- Email: [email protected]
Presence d'enzymes marqueurs des membranes plasmiques, de l'appareil de golgi et du reticulum endoplasmique dans les membranes des globules lipidiques de lait maternel
Volume 2 1, number 2
FEBS LETTERS
March 1972
PRESENCE D’ENZYMES MARQUEURS DES MEMBRANES PLASMIQUES; DE L’APPAREIL DE GOLGI ET DU RETICULUM ENDOPLASMIQUE DANS LES MEMBRANES DES GLOBULES LIPIDIQUES DE LAIT MATERNEL M.B. MARTEL-PRADAL
et R. GOT
Equipe de Recherche, CNRS N” 66, U.E.R. Lyon&d, BP 12, 69-Oullins, France
Received 20 December 197 1 We report here the presence in human milk fat globules membranes of 5’-nucleotidase, Na+-K+and Mg*+ ATPases, and phosphodiesterase which are marker enzymes for the plasma membrane. Thiamine-pyrophosphatase, lactose and lactosamine synthetase were also found, which are usually considered as Golgi apparatus marker enzymes. Lastly, glucose-6-phosphatase, NADH-cytochrome c reductase and RNase, characteristic enzymes of the endoplasmic membrane, were also present.
1. Introduction I1 parait bien acquis, actuellement, que les globules lipidiques du lait bovin sont enveloppks dans une membrane plasmique provenant des cellules de la glande mammaire. Les preuves en ont ktC apportCes par des Etudes morphologiques et biochimiques mettant en jeu des caractCrisations de lipides et de protknes [l] et des diterminations d’activitk enzymatique [2, 31. I1 ne semble pas que des Ctudes similaires aient CtB effect&es dans le lait matemel. Le but de cette note est de p&enter une Etude sur la teneur en enzymes des membranes des globules lipidiques (MGL) du lait maternel.
2. MatCriel et mkthodes Les laits colostraux, prklevks entre le 3e et le 10e jour aprks la parturition sont centrifugks, g tempkrature ambiante, pendant 1 hr g 2500 g. La crkme est lake dans 10 fois son volume d’un tampon Tris-HCI 0.01 M pH 7,2, puis soumise g un barattage lent au Polytron, g 0”. Aprks formation des granules de beurre, le babeurre est diluk 10 fois dans le tampon prkedent et centrifuge 1 hr a 40.000 g. Le culot 220
de membranes ainsi obtenu est 1avCdans 30 fois son volume de tampon, recentrifugk dans les m6mes conditions et remis en suspension dans le s&urn physiologique ?I une concentration de 4 mg des protkines par ml. Les enzymes suivants ont BtB do&, dans le lait total, le lait BcrCmk et la suspension de membranes: RNase [4], phosphodiestkrase non spkcifique [5], ATPases acti& par Na+, K’ ou Mg*+ [6] , thiaminepyrophosphatase [7] , le phosphore lib& Btant dose selon Ueda et Wada [8], glucose-6-phosphatase, 5’-nuclkotidase et NADH-cytochrome c rkductase [9] , nuclkotide-pyrophosphatase avec, pour substrat, 1’ UDP-glucose [lo] ou le NADH [ 1 l] et la xanthineoxydase [ 121. La milieux d’incubation des glycosyltransftkases sont constitks, pour un volume final de 260 ~1, de tampon pipkazine-glycylglycine pH 6,5 (concentration finale 0,028 M), MtiC12 (8 mM), UDP-galactose (0,04 n&l) contenant 0,l /.Xi d’UDP-galactose[ 1-3H] (N.E.N., 1500 mCi/mmole) et de 25 ~1 de la suspension enzymatique (200 pg de protkines). Apres 40 min d’incubation SI37”) l’activitk endogene est determinCe en dosant la radioactivitb du prkcipitk obtenu sur filtre (Whatman GF/B) par l’acide trichloracktique ?I lo%, lavk par un m6lange North-Holland Publishing Company - Amsterdam-
Volume 21, number 2
FEBS LETTERS
March 1972
Tableau 1 Activites enzymatiques du bait total, du lait e&me et des membr~es Enzymes
Lait total
RNase Phosphodiestirase
ATPases (activkes par Na+-K+)
0,4 x 1o-2 3
Thiamine pyrophosphatase Galactosyltransf&ase endogene)
40 0,3 x 1o-2
x 1o-3
ATPases (activees par Mg*+)
-
0,20 3
x lo-”
Membranes 56 4
x 1o-2
60
X 1O-3
0,lO 2
x 1o-3
1,4 4,4x
1o-3
(accepteur
N-acetyllactosamine
synthetase
N-acetyllactosamine Lactose synthetase
synthetase
30
30
1000
1000
Lactose synthitase Glucose-6-phosphatase NADH-cytochrome
Lait &&me
40 non specifique
des globules lipidiques.
