- Email: [email protected]
Quantification génomique : applications aux infections par le virus de l’immunodéficience humaine (HIV)
Dossier scientifique
H1
Article
Quantification molécula~reen b~ologlecl~nique
QUANTIFICATION GÉNOMIQUE : APPLICATIONS AUX INFECTIONS PAR LE VIRUS DE CIMMUNODEFICIENCE HUMAINE (HIV) Véronique Schneider as*
rêt est de permettre le suivi virologique de I'infection à HIV chez les patients infectés. Elle peut être réalisée dans différents compartiments de l'organisme :
R6sumé La quantification du génome HIV a permis de mieux comprendre la physiopathologie et I'histoire naturelle de la maladie. La charge virale plasmatique est un excellent marqueur pour apprécier I'évolutivité de I'infection à HIV. Elle peut aider au diagnostic de primoinfection et de transmission maternofœtale. Les tests de quantification du génome HIV dans les cellules mononucléées du sang périphérique ou des tissus lymphoides sont réservés actuellement aux protocoles de recherche.
-
-
HW quantification genomique charge virale plasmatique ADN proviral.
-
HlV genome quantification has already contributed significantly to the understandingof the pathogenesis and the natural course of the disease. Plasmatic HIV-1 RNA has become a reference prognostic rnarker for HlV- 1 infection. I t is also useful for acute HIV-1 infection diagnosis and for the mother-to-child transmission. HIV genome quantification in peripheral blood mononuclear cells or lymphoid tissues is currently limited to clinical trials.
- la quantification de l'acide ribonucléique (ARN)-HIV plasmatique, appelée communément charge virale plasmatique, est un excellent marqueur de la réplication virale. Elle quantifie le virus dans le plasma. Ce marqueur est systématiquement réalisé en routine pour le suivi virologique des patients ; - la quantification du génome HIV peut également être réalisée dans les cellules mononucléées du sang périphériquevoire des tissus lymphoïdes (ganglions, biopsies rectales). L'acide désoxyribonucléique (ADN) proviral est un marqueur des cellules infectées latentes (réservoir), alors que I'ARN HIV intracellulaireest un marqueur des cellules en phase réplicative. Ces tests de quantification de l'ADN ou de I'ARN HIV dans les cellules ne sont pas recommandés actuellement en dehors des protocoles de recherche.
2. Les situations cliniques où la quantification du HIV est utile
HW genome quantification plasmatic viral load proviral DNA.
- L'indicationprincipale de la charge virale plasmatique est le suivi virologique des patients infectés par le HIV. Elle permet de suivre la progression de la maladie chez les sujets non traités, et l'efficacité de la thérapeutiqueantirétrovirale chez les patients traités. Elle est à prendre en compte pour la décision de la mise sous traitement antirétroviral.
1. Introduction
- La charge virale plasmatique peut être demandée associée au dépistage des anticorps (Ac) anti-HIV en cas de suspicion de primo-infection, aidant ainsi au diagnostic précoce de contamination.
-
-
-
L
e virus de I'immunodéficience humaine (HIV) appartient à la famille des Retroviridae. II est responsable d'une infection virale persistante chronique entraînant à long terme le syndrome d'immunodéficience acquise. Le diagnostic virologique chez l'adulte repose essentiellement sur la mise en évidence des anticorps circulants. Pour établir le diagnostic d'infection HIV chez le nouveau-né de mére séropositive, des techniques de diagnostic direct (détection du génome viral, mise en culture du virus) doivent être utilisées.
- Elle est également utilisée pour rechercher une transmission maternofœtale chez un nouveau-né de mére séropositive.
3. Les methodes utîlisties --
-
--
-
p .
-
3.1. Quantification de !'AR%-HW plasmatique
La quantification du génome HIV a permis de mieux comprendre la physiopathologieet l'histoire naturelle de la maladie. Son principal inté-
La quantification de I'ARN-HIV-1 plasmatique est réalisée grâce à des techniques de biologie moléculaire standardisées et commercialisées. Quatre techniques diffé-ntes sont actuellement utilisées (tableau l).
Laboratoire de virologie Hbpital Tenon 4, nie de la Chine 75970 Paris cedex 20
- une technique basée sur la reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) a été développée par Roche Diagnostics. La région amplifiée est située dans le géne gag et la quantification est obtenue par une méthode de PCR compétitive (Amplicor TM HIV-1 Monitor v.1.5) ;
a
* Correspondance [email protected] aMde reçu le 7 fevrier, accepte le 3 m a n 2003.
