Préparation et étude de la β-lactoglobuline de brebis cristallisée

BIOCBIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

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BBA 25406 PRI~PARATION ET ]~TUDE DE LA fl-LACTOGLOBULINE DE B R E B I S C R I S T A L L I S ~ E J. L. MAUBOIS*§, R. PION§§ ET B. RIBADEAU-DUMAS§ Avec la collaboration technique de MONIQUEVEAUX§et de FRAN~OISELABONNE§ § Station Centrale de Recherches Laiti?res et de Teehnologie des Produits A n i m a u x - I . N . R . A . -~ 78. Jouy-en-Josas (France) §2 Laboratoire des Mdtabolismes - I . N . R . A . - 78. Jouy-en-Josas (France)

(Regu le 19 Novembre, 1964)

SUMMARY P r e p a r a t i o n a n d s t u d y o f c r y s t a l l i n e ewe m i l k fl-lactoglobulin

Ewe's fl-lactoglobulin has been isolated. It has been prepared in crystalline form by a method derived from the method of ASCHAFFENBURGAND DREWRY for COW'S crystallized fl-lactoglobulin. Purification has been followed by chromatography on DEAE-cellulose column and paper electrophoresis. Amino acid composition, diffusion and sedimentation coefficients, molecular weight and C-terminal group have been determined and compared with the corresponding characteristics of cow's /~-lactoglobulin. Two equal bands have been detected on paper electrophoresis of ewe's fl-lactoglobulin prepared from bulk milk after four successive crystallizations; the existence of genetic variants is proposed.

INTRODUCTION Par souci de simplification et pour conserver l'analogie avec le cas du lait de vache, les auteurs (r6fs. 1-7) qui ont 6tudi6 la composition en prot6ines du lait provenant de diff6rentes esp~ces de mammif~res ont appel6 fl-lactoglobuline le constituant principal du lactos6rum. L'objet de notre travail a 6t6 de s@arer, purifier et 6tudier cette prot6ine dans le lactos6rum de brebis, et de poser Ansi des bases d'appr6ciation, permettant soit de confirmer soit d'infirmer la validit6 d'une telle d6signation. Les 6tapes de la purification de la fl-lactoglobuline de brebis ont 6t6 suivies l'aide de deux techniques compl6mentaires: la ehromatographie sur colonne de DEAE-cellulose qui permet de d6celer facilement les constituants ~ base de nucl6otides pr6sents darts routes les pr6parations de lactos6rum de brebis 8 et l'61ectrophor~se sur papier, technique qui a conduit ASCHAFFENBURGET DREWRY9 ~ mettre en 6vidence les variants g6n6tiques de la fl-lactoglobuline de vache. Le poids mol6culaire, la composition en acides amin6s, l'absorption en U.V. et l'acide amin6 C terminal de la fl-lactoglobuline de brebis ont ~t6 d6termin~s. Nous * Adresse actuelle: Laboratoire de Recherches de Technologie Laiti&re, 65, rue de Saint Brieuc - I.N.R.A. - 35. Rennes (France). Bioehim. Biophys. Aeta, lO7 (1965) 5Ol-51o

