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Protéine-kinases contrôlant la prolifération cellulaire chez Plasmodium : cibles moléculaires pour de nouveaux anti-paludiques ?
Pathol Biol 2002 ; 50 : 223-6 2002 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés S0369-8114(02)00292-4/EDI
Éditorial
Protéine-kinases contrôlant la prolifération cellulaire chez Plasmodium : cibles moléculaires pour de nouveaux anti-paludiques ? Dominique Dorin, Christian Doerig ∗ INSERM U 511, CHU Pitié-Salpêtrière, Paris, France
anti-paludique / cible chimiothérapeutique / paludisme / phosphorylation / protéine-kinase anti-malarial / chemotherapeutic target / malaria / phosphorylation / protein kinase
Le paludisme tue, encore et toujours. Entre un et trois millions de vies humaines, en majorité celles de jeunes enfants en Afrique sub-saharienne, sont perdues chaque année en conséquence d’infections à Plasmodium falciparum, l’hématozoaire responsable de la forme létale de la maladie. L’impact de cette affection sur le développement socio-économique de nombreux pays en zone intertropicale est considérable, non seulement à cause de P. falciparum, mais également à cause des trois autres espèces infectant l’être humain (P. vivax, P. malariae et P. ovale), qui causent un énorme fardeau de morbidité. Les espoirs suscités par les plans d’éradication du paludisme mis en œuvre dans les décennies qui ont suivi la Seconde Guerre Mondiale ont bien vite été réduits à néant, en grande partie de par l’émergence de parasites résistants aux anti-paludiques communément utilisés (notamment la chloroquine), et celle d’Anophèles (le genre de moustiques vecteur de la maladie) résistants aux insecticides. Il semble probable, selon les scénarios les plus optimistes, que l’addition d’un vaccin dans l’arsenal de la lutte contre le paludisme demande encore de nombreuses années. Il est donc urgent de développer de nouvelles approches chimiothérapeutiques (voir http://www.malaria.org et [1]). L’identification rationnelle de nouvelles cibles moléculaires pour la chimiothérapie anti-palustre dépend de la connaissance de la biologie fondamentale du parasite. Les recherches dans ce domaine bénéficient d’un programme international de séquençage du génome de P. falciparum, qui arrivera à complétion en 2002 ; les bases de données ainsi générées, en grande partie d’ores et déjà disponibles
sur le Web (http://www.plasmodb.org et [2]), s’avèrent être d’une utilité extraordinaire pour les chercheurs visant à identifier de nouvelles cibles chez le parasite. En guise d’illustration des perspectives offertes par la génomique plasmodiale, nous allons brièvement présenter nos recherches sur les enzymes régulant la prolifération et le développement du parasite, et sur leur application possible dans la mise au point de nouveaux anti-paludiques.
1. CYCLE PARASITAIRE ET CYCLE CELLULAIRE Le cycle parasitaire de Plasmodium est constitué d’une succession de stades entre lesquels le statut de division cellulaire varie. Ainsi, les sporozoïtes accumulés dans les glandes salivaires du moustique ne se divisent pas ; une fois injectés dans la circulation sanguine de l’hôte humain, ces sporozoïtes gagnent le foie et pénètrent dans un hépatocyte, où ils se différencient en trophozoïtes, puis en schizontes. Ces derniers sont le siège d’une activité intense de division schizogonique produisant plusieurs milliers de mérozoites. Ceux-ci, à l’instar des sporozoïtes, ne se divisent pas jusque après invasion d’une cellule-hôte ; dans le cas des mérozoïtes, cette dernière est un érythrocyte, au sein duquel le mérozoïte se développe en trophozoïte, puis en schizonte, qui produit à son tour de nouveaux mérozoïtes. Cette schizogonie intra-érythrocytaire est le processus responsable de la pathologie palustre. Certains mérozoïtes, après invasion
∗ Correspondance et tirés à part : Christian Doerig, INSERM U 511, CHU Pitié-Salpêtrière, 91, boulevard de l’Hôpital, 75013 Paris, France.
Adresse e-mail : [email protected] (C. Doerig).
