a r l ' i n t e r m G d i a i r e d e la chaine respiratoire mats peuvent 6tre mesurGes h l'aide du dichloroph6nolirrdoph6nol comme accept e u r d ' 6 1 e c t r o n s a r t i f i c i e l . L ' e f f e t - d e la p h o s p h o l i p a s e A d u v e n i n d e s e r p e n t s u r l a r G a c t i o n et les variations de celle-ci en fonction de la tempGral u r e s u g g G r e n t q u e l ' o x y d a t i o n d e la p h G n y l a l a n i n e est, a u m o i n s p a r t i e l l e m e n t , s o u s la dGpend a n c e d e s p h o s p h o l i p i d e s d e l ' e n v e l o p p e [3]. Ce t r a v a i l c o n s t i t u e l a p r e m i G r e p a r t i e d ' u n e 6 t u d e d o n t le b u t est l ' e x a m e n dGtaill6 d e s r e l a t i o n s e n t r e les a n a i n o a c i d e o x y d a s e s et les p h o s p h o l i p i d e s d e Proteus. L e s o b s e r v a t i o n s d G c r i t e s clans ce q u i s u i t m o n t r e n t n o t a m m e n t q u ' i l e x i s t e u n p a r a l l 6 1 i s m e e n t r e la c o m p o s i t i o n d e s p h o s p h o l i p i d e s e n a c i d e s g r a s et le c o m p o r t e m e n t d e s aminoacide oxydases h diverses tempGratures, en ce q u i c o n c e r n e l ' a c t i v i t 6 e n z y m a t i q u e e t l a stab i l i t 6 d u systGme.
G. Arlaud, H. J o u v e et J. P e l m o n t .
1288
M A T E R I E L ET METHODES.
Souche el milieux de culture. Proteus mirabilis, sans c a r a c t b r e s g6n6tiques p a r t i c u l i e r s , p r o v i e n t de la Collection de l ' I n s t i t u t Pasteur, Paris. La s o u c h e est e n t r e t e n u e sur g61ose n u t r i t i v e c o m m e p r 6 c 6 d e m m e n t d 6 c r i t [3]. Les cultures en m i l i e u l i q u i d e sont a6r6es p a r agitation dans nn m i l i e u c o n t e n a n t p o u r 1 1 : p e p tone (Prolabo) 20 g ; e x t r a i t de levure (M6rieux) 5 g ; glucose 4 g. Prdparalion des enveloppes. Nous avons utilis6 la m 6 t h o d e de la r6f6r e n c e [3] modifi6e c o m m e suit : les bact6ries cultiv6es en m i l i e u l i q u i d e (2 l, e n v i r o n 2.10 s cell./ml) sont centrifug6es 20 rain h 10 00~) g. Aprbs un lavage p a r c e n t r i f u g a t i o n dans le T r i s (2.10-2 M)malbate, s a c c h a r o s e 0,4 M, EDTA (Na) 10 -2 M (pH 7,5), les b a c t 6 r i e s sont s u s p e n d u e s d a n s 30 ml de ce t a m p o n et incub6es 5 rain h 30°C en prdsence d ' u n e forte dose de l y s o z y m e (100 ~ g / m l , Boehringer) : b i e n q u ' a y a n t peu d'effet s u r la p a r o i de Proteus [4] cette e n z y m e facilite cepend a n t la lyse ult6rieure des cellules. Aprbs a d d i t i o n d ' u n volume d ' E G T A (ou Chel-DE, f o u r n i p a r Sigma) 0,2 M h p H 10,5, le m61ange est agit6 h l ' a i d e d ' u n b a r r e a u magn6tique p e n d a n t au m o i n s 30 rain h 0°C, le p H 6tant m a i n t e n u h 10,5-10,7 p a r de petites a d d i t i o n s de KOH. Apr6s une centrifugation (20 rain h 30 000 g) suivie de deux lavages p a r c e n t r i f u g a t i o n dans le T r i s (2.10-2 M)-mal6ate (pH 7,5) les p a r t i c u l e s sont homog6n6is6es dans 10 ml de ce t a m p o n . Dans c e r t a i n s cas pr6cis6s plus loin la m 6 t h o d e de la r6f6rence [3] a 6t6 utilis6e int6gralement. Mesure de l'activit~ oxydasique par le dichlorophdnolindophdnol. Le m61ange test c o n t i e n t dans 1 m l : L-aminoa c i d e (Merck) 50 ~moles, MgCL 10 ~tmoles, T r i s (20 J~tmoles)-mal6ate, p H 7,5, DCIP (Fluka) 0,06 ~vmole, PMS ( S c h u c h a r d t ) 0,82 .umole. Le m6lange est form6 au d e r n i e r m o m e n t h l ' a b r i de la lumibre. Aprbs a d d i t i o n des p a r t i c u l e s (concent r a t i o n finale : 2 fi 50 .~g de p r o t 6 i n e s totales p a r ml), la d i m i n u t i o n de densit6 optique h 600 n m est enregistr6e h l ' a i d e d ' u n s p e c t r o p h o t o m b t r e Unic a m SP 500 m u n i d ' u n e cellule t h e r m o s t a t 6 e 30°C et d ' u n e n r e g i s t r e u r SP 22. Une v a r i a t i o n de densit6 o p t i q u e de 0,1 c o r r e s p o n d h la r6duction de 6,25 ~moles de DCIP. Dosage des prot~ines el du phosphore. Aprbs p r 6 c i p i t a t i o n p a r l ' a c i d e t r i c h l o r o a c 6 tique, on m e s u r e les p r o t 6 i n e s totales p a r la m6t h o d e de F o l i n - L o w r y modifi6e p a r Z a c k et
BIOCHIMIE, 1 9 7 3 ,
55, n ° 10.
Cohen [5] en u t i l i s a n t la s 6 r u m - a l b u m i n e b o v i n e c o m m e prot6ine-6talon. Le p h o s p h o r e p h o s p h o l i p i d i q u e est dos6 p a r la m 6 t h o d e de Bartlett [6] aprbs m i n 6 r a l i s a t i o n h u m i d e de l ' 6 c h a n t i l l o n (45 m i n h 250°C cn pr6sence de H2SO4) compl6t6e p a r un chauffage de 10 m i n fi 250 ° aprbs a d d i t i o n de quelques gouttes de H20 2 ~ 30 volumes. Darts les c o n d i t i o n s utilis6es 3 i~g de p h o s p h o r e c o r r e s p o n d e n t h une densit6 o p t i q u e de 0,49 h 830 rim. La p l u p a r t des d 6 t e r m i n a t i o n s q u a n t i t a t i v e s ont 6t6 effectu6es h p a r t i r d ' e n v e l o p p e s marqu6es p a r le phosphore-32, aprbs i n c o r p o r a t i o n de H~PO4 [32p] au m i l i e u de c u l t u r e (1 "h 10 mC/1). L'activit6 sp6cifique n n i f o r m e v a r i a i t selon les p r 6 p a r a t i o n s de 5.10 '3 h 5.104 dpm/txg de p h o s p h o r e . La r a d i o activit6 est mesur6e p a r c o m p t a g e en s c i n t i l l a t i o n l i q u i d e dans le l i q u i d e de B r a y [7! h l ' a i d e d ' u n a p p a r e i l I n t e r t e c h n i q u e SL 30.