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avons ainsi pu comparer les caract6ristiques physiques et chimiques de cette prot6ine avec la prot6ine homologue du lait de vache. MATt~RIEL ET MI~THODES Prdparation de la fi-lactoglobuline de brebis cristallisde Trois prfparations ont 6t6 rfalis6es avec le lait obtenu en m61angeant chaque fois le produit d'une m~me traite de 3 ou 4 brebis au milieu de leur lactation (race Pr6alpes du Sud), appartenant au troupeau du Centre National de Recherches Zootechniques de Jouy-en-Josas. La mfthode pr6conis6e par ASCHAFFENBURG ET DREWRY1° pour la cristallisation des/~-lactoglobulines de vache 6tait appliqu6e au lait de brebis, mais 16g6rement modifi6e. Le filtrat F I (lait additionn6 de Na2SO 4 20 %) et le filtrat F I I (filtrat F I acidifi6 ~ p H 2.3 par HC1) 6taient obtenus selon la technique pr6conis6e par les auteurs. De mfime, la fl-lactoglobufine de brebis 6tait pr6cipitde h p H 6.0 par le sulfate d'ammonium, puis recueillie sur hyflosupercel. Mais apr6s 61imination de ce support, la cristallisation s'effectuait directement par dialyse de la solution concentr6e de fl-lactoglobuline contre 5 ° volumes d'eau distillde saturfe de tolu6ne. I1 n'6tait pas n6cessaire de faire une dialyse prdliminaire contre un tampon ~t p H 5.2, comme pour la cristallisation des fl-lactoglobulines de vache. L'eau de dialyse 6tait chang6e quotidiennement. La fl-lactoglobuline de brebis cristallisait en gros cristaux apr6s une dur6e comprise entre 48 h et 72 h, ~ la temp6rature du laboratoire. Nos prfparations 6taient recristallis6es 4 fois. 24 h apr6s le d6but de la premi6re cristallisation, on centrifugeait 5 rain ~ 2000 × g le contenu du sac de dialyse. Le surnageant 6tait 61imin6. Les cristaux 6talent lav6s avec de l'eau bidistill6e, puis centrifug6s dans les m~mes conditions. On ajoutait au culot un volume 6gal de NaC1 0.3 M. La dissolution 6tait imm4diate. La solution 6tait raise ~ dialyser comme pr6c6demment. La recristallisation s'effectuait dans les 24 h. P.lectrophor~ses sur papier Elles 6taient effectu6es en tampon v6ronal-v6ronal sodique ~ p H 8.6 selon ASCHAFFENBURG ET I)REWRY9. Chromatographies sur colonne de DEAE-cellulose Elles 6talent effectu6es en tampon Tris o.oi M-HCI, p H 8.5 et 61ution par gradient de NaC1 (o-~ 0. 4 M) selon la m6thode indiqu6e par MAUBOlS8. Dosage des acides aminOs Environ IO mg de fl-lactoglobuline cristallisfe, pr6alablement dess6ch6e sous vide et PzO 5 pendant 24 h, 6taient pes6s dans un tube ~ hydrolyse. On ajoutait 5 ml d'HC1 environ 6 N. Les tubes 6talent placfs sous vide et scell6s. L'hydrolyse 6tait effectufe dans un bain de glyc6rine agit6, ~ lO2-1o5 ° pendant 24 h et 48 h. La dftermination des acides amin6s dans les hydrolysats 6tait r6alis6e au moyen d'un appareil automatique Phoenix K 8000 selon la m6thode d6crite par SPACKMAN et al. 11. Le tryptophane 6tait d6termin6 par spectrophotom6trie selon BENZCEET SCHMID12. Biochim. Biophys. dcta, lO7 (1965) 5oi-5IO

ETUDE DE LA fl-LACTOGLOBULINE DE BREBIS

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La cyst6ine et la cystine 6taient dos6es selon la m6thode d6crite par DE BELo SUNCE ET PION la.