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de l’érythrocyte, subissent un développement sexué en gamétocyte mâle ou femelle, au cours duquel le cycle cellulaire est arrêté. Ce sont ces formes sexuées qui sont capables de transmettre l’infection au moustique lors d’un repas sanguin (les formes asexuées ne survivent pas à l’ingestion par le moustique). Dans l’estomac du moustique, les gamétocytes poursuivent leur développement en gamètes (ce qui implique, pour les mâles, trois cycles de division rapides produisant huit gamètes par gamétocyte), qui fusionnent ensuite pour former un zygote. Ce dernier se développe en un ookinète mobile qui, tout en subissant une réduction méiotique, franchit l’épithélium intestinal de l’insecte. L’ookinète gagne ensuite la lamina basale située sur la face externe de l’épithélium intestinal et se développe en oocyste, qui va produire par multiplication asexuée plusieurs milliers de sporozoïtes, lesquels s’accumulent dans les glandes salivaires et sont prêts à infecter un nouvel hôte humain. Un examen superficiel de ce cycle parasitaire indique que la survie du parasite dépend de sa capacité à contrôler strictement son cycle cellulaire, de façon à ce que la cellule entre en division au moment adéquat (par exemple à la transition entre trophozoïte et schizonte), et, inversement, arrête le cycle cellulaire à certains stades (par exemple dans les gamétocytes et les sporozoites). Que sait-on des modalités de ce contrôle chez le parasite ? Peu de choses, en vérité. Cependant, il est clair que des divergences importantes existent entre le cycle cellulaire « classique » des eucaroytes supérieurs et celui du parasite. Par exemple, la membrane nucléaire disparaît durant la métaphase chez les métazoaires, mais est maintenue lors de la schizogonie des plasmodies (un phénomène appelé cryptomitose). Les divisions nucléaires sont en outre asynchrones dans un schizonte donné, ce qui n’est pas observé dans le cas d’autres multiplications de type schizogonique, comme par exemple lors de l’embryogenèse précoce de la drosophile [3]. Ces particularités sont vraisemblablement sous-tendues par des spécificités au niveau moléculaire, qui pourraient être exploitées en vue d’interférer spécifiquement avec les processus de contrôle de division cellulaire du parasite. La progression du cycle cellulaire eucaryote est assurée par une famille de protéine-kinases, les CDK (« cyclindependent kinases »). L’activité des CDK dépend de leur association avec une sous-unité régulatrice (cycline), dont l’abondance fluctue au cours du cycle cellulaire. Plusieurs CDK et cyclines sont exprimées par la cellule, et l’association temporaire entre une CDK et une cycline permet l’activation de l’enzyme durant la phase idoine de la division cellulaire [4]. Cette machinerie est elle-même placée sous le contrôle de signaux extra- ou intra-cellulaires, qui lui sont transmis par des voies de transduction. L’une de ces voies, celle des MAP kinases (« mitogen-activated protein kinases »), joue dans plusieurs systèmes un rôle particulièrement important dans la « décision » de la cellule à entrer en prolifération, ou, au contraire, à arrêter le
cycle cellulaire et à entrer en différenciation. Les MAPK sont structurellement apparentées aux CDK, mais leur activation ne nécessite pas un partenaire de type cycline : ces enzymes sont activées par double phosphorylation d’un site Thr-X-Tyr par une MAPK kinase (MAPKK), elle-même activée par une MAPKK kinase (MAPKKK), en réponse à certains stimuli. Certaines MAPK peuvent phosphoryler des inhibiteurs de CDK, qui deviennent alors capables d’arrêter le cycle cellulaire en empêchant l’action des CDK ; d’autres substrats sont des facteurs de transcription, dont l’activation par la MAPK permet un remodelage de l’expression génique en réponse à un signal donné [5].
2. ÉLÉMENTS RÉGULATEURS DE LA PROLIFÉRATION CHEZ P. FALCIPARUM : D’IMPORTANTES PARTICULARITÉS STRUCTURALES ET FONCTIONNELLES Qu’en est-il de ces éléments chez les parasites du genre Plasmodium ? La recherche ciblée de gènes parasitaires codant pour des CDK et des MAPK, puis, plus récemment, l’exploitation des bases de données issues du projet de séquençage du génome de P. falciparum, indiquent que ce parasite possède plusieurs gènes codant pour des molécules appartenant aux familles des MAPK, CDK et cyclines. Si la présence de tels éléments chez le parasite n’a rien d’inattendu – les plasmodies sont, après tout, des cellules eucaryotes –, il est en revanche très intéressant de constater les nombreuses particularités que présentent ces molécules parasitaires relativement à leurs homologues trouvés chez les eucaryotes supérieurs. Les homologues plasmodiaux des CDK et MAPK présentent une homologie de 40 à 60 % avec les kinases homologues de mammifères. En outre, plusieurs protéine-kinases parasitaires présentent, en plus du domaine catalytique de l’enzyme, de grandes extensions et/ou insertions, incluant dans certains cas des motifs répétés d’acides aminés. Cette particularité est partagée par de nombreuses autres protéines plasmodiales. La fonction de ces régions reste à déterminer [6]. D’autres divergences structurales touchent à des régions fonctionnelles du domaine catalytique lui-même ; par exemple, Pfmap-2, l’une des MAPK parasitaires que nous avons identifiées, comporte un site d’activation atypique (Thr-Ser-His, au lieu du motif ThrX-Tyr trouvé chez les MAPK d’autres eucaryotes) qui suggère un mode de régulation de cette enzyme divergent par rapport à celui des MAPK de mammifères [7]. Une autre particularité est partagée par la structure primaire de plusieurs protéine-kinases plasmodiales : celle de comporter sur le même domaine catalytique des motifs caractéristiques de familles de kinases distinctes. Nous avons jusqu’ici caractérisé deux enzymes [8, 9] qui partagent cette apparence de protéine-kinase « hybride » :
Protéine-kinases contrôlant la prolifération cellulaire chez Plasmodium
2.1. Pfnek-1 Chez tous les organismes, dans la voie bien étudiée des MAPK, on retrouve un module MAPKKK-MAPKKMAPK, dont chaque élément porte une « signature » particulière [5]. On a vu que P. falciparum possède une MAPK (Pfmap-2) ne possédant pas le site d’activation attendu. Or, un examen des bases de données génomiques disponibles actuellement (qui couvrent la quasi-totalité des séquences codantes) suggère que cet organisme ne possède pas de MAPKK typique avec un site d’activation répondant à la MAPKKK. En revanche, Pfnek-1, une protéine que nous avons récemment décrite [8] porte un tel site, bien qu’elle soit apparentée à une famille de kinases qui n’est pas celle des MAPKK (cette enzyme, Pfnek-1, présente en effet une homologie maximale avec les kinase de la famille NIMA/Nek). Pfnek-1 présente donc une séquence similaire à celle des kinases NIMA avec cependant un site d’activation caractéristique des MAPKK. Qui plus est, Pfnek-1 est capable de phosphoryler Pfmap-2 in vitro, et d’agir en synergie avec cette dernière pour phosphoryler un substrat exogène [8]. Il semble donc que la voie de signalisation impliquant Pfmap-2 puisse diverger de façon importante des voies des MAPK classiques.