Analyse des phospholipides el des acides 9ras. Les p h o s p h o l i p i d e s ont 6t6 e x t r a i t s p a r la m6t h o d e de F o l c h et coll. [8] aprbs s u s p e n s i o n des 6chantillons dans le c h l o r o f o r m e - i n 6 t h a n o l (2/1, v/v). a) c h r o m a t o g r a p h i e sur colonne d ' a c i d e silicique : p o u r 1 mg de p h o s p h o r e l i p i d i q u e , 2 g d ' a c i d e silicique (Mallinckrodt) et 1 g de Celile 545 (Prolabo) sont pr6activ6s p e n d a n t une nuit /l 120°C, s u s p e n d u s darts un volume de c h l o r o f o r m e suffisant p o u r f o r m e r une bouillie homog6ne, qui est d6pos6e u n i f o r m 6 m e n t dans une c o l o n n e de v e r r e et lav6e a b o n d a m m e n t p a r le c h l o r o f o r m e . L ' 6 c h a n t i l l o n l i p i d i q u e est d6pos6 au s o m m e t du gel clans une solution c h l o r o f o r m i q u e de 1 ~ 5 ml. Le c h l o r o f o r m e (15 h 20 ml p a r mg de p h o s p h o r e l i p i d i q u e d6pos6) e n t r a i n e les l i p i d e s neutres. Les p h o s p h o l i p i d e s sont 61u6s p a r le m6thanol (20 25 ml p a r mg de p h o s p h o r e ) ou p a r des m61anges chloroforme-m6~hanol en p r o p o r t i o n s v a r i a b l e s (voir r6sultats) dans le but de s 6 p a r e r les phospholipides individuels. b) c h r o m a t o g r a p h i e sur eouche m i n c e : on utilise des p l a q u e s de gel de silice G (Merck) 20 × 20 cm, d ' 6 p a i s s e u r 0,5 mm, activ6es p e n d a n t une h e u r e 30 fi 100°C. La c h r o m a t o g r a p h i e est r6alis6e d a n s le solvant c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l / e a u (65/25/ 4, v / v ) ou d a n s un syst6me b i d i m e n s i o n n e l [9] avec le c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l / a m m o n i a q u e 7N (~6/36,4 /5 v / v ) dans la p r e m i 6 r e dimen,sion, et le c h l o r o f o r m e / m 6 t h a n o l / a c i d e a c 6 t i q u e / e a u (90/ 14/6, 3/1 v / v ) dans la s e c o n d e d i m e n s i o n . On localise les p h o s p h o l i p i d e s p a r les v a p e u r s d'iode, p u l v 6 r i s a t i o n de n i n h y d r i n e et a u t o r a d i o g r a p h i e ( K o d a k Regulix).
M d t a b o l i s m e i n t e r m d d i a i r e el d n e r g d t i q u e - M e m b r a n e s . c) h y d r o | y s e e n z y m a t i q u e des p h o s p h o l i p i d e s : la p h o s p h o l i p a s e A (EC 3.1.1.4) de venin de Crotale, et la p h o s p h o l i p a s e D du c h o u x (EC 3.1.4.4.) ont 6t6 utilisOes dans les c o n d i t i o n s suivantes : la solution p h o s p h o l i p i d i q u e est 6vapor6e ~ sec sous azote h 30°C et r e p r i s e dans 1,0 ml d'Other 6thylique. On y ajoute le m i l i e u r e a c t i o n n e l (2,0 ml) contenant, dans le p r e m i e r c a s : p h o s p h o l i p a s e A (Boehringer) 10 :ag, t a m p o n g l y c y l g l y c i n e 20 ~moles, CaCI 2 10 ~moles, MgCI~ 1 ~mole dOsoxycholate de s o d i u m 10 ,~inoles, (pH = 8,9) ; d a n s le s e c o n d cas : p h o s p h o l i p a s e D (Boehringer) 2 mg d ' e x t r a i t lyophilisO, t a m p o n acOtate de s o d i u m 200 ~moles, CaC12 40 ~moles (pH = 5,6). Apr~s i n c u b a t i o n h 30°C et 6vaporation du r e l i q u a t d'Other, on ajoute 4,4 ml de c h l o r o f o r m e / m O t h a nol (2/1, v / v ) . Le mOlange homogOnOis6 et c e n t r i fug6 se sOpare en deux phases ; la c o u c h e infOr i e u r e c h l o r o f o r m i q u e c o n t i e n t Ies p h o s p h o l i p i d e s et leurs p r o d u i i s de dOgradation qui sont analysOs p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur c o u c h e m i n c e . d) dOsacylation des p h o s p h o l i p i d e s : la mOthode utilisOe est celle de W h i t e [9], modifi6e c o m m e s u i t : le mOlange p h o s p h o l i p i d i q u e est dissout dans un v o l u m e de mOthanol/tolubne (1/1, v / v ) .
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FRACTIONS
Flo. 2. - - Chromatographie des phospholipides sur colonne d'acide silieique. Adsorbant : acide silicique 5 g A- c6lite 545 : 2,5 g ; colonne 15 X 1,1 cm ; dlution par les mOlanges de chloroforme-mdthanol (v/v) : 95/5, 80 m l ; 90/10, 26 ml ; 80/20, 125 ml. D6bit moyen : 0,7 m l / m i n ; volume des fractions : 3,3 ml. La radioactivit6 to.tale de chaque fraction est dOterminde par com4atage en scintillation liquide. AbrOviations : voir liste au bas de la premiOre page. Le deuxiOme pic de DPG est un artefact cans6 par le changement d'61uant.
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1289
•
•
"31
, •
/
++
,
,i
I
FIG. 1. - - Chromatographie bidimensionnelle des phospholipides extraits des enoeloppes de P. mirabilis. Les enveloppes on t 6t6 prOpar~es par la mOthode de la rOfOrence (3) non modifide. PremiOre dimension (sens horizontal): chloroforme-mOthanol-ammoniaque 7 N (66/36,4/5, v/v) ; deuxiOme dimension (sens vertical) : chloroforme-mOthanol-acide acOtique-eau (90/14/6,3/1, v/v). Les phospholipides sont rOvOlOs par autoradiographie et les lipides neutres par les vapeurs d'iode. Autres conditions expOrimentales : voir MatOriel et MOthodes. N I : compos6 non identifi6 ; L N : lipides neutres ; autres symboles : voir liste des abrOviations au has de la premiOre page.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 10.
61imin6e p a r c e n t r i f u g a t i o n , puis lavOe p a r 2 ml de m O t h a n o l / e a u (3/1, v / v ) et 2 ml d'eau. Les acides gras sont extraits p a r 3 fois 2 ml d'6ther de pOtrole et concentrOs p a r 6vaporation sons azote 30°C. La phase aqueuse c o n t e n a n t les esters g l y c 6 r o p h o s p h o r i q u e s est 6vapor6e h sec sous v i d e en p r 6 s e n c e d ' a n h y d r i d e p h o s p h o r i q u e . e) c h r o m a t o g r a p h i e des p h o s p h o l i p i d e s d6sacy16s: les esters g l y c 6 r o p h o s p h o r i q u e s lib6r6s p a r d6sacylation des p h o s p h o l i p i d e s sont c h r o m a t o graphi6s sur c o u c h e m i n c e de cellulose MN 300 (Macherey, Nagel & Co). Avant emploi, les plaques (20 X 20 cm, 6paisseur 0,25 ram) sont s6ch6es p e n d a n t une nuit /t t e m p 6 r a t u r e ambiante. Nous avons utilis6 dans la p r e m i b r e d i m e n s i o n : NHgOH