Ddtermination des acides aminds C terminaux A 15o mg de fl-lactoglobuline cristaUis6e, on ajoutait i8o ml d'eau distillde et 2-3 gouttes de tolu6ne. La solution 6tait portfe ~ 37 °, et on ajustait alors le pH/~ 8.5 avec NaOH 0.2 N. On ajoutait ensuite 0.06 ml d'une solution ~ 5 % de carboxypeptidase A trait6e par le diisopropylfluorophosphate (Sigma). Des pr616vements de 27 ml de solution 6taient effectuds au bout de i h, 2 h, 17 h 20 rain, 24 h, 72 h e t 96 h de r6action. Chaque prdl~vement 6tait m61ang6 ~t un volume 6gal d'acide trichlorac6tique ~ IO %. Le m61ange 6tait plac6 au congdlateur ~t - - i o ° pendant 20 rain, puis filtr6 sur papier Durieux bande bleue. 50 ml du filtrat clair ainsi obtenu 4taient charg6s sur une colonne d'Amberlite I R 45 (20 × 2 cm) sous forme C1. Les premi6res portions (12 ml) de l'effluent 6taient rejetdes. La colonne 6tait lavde 3 fois avec 25 ml d'eau distill6e. L'effiuent et les eaux de lavage 6taient 6vapor6s ~ sec dans un courant d'air chaud, puis repris dans 5 ml de tampon citrate p H 2.2. Les acides amin6s 6taient dos6s comme pr6c6demment. Ddtermination du coep%ient d'extinction La fl-lactoglobuline cristallisfe 6tait dess6chde sous vide et P~O 5 pendant 24 h. Les mesures 6taient rdalis6es en tampon Tris o.oi M-HC1 p H 8. 5 A l'aJde d'un spectrophotom6tre Cary 14. Dosages d'azote Les dosages 6taient effectuds par microkjeldahl, selon OGG~4. Ddtermination du poids moldculaire Le coefficient de s6dimentation 6tait d6termin6 dans le tampon NaC1 o.I MCHaCOONa o.I M-CHaCOOH 0.04 M, p H 5.Ol, pr6conis6 par CECIL ET OGSTON15. La concentration de la solution (1.o2 %) apr6s dialyse 6tait d6termin6e spectrophotom6triquement. L'expdrience a 6t6 r6alisde ~ 2 °, ~ 59780 t/min dans une ultracentrifugeuse Spinco "Model E". Le coefficient de diffusion 6tait ddtermin6 darts un appareil Fokal B Strflbin. Les conditions exp6rimentales 6taient celles indiqu6es ci-dessus lots de la ddtermination du coefficient de sddimentation. RESULTATS

Prdparetion de la fl-lactoglobuline de brebis cristallisde Les 6tapes de l'isolement et de la purification de la fl-lactoglobuline de brebis ont 6t6 suivies par chromatographie sur colonne de DEAE-cellulose et par dlectrophor~se sur papier, ces deux techniques d'analyse donnant des renseignements compl6mentaires. En effet, l'61ectrophor6se sur papier du flltrat F I (Fig. I) nous indique qu'en plus de la cas6ine, la totalit6 des immunoglobulines et une grande partie du m61ange constitu6 par la s6rum albumine et un constituant non identifi6 sont prdcipit6es par Biochim. Biophys. Acta, lO7 (1965) 5Ol-51o

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le sulfate de sodium & 20 %. Le diagramme de chromatographie de F I (Fig. 2) donne plus de renseignements. Si l'on se r6f~re au diagramme obtenu avec le lactos6rum total s, on constate que le sulfate de sodium fl 20 % pr6cipite un m61ange de prot6ines comprenant: la lactoperoxydase (pic F1) , un constituant & base de nucl60tides (pic F2), les immunoglobulines (pic F3), un constituant prot6ique non identifi6 (pic F9) et une grande partie de la s6rum albumine (pic Flo ). L'examen par 6lectrophor~se sur papier de la fraction correspondant au pic F4 montre que les immunoglobulines qui

Fig. I. t~lectrophor~se s u r papier des fractions o b t e n u e s lors de la p r 6 p a r a t i o n de la/3-1actoglobuline de lair de brebis. De g a u c h e k droite: l a c t o s 6 r u m total, filtrat I, filtrat II, /3-1actoglobuline recristallis6e 4 fois. ~. 2 . 6 2 0 ZZ--

. . . .

F,2

i__

E © ~3

c~ 1.0

F6

°

%-

-

doo

I

1500

Fig. 2. C h r o m a t o g r a p h i e sur colonne de D E A E - c e l l u l o s e du filtrat I.

Biochim. Biophys. Acta, Io7 (1965) 5Ol-51o

I

2000

mt

t~TUDE DE LA ]~-LACTOGLOBULINEDE BREBIS

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contaminaient ce pic (3) ont 6galement 6t6 pr6cipit6es. Aucune coloration n'est observ~e, en effet, avec le bleu de bromoph6nol. Ce pic ne contient donc plus q u ' u n ou plusieurs constituants & base nucl6otidique. L'acidification ~ p H 2.3 du filtrat F I (filtrat F II) provoque la pr6cipitation (voir Figs. I, 2 et 3) de la s~rum albumine restante (composant plus mobile en 61ectrophor~se sur papier, pic F10), d'une fraction du composant migrant 16g6rement en a v a n t de la fl-lactoglobuline, fraction qui doit vraisemblablement correspondre aux pics F 6 et F~ et de la quasi totalit6 des fractions 61u6es par la soude (pics F l l et F12). On remarque d'autre part que l'6paulement du pic F s a disparu et que ce pic est sym6trique. Les 6tapes suivantes conduisant & la cristallisation ~liminent t o u s l e s conta-

2.oi I I

E

oC0 , o•

I 1.