2.2. PfPK6 Un autre exemple concerne une kinase apparentée aux CDK et caractérisée en collaboration avec le groupe de D. Chakrabarti en Floride [9]. La séquence polypeptidique de cette enzyme comporte des caractéristiques propres aux CDK d’une part, et aux MAPK d’autre part. Les bases de données génomiques nous indiquent que d’autres exemples de protéine-kinases de ce type existeraient chez P. falciparum. Les séquences « hybrides » de ces protéines kinases plasmodiales suggèrent que ces enzymes soient régulées de façon distincte. En outre, comme ces kinases n’ont pas d’homologue connu chez les autres eukaryotes, il est difficile de prédire leur fonction sur la seule base de leur séquence polypeptidique. Il semblerait donc qu’au-delà de la structure primaire de certaines des enzymes probablement impliquées dans la signalisation, l’organisation même de certaines voies de transduction diffère entre Plasmodium et les eucaryotes supérieurs. À ces divergences structurales, s’ajoutent des particularités fonctionnelles également décelées chez les CDK parasitaires. Par exemple, PfPK5, une kinase qui présente une homologie maximale avec CDK1, est susceptible d’être activée in vitro par une grande variété de cyclines (plasmodiales ou hétérologues). Cette propriété, qui n’est pas partagée par les CDK de mammifères, suggère une spécificité relâchée de cette enzyme par rapport aux cyclines, est pourrait refléter un mode de régulation différent de celui qu’on trouve chez les CDK d’eucaryotes
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supérieurs [10]. De même, PfPK5 est capable d’autophosphorylation in vitro en présence de cycline [10], un phénomène qui à notre connaissance n’a pas été observé avec d’autres CDK.
3. VERS UNE INHIBITION SPÉCIFIQUE DES KINASES PARASITAIRES ? Les spécificités propres aux protéine-kinases parasitaires permettent d’espérer qu’une inhibition sélective de ces dernières sera possible. Il a d’ailleurs été démontré que les homologues de CDK1 (cdc2) de levure et vertébrés ont des susceptibilités très différentes à certains inhibiteurs [11]. L’utilisation de protéine-kinases parasitaires recombinantes dans des tests d’inhibition tend à montrer le même phénomène de susceptibilité différentielle. Certaines des enzymes parasitaires ont une activité spécifique suffisante pour envisager le développement de tests de criblage de chimiothèques à haut débit. En cas de découverte de composés capables d’inhiber efficacement une kinase parasitaire, leur efficacité sera testée sur le parasite en culture, et leur spécificité évaluée au moyen de tests sur des cellules de mammifères et sur des enzymes homologues de mammifères. Une stratégie alternative, que nous suivons également, consiste à cribler des collections de dérivés d’inhibiteurs de protéine-kinases directement sur le parasite en culture [12] ; les cibles potentielles des composés actifs éventuels peuvent ensuite être identifiées par chromatographie d’affinité sur l’inhibiteur immobilisé sur une résine. Cette approche nous a déjà permis d’identifier une kinase parasitaire comme cible présumée d’un inhibiteur efficace ex vivo [13]. La co-cristallisation et la résolution de la structure tridimensionnelle du complexe kinase-inhibiteur permettra la conception de molécules plus performantes en termes d’affinité et de spécificité. La validation d’enzymes comme cibles chimiothérapeutiques pose un problème aigu dans le cas du paludisme, à cause de la difficulté d’obtenir des mutants à phénotype « nul » pour les gènes essentiels [14]. Toutefois, les protéine-kinases se prêtent particulièrement bien aux approches dites de « génétique chimique » [15]. Cette stratégie consiste à remplacer dans le génome du parasite l’allèle sauvage d’une kinase donnée par une forme mutante dont le produit est hypersensible à une certaine catégorie d’inhibiteurs chimiques. Le traitement des parasites mutants par ces inhibiteurs résulte en l’inactivation spécifique de la kinase mutée, et permet ainsi d’obtenir un phénotype « nul ». Cette approche devrait permettre de résoudre le problème de la détermination de la fonction des protéine-kinases et de leur validation comme cibles pour la chimiothérapie. Les travaux sur les protéine-kinases de Plasmodium présentés ici illustrent les apports de la génomique à la recherche de nouvelles cibles chimiothérapeutiques. Il est encore trop tôt pour savoir si, dans ce cas précis, cette
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approche permettra la mise au point de nouveaux antipaludiques. Néanmoins, des stratégies similaires étant suivies avec de nombreux autres types d’enzymes parasitaires, il est permis d’espérer que les recherches fondamentales, elles-mêmes facilitées par la génomique, aboutiront au développement de nouveaux moyens d’intervention dont bénéficieront les populations affectées par le fléau du paludisme.