G. Arlaud, H. Jouve et J. P e l m o n t .
1290
9.10-2 M, EDTA (Na) 3,8.10-a M, b i c a r b o n a t e d ' a m m o n i u m 0,7 M, en solution dans l'6thanol 67 p. cent (v/v) ; d a n s la deuxi6me : acide isobut y r i q u e / e a u / N H 4 O H (66/33/1, v/v) [10]. E n t r e les deux d i m e n s i o n s , les plaques sont s6ch6es p e n d a n t une n u i t h t e m p 6 r a t u r e a m b i a n t e ; la dur6e de chaque m i g r a t i o n varie de 4 h 6 heures. f) analyse des acides gras : les acides gras obtenus p a r d6sacylation des p h o s p h o l i p i d e s sont m6thyl6s p a r la m6thode de Lorette et B r o w n [11] et analys6s p a r c h r o m a t o g r a p h i c en phase gazeuse. Les analyses ont 6t6 effectu6es h l'aide d ' u n chrom a t o g r a p h e Girdel 75 C D / P T 6quip6 d ' u n d6tecteur h i o n i s a t i o n de flamme. Deux colonnes ont 6t6 utilis6es, l ' u n e du type polaire (DEGS 4 p. cent (p/p) sur c h r o m o s o r b G-DMCS (80-100 mesh), l o n g u e u r 3 m, diam6tre 1/8", la seconde de type apolaire (Apiezon L 10 p. cent p / p ) sur chromosorb P-NAW (60-80 mesh), l o n g u e u r 2 m, diam~tre 1/8"). Le n o m b r e de plateaux th6oriques (mesur6 p o u r l'acide p a l m i t i q u e ) variait de 1 500 h 2 000. A l'aide d'acides gras s t a n d a r d s satur6s et monoinsatur6s, nous avons 6tabli des courbes d'6talonnage r e p r 6 s e n t a n t les v a r i a t i o n s lin6aires du logarithme du temps de r 6 t e n t i o n en fonction du n o m b r e de c a r b o n e s de l ' a c i d e gras, selon la m6thode de James [12]. Ces analyses, effectu6es diff6rentes temp6ratures, et l ' u t i l i s a t i o n de deux colonnes caract6ris6es p a r u n e r6tention diff6rente des acides gras insatur6s p a r r a p p o r t h ]curs homologues satur6s, ont p e r m i s d'identifier les p r i n c i p a u x acides gras des enveloppes de Proteus
mirabilis. RESULTATS.
Phospholipides des enveloppes de Proteus m i r a -
(EC.3.1.1.4.) g6n6ratrice des lysod6riv6s correspondants. L'action de cette enzyme sur la cardiol i p i n e se caract6rise p a r la f o r m a t i o n de deux lysod6riv6s s6parables sur couche m i n c e dans le chloroforme-m6thanol-eau (66/25/4, v/v). En outre le PG se caract6rise p a r la f o r m a t i o n d ' a c i d e p h o s p h a t i d i q u e (PA) en pr6sence de phospholipase D (EC.3.1.4.4.). La PE et ses p r o d u i t s de d6gradation sont facilement localis6s p a r leur r6ac-
GPGPG
O
GPE
.
,
-
~:
.~:
I
"
t,
O
FI6. 3. - - Chromatographic bidimensionnelle des ~hospholipides ddsacylds. Adsorbant : cellulose MN 300.
remi6re dimension (sens vertical) NH~OH 9.10 2 M, EDTA(Na) 3,8.10-3 M, NH~CO~H 0,7 M, en solution dans l'6thanol 67 p. cent (v/v). Deuxi6me dimension (sens horizontal) : acide isobutyrique-NH~OH 14 N-eau (66/ 133, v/v). Les phospholipides d6sacyl6s sont r~v616s par autoradiographie. NI : compos6 non identifi6 ; autres symboles : voir liste des abrdviafions au bas de la premi6re page.
bilis. L'analyse
qualitative
des
phospholipides
de
Proteus mirabilis, r6alis6e h l'aide de diff6rentes t e c h n i q u e s (cf. m6thodes) r6vble une r 6 p a r t i t i o n c o m p a r a b l e h celle qui a 6t6 d6crite p o u r d ' a u t r e s bact6ries Gram-n6gatives [13-15]. Les p r i n c i p a l e s fractions p h o s p h o l i p i d i q u e s des enveloppes isol6es, obtenues p a r c h r o m a t o g r a p h i c sur couche m i n c e (fig. 1) ou sur c o l o n n e d ' a c i d e siliciqne (fig. 2), sont la p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e (PE), le p h o s p h a t i d y l g l y c 6 r o l (PG) et la cardiolip i n e ou d i p h o s p h a t i d y l g l y c 6 r o l (DPG). Elles r e p r 6 s e n t e n t r e s p e c t i v e m e n t 60-75 p. cent, 10-15 p. cent et 10 p. 100 du p h o s p h o r e p h o s p h o l i p i d i q u e total. Ces c o n s t i t u a n t s ont 6t6 identifi6s : 1) p a r leurs p r o d u i t s de d6sacylation complbte, qui sont respective m e n t la GPE, le GPG et le GPGPG, isol6s sur couche m i n c e de cellulose (fig. 3) ; 2) p a r Faction de la p h o s p h o l i p a s e A de v e n i n
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 10.
tion avec la n i n h y d r i n e . E n f i a la n a t u r e de ces constituants a 6t6 v6rifi6e p a r leur c o m p o r t e m e n t c h r o m a t o g r a p h i q u e compar6 h des t6moins ou aux donn6es de litt6rature [16, 17]. Un c o n s t i t u a n t m i a e u r pr6sent p a r m i les phospholipides d6sacyl6s (fig. 3) p o u r r a i t correspondre fi la p h o s p h o r y l , N - m o n o m 6 t h y l 6 t h a n o l a m i n e (GPMME) p a r r6f6rence aux r6sultats d ' a u t r e s auteurs [10]. Ce compos6 est le p r o d u i t de d6sacylation de la p h o s p h a t i d y l - N - m o n o m 6 t h y l 6 t h a n o l a m i n e (PMME), n o n s6par6e de la PE dans les syst6mes de solvants utilis6s ; la PMME, qui repr~sente chez P. vulgaris u n e fraction phospho]ipidique i m p o r t a n t e (12 p. cent) [14], n'est pas d6cel6e chez E. colt [13]. L'identification de l'(t-glyc6rophosphate (~ GP) i n d i q u 6 h l'6tat de traces sur la figure 3 reste 6galement h confirmer.
M~tabolisme interm~diaire et dnergdtiqlte-Membranes.
1291
une d i m i n u t i o n du taux de PE au sein des enveloppes, ainsi que l ' a p p a r i t i o n de lysoddriv6s tels que la L P E et le LPG (fig. 1 et tableau I). Le total PE + L P E des e n v e l o p p e s est r e l a t i v e m e n t
Les rdsultats du tableau I montrent des diff6r e n c e s s i g n i f i c a t i v e s e n t r e la c o m p o s i t i o n e n p h o s p h o l i p i d e s d e s e n v e l o p p e s c e l l u l a i r e s et d e s b a c tdries dont elles sont issues: on peut constater
TABLEAU I.
Analyse des phospholipides de P r o t e u s m i r a b i l i s . Echantillons
cP E pe.
Bact~ries enti~res
cPG ep.
74,8
DPGp.centLPE p.cea!
9,9
LPG p.cent PE + LPE p. cent
7,9
74,8 ~ 1 1 ~ - , 5
Enveloppes (')
1
72,9
La c o m p o s i t i o n en p h o s p h o l i p i d e s est d o n n d e en p o u r c e n t a g e d u p h o s p h o r e l i p i d i q u e total. (*) Les e n v e l o p p e s utilisdes o n t 6td p r d p a r d e s p a r la m d t h o d e de rdfdrence [3] n o n modifide. TABLEAU II.
Variations de la composition en acides gras des enveloppes de P r o t e u s m i r a b i l i s en [onction de la temperature et de la phase de croissance. Phase stati0nnaire
Phase exp0nentielle
~°C
t4' C
1 30"C
38 °C
~40C
T
l
I
i
.~12 : 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
I
,Z13 : 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
38oC
T 0,9
,
T
T
T
T
0,7
1,2
0,6
T
T T
213 : 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
T
T
T
T
T
?,14 : 0.