01-

0 F-12 c 121

Gr

NaOH F,, 560

lOOO

I

15oo

200Oral

Fig. 3- Chromatographie sur colonne de DEAE-cellulose du fittrat II.

Fig. 4. Cristaux de fl-lactoglobuline de lait de brebis: microphotographie (G = 250). Biochim. Biophys. Acta, lO7 (1965) 5ol-51o

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minants de la fl-lactoglobuline, qu'ils soient de nature prot6ique ou nucl6otidique. L'6lectrophor+se sur papier de la fl-lactoglobuline de brebis recristallis6e 4 fois (Fig. I) montre 2 bandes d'6gale importance. Nous discuterons plus loin de cette h6t6rog~n6it6. La fl-lactoglobuline de brebis cristallise dans le syst~me monoclinique (Fig. 4). Apr&s 12 mois de conservation en solution dans le sulfate d'ammonium ~ 50 % ~ 2 ° elle cristallise encore abondamment, apr~s 48 h de dialyse. Composition en acides amines et acides aminds C terminaux

Le Tableau I donne la composition en acides amin6s de la fl-lactoglobuline de brebis. Les deux premieres colonnes indiquent les r6sultats apr+s 24 h et 48 h d'hydrolyse. La colonne 3 indique le chiffre retenu pour le calcul du nombre de r6sidus entrant dans la mol6cule. Pour la s6rine et la thr6onine nous avons ajout6, aux valeurs de 24 h, la diff6rence constat6e entre les deux temps d'hydrolyse. Les valeurs de 48 h out 6t6 retenues pour la valine et l'isoleucine; les valeurs moyennes pour les autres acides amin6s, sauf le tryptophane (d6termin6 spectrophotom6triquement), la cyst6ine et ]a cystine (d6termin6es ensemble apr~s oxydation performique). L'ammoniac augmentant de o.17 % entre 24 h et 48 h, on a soustrait arbitrairement au chiffre de 24 h cette diff6rence pour obtenir la valeur au temps z6ro de l'hydrolyse. Le hombre de r6sidus de chaque acide amin6 (colonne 4) a 6t~ calcul6 sur la base arbitraire du poids mol6culaire moyen obtenu, en supposant la pr6sence de TABLEAU I COMPOSITION

EN

Acides amines

ACIDES

AMIN1~S

DE

LA

/{-LACTOGLOBULINE DE BREBIS

Acide aspartique Thr6onine S6rine Acide glutamique Proline Glycine Alanine Valine M6thionine Isoleucine Leucine Tyrosine Phenylalanine Lysine Histidine NH 3 Arginine Tryptophane Cyst6ine

Nombre de rgsidus

°/o produit sec Durde d'hydrolyse 24 h

48 h

(I) lO.7O 4-93 3.18 18.64 5 .o I 1.98 7.84 6.21 3.34 5.36 15.o 5 3.77 3- 79 i 1.76 1.75 1.31 2.57

(2) lO.73 4.74 2.87 18.37 5.29 1.97 7.56 6.32 3.28 6.06 14.74 3.69 3-65 i 1.94 1.86 1.48 2.58

Chiffre retenu

(3) lO.71 5.12 3.49 18.5 o 5.15 1.97 7.7 ° 6.32 3.3 i 6.o6 14.89 3.73 3.72 I 1.85 1.8o 1.14 2.57 3.34

* Poids mol6culaire 18 35 ° d'apr6s PIEZ et al. 1~.