REMERCIEMENTS Nous tenons à remercier tous les membres présents et passés de l’équipe « protéine-kinases » de l’Unité 511 de l’INSERM (K. Le Roch, A. Merckx, M.-P. Nivez, L. Cicéron, L. Equinet, A. Jafarshad, S. Brun, C. Doerig), où a été effectuée la plupart des travaux évoqués ici, ainsi que les nombreux collaborateurs extérieurs (L. Meijer, P. Alano, D. Parzy, L. Harmse, J. Endicott, D. Chakrabarti, N. Gray, K. Shah, N. Waters) impliqués dans ce projet. Ces travaux sont financés par l’INSERM, le Ministère de la Recherche (programmes PRFMMIP et PAL+), le Ministère de la Défense (Délégation Générale pour l’Armement), le Ministère des Affaires Etrangères (Coopération Scientifique avec l’Afrique de Sud) et l’Organisation Mondiale de la Santé (« TDR programme of the UNDP/World Bank/WHO »).
RÉFÉRENCES 1 Trigg PI, Kondrachine AV. The current global malaria situation. In : Sherman IW, editor. Malaria: parasite biology, pathogenesis, and protection. Washington, DC : Am Soc Microbiol ; 1998, p. 11-22. 2 The Plasmodium Genome Database Collaborative. PlasmoDB: An integrative database of the P. falciparum genome. Tools for accessing and analyzing finished and unfinished sequence data. Nucl Acids Res 2001 ; 29 : 66-9. 3 Doerig C, Chakrabarti D, Kappes B, Matthews K. The cell cycle in protozoan parasites. Progress in Cell Cycle Research 2000 ; 4 : 163-83.
4 Morgan DO. Cyclin-dependent kinases: engines, clocks, and microprocessors. Annu Rev Cell Dev Biol 1997 ; 13 : 261-91. 5 Madhani HD, Fink GR. The riddle of MAP kinase signaling specificity. Trends Genet 1998 ; 14 : 151-5. 6 Kappes B, Doerig C, Graeser R. An overview of Plasmodium protein kinases. Parasitol Today 1999 ; 15 : 449-54. 7 Dorin D, Alano P, Boccaccio I, Cicéron L, Doerig CM, Sulpice R, Parzy D, Doerig C. An atypical MAP kinase homologue expressed in gametocytes of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Identification of a MAPK signature. J Biol Chem 1999 ; 274 : 29912-20. 8 Dorin D, Le Roch K, Sallicandro P, Alano P, Poullet P, Parzy D, Meijer L, Doerig C. Pfnek-1, a novel NIMA-related protein kinase from the human malaria parasite Plasmodium falciparum: biochemical properties and possible involvement in a MAPK pathway. Eur J Biochem 2001 ; 268 : 2600-8. 9 Bracchi-Ricard V, Barik S, DelVecchio C, Doerig C, Chakrabarti R, Chakrabarti D. PfPK6, an unusual CDK/MAP kinase-related protein from Plasmodium falciparum. Biochem J 2000 ; 347 : 255-63. 10 Le Roch K, Sestier C, Dorin D, Waters N, Kappes B, Chakrabarti D, Meijer L, Doerig C. Activation of a Plasmodium falciparum cdc2related kinase by heterologous p25 and cyclin H. Functional characterisation of a P. falciparum cyclin homologue. J Biol C 2000 ; 275 : 8952-8. 11 Gray N, Wodicka L, Thunnissen AM, Norman T, Kwon S, Espinoza FH, Morgan DO, Barnes G, Leclerc S, Meijer L, Kim SH, Lockhart DJ, Schultze P. Exploiting chemical libraries, structure, and genomics in the search for new kinase inhibitors. Science 1998 ; 281 : 533-8. 12 Harmse L, Van Zyl R, Gray N, Meijer L, Doerig C, Havlik I. The effect of purine-derived cyclin-dependent kinase inhibitors on Plasmodium falciparum. Biochem Pharmacol 2001 ; 62 : 341-58. 13 Knockaert M, Gray N, Damiens E, Grellier P, Grant K, Fergusson D, Mottram J, Soete M, Dubremetz J-F, Le Roch K, Doerig C, Schultz PG, Meijer L. Intracellular targets of cyclindependentkinase inhibitors: identification by affinity chromatography using immobilized inhibitors. Chemistry & Biology 2000 ; 7 : 411-22. 14 Waters AP, Thomas AW, van Dijk MR, Janse CJ. Transfection of malaria parasites. Methods 1997 ; 13 : 134-47. 15 Bishop AC, Ubersax JA, Petsch DT, Matheos DP, Gray NS, Blethrow J, Shimizu E, Tsien JZ, Schultz PG, Rose MD, Wood JL, Morgan DO, Shokat KM. A chemical switch for inhibitor-sensitive alleles of any protein kinase. Nature 2000 ; 40 : 395-401.