1,7
1,9
1,6
1,6
1,4
2,7
214 : 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
T
T
T
T
T
T
215 : 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
T
T
T
T
T
T
215 : 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
T
T
T
T
T
T 5i,3
216 : 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33,8
39,2
43.6
51,0
29,2
C16 : 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19,3
20,8
15,4
11,3
14,7
4,6
C17 : 0.
T
T
T
T
T
T
(:,17 A C ) . -
2,3
1,8
4,4
4,1
9,9
21,0
4,8
3,5
1,3
33,8
8,8
C18 : 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3,0
3,7
4,0
C18 : 1
35,0
28,2
22,7
21,5
Ni (*').
1,6
1,6
1,9
1,8
T
T
C19 A (') . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1,3
0,5
1,9
1,8
7,4
9,5
Cyclopropaniques . . . . . . . . . . .
3,6
2,4
6,3
5,9
17,3
30,5 55,3 13,4
Saturds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39,4
45,5
50,4
58,0
34,1
Insaturds
54,3
49,0
38,1
32,8
48,5
Insaturds/saturds ...........
!
1,38
1,08
0,76
Le p o u r c e n t a g e de e h a q u e acide gras est e x p r i m d en poids. (*) Acides gras c y c l o p r o p a n i q u e s . (**) C o m p o s d n o n identifid. T : t r a c e s ( q u a n t i t d s i n f d r i e u r e s /, 0,5 p. cent).
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 10.
0,57
1,42
0,24
1292
G. A r l a u d , H. Jottve et J. P e l m o n t .
c o n s t a n t et c o r r e s p o n d h la quantit6 de PE des bact6ries de d6part (75 p. cent e n v i r o n ) . I1 est v r a i s e m b l a b l e que la LPE soit lib6r6e p a r d6gradation e n z y m a t i q u e de la P E au cours de la pr6p a r a t i o n des enveloppes, comme c'est le cas chez E. colt, oft la t r a n s f o r m a t i o n des bact6ries en sph6roplastes s ' a c c o m p a g n e d ' u n e a u g m e n t a t i o n du taux de LPE [18]. Des essais i n d 6 p e n d a n t s nous out p e r m i s de d6tecter darts les enveloppes au moths deux activit6s p h o s p h o l i p a s i q u e s dont l ' u n e c o r r e s p o n d h une p h o s p h o l i p a s e A [19].
sultats analogues out 6t6 obtenus chez E. colt [13, 23]. Ce p h 6 n o m 6 n e de d 6 s a t u r a t i o n des acides gras de l'enveloppe en r6ponse h u n a b a i s s e m e n t de t e m p 6 r a t u r e du m i l i e u c o n s t i t u e r a i t u n e adaptation de la bact6rie en r u e de m a i n t e n i r u n degr6 de fluidit6 c o n v e n a b l e de la m e m b r a n e . Cette hypoth6se laisserait supposer qu'~ basse temp6rature la bact6rie doive conserver un laux suffisant d'acides gras insatnr6s, et cela quelle que soft la T (°C)
40
Analyse des acides gras phospholipidiqzzes des enveloppes de P. mirabilis. Les acides gras de type satur6 repr6sentent, selon les c o n d i t i o n s de culture, 34 /~ 58 p. cent des acides gras p h o s p h o l i p i d i q u e s (tableau II). Le plus i m p o r t a n t est l'acide p a l m i t i q u e (C16:0) accompagn6 d ' a c i d e st6arique (C18:0) et d ' a c i d e m y r i s t i q u e (C14:0). L'acide palmitol6ique (C16:1) et u n acide octad6cbnoique (C18:1) sont les p r i n cipaux acides gras monoinsatur6s. Ce d e r n i e r p o u r r a i t 6tre, comme chez E. colt [20], l'acide vacc6nique (11-octad6c6no:ique). Les p r 6 p a r a t i o n s c o n t i e n n e n t 6galement deux compos6s qui out 6t6 identifi~s comme des acides gras c y c l o p r o p a n i q u e s : les acides cis-9,10-m6thy16nehexad6canoique (C17 A) et cis-ll,12-m6thy16neoctad6canoique (C19 A). Ces deux acides gras, pr6sents chez P. morganii [21] et E. colt [13,22], sont synth6tis~s p a r m 6 t h y l a t i o n des acides gras insatur6s c o r r e s p o n d a n t s (C16:1 et C18:1 [13]). Plusieurs analyses out m o n t r 6 que la composition en acides gras des enveloppes de P. mirabilis est 6troitement li6e aux c o n d i t i o n s de croissance des bact~ries (tableau II). Le passage de la phase e x p o n e n t i e l l e ~ la phase s t a t i o n n a i r e a 38°C s ' a c c o m p a g n e d ' u n e d i m i n u t i o n du taux des acides gras insatur6s (C16:1 et C18:1) au profit des acides gras c y c l o p r o p a n i q u e s (C17t~ et C19t,), qui atteignent au total e n v i r o n 30 p. cent des acides gras de l ' e n v e l o p p e ; ce c h a n gement a 6t6 observ6 chez E. colt [13] et son r61e physiologique reste encore obscnr. A n c u n e modification de la composition en acides gras n'est observ6e au cours de la phase e x p o n e n t i e l l e ou au cours de la phase stationnaire. D'autres modifications significatives apparaissent en fonction de la t e m p e r a t u r e de croissance des bact6ries (tableau II) : le r e f r o i d i s s e m e n t du m i l i e u de culture de 38°C fi 14°C provoque u n e a u g m e n t a t i o n i m p o r t a n t e du taux des acides gras insatur6s due aux acides palmitol6ique et octad6c6noique ; les acides gras c y c l o p r o p a n i q u e s ne subissent pas de v a r i a t i o n s significatives. Des r6BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° lO.
i
30
20
10
|
1,4i
1,0
0
--J
0,6
\ \ \
0,2
b
0 I
3 3 34 3,5 3,6 1 / T . 1 0 3 (°K'I) Fro. 4. - - Graphiques d'Arrh~nius de l' activitd L-aminoacide-DCIP oxydordductase dans les enveloppes prdpardes dt partir de bactdries cnltiods dt 38°C. La vitesse de r~duction du DCIP est mesurde h diff6rentes temperatures en presence de L-ph~nylalanine (cercles noirs), L-leucine (cercles blancs), L-histidine (triangles noirs), L-lysine (triangles blancs). Concentration en prot6ines totales : environ 50 Ixg/ml. Les courbes sont plac~es arbitrairement darts l'dchelle verticale ; vitesses r~elles h 30°C (nanomoles de DCIP r~duit/min) : Phe 16,2 ; Leu 14,2 ; His 14,1 ; Lys 7,3. 3,2
phase de croissance. A. 14°C, on constate effectiv e m e n t que l ' a u g m e n t a t i o n des acides gras cyclop r o p a n i q u e s h l ' a v 6 n e m e n t de la phase stationn a i r e ne s ' a c c o m p a g n e pas d ' u n e d i m i n u t i o n notable des acides gras insatur6s. Transition thermique du systbme Le g r a p h i q u e d ' A r r h 6 n i u s de la nine-DCIP oxydor6ductase met en p h 6 n o m 6 n e biphasique, comme il
oxydasiqae. L-ph6nylala6vidence un a 6t6 signal6
Mdtabolisme
intermddiaire
a n t 6 r i e u r e m e n t [3]. B i e n q u e ]es o x y d a t i o n s d e s a m i n o a c i d e s d e t y p e a p o l a i r e et d e s a m i n o a c i d e s b a s i q u e s s o i e n t s o u s l a d 6 p e n d a n c e d e d e u x systbmcs oxydasiques d i s t i n c t s , elles p a r a i s s e n t donner lieu h la m6me transition thermique dans les e n v e l o p p e s d e b a c t 6 r i e s c u l t i v 6 e s e n p h a s e e x p a n e n t i e l l e ~ 38°C : la f i g u r e 4 m o n t r e e n effet q u ' u n e t r a n s i t i o n c o m m u n e s ' o b s e r v e ~ 18°C e n v i r o n d a n s le c a s d e l a p h 6 n y l a l a n i n e et d e la leuc i n e c o m m e d a n s c e l u i d e l ' h i s t i d i n e et d e l a lysine.