O Elsevier, Paris. b m e Française des Laboratoires,mars 2003, Ne351
- la technique des ADN branchés (Quantiplex HIV RNA 3.0,
Bayer Diagnostics) repose sur l'amplification du signal de détection des ARN génomiques viraux (géne pol) ;
- la technologie NASBA (Nuclisens HIV-1 QT, AKZO Organon Teknika) quantifie I'ARN amplifié dans le géne gag.
Dossier scientifique Quantification moléculaire en biologie clinique
I
Tabkau I /Quantification de LXRN-HIV plasmatique.
,
de la cible
AmplmCafion du signal Pol
Seuil {selon la notice d'enregistrement)
400 copiestml 50 copiedm1 si concentration
Prise d'essai
0,2 ml 0,5 ml si concentration
Linhité (copies/ml)
400 750.000 50 - 75.000
Ampiiii de la cible
1
Amplification de la cible
gag
80 copiedml si 1 ml
Pol
1
50 c o p i e h l
40 copiedml si 2 ml 1 ou 2 ml 1
-
-
80 1 000 O00
50 1 O00 OOC
Semiautomatisation Méthode manuelle Quantiplex bDNA ou Cobas Amplicor system 340
Nuclisens QR-system
Thermocycleur et analyseur LC-
ARN-HIV plasmatique
1 1
Sang
1 1
Tube EDTA ouACD
-
1 1
7 à 10 ml
1
1
4h
1 1
Plasma à-80%
ADN proviral
Sang
Tube EDTA ou ACD
10 ml
4h
Culots secs à - 80%
ARN-HIV intracellulaire
Sang
Tube EDTA ou ACD
10 ml
4h
Culots secs
-
1
,
EDTA :BthyiBne-diaminet6tra-acétique, ACD :acide cltrate dextmse, ARN :acide nbonuciéique,ADN :acide désoxyribonucl6ique.
Ces trois tests ne permettent pas de quantifier les HIV-1 du groupe O et les HIV-2.
4. Les prelhvements
Un nouveau test également basé sur la RT-PCR avec quantification par méthode de PCR compétitive vient d'être commercialisé par Abbott Diagnostic (LCx HIV RNA quantitative Assay). La région amplifiée est située dans le géne pol. Ce test a l'avantage de quantifier les virus HIV-1 du groupe M mais également du groupe O.
Les différents types de prélévements sanguins utiles au diagnostic et au suivi de l'infection HIV sont résumés dans le tableau II.
La quantification de I'ARN-HIV-2 plasmatique peut être obtenue par une technique * maison * de PCR quantitativeen temps réel, réalisée seulement dans quelques laboratoires spécialisés 131.
Les plasmas de charge virale doivent être conservés au minimum 1 ana-80%. Pour quantifier l'ADN proviral ou I'ARN-HIV intracellulaire, il est nécessaire de réaliser un Ficoll pour isoler les cellules mononucléées.
La quantification de I'ARN-HIV peut également être réalisée dans d'autres liquides biologiques tels que le liquide céphalorachidien(LCR) ou les sécrétions génitales. WDN proviral ou I'ARN HIV intracellulaire peuvent également être quantfiés dans le tissu lymphoide (biopsies ganglionnaires, biopsies rectales).
IIn'existe à ce jour aucun test commercialisé pour la quantification de I'ADN proviral, qui peut être réalisée par des techniques a maison * : PCR quantitative en temps réel 15, QI, adaptation de la trousse de quantification de I'ARN (Amplicor TM HIV-1 Monitor v.1.5 ; Roche Diagnostics) en utilisant un standard interne ADN [Il, titrage semiquantitatif par dilutions successives de cellules en utilisant le test qualitatif AmplicorTMADN HIV-1 (Roche Diagnostics) 171.
5.3. Quantification de I'ARN-HIV irrtrace1tlcle;ire La quantification de I'ARN viral dans les cellules peut être réalisée par adaptation des trousses utilisées pour la quantification de I'ARN dans le plasma (Amplicor TM HIV-1 Monitor v.1.5; Roche Diagnostic).