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Protéine-kinases contrôlant la prolifération cellulaire chez Plasmodium : cibles moléculaires pour de nouveaux anti-paludiques ? Dominique Dorin, Christian Doerig ∗ INSERM U 511, CHU Pitié-Salpêtrière, Paris, France
anti-paludique / cible chimiothérapeutique / paludisme / phosphorylation / protéine-kinase anti-malarial / chemotherapeutic target / malaria / phosphorylation / protein kinase
Le paludisme tue, encore et toujours. Entre un et trois millions de vies humaines, en majorité celles de jeunes enfants en Afrique sub-saharienne, sont perdues chaque année en conséquence d’infections à Plasmodium falciparum, l’hématozoaire responsable de la forme létale de la maladie. L’impact de cette affection sur le développement socio-économique de nombreux pays en zone intertropicale est considérable, non seulement à cause de P. falciparum, mais également à cause des trois autres espèces infectant l’être humain (P. vivax, P. malariae et P. ovale), qui causent un énorme fardeau de morbidité. Les espoirs suscités par les plans d’éradication du paludisme mis en œuvre dans les décennies qui ont suivi la Seconde Guerre Mondiale ont bien vite été réduits à néant, en grande partie de par l’émergence de parasites résistants aux anti-paludiques communément utilisés (notamment la chloroquine), et celle d’Anophèles (le genre de moustiques vecteur de la maladie) résistants aux insecticides. Il semble probable, selon les scénarios les plus optimistes, que l’addition d’un vaccin dans l’arsenal de la lutte contre le paludisme demande encore de nombreuses années. Il est donc urgent de développer de nouvelles approches chimiothérapeutiques (voir http://www.malaria.org et [1]). L’identification rationnelle de nouvelles cibles moléculaires pour la chimiothérapie anti-palustre dépend de la connaissance de la biologie fondamentale du parasite. Les recherches dans ce domaine bénéficient d’un programme international de séquençage du génome de P. falciparum, qui arrivera à complétion en 2002 ; les bases de données ainsi générées, en grande partie d’ores et déjà disponibles
sur le Web (http://www.plasmodb.org et [2]), s’avèrent être d’une utilité extraordinaire pour les chercheurs visant à identifier de nouvelles cibles chez le parasite. En guise d’illustration des perspectives offertes par la génomique plasmodiale, nous allons brièvement présenter nos recherches sur les enzymes régulant la prolifération et le développement du parasite, et sur leur application possible dans la mise au point de nouveaux anti-paludiques.
1. CYCLE PARASITAIRE ET CYCLE CELLULAIRE Le cycle parasitaire de Plasmodium est constitué d’une succession de stades entre lesquels le statut de division cellulaire varie. Ainsi, les sporozoïtes accumulés dans les glandes salivaires du moustique ne se divisent pas ; une fois injectés dans la circulation sanguine de l’hôte humain, ces sporozoïtes gagnent le foie et pénètrent dans un hépatocyte, où ils se différencient en trophozoïtes, puis en schizontes. Ces derniers sont le siège d’une activité intense de division schizogonique produisant plusieurs milliers de mérozoites. Ceux-ci, à l’instar des sporozoïtes, ne se divisent pas jusque après invasion d’une cellule-hôte ; dans le cas des mérozoïtes, cette dernière est un érythrocyte, au sein duquel le mérozoïte se développe en trophozoïte, puis en schizonte, qui produit à son tour de nouveaux mérozoïtes. Cette schizogonie intra-érythrocytaire est le processus responsable de la pathologie palustre. Certains mérozoïtes, après invasion
∗ Correspondance et tirés à part : Christian Doerig, INSERM U 511, CHU Pitié-Salpêtrière, 91, boulevard de l’Hôpital, 75013 Paris, France.