art c o u r s d e l ' 6 1 6 v a t i o n d e t e m p 6 r a t u r e , h y p o t h 6 s e confirm6e notamment par des mesures physiques [30, 31] et p a r l ' e m p l o i d e m u t a n t s a u x o t r o p h e s l ' 6 g a r d d e s a c i d e s g r a s i n s a t u r 6 s [26, 27!. C o m p t e - t e n u d e s v a r i a t i o n s d e la c o m p o s i t i o n e n a c i d e s g r a s c o n s t a t 6 e s c h e z P. m i r a b i l i s e n fonction des conditions de croissance, on peut
40
D i v e r s a u t e u r s o n t m i s en 6 v i d e n c e chez E. colt l'existence d'une transition similaire affectant n o t a m m e n t d e s m 6 c a n i s m e s d e t r a n s p o r t [24-28]
\.
1,4
T (°C) 20
30
40
10
1293
et dnergdtique-Membranes.
T (°C) 20 |
30
10
0
1,4
0
1,0 38 o >
~k- f.-14 °
0 0
,,--1
0,6
1,0 > 0
..1
0,2 • 0,6
,
3,2
;
33
,
,
3,4
1/T.103 0,2
*
3t
3
i
i
3,4
!
!
3,5
3,6
1 / T . 10 3 (°K "1) 5.
3,5
,
3,6
(°K -1)
Fro. 6. - - G r a p h i q u e s d ' A r r h d n i u s de l'actioit~ L - p h ~ n ! t l a l a n i n e - D C I P o x y d o r ~ d u c t a s e des e n v e l o p p e s p r ~ p a r d e s & p a r t i r de bact~ries c u l t i v ~ e s en p h a s e stat i o n n a i r e ~ 1~ ° et 38°C. Enveloppes 14 ° : cercles 32
FIG.
, _ ,
G r a p h i q u e s d ' A r r h ~ n i u s de l'activitd L - p h ~ n g l a l a n i n e - D C I P o x y d o r ~ d u c t a s e des e n v e l o p p e s pr~par~es ~ p a r t i r d e s bact~ries c u l t i v ~ e s ~ 1~ °, 22 °, 30 °" et 38 ° . 14°C: triangles b l a n c s ; 22°C: triangles -
blancs ; enveloppes 3 8 ° : cercles noirs. C o n c e n t r a t i o n en prot6ines totales : e n v i r o n 50 ~tg/ml. Les courbes sont localis6es a r b i t r a i r e m e n t d a n s l'~chelle verticale. Vitesses rfelles h 30°C (nanomoles de DCIP r ~ d u i t / rain) : enveloppes 38°C 7,7 ; enveloppes 14°C 9,5.
-
no]rs ; 30°C : cercles blancs ; 38°C : cercles noirs. C o n c e n t r a t i o n en prot6ines totales : e n v i r o n 50 ttg/mL Les courbes sont plac6es a r b i t r a i r e m e n t dans l'6chelle verticale. Vitesses r6elles h 30 ° (nanomoles de DCIP r 6 d u i t / m i n ) : enveloppes 14 ° 18,7 ; enveloppes 22 ~ 12,9 ; enveloppes 30 ° 7,5 ; enveloppes 38 ° 9,0.
et l a s u c c i n a t e - D C I P o x y d o r 6 d u c t a s e [29]. O n i n t e r p r ~ t e g 6 n 6 r a l e m e n t ce p h 6 n o m ~ n e c o m m e le r6sultat d'une modification physique, comparable h une fusion de la phase lipidique membranaire B I O C H I M I E , 1973, 55, n ° 10.
done s'attendre h des modifications corr61atives de la transition thermique observ6e. La figure 5 m o n t r e q u e l ' a b a i s s e m e n t d e la t e m p 6 r a t u r e d u milieu de culture coincide effectivement avec de p r o f o n d e s m o d i f i c a t i o n s : la t r a n s i t i o n v i s i b l e e n t r e 16°C et 18°C c h e z les b a c t 6 r i e s c u l t i v 6 e s h 30 et 38°C se r e t r o u v e c h e z les b a c t 6 r i e s c u l t i v 6 e s 14 et 22°C ~ u n e t e m p 6 r a t u r e b e a u c o u p p l u s b a s s e (4 h 5oC). Ce c h a n g e m e n t p o u r r a i t d o n e 6tre c o n s i d 6 r 6 c o m m e le r 6 s u l t a t d ' u n e a u g m e n t a t i o n d e la f l u i d i t 6 d e l a p h a s e l i p i d i q u e li6e ~ l ' 6 1 6 v a -
G. Arlaud, H. Jouve et J. Pelmont.
1294
t i o n d u t a u x des a c i d e s g r a s i n s a t u r 6 s . I.a m 6 t h y l a t i o n p a r t i e l l e de ces c o m p o s 6 s h l ' a v 6 n e m e n t de la p h a s e s t a t i o n n a i r e s ' a c c o m p a g n e de la r 6 a p p a r i t i o n d ' u n e t r a n s i t i o n n e t t e h des t e m p 6 r a t u r e s de l ' o r d r e de 20-24°C (fig. 6). D a n s l ' h y p o t h 6 s e d ' u n e c o r r 6 1 a t i o n d i r e e t e e n t r e la t e m p 6 r a t u r e de t r a n s i t i o n e t l a c o m p o s i t i o n en a c i d e s g r a s des e n v e l o p p e s , l ' a u g m e n t a t i o n des a c i d e s gras c y c l o p r o p a n i q u e s c a r a c t 6 r i s t i q u e s de la p h a s e s t a t i o n naire apparait donc comme un facteur susceptible de r e n d r e la m e m b r a n e m o i n s f l u i d e q u ' a u c o u r s d e l a p h a s e e x p o n e n t i e l l e . I1 est doric p r o b a b l e cet 6 g a r d que les a c i d e s g r a s c y c l o p r o p a n i q u e s se c o m p o r t e n t e s s e n t i e l l e m e n t , au p o i n t de v u e de l'6tat p h y s i q u e de la m e m b r a n e , c o m m e des a c i d e s g r a s satur6s o r d i n a i r e s .
de c r o t a l e ( B o e h r i n g e r ) [3]. L a figure 7 m o n t r e l ' h y d r o l y s e des p r i n c i p a u x p h o s p h o l i p i d e s de l ' e n v e l o p p e a u c o u r s d ' u n e i n c u b a t i o n en p r 6 s e n c e de p h o s p h o l i p a s e A et d ' i o n s c a l c i u m : les f r a c t i o n s P E et P G s o n t f o r t e m e n t d 6 g r a d 6 e s (90 p. cen~ en u n e h e u r e e n v i r o n ) , a l o r s q u e la c a r d i o l i p i n e (DPG) r6siste en p a r t i e h l ' h y d r o l y s e . L'inactivation du pouvoir oxydasique reste part i e l l e d a n s les m S m e s c o n d i t i o n s (fig. 7). La supT (°C) 55 •
Le s y s t 6 m e L - a m i n o a c i d e o x y d a s i q u e des e n v e l o p p e s de P. m i r a b i / i s est p a r t i e l l e m e n t i n a c t i v 6 p a r u n e d o s e 61ev6e de p h o s p h o l i p a s e A de v e n i n
0,5
de
venin
50 •
•
m
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1,0
A
•
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|
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2,0
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A c t i o n de la p h o s p h o l i p a s e s e r p e n t s u r les e n v e l o p p e s .