5. Résultats et interprétation 5.1. ARN-HIV plasmatique 5.1.1. Expression des résultats
II existe une différence d'environ 0,3 log,, entre les valeurs obtenues par la technique Roche et celles obtenues par la technique Bayer, les valeurs obtenues par RT-PCR étant en général supérieures à celles obtenues par la technique de I'ADN branché. Les recommandations sont par conséquent de suivre l'évolution des charges virales plasmatiques d'un patient en utilisant toujours la même technique [4]. Revue Française des Laboratoires,mars 2003, No351
Dossier scientitique Quantification moléculaire en biologie clinique
Quelle que soit la technique utilisée, la charge virale est exprimée en nombre de copies par millilitre de plasma. Le résultat chez un même patient peut varier sans signification particuliére jusqu'à un facteur 3 (0,s log,,) sur deux prélévements successifs. La variabilité peut être importante dans les valeurs basses. Des infections intercurrentes ou une vaccination peuvent entraîner une augmentation transitoire de la charge virale.
1)
1
Traitement
J
...............................................
........... cm =zoo*.....................
g 1.2. Interprétation des résultats 5.1.2.1. Suivi virologique des patients infectés par le HIV [4] (figure
1
Charge Vinlc
z
Le suivi biologiquedes patients infectés par le HIV repose sur la numération des lymphocytes T CD4 et sur la mesure de la charge virale. Patients non traités 5.1.2.1 .l.
Prélèvements
Augmentation de la fdquence des prélèvementsau moment de la mise sous traitement
tous les 2 9 4 mois
- Chez les patients asymptomatiques ayant des lymphocytes T CD4 supérieurs ou égaux à 350/mm3, la périodicité des contrôles immunologiques et virologiques est de 2 à 4 mois.
-
Chez les patients asymptomatiques ayant des lymphocytes T CD4 compris entre 200 et 350/mm3, l'évolution immunovirologique doit être conklée au moins tous les 2 mois. Une charge virale plasmatique supérieure ti 100 000 copieslml a une valeur pronostique péjorative, indépendamment du niveau des lymphocytes T CD4. Le choix du moment optimal pour la mise en route du traitement antirétroviral doit étre individualisé pour chaque patient, et doit tenir compte de plusieurs Aléments tels que la pente de décroissance des lymphocytes T CD4, le niveau de la charge virale plasmatique, les traitements associés et la disponibilité du patient.
Prélèvements tous les 3 mois**
Rapport Delfraissy 2002. CD4 < 200/mm3 ou patients symptomatiques :traitement recommande. Patients asymptomatiques : -taux de lymphocytes 200 < CD4 < 350/mm3 :tenir compte de la pente des CD4, du niveau de la charge virale plasmatique O 100 0 0 0 copieslml), des traitements associés et de la disponibilitédu patient pour instaurer le traitement. Suivi tous les 2 mois si non traite ; -taux de lymphocytesCD4 > 350/mm3 :traitement difieré. Suivi tous les 2 A 4 mois. " Sauf en cas de diifficulte particulibre (intolérance ou mauvaise adhésion au traitement, résultats virologiques ou immunologiquesinsuffisants).
5.1.2.1.2. Patients traités L'objectif du premier traitement antirétroviral est de rendre la charge virale plasmatique indétectableen 3 à 6 mois. La mesure de la charge virale plasmatique permet d'évaluer l'efficacité du traitement et la nécessité éventuelle de le modifier. Pour cela, des prélévements séquentiels sont réalisés : avant la mise sous traitement, 1 mois après le début du traitement, puis tous les 3 mois.
La charge virale plasmatique doit diminuer d'au moins 1 log,, copieslml aprés 1 mois de traitement et devenir indétectable ., en pratique moins de 400 copieslml, entre le 3eet au plus tard le 6emois de traitement. Des e blips n correspondant à des mesures d'ARN-HIV de faible valeur (<1000 copieslml) transitoirement détectables sont parfois observés au cours du suivi des patients. Ils ne doivent pas &tre interprétés comme un début d'échappement. En cas d'échec virologique, deux situations peuvent se présenter : la réduction non optimale de la charge virale et l'échappement virologique (rebond). Tout rebond important de la charge virale sera contrôlé avant de décider un éventuel changement de traitement.
A c anti-HIV
ARN-HIV plasmatique Seuil de dheclion
JO COntage
.'. ;.. : .. : .'.....
....