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de l’érythrocyte, subissent un développement sexué en gamétocyte mâle ou femelle, au cours duquel le cycle cellulaire est arrêté. Ce sont ces formes sexuées qui sont capables de transmettre l’infection au moustique lors d’un repas sanguin (les formes asexuées ne survivent pas à l’ingestion par le moustique). Dans l’estomac du moustique, les gamétocytes poursuivent leur développement en gamètes (ce qui implique, pour les mâles, trois cycles de division rapides produisant huit gamètes par gamétocyte), qui fusionnent ensuite pour former un zygote. Ce dernier se développe en un ookinète mobile qui, tout en subissant une réduction méiotique, franchit l’épithélium intestinal de l’insecte. L’ookinète gagne ensuite la lamina basale située sur la face externe de l’épithélium intestinal et se développe en oocyste, qui va produire par multiplication asexuée plusieurs milliers de sporozoïtes, lesquels s’accumulent dans les glandes salivaires et sont prêts à infecter un nouvel hôte humain. Un examen superficiel de ce cycle parasitaire indique que la survie du parasite dépend de sa capacité à contrôler strictement son cycle cellulaire, de façon à ce que la cellule entre en division au moment adéquat (par exemple à la transition entre trophozoïte et schizonte), et, inversement, arrête le cycle cellulaire à certains stades (par exemple dans les gamétocytes et les sporozoites). Que sait-on des modalités de ce contrôle chez le parasite ? Peu de choses, en vérité. Cependant, il est clair que des divergences importantes existent entre le cycle cellulaire « classique » des eucaroytes supérieurs et celui du parasite. Par exemple, la membrane nucléaire disparaît durant la métaphase chez les métazoaires, mais est maintenue lors de la schizogonie des plasmodies (un phénomène appelé cryptomitose). Les divisions nucléaires sont en outre asynchrones dans un schizonte donné, ce qui n’est pas observé dans le cas d’autres multiplications de type schizogonique, comme par exemple lors de l’embryogenèse précoce de la drosophile [3]. Ces particularités sont vraisemblablement sous-tendues par des spécificités au niveau moléculaire, qui pourraient être exploitées en vue d’interférer spécifiquement avec les processus de contrôle de division cellulaire du parasite. La progression du cycle cellulaire eucaryote est assurée par une famille de protéine-kinases, les CDK (« cyclindependent kinases »). L’activité des CDK dépend de leur association avec une sous-unité régulatrice (cycline), dont l’abondance fluctue au cours du cycle cellulaire. Plusieurs CDK et cyclines sont exprimées par la cellule, et l’association temporaire entre une CDK et une cycline permet l’activation de l’enzyme durant la phase idoine de la division cellulaire [4]. Cette machinerie est elle-même placée sous le contrôle de signaux extra- ou intra-cellulaires, qui lui sont transmis par des voies de transduction. L’une de ces voies, celle des MAP kinases (« mitogen-activated protein kinases »), joue dans plusieurs systèmes un rôle particulièrement important dans la « décision » de la cellule à entrer en prolifération, ou, au contraire, à arrêter le
cycle cellulaire et à entrer en différenciation. Les MAPK sont structurellement apparentées aux CDK, mais leur activation ne nécessite pas un partenaire de type cycline : ces enzymes sont activées par double phosphorylation d’un site Thr-X-Tyr par une MAPK kinase (MAPKK), elle-même activée par une MAPKK kinase (MAPKKK), en réponse à certains stimuli. Certaines MAPK peuvent phosphoryler des inhibiteurs de CDK, qui deviennent alors capables d’arrêter le cycle cellulaire en empêchant l’action des CDK ; d’autres substrats sont des facteurs de transcription, dont l’activation par la MAPK permet un remodelage de l’expression génique en réponse à un signal donné [5].
2. ÉLÉMENTS RÉGULATEURS DE LA PROLIFÉRATION CHEZ P. FALCIPARUM : D’IMPORTANTES PARTICULARITÉS STRUCTURALES ET FONCTIONNELLES Qu’en est-il de ces éléments chez les parasites du genre Plasmodium ? La recherche ciblée de gènes parasitaires codant pour des CDK et des MAPK, puis, plus récemment, l’exploitation des bases de données issues du projet de séquençage du génome de P. falciparum, indiquent que ce parasite possède plusieurs gènes codant pour des molécules appartenant aux familles des MAPK, CDK et cyclines. Si la présence de tels éléments chez le parasite n’a rien d’inattendu – les plasmodies sont, après tout, des cellules eucaryotes –, il est en revanche très intéressant de constater les nombreuses particularités que présentent ces molécules parasitaires relativement à leurs homologues trouvés chez les eucaryotes supérieurs. Les homologues plasmodiaux des CDK et MAPK présentent une homologie de 40 à 60 % avec les kinases homologues de mammifères. En outre, plusieurs protéine-kinases parasitaires présentent, en plus du domaine catalytique de l’enzyme, de grandes extensions et/ou insertions, incluant dans certains cas des motifs répétés d’acides aminés. Cette particularité est partagée par de nombreuses autres protéines plasmodiales. La fonction de ces régions reste à déterminer [6]. D’autres divergences structurales touchent à des régions fonctionnelles du domaine catalytique lui-même ; par exemple, Pfmap-2, l’une des MAPK parasitaires que nous avons identifiées, comporte un site d’activation atypique (Thr-Ser-His, au lieu du motif ThrX-Tyr trouvé chez les MAPK d’autres eucaryotes) qui suggère un mode de régulation de cette enzyme divergent par rapport à celui des MAPK de mammifères [7]. Une autre particularité est partagée par la structure primaire de plusieurs protéine-kinases plasmodiales : celle de comporter sur le même domaine catalytique des motifs caractéristiques de familles de kinases distinctes. Nous avons jusqu’ici caractérisé deux enzymes [8, 9] qui partagent cette apparence de protéine-kinase « hybride » :
Protéine-kinases contrôlant la prolifération cellulaire chez Plasmodium
2.1. Pfnek-1 Chez tous les organismes, dans la voie bien étudiée des MAPK, on retrouve un module MAPKKK-MAPKKMAPK, dont chaque élément porte une « signature » particulière [5]. On a vu que P. falciparum possède une MAPK (Pfmap-2) ne possédant pas le site d’activation attendu. Or, un examen des bases de données génomiques disponibles actuellement (qui couvrent la quasi-totalité des séquences codantes) suggère que cet organisme ne possède pas de MAPKK typique avec un site d’activation répondant à la MAPKKK. En revanche, Pfnek-1, une protéine que nous avons récemment décrite [8] porte un tel site, bien qu’elle soit apparentée à une famille de kinases qui n’est pas celle des MAPKK (cette enzyme, Pfnek-1, présente en effet une homologie maximale avec les kinase de la famille NIMA/Nek). Pfnek-1 présente donc une séquence similaire à celle des kinases NIMA avec cependant un site d’activation caractéristique des MAPKK. Qui plus est, Pfnek-1 est capable de phosphoryler Pfmap-2 in vitro, et d’agir en synergie avec cette dernière pour phosphoryler un substrat exogène [8]. Il semble donc que la voie de signalisation impliquant Pfmap-2 puisse diverger de façon importante des voies des MAPK classiques.