c reductase
S’!Nucleotidase
2
40 1x5*
_
_
-
_
0*
_
-
23**
52**
0
0,3 x 1o-3
2
x 1o-3
x 1o-3
2
x 1o-3
9
x 1o-3
0
4
0.4 x 1o-3
Nucliotide pyrophosphatase
0
Xanthine oxydase
0
-
x 1o-3 0
0
0,02
Les activitks enzymatiques sont don&es en pmole/min/mg de proteines, sauf en ce qui conceme la RNase dont I’unite represente une AE,,,de 0,001 par mm d’incubation et les glycosyltransferases dont l’activite est exprimee en cpm/mg de proteines et par min d’incubation. * Sans cr-lactalbumine. ** Avec ~-lact~bumine (1 mg/ml).
m&hylal-m&hanol(4/ 1). Dam le cas de la N-acetyllactosamine synthetase ou de la lactose synthetase, 10 I_rld’une solution de ~-ac~tyl-~ucosam~e ou de glucose (2 mM) sont ajoutes et Bventuellement 25 fi dune solution ~~-lactalbu~ne (250 pg). Apres incubation, 20 $ du milieu sont soumis a une electrophorese a haut voltage (60 V/cm) a pH 6,5 durant 40 mm et la radioactivite restant au point de depart est determinee. Les proteines sont do&es par la methode de Lowry.
3. Rhdtats
et discussion
Les lavages successifs auxquels ont Bte soumises la creme et les MGL permettent d’exclure les resques de conflation par les enzymes solubles du lait. Les resultats rapport& dans le tableau 1 corres-
pondent a une experience type. Les activites enzymatiques ont pu varier du simple au double dans les diverses preparations membran~res real&es, mais la repartition generale des enzymes reste la meme. D’autre part, il est evident que les enzymes typiquement membranaires doivent voir leur activite specifique diminuer dans le lait CcrCme, par rapport au Iait total. Ainsi, les enzymes marqueurs classiques des membranes plasmiques, 5’-nucleotidase et ATPases, se retrouvent dans les MGL avec un enrichissement considerable en activite specifique. Les ATPases, insensibles a l’ouabaine, ont une activite nettement plus 6levCe que celJes du lait bovin, contrairement h la 5’-nucleotidase [3]. Nous n’avons pu mettre en evidence de nucleotides-pyrophosphatases, alors qu’elles ont BtC dodes dam le lait bovin [3] et dans les membranes plasmiques du foie de rat [ 1 l] . Par contre, les phosphodiesterases non 221
Vofume 21, number 2
FEBS LETTERS
specifiques, considerees Cgalement comme caracteristiques des membranes plasmiques du foie de rat [ 131, existent dans les MGL avec une activite relativement Clevee. Mis a part ces enzymes qui confirment i’importance des membranes plasmiques dans les MGL, now avons pu doser deux enzymes caracteristiques du reticulum endoplasmique, la glucosed-phosphatase et Ia NADH-cytochrome c reductase. De mbme, a cot& des RNases solubles, iI existe dans le lait maternel, une RNase membranaire, comme dam les microsomes du foie de rat [ 141. La presence des membranes golgiennes nous est suggeree par les activites thiam~e pyrophospha tase et surtout N-ac6tyllactosamine synthetase qui en est l’enzyme marqueur type [ 15, 161, en particulier dans la glande mammaire [ 171. Nous avons d’ailleurs v&if% que ~~-lactalbum~e modifiait i’affinite de fa transferase vis a vis du glucose et de la N-acitylglucosamine. I1 est interessant de constater qu’il existe Cgalement activite de transfert du galaclose sur accepteur endogene similaire a celle qui a deja Cte montree dans les microsomes de divers tissus ou organes. Enfin, les MGL ccntiennent une activite xanthine oxydase, un des principaux enzymes du lait bovin, consid& d’ailleurs comme enzyme microsomique [2] . La presence de cet enzyme dans le lait maternel est discutee; il est de fait que nous n’avons pu le mettre
en Evidence
ni dans le lait total ni dans le
lait bcrCmC, ce qui confirme exclusivement
d’ailleurs
sa localisation
membranaire.