11-12 14-15
.. .. 1 20-21
28-29 en jours
ARN-HIV pl~smattque Antig&nemiep24
-
ADN proviral Ac anii-HIV detectes par ELISA
5.1.2.2. Diagnostic virologique d'une primo-infection HIV Lors d'une primo-infection due au HIV, les Ac anti-HIV sont absents durant la phase très précoce qui suit la contamination. Aussi est-il recommandé d'associer au dépistage des Ac anti-HIV, la recherche de l'antigène p24 et/ou de I'ARN-HIV plasmatique. La charge virale plasmatique est en effet le marqueur le plus précoce se positivant vers le 1le-12e jour après la contamination, et atteignant rapidement un maximum variable d'un sujet à l'autre (figure 2). Une charge virale positive, sous réserve d'un contrôle sur un deuxième prélèvement, signe une contamination par le HIV. Cependant, la charge virale n'a pas reçu ragrément de l'Agence française de sécurité sanitaire des produits de Santé (AFSSAPS) dans un but diagnostique. En effet, l'interprétation des charges virales est délicate pour les valeurs proches du seuil de détection, et doit tenir compte des résultats faussement négatifs liés aux souches HIV-1 du groupe O et HIV-2. Revue Française des Laboratoires,mars 2003, No351
Ac anii-HIV dCtectCs parWestern Blot
*
ADN :acide d8soryribonucléique,Elisa :enzyme-linked immunsorbentassay, Ac : anticorps, Ag :antigbne.
5.1.2.3. Diagnostic chez le nouveau-né de rnére HIV séropositive En France, environ 2 % des nouveau-nés qui naissent de mère HIV séropositive sont contaminés. Le diagnostic sérologique est ininterprétable chez l'enfant jusqu'8 l'âge de 18 mois, ti cause du passage des immunoglobulines (Ig)G maternelles à travers la barriére placentaire. Le diagnostic précoce est donc un diagnostic direct : PCR ADN pour la recherche du génome viral intégré, mise en culture du virus, ARN-HIV plasmatique. La charge virale plasmatique est utile sur-
Dossier scientifique . : ,8
Quantification moléculaire en biologie clinique
tout en l'absence de traitement du nouveau-né, et à condition qu'il s'agisse d'une infection par un sous-type du groupe M du HIV-1.
dans le cadre de protocoles, I'ADN proviral peut permettre de rechercher une réplication virale résiduelle, lorsque sous traitement la charge virale plasmatique est devenue indétectable.
Les résultats peuvent être exprimés en copies par pg d'ADN, nécessitant de doser I'ADN extrait ou en copies par nombre de cellules mononucléées. Dans ce cas, il est possible de quantifier le nombre de cellules en réalisant en paralléle une PCR quantitative en temps réel de l'albumine.
5.2.2. ADN proviral dans le tissu lymphoïde
5.2.1. ADN proviral sanguin
6. Conclusion
L'ADN proviral quantifie le nombre de cellules infectées circulantes, et permet d'évaluer le stock de virus (réservoir) établi dés le début de l'infection [2]. Pour certains auteurs, le taux d'ADN proviral serait prédictif du risque de progression de la maladie, et il serait intéressant de le prendre en compte dans la décision d'instaurer le traitement antirétroviral [a]. Sous traitement, la diminution de I'ADN proviral dans le sang périphérique est plus lente que celle de la charge virale plasmatique 11, 51. Enfin
La détection de I'ADN proviral dans les ganglions sous traitement antirétroviral efficace (charge virale plasmatique indétectable) a permis de montrer une réplication virale résiduelle dans le tissu lymphoïde [6].
L
a charge virale plasmatiqueest un excellent marqueur pour apprécier I'évolutivité de I'infection à HIV. Elle peut aider à poser le diagnostic de primo-infection et de transmission maternofœtale. L'intérêt de la quantification du génome HIV dans les autres compartiments de l'organisme : LCR, sécrétions génitales, cellules mononucléées circulantes, tissu lymphoïde, est actuellement évalué dans différents protocoles de recherche.