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Calcul sur la base P . M . moyen

Entier le plus proche

fl-Lactoglobuline de vache*

A

/3

(4)

(5)

(6)

(7)

13.97 7-46 5.76 21.83 7-77 4.56 15.oo 9.37 3-85 8.02 19.71 3.57 3.91 14.o7 2.Ol 11.64 2.56 2.38 4.79

14 7-8 6 22 8 4-5 15 9 4 8 20 3-4 4 14 2 12 2-3 2 5

16 8 7 25 8 3 14 IO 4 IO 22 4 4 15 2 13 3 2 5

15 8 7 25 8 4 15 9 4 IO 22 4 4 15 2 13 3 2 5

507

1~TUDE DE LA fl-LACTOGLOBULINE DE BREBIS

2 His, 4 Phe, 8 Ileu, 8 Pro, 9 Val, 14 Asp, 14 Lys et 15 Ala dans la mol6cule de fl-lactoglobuline. Ces acides amin6s ont ~t6 choisis pour leur hydrolyse non destructive et pour leur faible nombre de r6sidus. Les valeurs ainsi obtenues ont 6t6 arrondies tt l'entier le plus proche (colonne 5)- Cette approximation est justifi6e pour la plupart des acides amin6s, sauf pour la glycine, la thr6onine, la tyrosine et l'arginine pour lesquelles les valeurs obtenues ne permettent pas de se prononcer soit pour le nombre entier sup6rieur, soit pour le nombre entier inf6rieur. Pour 1'ammoniac, nous avons pr6f6r6 le nombre entier sup6rieur, consid6rant que 1'extrapolation au temps z6ro ~tait un peu excessive. Les colonnes 6 et 7 indiquent, pour m6moire, les r6sultats obtenus par PIEZ et al. 1~ dans la d6termination de la composition en acides amin6s des fl-lactoglobulines de vache A et B. PrOs de 2 r~sidus valine pour un poids mol6culaire de 33 ooo sont rapidement libdr6s lors de l'attaque de la fl-lactoglobuline de brebis par la carboxypeptidase A (Fig. 5); le m a x i m u m est atteint apr~s 2 h de temps de contact, une l~g~re baisse est constat6e aux temps d'hydrolyse sup6rieurs. La lib6ration de l'histidine est diff6rente, le m a x i m u m n'est atteint qu'apr~s 17 h d'attaque enzymatique. 2.0 2

_o 0

L%

Histidine 41

0 cl

I

I

L

17 20 24

72

I

96

Temps(h)

Fig. 5- Action de la c a r b o x y p e p t i d a s e A s u r la fl-lactoglobuline de brebis.

Caract&istiques physiques Les r6sultats de nos exp6riences ont 6t6 r6sum6s dans le Tableau II. Le coefficient de s6dimentation a 6t6 d6termin6 ~ basse temp6rature car nous esp6rions retrouver ainsi l'h6t6rog6n6it6 constat6e en 61ectrophor~se sur papier, nous inspirant, ce faisant, des r6sultats obtenus par OGSTON ET TILLEY17 avec la fl-lactoglobuline de vache. Mais les diagrammes obtenus, rant en ultracentrifugation qu'en diffusion, sont parfaitement sym6triques. Le volume sp6cifique partiel a dtd pris 6gal ~ o.751 , valeur d6termin6e par PEDERSENis pour la fi-lactoglobuline de vache. DISCUSSION

Le principal constituant des prot6ines du lactos6rum de brebis est indiscutablement l'homologue de la fl-lactoglobuline de vache. En effet, toutes les d6terminations que nous avons faites montrent que les caract6ristiques physiques et surtout chimiques Biochim. Biophys. Acta, lO 7 (1965) 5Ol-51o

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(composition en acides amin6s) de la fl-lactoglobuline de brebis sont tr6s voisines de celles de la fl-lactoglobuline de vache. Confirmation suppl6mentaire, JOHKE et al. ~ ont montr6 tout r6cemment qu'un 6chantillon issu de l'une de nos pr6parations donnait une r6action erois6e tr6s 6troite avec un s6rum anti-fl-lactoglobuline de vache. TABLEAU II CARACT]~RISTIQU~S

DE LA fl-LACTOGLOBULINE D]~ BREBIS

si% 20,W

2.79 ~: o.o3

D 20,W ~%

8.18" IO-~ cm~/sec

Poids mol6culaire N Eo.~ %Icm

333oo ~ 5oo (165oo ± 5oo) * 15.21% (15.35%)** 0.9o ::: o.oi 5. 278 m/~ et 0.89 5. 280 m #

* Poids mol6culaire calcul6 d'apr6s la composition en acides amin6s. ** D'apr6s la composition en acides amin4s.