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0,1
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o,1 DPG ",
PHE 14°
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310
I
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.
315
50
1/T. lo 5 (°K~) Fro. 8. - - Inactivation des DCIP oxydor~ductases de la phdnylalanine et de l'histidine it diverses temperalures. Les enveloppes (100 Ivg de prot6ines totales envi-
•
ffl
~ -1-
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305
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i 11; 20
40
60
TEMPS (minutes) Fro. 7. - - E f f e t de la phospholipase A de venin de crotale sur les phospholipides el sur l'acHvit~ L-phdnlllalanine-DClP oxydordductase des enveloppes. Phos-
p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e : eereles n o i r s ; phosphatidylglye6rol : triangles noirs ; diphosphatidylglye6rol : earr6s noirs ; activit6 L-ph6nylalanine-DCIP oxydor~duetase : cerctes blancs. Les enveloppes (prot6ines totales 200 ~xg/ml) sont ineub6es en presence de Tris (2.10-2 1Vf)-mal6ate, CaC12 5.10-z M, phospholipase A 25 ilxg/ml (pH 7,5). La quantit6 de chaque phospholipide ainsi que l'activit6 de l'oxydor6ductase sont exprim6es en pourcentage des valeurs mesur6es dans l'6ehantillon t6moin (sans CaCI~ ni phospholipase A, non ineub6 h 30°). BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 10.
ron) sont chauff~es aux temperatures indiqu~es pendant un temps fixe de 5 minutes, dans 0,25 ml de Tris (2.10-2 M)-mal~ate, MgCI_o 10-2 M, pH 7,5. Le test est effeetu~ ~t 30 ° apr6s addition des autres ingredients (voir m~thodes) dans un volume final de 1 ml. k : eonstante de vitesse de la r~aetion d'inactivation ; t : temps fixe de chauffage. En appelant a le r a p p o r t : activit~ enzymatique avant chauffage/aetivit6 enzymatique apr6s 5 rain de ehauffage, on a : log a = ~t/2,31. Oxydation de la ph~nylalanine : enveloppes provenant de bact~ries eulh'v~es h 38°C (cereles noirs), eultiv~es h 14°C (eercles blancs). Oxydation de l'histidine : enveloppes provenant de bact~ries eultiv~es h 38°C (triangles noirs), eultiv~es h 14°C (triangles blancs). p r e s s i o n des i o n s c a l c i u m e n t r a i n e u n e d i m i n u t i o n des effets c o n s t a t 6 s s u r l ' a c t i v i t 6 des e n v e l o p p e s et s u r les p h o s p h o l i p i d e s , n o l a m m e n t en ee q u i c o n c e r n e la c a r d i o l i p i n e . D a n s la m e s u r e off les p h o s p h o l i p i d e s s e r a i e n t e n t i ~ r e m e n t n6cess a i r e s h l ' a c t i v i t 6 o x y d a s i q u e on p o u r r a i t e x p l i q u e r la r 6 s i s t a n c e p a r t i e l l e de celle-ci h la p h o s -
M~tabolisme intermddiaire et dnergdlique-Membranes. pholipase A en a d m e t t a n t soit u n m a n q u e d'accessibilit6 de certains p h o s p h o l i p i d e s associ6s h l'oxydor6ductase, soil une association pr6f6rentielle de cette enzyme avec la c a r d i o l i p i n e . Une lroisi~me hypoth6se consiste h envisager la possibilit6 p o u r les lysod6riv6s d ' e x e r c e r sur le systbme 6tudi6 le m~me r61e f o n c t i o n n e l que Ies phospholipides intacts. Sachant que la p h o s p h o l i p a s e de v e n i n de crotale d6sacyle la position 2 d,u subslral l i p i d i q u e que l'on consid6re comme occup6e pr6f6rentiellement p a r des acides gras insatur6s ~13, 32], la t r a n s f o r m a t i o n des p h o s p h o l i p i d e s activateurs en lysod6riv6s devrait s ' a c c o m p a g n e r d ' u n e a u g m e n t a t i o n de la temp6rature de t r a n s i t i o n du syst6me mesur6. Nous avons effectivement observ6 une telle variation, de l ' o r d r e de 2 h 4°C. Cette a u g m e n t a t i o n est n 6 a n m o i n s assez faible et ne permet gu6re de t r a n c h e r entre ces diff6rentes bypothbses.
Stabilit~ thermique des enzymes oxydant la ph~nylalanine el l'histidine. L ' i n a c t i v a t i o n fi 51°C de l'activit6 oxydasique des enveloppes fi l'6gard des acides amin6s ob6it ,i • une cin6tique du p r e m i e r ordre ; elle est plus rapide p o u r l ' h i s t i d i n e que pour la p h 6 n y l a l a n i n e [3]. Au cours d,e ce travail nous avons constat6 que la p h 6 n y l a l a n i n e - D C I P oxydor6ductase des enveloppes 6tail 16g6remen! plus thermolabi!e 51°C q u a n d les baet6ries a v a i e n t 6t6 eultiv6es "~ 14 ° au lieu de 38 °. Nous avons done mesur6 h diff6rentes temp6ratures la vitesse de d6naturation de l'enzyme p r o v e n a n t , soit de bact6ries eultiv6es ~ 14 ° , soil de bact6ries cultiv6es ~ 38 ° . La figure 8 m o n t r e les graphiques d ' A r r h 6 n i u s de ces vitesses de d6naturation. P o u r l'oxydation de la p h 6 n y l a l a n i n e , la d 6 n a t u r a t i o n corr e s p o n d h une 6nergie d ' a c t i v a t i o n qui est plus forte dans le p r e m i e r eas (enveloppes-14 °) que dans le second. Les 6nergies d ' a c t i v a t i o n ealcul6es sont r e s p e c t i v e m e n t de 68 000 et 33 000 calories par mole e n v i r o n . On voit 6galement que l'aetivit6 est plus t h e r m o l a b i l e dans le p r e m i e r eas h condition que la t e m p 6 r a t u r e atteigne une certaine valeur (plus de 50°C dans l ' e x p 6 r i e n c e de la figure 8). Notons enfin q u ' o n ne retrouve pas ce p h 6 n o m 6 n e si on e x a m i n e l ' o x y d a t i o n de l'histidine. II est t e n t a n t de supposer que les changements constat6s au n i v e a u de l ' e n z y m e sp6cifique de la p h 6 n y l a l a n i n e refl6tent les v a r i a t i o n s du mode d'association e n t r e la p r o t 6 i n e et les phosp h o l i p i d e s qui l ' e n t o u r e n t et d 6 p e n d e n t ainsi de la n a t u r e des acides gras pr6sents. D'autre part le e o m p o r t e m e n t diff6rent des enveloppes selon que le substrat utilis6 est la p h 6 n y l a l a n i n e ou l'histidine confirme que l ' o x y d a t i o n de ces deux acides amin6s est exerc6e p a r deux prot6ines distinctes.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 10.