Simon E, Quantificationof proviral load of h u m immunodeficcencyMus(ype2suwAandBu@ re9]-time PCR,J. Clin. M i i o l . 39(12) (2001) 42648. B.* Tamalet C-3 DescampsD.t Ruffault A.t A.* Bargues G.* Mouroux M., Pellegrin I., lvanoff S., Guisthau O., 1 Wez V., SeigneurinJ.M, RouziouxC., HN RNA and HIV DNA in peripheralblood mononuclearcells are consistent markers for estimahg virai loadin peiüents undergoing long-term potent treatment, AlDS Res. Hum. Retmviruses 16 (2000) 1939-47. 121 TW., ~~~~l D., B~~~~MM., shee~.,corey L.,FauciAS., Edy establishmentof a pool of infecte4 resting CD4(+) T ceils during primary HIV-1 infection, Proc. Nat[. Acad. Sei. USA 95 (1998) 8869-8873. [3] DamondF., Descamps D., FarfaraI., TellesJ.N., Fbyeo S., Campa P., Lepretre A, Mathemn S., Brun-VanetF.,
[4] OeffreissyJ.F., Prise en charge thdrapeutique des personn, infectées par le HIV. R~commandations du groupe d,experts. Rapport 2002, Flammarion MBdecint)iSc'mnC88, pParis,2002. 151 Desire N, I3ehee A., Schneider V., Jacon~etC.. Goujon C., GirardPM., RozenbaumW., NiwlasJ.C, Quantificationof human immunodeficiencyvirus type 1 proviral load by a TaqMan real-time PCR assay, J. Clin. Microbiol. 39(4) (2001) 1303-10. [61 Gunthard H.F., Havlir D.V., Fiscus S., Zhang Z.Q., Eron J., Mellors J., Gulick R., Frost S.D., Brown A.J., Schleif W., Valentine F., Jonas L, Meibohm A., lgnacio C.C., lsaacs R., Gamagami R., Emini E., Haase A., Richman D.D., Wong J.K., Residuai
human immunodeficWncy virus (HIV) Type 1 RNA and DNA in lymph nodes and HIV RNA in genitai secretions and in cerebrospinal fluid afier suppression of viremia for 2 years, J. Infect. Dis. 183 (2001) 1318-27.
[71 lzopet J., Tamalet C, Pasquier C., Sandres K., MarchouB.. Massip P., Pue1J., Quantikation of HN1 proviraiDNA by astadardid wlorimetric PCRmay, J. ~ e dwrd. . 54 (1998) 54-59. ROuzioux Huberi vJ. Burgard and the Seroco Study Group, Eariy HIV-1 DNA leval p r e d i i disease progression and death independentiy of HN-RNA and CD4 ceIl wunt Co"ference on -OSAires, J"ly 2001' Q-l
[QI khfiqueConsensw,de PActim C o o r d d 11 de I'ANRS.
Revue Française des Laboratoires, mars 2003, No351
H1
Article
Quantification molécula~reen b~ologlecl~nique
QUANTIFICATION GÉNOMIQUE : APPLICATIONS AUX INFECTIONS PAR LE VIRUS DE CIMMUNODEFICIENCE HUMAINE (HIV) Véronique Schneider as*
rêt est de permettre le suivi virologique de I'infection à HIV chez les patients infectés. Elle peut être réalisée dans différents compartiments de l'organisme :
R6sumé La quantification du génome HIV a permis de mieux comprendre la physiopathologie et I'histoire naturelle de la maladie. La charge virale plasmatique est un excellent marqueur pour apprécier I'évolutivité de I'infection à HIV. Elle peut aider au diagnostic de primoinfection et de transmission maternofœtale. Les tests de quantification du génome HIV dans les cellules mononucléées du sang périphérique ou des tissus lymphoides sont réservés actuellement aux protocoles de recherche.
-
-
HW quantification genomique charge virale plasmatique ADN proviral.
-
HlV genome quantification has already contributed significantly to the understandingof the pathogenesis and the natural course of the disease. Plasmatic HIV-1 RNA has become a reference prognostic rnarker for HlV- 1 infection. I t is also useful for acute HIV-1 infection diagnosis and for the mother-to-child transmission. HIV genome quantification in peripheral blood mononuclear cells or lymphoid tissues is currently limited to clinical trials.
- la quantification de l'acide ribonucléique (ARN)-HIV plasmatique, appelée communément charge virale plasmatique, est un excellent marqueur de la réplication virale. Elle quantifie le virus dans le plasma. Ce marqueur est systématiquement réalisé en routine pour le suivi virologique des patients ; - la quantification du génome HIV peut également être réalisée dans les cellules mononucléées du sang périphériquevoire des tissus lymphoïdes (ganglions, biopsies rectales). L'acide désoxyribonucléique (ADN) proviral est un marqueur des cellules infectées latentes (réservoir), alors que I'ARN HIV intracellulaireest un marqueur des cellules en phase réplicative. Ces tests de quantification de l'ADN ou de I'ARN HIV dans les cellules ne sont pas recommandés actuellement en dehors des protocoles de recherche.
2. Les situations cliniques où la quantification du HIV est utile
HW genome quantification plasmatic viral load proviral DNA.