Si la cristallisation se produit dans les m~mes conditions exp6rimentales, la dialyse finale pr6s, indiquant ainsi des propri6t6s de solubilit6 identiques, le syst6me de cristallisation est diff6rent. La fl-lactoglobuline de vache isol6e de lait de m61ange et le variant g6n6tique A de cette prot6ine cristallisent dans le syst6me orthorhombique ~°, la fl-lactoglobuline de brebis isol6e de lait de m61ange cristallise dans le syst~me monoclinique comme le variant g6n6tique B de vache 1°. Le poids mol6culaire de la fl-lactoglobuline de brebis, calcul6 d'apr6s la composition en acides amin6s sur la base de 2 histidines est de 16500. Si cette prot6ine, comme la fl-lactoglobuline de vache 2°, forme un dim6re, cela donne, un poids mol6culaire de 33 ooo, valeur en bon accord avec celle d6termin6e ~ partir des coefficients de s6dimentation et de diffusion (Tableau II). La mo16cule de la fl-lactoglobuline semble donc 16g6rement plus petite que celle de la prot6ine correspondante de vache. Le monom~re comprendrait au maximum 13 ~ 17 r6sidus en moins et son poids mol6culaire serait inf6rieur de 185o ~ celui du monom6re de la fl-lactoglobuline de vache 16. Cette diff6rence se manifeste 6galement au niveau des coefficients de diffusion d6termin6s dans les m~mes conditions: D20,w est 6gal ~ 7.70" lO-7 cm2/s ec (r6f. IO) pour la fi-lactoglobuline de vache contre 8.18. lO-7 cm2/sec pour celle de brebis. An niveau des coefficients de s4dimentation, la diff6rence observ6e n'est pas significative s2o,w est 6gal ~ 2.78. IO-~3 pour la prot6ine de brebis contre 2.8. IO-~3 pour celle de vache 1~. L'acide amin6 C terminal n'est pas le m~me: valine au lieu d'isoleucine 15. Mais il s'agit d'acides amin6s tr6s voisins quant ~ leur parent6 chimique. I1 est plausible de supposer l'existence de 2 monom~res comme dans la fl-lactoglobuline de vache puisque 2 r6sidus valine sont lib6r6s par mole de fl-lactoglobuline de brebis. Chaque monom6re serait constitu6 par une seule chaine ayant une s6quence C terminale de la forme: ...His.Val. L'avant-dernier acide amin6 C terminal serait donc le m~me que celui de la fl-lactoglobuline de vache2L Fait remarquable, la lib6ration de ce dernier acide amin6 est 6galement tr~s lente avec la seule carboxypeptidase A, ce qui sugg6re une structure secondaire et tertiaire ~2 tr6s voisine, tout au moins dans la partie C terminale, entre les fi-lactoglobulines des deux esp6ces. La lib6ration de 2 I3iochim. Biophys. dcta, lO 7 (1965) 5Ol-51o