En conclu~on, si les MGL du kit maternel sont constituees principalement de membranes plasmiques des cellules de la glande mammaire, elles contiennent
222
March 1972
Bgalement des elements de l’appareil de Golgi et du reticulum endoplasmique. Cette h6tCrogenCite n’est d’ailleurs pas incompatible avec le mode de secretion des lipides du lait .
Bibliographic
111T.W. Keenan, D.J. Morre, D.E. Olson, W.N. Yunghans et S. Patton, J. Cell Biol. 44 (1970) 80.
121 R.M. Dowben, J.R. Brunner et DE. Philpott, Biochim. Biophys. Acta 135 (1967) 1. L31 S. Patton et E.G. Trams, FEBS Letters 14 (1971) 230. 141 S. Green et 0. Bodansky, J. Biol. Chem. 239 (1964) 2613. LSl A.I. Lansing, M.L. Belkhode, W.E. Lynch et 1. Lieberman, J. Biol. Chem. 242 (1967) 1772. (61 G. Avigland et S. England, J. Biol. Chem. 243 (1968) 1511. [?I M. Yamazaki et 0. Hayaishi, J. Biol. Chem. 243 (1968) 2934. 181 I. Ueda et T. Wada, Anal. Biochem. 37 (1970) 169. PI H. Schachter, I. Jabbal, R. Hudgin, L. Pinteric, E.J. McGuire et S. Roseman, J. Biol. Chem. 245 (1970) 1090. 1101 L.H. ~h~selfeld, J. van Eys et 0. Touster, J. Biol. Chem. 240 (1965) 811. J.R. Skidmore et E.G. Trams, Biochim. Biophys. Acta IllI 219 (1970) 93. [12] L.I. Hart, M.A. McGartoll, H.R. Chapman et R.C. Bray, Biochem. J. 116 (1970) 851. [ 131 0. Touster, N.N. Aronson, Jr., J.T. Dulaney et H. Hendrickson, J. Cell. Biol. 47 (1970) 604. (141 T. Scott-Burden et A.O. Hawtrey, Biochem. J. 115 (1969) 1063. [IS] D.J. Morre, L.M. Merlin et T.W. Keenan, Biochem. Biophys. Res. Commun. 37 (1969) 813. [ 161 B. Fleisher, S. Fleisher et H. Ozawa, J. Cell. Biol. 43 (19693 59. (171 P.N. Campbell, FEBS Letters 7 (1970) 1.
FEBS LETTERS
March 1972
PRESENCE D’ENZYMES MARQUEURS DES MEMBRANES PLASMIQUES; DE L’APPAREIL DE GOLGI ET DU RETICULUM ENDOPLASMIQUE DANS LES MEMBRANES DES GLOBULES LIPIDIQUES DE LAIT MATERNEL M.B. MARTEL-PRADAL
et R. GOT
Equipe de Recherche, CNRS N” 66, U.E.R. Lyon&d, BP 12, 69-Oullins, France
Received 20 December 197 1 We report here the presence in human milk fat globules membranes of 5’-nucleotidase, Na+-K+and Mg*+ ATPases, and phosphodiesterase which are marker enzymes for the plasma membrane. Thiamine-pyrophosphatase, lactose and lactosamine synthetase were also found, which are usually considered as Golgi apparatus marker enzymes. Lastly, glucose-6-phosphatase, NADH-cytochrome c reductase and RNase, characteristic enzymes of the endoplasmic membrane, were also present.
1. Introduction I1 parait bien acquis, actuellement, que les globules lipidiques du lait bovin sont enveloppks dans une membrane plasmique provenant des cellules de la glande mammaire. Les preuves en ont ktC apportCes par des Etudes morphologiques et biochimiques mettant en jeu des caractCrisations de lipides et de protknes [l] et des diterminations d’activitk enzymatique [2, 31. I1 ne semble pas que des Ctudes similaires aient CtB effect&es dans le lait matemel. Le but de cette note est de p&enter une Etude sur la teneur en enzymes des membranes des globules lipidiques (MGL) du lait maternel.