- L'indicationprincipale de la charge virale plasmatique est le suivi virologique des patients infectés par le HIV. Elle permet de suivre la progression de la maladie chez les sujets non traités, et l'efficacité de la thérapeutiqueantirétrovirale chez les patients traités. Elle est à prendre en compte pour la décision de la mise sous traitement antirétroviral.
1. Introduction
- La charge virale plasmatique peut être demandée associée au dépistage des anticorps (Ac) anti-HIV en cas de suspicion de primo-infection, aidant ainsi au diagnostic précoce de contamination.
-
-
-
L
e virus de I'immunodéficience humaine (HIV) appartient à la famille des Retroviridae. II est responsable d'une infection virale persistante chronique entraînant à long terme le syndrome d'immunodéficience acquise. Le diagnostic virologique chez l'adulte repose essentiellement sur la mise en évidence des anticorps circulants. Pour établir le diagnostic d'infection HIV chez le nouveau-né de mére séropositive, des techniques de diagnostic direct (détection du génome viral, mise en culture du virus) doivent être utilisées.
- Elle est également utilisée pour rechercher une transmission maternofœtale chez un nouveau-né de mére séropositive.
3. Les methodes utîlisties --
-
--
-
p .
-
3.1. Quantification de !'AR%-HW plasmatique
La quantification du génome HIV a permis de mieux comprendre la physiopathologieet l'histoire naturelle de la maladie. Son principal inté-
La quantification de I'ARN-HIV-1 plasmatique est réalisée grâce à des techniques de biologie moléculaire standardisées et commercialisées. Quatre techniques diffé-ntes sont actuellement utilisées (tableau l).
Laboratoire de virologie Hbpital Tenon 4, nie de la Chine 75970 Paris cedex 20
- une technique basée sur la reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) a été développée par Roche Diagnostics. La région amplifiée est située dans le géne gag et la quantification est obtenue par une méthode de PCR compétitive (Amplicor TM HIV-1 Monitor v.1.5) ;
a
* Correspondance [email protected] aMde reçu le 7 fevrier, accepte le 3 m a n 2003.
O Elsevier, Paris. b m e Française des Laboratoires,mars 2003, Ne351
- la technique des ADN branchés (Quantiplex HIV RNA 3.0,
Bayer Diagnostics) repose sur l'amplification du signal de détection des ARN génomiques viraux (géne pol) ;
- la technologie NASBA (Nuclisens HIV-1 QT, AKZO Organon Teknika) quantifie I'ARN amplifié dans le géne gag.
Dossier scientifique Quantification moléculaire en biologie clinique
I
Tabkau I /Quantification de LXRN-HIV plasmatique.
,
de la cible
AmplmCafion du signal Pol
Seuil {selon la notice d'enregistrement)
400 copiestml 50 copiedm1 si concentration
Prise d'essai
0,2 ml 0,5 ml si concentration
Linhité (copies/ml)
400 750.000 50 - 75.000
Ampiiii de la cible
1
Amplification de la cible
gag
80 copiedml si 1 ml
Pol
1
50 c o p i e h l
40 copiedml si 2 ml 1 ou 2 ml 1
-
-
80 1 000 O00
50 1 O00 OOC
Semiautomatisation Méthode manuelle Quantiplex bDNA ou Cobas Amplicor system 340
Nuclisens QR-system
Thermocycleur et analyseur LC-
ARN-HIV plasmatique
1 1
Sang
1 1
Tube EDTA ouACD
-
1 1
7 à 10 ml
1
1
4h
1 1
Plasma à-80%
ADN proviral
Sang
Tube EDTA ou ACD
10 ml
4h
Culots secs à - 80%
ARN-HIV intracellulaire
Sang
Tube EDTA ou ACD
10 ml
4h
Culots secs
-
1
,
EDTA :BthyiBne-diaminet6tra-acétique, ACD :acide cltrate dextmse, ARN :acide nbonuciéique,ADN :acide désoxyribonucl6ique.
Ces trois tests ne permettent pas de quantifier les HIV-1 du groupe O et les HIV-2.
4. Les prelhvements
Un nouveau test également basé sur la RT-PCR avec quantification par méthode de PCR compétitive vient d'être commercialisé par Abbott Diagnostic (LCx HIV RNA quantitative Assay). La région amplifiée est située dans le géne pol. Ce test a l'avantage de quantifier les virus HIV-1 du groupe M mais également du groupe O.