1295
DISCUSSION ET CONCLUSION. Les r6sultats pr6sent6s dans la p r e m i 6 r e partie de ce travail m o n t r e n t que la c o m p o s i t i o n en p h o s p h o l i p i d e s des enveloppes isol~es de P. mirabilis pr6sente de profondes analogies avec les donn6es obtenues ehez d'autres ent6robaet6ries el n o t a m m e n t E. colt [13]. Le e o n s t i t u a n t m a j e u r est la p h o s p h a t i d y l 6 t h a n o l a m i n e qui repr6sente plus des deux tiers du p h o s p h o r e l i p i d i q u e extrait p a r la m6thode de F o l e h et coll. [8]. Le p h o s p h a ! i d y l glye6rol e t l a e a r d i o l i p i n e sont 6galement pr6sents en quantit6s notables. I1 est p r o b a b l e que les lysod6riv6s d6cel6s dans les enveloppes p r o v i e n n e n t d ' u n e h y d r o l y s e e n z y m a t i q u e au eours de la pr6p a r a t i o n . L'aetivit6 oxydasique des enveloppes est g6n6ralement tr~s stable au cours d ' u n stockage prolong6 h 0°C : d a n s u n e p u b l i c a t i o n a n t 6 r i e u r e [3] nous avons suppos6 que cette stabilit6 6tail due h l ' i n a c t i v a t i o n des phospholipases endogbnes p a r le t r a i t e m e n t alcalin des cellules et la prbsence d ' u n agent c o m p l e x a n t des cations divalents. Des essais n o n d6crits dans cet article nous ont en fait montr6 que les enveloppes ainsi obtenues c o n s e r v e n t une activit6 p h o s p h o l i p a s i q u e de type A ainsi q u ' u n e deuxibme activit6 a t t r i b u a b l e ~t une lysophospholipase, mats que ces enzymes ne d6gradent n o t a b l e m e n t les lipides in silu q u ' e n pr6sence d ' u n d6tergenl (Triton X 100) ou d'6thanol. L ' h y d r o l y s e consid6rable q u ' o n peut o b t e n i r dans la fraction l i p i d i q u e des enveloppes p a r l ' a d d i t i o n d ' u n e p h o s p h o l i p a s e exogbne (de v e n i n de crotale) n ' e n l r a i n e q u ' u n e i n a c t i v a t i o n partielle du systbme oxydasique, c o n f i r m a n t ainsi les observations ant6rieures [3]. Cette action 6pargne u n e grande partie de la c a r d i o l i p i n e qui persiste dans un r a p p o r t c o m p a r a b l e h celui de l'activit6 enzym a t i q u e mesur6e en u t i l i s a n t la p h 6 n y l a l a n i n e comme substrat. Si les p h o s p h o l i p i d e s sont n6cessaires h l ' o x y d a t i o n e n z y m a t i q u e de cet acide a m i n 6 par les enveloppes on peut supposer que la c a r d i o l i p i n e joue dans cette association u n r61e privil6gi6. Cette hypothbse est h r a p p r o c h e r d ' u n e observation de Kilo et coll. [33] sur le t r a n s p o r t de ~-galactoside chez E. colt. La r6sistance partielle de l'activit6 oxydasique peut c e p e n d a n t recevoir d'autres explications. Tout d ' a b o r d il est possible que les relations f o n c t i o n n e l l e s prol6ineslipides ne c o n c e r n e n t q u ' u n e fraction trbs limit6e des p h o s p h o l i p i d e s m e m b r a n a i r e s : certains constituants p o u r r a i e n t c o n t r a c t e r avee l ' e n z y m e u n e association 6troite plus ou m o i n s p e r m a n e n t e off ils seraient fortement prot6g6s de Faction des phospholipases exog6nes. D ' a u t r e part on ne peut exclure a priori que les lysoddriv6s p u i s s e n t lenir, au m o i n s en partie, le m6me r61e f o n c t i o n n e l 84
1296
G. A r l a u d , H. J o u v e et J. P e l m o n t .
auprbs de l ' o x y d o r 6 d u c l a s e que les p h o s p h o l i p i d e s intacts. Cette discussion pose le p r o b l b m e de l'homog6n6it6 de la p h a s e l i p i d i q u e des e n v e l o p p e s au p o i n t de r u e f o n c t i o n n e l . La cassure visible sur les g r a p h i q u e s d ' A r r h 6 n i u s pr6sent6s au cours de ce t r a v a i l semble m e t t r e en l u m i b r e l ' i n t e r v e n t i o n de la p o r t i o n l i p i d i q u e des e n v e l o p p e s sur les o x y d o r ~ d u c t a s e s 6ludi6es. Est elle due ~ une m o d i f i c a t i o n d ' e n s e m b l e de l'6tat p h y s i q u e des lipides, e o m m e il est g6n~ralement admis, ou est elle like h u n e h a n g e m e n t local de l ' a s s o c i a t i o n enzyme-lipide ? La c o m p o s i t i o n en acides gras des p h o s p h o l i p i d e s dans les e n v e l o p p e s de P. mirabilis est sujette h des v a r i a t i o n s i m p o r t a n t e s en f o n c t i o n de la t e m p 6 r a t u r e et de la p h a s e de eroissance. L ' a b a i s s e m e n t de la t e m p 6 r a t u r e de c r o i s s a n c e de 38 ° h 14°C s'accompagn.e d'un r e l ~ v e m e n t du r a p p o r t acides gras i n s a t u r 6 s / a c i d e s gras satur6s de 0,57 h 1,38. Cette t r a n s f o r m a t i o n c o i n c i d e avee une p r o f o n d e d i m i n u t i o n de la t e m p 6 r a t u r e de transition. Dans le eas du t r a n s p o r t des 8-galactosides ehez E. coli les v a r i a t i o n s de c o m p o s i t i o n en acides gras constat~s p a r Kito et coll. [33] a p p a r a i s s e n t comparativemen.t p e u i m p o r t a n t s , ce qui p o u r r a i t e x p l i q u e r l ' a b s e n c e d ' u n dSplacem e n t net de la t r a n s i t i o n constat6e p a r ces auteurs. D ' a u t r e p a r t le passage des bact6ries h la p h a s e s t a t i o n n a i r e s ' a c c o m p a g n e du r e m p l a c e m e n t p a r t i e l des acides gras insatur6s p a r des acides gras c y c l o p r o p a n i q u e s et entraine, h 14 ° et 36"C, un r e l 6 v e m e n t m a r q u 6 de la t e m p e r a t u r e de t r a n s i t i o n qui d~passe dans les d e u x cas la v a l e u r trouv~e p o u r les bact6ries cultiv~es en p h a s e e x p o n e n t i e l l e h 38 °. Les aeides gras cyclop r o p a n i q u e s c o n t r i b u e n t d o n e h r e n d r e ]a m e m b r a n e plus rigide. On peut s ' i n t e r r o g e r sur la signification p h y s i o l o g i q u e de ces c h a n g e m e n t s d'~tat au sein de la m e m b r a n e et s u p p o s e r p a r e x e m p l e q u ' u n e mobilit~ a c c r u e de l ' e n s e m b l e des mol6cules l i p i d i q u e s f a v o r i s e c e r t a i n e s f o n c t i o n s m e m b r a n a i r e s i m p o r t a n t e s . Cette question, plusieurs fois discut6e ~13, '24=28], reste obscure. On r e m a r q u e que P. mirabilis cultiv6 h des temp6ratures sup6rieures h 22-25°C m a i n t i e n t sa m e m b r a n e h l'6tat fluide, m6me apr~s arr6t de la croissance, alors q u ' i l n ' e n est pas de mSme p o u r ces bact6ries cultiv6es h basse t e m p 6 r a t u r e l o r s q u ' e l l e s atteignent la p h a s e s t a t i o n n a i r e . Le c h a n g e m e n t p h y s i o l o g i q u e qui en r6sulte est peut-6tre plus i m p o r t a n t et m 6 r i t e r a i t sans doute un e x a m e n d6taill6. Les diff6rences de c o m p o s i t i o n en acides gras des p h o s p h o l i p i d e s s e m b l e n t 6galement s ' a c c o m -
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 10.