2. MatCriel et mkthodes Les laits colostraux, prklevks entre le 3e et le 10e jour aprks la parturition sont centrifugks, g tempkrature ambiante, pendant 1 hr g 2500 g. La crkme est lake dans 10 fois son volume d’un tampon Tris-HCI 0.01 M pH 7,2, puis soumise g un barattage lent au Polytron, g 0”. Aprks formation des granules de beurre, le babeurre est diluk 10 fois dans le tampon prkedent et centrifuge 1 hr a 40.000 g. Le culot 220
de membranes ainsi obtenu est 1avCdans 30 fois son volume de tampon, recentrifugk dans les m6mes conditions et remis en suspension dans le s&urn physiologique ?I une concentration de 4 mg des protkines par ml. Les enzymes suivants ont BtB do&, dans le lait total, le lait BcrCmk et la suspension de membranes: RNase [4], phosphodiestkrase non spkcifique [5], ATPases acti& par Na+, K’ ou Mg*+ [6] , thiaminepyrophosphatase [7] , le phosphore lib& Btant dose selon Ueda et Wada [8], glucose-6-phosphatase, 5’-nuclkotidase et NADH-cytochrome c rkductase [9] , nuclkotide-pyrophosphatase avec, pour substrat, 1’ UDP-glucose [lo] ou le NADH [ 1 l] et la xanthineoxydase [ 121. La milieux d’incubation des glycosyltransftkases sont constitks, pour un volume final de 260 ~1, de tampon pipkazine-glycylglycine pH 6,5 (concentration finale 0,028 M), MtiC12 (8 mM), UDP-galactose (0,04 n&l) contenant 0,l /.Xi d’UDP-galactose[ 1-3H] (N.E.N., 1500 mCi/mmole) et de 25 ~1 de la suspension enzymatique (200 pg de protkines). Apres 40 min d’incubation SI37”) l’activitk endogene est determinCe en dosant la radioactivitb du prkcipitk obtenu sur filtre (Whatman GF/B) par l’acide trichloracktique ?I lo%, lavk par un m6lange North-Holland Publishing Company - Amsterdam-
Volume 21, number 2
FEBS LETTERS
March 1972
Tableau 1 Activites enzymatiques du bait total, du lait e&me et des membr~es Enzymes
Lait total
RNase Phosphodiestirase
ATPases (activkes par Na+-K+)
0,4 x 1o-2 3
Thiamine pyrophosphatase Galactosyltransf&ase endogene)
40 0,3 x 1o-2
x 1o-3
ATPases (activees par Mg*+)
-
0,20 3
x lo-”
Membranes 56 4
x 1o-2
60
X 1O-3
0,lO 2
x 1o-3
1,4 4,4x
1o-3
(accepteur
N-acetyllactosamine
synthetase
N-acetyllactosamine Lactose synthetase
synthetase
30
30
1000
1000
Lactose synthitase Glucose-6-phosphatase NADH-cytochrome
Lait &&me
40 non specifique
des globules lipidiques.
c reductase
S’!Nucleotidase
2
40 1x5*
_
_
-
_
0*
_
-
23**
52**
0
0,3 x 1o-3
2
x 1o-3
x 1o-3
2
x 1o-3
9
x 1o-3
0
4
0.4 x 1o-3
Nucliotide pyrophosphatase
0
Xanthine oxydase
0
-
x 1o-3 0
0
0,02
Les activitks enzymatiques sont don&es en pmole/min/mg de proteines, sauf en ce qui conceme la RNase dont I’unite represente une AE,,,de 0,001 par mm d’incubation et les glycosyltransferases dont l’activite est exprimee en cpm/mg de proteines et par min d’incubation. * Sans cr-lactalbumine. ** Avec ~-lact~bumine (1 mg/ml).
m&hylal-m&hanol(4/ 1). Dam le cas de la N-acetyllactosamine synthetase ou de la lactose synthetase, 10 I_rld’une solution de ~-ac~tyl-~ucosam~e ou de glucose (2 mM) sont ajoutes et Bventuellement 25 fi dune solution ~~-lactalbu~ne (250 pg). Apres incubation, 20 $ du milieu sont soumis a une electrophorese a haut voltage (60 V/cm) a pH 6,5 durant 40 mm et la radioactivite restant au point de depart est determinee. Les proteines sont do&es par la methode de Lowry.