Les différents types de prélévements sanguins utiles au diagnostic et au suivi de l'infection HIV sont résumés dans le tableau II.
La quantification de I'ARN-HIV-2 plasmatique peut être obtenue par une technique * maison * de PCR quantitativeen temps réel, réalisée seulement dans quelques laboratoires spécialisés 131.
Les plasmas de charge virale doivent être conservés au minimum 1 ana-80%. Pour quantifier l'ADN proviral ou I'ARN-HIV intracellulaire, il est nécessaire de réaliser un Ficoll pour isoler les cellules mononucléées.
La quantification de I'ARN-HIV peut également être réalisée dans d'autres liquides biologiques tels que le liquide céphalorachidien(LCR) ou les sécrétions génitales. WDN proviral ou I'ARN HIV intracellulaire peuvent également être quantfiés dans le tissu lymphoide (biopsies ganglionnaires, biopsies rectales).
IIn'existe à ce jour aucun test commercialisé pour la quantification de I'ADN proviral, qui peut être réalisée par des techniques a maison * : PCR quantitative en temps réel 15, QI, adaptation de la trousse de quantification de I'ARN (Amplicor TM HIV-1 Monitor v.1.5 ; Roche Diagnostics) en utilisant un standard interne ADN [Il, titrage semiquantitatif par dilutions successives de cellules en utilisant le test qualitatif AmplicorTMADN HIV-1 (Roche Diagnostics) 171.
5.3. Quantification de I'ARN-HIV irrtrace1tlcle;ire La quantification de I'ARN viral dans les cellules peut être réalisée par adaptation des trousses utilisées pour la quantification de I'ARN dans le plasma (Amplicor TM HIV-1 Monitor v.1.5; Roche Diagnostic).
5. Résultats et interprétation 5.1. ARN-HIV plasmatique 5.1.1. Expression des résultats
II existe une différence d'environ 0,3 log,, entre les valeurs obtenues par la technique Roche et celles obtenues par la technique Bayer, les valeurs obtenues par RT-PCR étant en général supérieures à celles obtenues par la technique de I'ADN branché. Les recommandations sont par conséquent de suivre l'évolution des charges virales plasmatiques d'un patient en utilisant toujours la même technique [4]. Revue Française des Laboratoires,mars 2003, No351
Dossier scientitique Quantification moléculaire en biologie clinique
Quelle que soit la technique utilisée, la charge virale est exprimée en nombre de copies par millilitre de plasma. Le résultat chez un même patient peut varier sans signification particuliére jusqu'à un facteur 3 (0,s log,,) sur deux prélévements successifs. La variabilité peut être importante dans les valeurs basses. Des infections intercurrentes ou une vaccination peuvent entraîner une augmentation transitoire de la charge virale.
1)
1
Traitement
J
...............................................
........... cm =zoo*.....................
g 1.2. Interprétation des résultats 5.1.2.1. Suivi virologique des patients infectés par le HIV [4] (figure
1
Charge Vinlc
z
Le suivi biologiquedes patients infectés par le HIV repose sur la numération des lymphocytes T CD4 et sur la mesure de la charge virale. Patients non traités 5.1.2.1 .l.
Prélèvements
Augmentation de la fdquence des prélèvementsau moment de la mise sous traitement
tous les 2 9 4 mois
- Chez les patients asymptomatiques ayant des lymphocytes T CD4 supérieurs ou égaux à 350/mm3, la périodicité des contrôles immunologiques et virologiques est de 2 à 4 mois.
-
Chez les patients asymptomatiques ayant des lymphocytes T CD4 compris entre 200 et 350/mm3, l'évolution immunovirologique doit être conklée au moins tous les 2 mois. Une charge virale plasmatique supérieure ti 100 000 copieslml a une valeur pronostique péjorative, indépendamment du niveau des lymphocytes T CD4. Le choix du moment optimal pour la mise en route du traitement antirétroviral doit étre individualisé pour chaque patient, et doit tenir compte de plusieurs Aléments tels que la pente de décroissance des lymphocytes T CD4, le niveau de la charge virale plasmatique, les traitements associés et la disponibilité du patient.