2.2. PfPK6 Un autre exemple concerne une kinase apparentée aux CDK et caractérisée en collaboration avec le groupe de D. Chakrabarti en Floride [9]. La séquence polypeptidique de cette enzyme comporte des caractéristiques propres aux CDK d’une part, et aux MAPK d’autre part. Les bases de données génomiques nous indiquent que d’autres exemples de protéine-kinases de ce type existeraient chez P. falciparum. Les séquences « hybrides » de ces protéines kinases plasmodiales suggèrent que ces enzymes soient régulées de façon distincte. En outre, comme ces kinases n’ont pas d’homologue connu chez les autres eukaryotes, il est difficile de prédire leur fonction sur la seule base de leur séquence polypeptidique. Il semblerait donc qu’au-delà de la structure primaire de certaines des enzymes probablement impliquées dans la signalisation, l’organisation même de certaines voies de transduction diffère entre Plasmodium et les eucaryotes supérieurs. À ces divergences structurales, s’ajoutent des particularités fonctionnelles également décelées chez les CDK parasitaires. Par exemple, PfPK5, une kinase qui présente une homologie maximale avec CDK1, est susceptible d’être activée in vitro par une grande variété de cyclines (plasmodiales ou hétérologues). Cette propriété, qui n’est pas partagée par les CDK de mammifères, suggère une spécificité relâchée de cette enzyme par rapport aux cyclines, est pourrait refléter un mode de régulation différent de celui qu’on trouve chez les CDK d’eucaryotes
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supérieurs [10]. De même, PfPK5 est capable d’autophosphorylation in vitro en présence de cycline [10], un phénomène qui à notre connaissance n’a pas été observé avec d’autres CDK.
3. VERS UNE INHIBITION SPÉCIFIQUE DES KINASES PARASITAIRES ? Les spécificités propres aux protéine-kinases parasitaires permettent d’espérer qu’une inhibition sélective de ces dernières sera possible. Il a d’ailleurs été démontré que les homologues de CDK1 (cdc2) de levure et vertébrés ont des susceptibilités très différentes à certains inhibiteurs [11]. L’utilisation de protéine-kinases parasitaires recombinantes dans des tests d’inhibition tend à montrer le même phénomène de susceptibilité différentielle. Certaines des enzymes parasitaires ont une activité spécifique suffisante pour envisager le développement de tests de criblage de chimiothèques à haut débit. En cas de découverte de composés capables d’inhiber efficacement une kinase parasitaire, leur efficacité sera testée sur le parasite en culture, et leur spécificité évaluée au moyen de tests sur des cellules de mammifères et sur des enzymes homologues de mammifères. Une stratégie alternative, que nous suivons également, consiste à cribler des collections de dérivés d’inhibiteurs de protéine-kinases directement sur le parasite en culture [12] ; les cibles potentielles des composés actifs éventuels peuvent ensuite être identifiées par chromatographie d’affinité sur l’inhibiteur immobilisé sur une résine. Cette approche nous a déjà permis d’identifier une kinase parasitaire comme cible présumée d’un inhibiteur efficace ex vivo [13]. La co-cristallisation et la résolution de la structure tridimensionnelle du complexe kinase-inhibiteur permettra la conception de molécules plus performantes en termes d’affinité et de spécificité. La validation d’enzymes comme cibles chimiothérapeutiques pose un problème aigu dans le cas du paludisme, à cause de la difficulté d’obtenir des mutants à phénotype « nul » pour les gènes essentiels [14]. Toutefois, les protéine-kinases se prêtent particulièrement bien aux approches dites de « génétique chimique » [15]. Cette stratégie consiste à remplacer dans le génome du parasite l’allèle sauvage d’une kinase donnée par une forme mutante dont le produit est hypersensible à une certaine catégorie d’inhibiteurs chimiques. Le traitement des parasites mutants par ces inhibiteurs résulte en l’inactivation spécifique de la kinase mutée, et permet ainsi d’obtenir un phénotype « nul ». Cette approche devrait permettre de résoudre le problème de la détermination de la fonction des protéine-kinases et de leur validation comme cibles pour la chimiothérapie. Les travaux sur les protéine-kinases de Plasmodium présentés ici illustrent les apports de la génomique à la recherche de nouvelles cibles chimiothérapeutiques. Il est encore trop tôt pour savoir si, dans ce cas précis, cette
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D. Dorin, C. Doerig
approche permettra la mise au point de nouveaux antipaludiques. Néanmoins, des stratégies similaires étant suivies avec de nombreux autres types d’enzymes parasitaires, il est permis d’espérer que les recherches fondamentales, elles-mêmes facilitées par la génomique, aboutiront au développement de nouveaux moyens d’intervention dont bénéficieront les populations affectées par le fléau du paludisme.