3. Rhdtats
et discussion
Les lavages successifs auxquels ont Bte soumises la creme et les MGL permettent d’exclure les resques de conflation par les enzymes solubles du lait. Les resultats rapport& dans le tableau 1 corres-
pondent a une experience type. Les activites enzymatiques ont pu varier du simple au double dans les diverses preparations membran~res real&es, mais la repartition generale des enzymes reste la meme. D’autre part, il est evident que les enzymes typiquement membranaires doivent voir leur activite specifique diminuer dans le lait CcrCme, par rapport au Iait total. Ainsi, les enzymes marqueurs classiques des membranes plasmiques, 5’-nucleotidase et ATPases, se retrouvent dans les MGL avec un enrichissement considerable en activite specifique. Les ATPases, insensibles a l’ouabaine, ont une activite nettement plus 6levCe que celJes du lait bovin, contrairement h la 5’-nucleotidase [3]. Nous n’avons pu mettre en evidence de nucleotides-pyrophosphatases, alors qu’elles ont BtC dodes dam le lait bovin [3] et dans les membranes plasmiques du foie de rat [ 1 l] . Par contre, les phosphodiesterases non 221
Vofume 21, number 2
FEBS LETTERS
specifiques, considerees Cgalement comme caracteristiques des membranes plasmiques du foie de rat [ 131, existent dans les MGL avec une activite relativement Clevee. Mis a part ces enzymes qui confirment i’importance des membranes plasmiques dans les MGL, now avons pu doser deux enzymes caracteristiques du reticulum endoplasmique, la glucosed-phosphatase et Ia NADH-cytochrome c reductase. De mbme, a cot& des RNases solubles, iI existe dans le lait maternel, une RNase membranaire, comme dam les microsomes du foie de rat [ 141. La presence des membranes golgiennes nous est suggeree par les activites thiam~e pyrophospha tase et surtout N-ac6tyllactosamine synthetase qui en est l’enzyme marqueur type [ 15, 161, en particulier dans la glande mammaire [ 171. Nous avons d’ailleurs v&if% que ~~-lactalbum~e modifiait i’affinite de fa transferase vis a vis du glucose et de la N-acitylglucosamine. I1 est interessant de constater qu’il existe Cgalement activite de transfert du galaclose sur accepteur endogene similaire a celle qui a deja Cte montree dans les microsomes de divers tissus ou organes. Enfin, les MGL ccntiennent une activite xanthine oxydase, un des principaux enzymes du lait bovin, consid& d’ailleurs comme enzyme microsomique [2] . La presence de cet enzyme dans le lait maternel est discutee; il est de fait que nous n’avons pu le mettre
en Evidence
ni dans le lait total ni dans le
lait bcrCmC, ce qui confirme exclusivement
d’ailleurs
sa localisation
membranaire.
En conclu~on, si les MGL du kit maternel sont constituees principalement de membranes plasmiques des cellules de la glande mammaire, elles contiennent
222
March 1972
Bgalement des elements de l’appareil de Golgi et du reticulum endoplasmique. Cette h6tCrogenCite n’est d’ailleurs pas incompatible avec le mode de secretion des lipides du lait .
Bibliographic
111T.W. Keenan, D.J. Morre, D.E. Olson, W.N. Yunghans et S. Patton, J. Cell Biol. 44 (1970) 80.
121 R.M. Dowben, J.R. Brunner et DE. Philpott, Biochim. Biophys. Acta 135 (1967) 1. L31 S. Patton et E.G. Trams, FEBS Letters 14 (1971) 230. 141 S. Green et 0. Bodansky, J. Biol. Chem. 239 (1964) 2613. LSl A.I. Lansing, M.L. Belkhode, W.E. Lynch et 1. Lieberman, J. Biol. Chem. 242 (1967) 1772. (61 G. Avigland et S. England, J. Biol. Chem. 243 (1968) 1511. [?I M. Yamazaki et 0. Hayaishi, J. Biol. Chem. 243 (1968) 2934. 181 I. Ueda et T. Wada, Anal. Biochem. 37 (1970) 169. PI H. Schachter, I. Jabbal, R. Hudgin, L. Pinteric, E.J. McGuire et S. Roseman, J. Biol. Chem. 245 (1970) 1090. 1101 L.H. ~h~selfeld, J. van Eys et 0. Touster, J. Biol. Chem. 240 (1965) 811. J.R. Skidmore et E.G. Trams, Biochim. Biophys. Acta IllI 219 (1970) 93. [12] L.I. Hart, M.A. McGartoll, H.R. Chapman et R.C. Bray, Biochem. J. 116 (1970) 851. [ 131 0. Touster, N.N. Aronson, Jr., J.T. Dulaney et H. Hendrickson, J. Cell. Biol. 47 (1970) 604. (141 T. Scott-Burden et A.O. Hawtrey, Biochem. J. 115 (1969) 1063. [IS] D.J. Morre, L.M. Merlin et T.W. Keenan, Biochem. Biophys. Res. Commun. 37 (1969) 813. [ 161 B. Fleisher, S. Fleisher et H. Ozawa, J. Cell. Biol. 43 (19693 59. (171 P.N. Campbell, FEBS Letters 7 (1970) 1.