p a g n e r d'un effet int6ressant sur l ' 6 n e r g i e d'activation raise en jeu p a r la d 6 n a t u r a t i o n darts le cas de la p h 6 n y l a l a n i n e - D C I P o x y d o r 6 d u c t a s e . II est t e n t a n t de s u p p o s e r que cette 6nergie d'activation d6pend de l ' e n v i r o n n e m e n t l i p i d i q u e imm6diat de la prot6ine. La pr6sence de doubles liaisons port6es p a r les acides gras p o u r r a i t cr6er des a t t r a c t i o n s s u p p l 6 m e n t a i r e s entre les l i p i d e s et certains groupes polaires de la prot6ine, qui s e r a i e n t n6cessaires h l'activit6 en.zymatique. L ' h i s t i d i n e - D C I P o x y d o r 6 d u c t a s e est plus t h e r m o labile. I1 se peut que cette e n z y m e pr6sente le m6me p h 6 n o m b n e qui serait masqu6 p a r la rupture d ' a u t r e s liaisons i n t e r v e n a n t h une temp6r a t u r e plus basse. I1 est d o n c tout h fair possible que le c o m p o r t e m e n t de ces enzymes soit r6gl6 non s e u l e m e n t p a r l'6tat p h y s i q u e de l ' e n s e m b l e de la m e m b r a n e mats aussi p a r des r e l a t i o n s tr6s localis6es avec c e r t a i n s c o n s t i t u a n t s p h o s p h o l i p i d i q u e s . Cette question ne p o u r r a 6tre analys6e en d6tail qu'h 1'aide d ' e x p 6 r i e n c e s de r e c o n s t i t u tio.n entre divers p h o s p h o l i p i d e s et les oxydor6ductases p r 6 a l a b l e m e n t isol6es de la m e m b r a n e et purifi6es.
Remerciements. Ce travail a b6n6fiei4 d'nne Aide Individuelle du Centre National de la Recherche Scientifique, Section de Biologic Cellulaire. R~suM~. Les enveloppes de Proteus mirabilis renferment des activit4s L-aminoacide oxydasiques, mesur~es par r~duction du dichloroph4nolindoph~nol (DCIP). Les relations fonctionnelles de ces enzymes avec les phospholipides out ~t~ abord~es. La phosphatidyl~thanolamine (60-75 p. cent), le phosphatidylglyc~rol (10-15 p. cent) et la cardiolipiue (10 p. cent) sont les eonstituants phospholipidiques majeurs des enveloppes, qui renferment en outre des quantit~s notables de lysod~riv~s. Les acides gras phospholipidiques principaux sont ]'acide palmitique, un acide oetad~c6noique, l'acide palmitol6ique et deux acides gras cyclopropaniques. L'abaissement de la temp6rature du milieu de culture entraine une augmentation importante du taux des acides gras insatur6s dans les enveloppes par rapport h leurs homologues satur~s. Le passage h la phase statiunnaire s'acco.mpagne d'une augmentation des aeides gras cyc.lopropaniques au d~triment des insatur4s. Ces variations coincident avec des modifications de la transition thermique observde sur les graphiques d'Arrh6nius de la L-ph6nylalanine-DCIP oxydordductase et de la L-histidine-DCIP oxydor6ductase. Une augmentation des aeides gras insatur~s abaisse la tempSrature de transition et celle des acides gras cyclopropaniques l'dl6ve. La phospholipase A de venin de serpent d6trnit la majeure partie des phospholipides h l'exception de la cardiolipine qui persiste h un taux 61ev6 comparable h l'aetivit6 r~siduelle de l'oxydor6ductase. L'6nergie d'activation de la d6naturation thermique des oxydorSduetases semb]e li6e, en ce qui concerne l'oxydation de la phdnylalanine, aux modifications de la composition en acides gras consdcutive h l'abaissement de la temperature de culture.
Mdtabolisme
intermddiaire
BIBLIOGRAPHIE. 1. Stumpf, P. K. ~, Green, D. E. (1944) J. Biol. Chem., 153, 387-403. 2. Henriksen, S. D. (1950) J. Baelerinl., 60, 225-231. 3. Pelmont, J., Arlaud, G. ,~ Rossat, A. M. (1972) Binchimie, 54, 1359-1374. 4. Katz, "W., Berger, D. ~, Martin, H. H. (1971) Biochim. Binphys. Acta, 244, 47-57. 5. Zack, B. & Cohen, J. (1961) Clin. Chim. Acta, 6, 665670. 6. Bartlett, G. R. (1959) J. Biol. Chem., 234, 466-468. 7. Bray, G. A. (1960) Anal. Biochem., 1, 279-285. 8. Folch, J., Lees, M. & Sloane-Stanley, G. H. (1957) J. Biol. Chem., 226, 497-509. 9. White, D. C. (1968) J. Baeleriol., 96, 1159-1170. 10. Short, S. A., ~ h i t e , D. C. a Aleem, M. I. H. (19691 J. Bacterinl., 99, 142-150. 11. Lorette, N. B. a Brt~wn, 3. H. (1959) J. Org. Chem., 24, 261-262. 12. James, A. T. (1960) Methnds Biochem. Anal., 8, 1-59.
13. Cronan, J. E. a Vagelos, P. R. (1972) Binchim. Binphys. Acta, 265, 25-60. 14. Randle, C. L., Alhro, P. W. a Dittmer, J. C. (1969) Biochim. Binphys. Acta, 187, 214-220. 15. Kanemasa, Y., Akamatsu, Y. a Nojima, S. (1967) Biochim. Biophgs. Acta, 144, 382-390. 16. Ono, Y. ~ Nojima, S. (1969) Biochim. Biophys. Acta, 176, 111-119. 17. Cunningham, C. C. a Hater, L. P. (1971) J. Biol. Chem., 246, 1575-1582.
BIOCHIMIE, 1973, 55, n ° 10.
et dnergdtique-Membranes.
1297
18. Simmler, M. C. a Barbu, M. E. (1970) Ann. Inst. Pasteur, Paris, 119, 289-301. 19. Arlaud, G. (1973) Th6se Doetorat 3" Cycle, Universit6 de Grenoble I. 20. Gronan, J. E. (1967) Binchim. Biophys. Acta, 144, 695-697. 21. Kremhel, J. (1964) Bull. Soc. Chim. Biol., 46, 503508. 22. Gronan, J. E. (1968) J. Bacleriol., 95, 2054-2061. ,'23. Sinensky, M. (1971) J. BacterinL, 106, 449-454. 24. Shairer, H. U. a Overath, P. (1969) J. Mol. Biol., 44, 209-214. 25. Wilson, G., Rose, S. P. ~ Fox, C. F. (1970) Biochem. Biophys. Res. Comm., 38, 617-623. 26. Wilson, G. a Fox, C. F. (1971) J. Mnl. Biol., 55, 4960. 27. Overath, P., Hill, F. F. ,~ Lamneck-Hirsch, I. (1971) Nature Ne,w Biol., 234, 264-267. 28. Gramer, W. A., Phillips, S. K. • Keenan, T. W. (1973) Biochemistry, 12, 1177-1181. 29. Esfahani, M., Crowfoot, P. D. ,~ Wakil, S. J. (1972) J. Biol. Chem., 247, 7251-7256. 30. Esfahani, M., Limbriek, A. R., Knutton, S. a Wakil, S. J. (1971) Fed. Proe., 30, 1120. 31. Schechter, E., Gulik-Krzywieki, T. ,t Kaback, H. R. (1972) Biochim. Biophys. Acta, 274, 466-477. 32. Long, C., Odavic, R. 8, Sargent, E. J. (1963) Binchem. J., 87, 13P. 33. Kito, M., Aibara, S., Kato, M., Ishinaga, M. a Hata, T . (1973) Binchim. Binphys. Aela, 298, 69-74.