REMERCIEMENTS Nous tenons à remercier tous les membres présents et passés de l’équipe « protéine-kinases » de l’Unité 511 de l’INSERM (K. Le Roch, A. Merckx, M.-P. Nivez, L. Cicéron, L. Equinet, A. Jafarshad, S. Brun, C. Doerig), où a été effectuée la plupart des travaux évoqués ici, ainsi que les nombreux collaborateurs extérieurs (L. Meijer, P. Alano, D. Parzy, L. Harmse, J. Endicott, D. Chakrabarti, N. Gray, K. Shah, N. Waters) impliqués dans ce projet. Ces travaux sont financés par l’INSERM, le Ministère de la Recherche (programmes PRFMMIP et PAL+), le Ministère de la Défense (Délégation Générale pour l’Armement), le Ministère des Affaires Etrangères (Coopération Scientifique avec l’Afrique de Sud) et l’Organisation Mondiale de la Santé (« TDR programme of the UNDP/World Bank/WHO »).
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4 Morgan DO. Cyclin-dependent kinases: engines, clocks, and microprocessors. Annu Rev Cell Dev Biol 1997 ; 13 : 261-91. 5 Madhani HD, Fink GR. The riddle of MAP kinase signaling specificity. Trends Genet 1998 ; 14 : 151-5. 6 Kappes B, Doerig C, Graeser R. An overview of Plasmodium protein kinases. Parasitol Today 1999 ; 15 : 449-54. 7 Dorin D, Alano P, Boccaccio I, Cicéron L, Doerig CM, Sulpice R, Parzy D, Doerig C. An atypical MAP kinase homologue expressed in gametocytes of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Identification of a MAPK signature. J Biol Chem 1999 ; 274 : 29912-20. 8 Dorin D, Le Roch K, Sallicandro P, Alano P, Poullet P, Parzy D, Meijer L, Doerig C. Pfnek-1, a novel NIMA-related protein kinase from the human malaria parasite Plasmodium falciparum: biochemical properties and possible involvement in a MAPK pathway. Eur J Biochem 2001 ; 268 : 2600-8. 9 Bracchi-Ricard V, Barik S, DelVecchio C, Doerig C, Chakrabarti R, Chakrabarti D. PfPK6, an unusual CDK/MAP kinase-related protein from Plasmodium falciparum. Biochem J 2000 ; 347 : 255-63. 10 Le Roch K, Sestier C, Dorin D, Waters N, Kappes B, Chakrabarti D, Meijer L, Doerig C. Activation of a Plasmodium falciparum cdc2related kinase by heterologous p25 and cyclin H. Functional characterisation of a P. falciparum cyclin homologue. J Biol C 2000 ; 275 : 8952-8. 11 Gray N, Wodicka L, Thunnissen AM, Norman T, Kwon S, Espinoza FH, Morgan DO, Barnes G, Leclerc S, Meijer L, Kim SH, Lockhart DJ, Schultze P. Exploiting chemical libraries, structure, and genomics in the search for new kinase inhibitors. Science 1998 ; 281 : 533-8. 12 Harmse L, Van Zyl R, Gray N, Meijer L, Doerig C, Havlik I. The effect of purine-derived cyclin-dependent kinase inhibitors on Plasmodium falciparum. Biochem Pharmacol 2001 ; 62 : 341-58. 13 Knockaert M, Gray N, Damiens E, Grellier P, Grant K, Fergusson D, Mottram J, Soete M, Dubremetz J-F, Le Roch K, Doerig C, Schultz PG, Meijer L. Intracellular targets of cyclindependentkinase inhibitors: identification by affinity chromatography using immobilized inhibitors. Chemistry & Biology 2000 ; 7 : 411-22. 14 Waters AP, Thomas AW, van Dijk MR, Janse CJ. Transfection of malaria parasites. Methods 1997 ; 13 : 134-47. 15 Bishop AC, Ubersax JA, Petsch DT, Matheos DP, Gray NS, Blethrow J, Shimizu E, Tsien JZ, Schultz PG, Rose MD, Wood JL, Morgan DO, Shokat KM. A chemical switch for inhibitor-sensitive alleles of any protein kinase. Nature 2000 ; 40 : 395-401.