I~.TUDE DE LA fl-LACTOGLOBULINEDE BREBIS

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r6sidus histidine par mole de fl-lactoglobuline de vache a 6t6 obtenue par DAVIE et al. 21 soit ~ partir de prot6ine d6natur~e avec la carboxypeptidase A, soit ~ partir de prot6ine native avec le m61ange des 2 carboxypeptidases A et B. La composition en acides amin6s est tr~s voisine chez les prot6ines des deux esp~ces (Tableau I). Pour le monom~re de 16500, l'identit6 porte, selon le variant g6n6tique de fl-lactoglobuline de vache, soit sur 7, soit sur i i des 18 acides amin6s d6termin6s. L'6cart maximum n'est que de 3 r6sidus pour un m~me acide amin6 (Glu). Si l'on fait un bilan sommaire des groupes ionisables, on constate que, par monom~re, la fl-lactoglobuline de brebis comprend 25 groupes carboxyles non amid6s (Tableau I) pour 14 groupes e-amin6s et 2- 3 groupes guanidine, tandis que la fllactoglobuline de vache comprend 28-29 groupes carboxyles non amid6s pour 15 groupes e-amin6s et 3 groupes guanidine. Ainsi s'explique la diff6rence de mobilit6 constat6e par plusieurs auteursl-3,5,% entre les prot6ines homologues des deux esp~ces. Le hombre de r6sidus d'acides amin6s aromatiques est tr~s voisin chez les prot6ines des deux esp~ces et pourtant le coefficient d'extinction molaire est diff6rent. E2so,n~---- 35600 pour la fl-lactoglobuline de vachen; E2som~ ---- 29700 pour la fl-lactoglobuline de brebis. Cela peut 8tre dfi soit au manque de pr6cision des m~thodes de dosage de la tyrosine et du tryptophane par spectrophotom6trie (cf. Tableau I et r6f. 16), soit ~t un environnement diff6rent de certains r6sidus aromatiques dans la mol6cule de fl-lactoglobuline de brebis. La fl-lactoglobuline de brebis cristallis6e provenant du lait de m61ange que nous avons utilis6 pour nos pr6parations forme deux bandes en 61ectrophor~se sur papier, l~tant donn6 les constatations faites ant6rieurement par ASCHAFFENBURG ET DREWRY9 sur la fl-lactoglobuline de vache, il parait plausible de supposer l'existence de variants g6n6tiques de fl-lactoglobuline de brebis. Si l'on examine le Tableau I, ces variants diff6reraient au moins par leur teneur en glycine, leucine, arginine et tyrosine. La diff6rence de deux charges positives A p H 8.6 par dim~re expliquerait l'absence de s6paration en chromatographie sur colonne de DEAE-cellulose, tandis que dans les m~mes conditions exp6rimentales *~, les fl-lactoglobulines de vache A et B, diff6rant de deux charges n6gatives, sont s~par6es. Les 6tudes que nous avons faites sur un petit nombre de laits individuels de brebis s n e nous permettent pas encore de conclure quant ~t la validit6 de cette hypoth~se mais nous esp6rons apporter une r6ponse ~ ce sujet dans un proche avenir. En d6finitive, la fl-lactoglobuline de brebis cristallise facilement et avec un gros rendement, plus de 2 g/1 de lait, et peut repr6senter un mat6riel int6ressant pour les 6tudes portant sur la structure des prot6ines et sur la comparaison de prot6ines homologues provenant d'esp~ces animales voisines. R~SUM~ La fl-lactoglobuline de brebis a 6t6 isol6e. Elle a 6t6 obtenue sous forme cristalline par une m6thode d6riv6e de celle qu'AsCHAFFENBURG ET DREWRY ont propos6e pour la cristallisation des fl-lactoglobulines de vache. Les 6tapes de la purification ont 6t6 suivies par chromatographie sur DEAE-cellulose et par 61ectrophor~se sur papier. La composition en acides amin6s, les coefficients de s6dimentation et de diffusion, le poids molfculaire, l'acide amin6 C terminal ont 6t6 d6termin6s et compar6s aux Biochim. Biophys. Acta, lO7 (1965) 5Ol-51o

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J . L . MAUBOIS, R. PION, B. RIBADEAU-DUMAS

caract~ristiques correspondantes des prot6ines homotogues du tait de vache. Recristallis6e 4 fois, la fl-lactoglobuline de brebis pr6sente deux bandes d'6gale importance en 61ectrophor~se sur papier, ce qui conduit ~ 6mettre l'hypothbse de l'existence de variants gdn6tiques. REMERCIEMENTS

Nous tenons ~ remercier Messieurs MOCQUOT,FAUCONNEAU et GARNIER, pour l'aide et les conseils qu'ils nous ont prodiguds durant ce travail, ainsi que Monsieur GROVEL dn Laboratoire de G6ologie de I'E.N.S.A., Rennes, qui a bien voulu se charger de l'examen des cristaux de fi-lactoglobuline de brebis et Madame DE MENDE du Laboratoire d'Electrochimie du C.N.R.S., Paris, qui a d6termin6 le coefficient de diffusion de cette prot6ine. BIBLIOGRAPHIE I 2 3 4 5 6 7 8 9 IO II 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

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