Prélèvements tous les 3 mois**
Rapport Delfraissy 2002. CD4 < 200/mm3 ou patients symptomatiques :traitement recommande. Patients asymptomatiques : -taux de lymphocytes 200 < CD4 < 350/mm3 :tenir compte de la pente des CD4, du niveau de la charge virale plasmatique O 100 0 0 0 copieslml), des traitements associés et de la disponibilitédu patient pour instaurer le traitement. Suivi tous les 2 mois si non traite ; -taux de lymphocytesCD4 > 350/mm3 :traitement difieré. Suivi tous les 2 A 4 mois. " Sauf en cas de diifficulte particulibre (intolérance ou mauvaise adhésion au traitement, résultats virologiques ou immunologiquesinsuffisants).
5.1.2.1.2. Patients traités L'objectif du premier traitement antirétroviral est de rendre la charge virale plasmatique indétectableen 3 à 6 mois. La mesure de la charge virale plasmatique permet d'évaluer l'efficacité du traitement et la nécessité éventuelle de le modifier. Pour cela, des prélévements séquentiels sont réalisés : avant la mise sous traitement, 1 mois après le début du traitement, puis tous les 3 mois.
La charge virale plasmatique doit diminuer d'au moins 1 log,, copieslml aprés 1 mois de traitement et devenir indétectable ., en pratique moins de 400 copieslml, entre le 3eet au plus tard le 6emois de traitement. Des e blips n correspondant à des mesures d'ARN-HIV de faible valeur (<1000 copieslml) transitoirement détectables sont parfois observés au cours du suivi des patients. Ils ne doivent pas &tre interprétés comme un début d'échappement. En cas d'échec virologique, deux situations peuvent se présenter : la réduction non optimale de la charge virale et l'échappement virologique (rebond). Tout rebond important de la charge virale sera contrôlé avant de décider un éventuel changement de traitement.
A c anti-HIV
ARN-HIV plasmatique Seuil de dheclion
JO COntage
.'. ;.. : .. : .'.....
....
11-12 14-15
.. .. 1 20-21
28-29 en jours
ARN-HIV pl~smattque Antig&nemiep24
-
ADN proviral Ac anii-HIV detectes par ELISA
5.1.2.2. Diagnostic virologique d'une primo-infection HIV Lors d'une primo-infection due au HIV, les Ac anti-HIV sont absents durant la phase très précoce qui suit la contamination. Aussi est-il recommandé d'associer au dépistage des Ac anti-HIV, la recherche de l'antigène p24 et/ou de I'ARN-HIV plasmatique. La charge virale plasmatique est en effet le marqueur le plus précoce se positivant vers le 1le-12e jour après la contamination, et atteignant rapidement un maximum variable d'un sujet à l'autre (figure 2). Une charge virale positive, sous réserve d'un contrôle sur un deuxième prélèvement, signe une contamination par le HIV. Cependant, la charge virale n'a pas reçu ragrément de l'Agence française de sécurité sanitaire des produits de Santé (AFSSAPS) dans un but diagnostique. En effet, l'interprétation des charges virales est délicate pour les valeurs proches du seuil de détection, et doit tenir compte des résultats faussement négatifs liés aux souches HIV-1 du groupe O et HIV-2. Revue Française des Laboratoires,mars 2003, No351
Ac anii-HIV dCtectCs parWestern Blot
*
ADN :acide d8soryribonucléique,Elisa :enzyme-linked immunsorbentassay, Ac : anticorps, Ag :antigbne.
5.1.2.3. Diagnostic chez le nouveau-né de rnére HIV séropositive En France, environ 2 % des nouveau-nés qui naissent de mère HIV séropositive sont contaminés. Le diagnostic sérologique est ininterprétable chez l'enfant jusqu'8 l'âge de 18 mois, ti cause du passage des immunoglobulines (Ig)G maternelles à travers la barriére placentaire. Le diagnostic précoce est donc un diagnostic direct : PCR ADN pour la recherche du génome viral intégré, mise en culture du virus, ARN-HIV plasmatique. La charge virale plasmatique est utile sur-
Dossier scientifique . : ,8
Quantification moléculaire en biologie clinique
tout en l'absence de traitement du nouveau-né, et à condition qu'il s'agisse d'une infection par un sous-type du groupe M du HIV-1.
dans le cadre de protocoles, I'ADN proviral peut permettre de rechercher une réplication virale résiduelle, lorsque sous traitement la charge virale plasmatique est devenue indétectable.
Les résultats peuvent être exprimés en copies par pg d'ADN, nécessitant de doser I'ADN extrait ou en copies par nombre de cellules mononucléées. Dans ce cas, il est possible de quantifier le nombre de cellules en réalisant en paralléle une PCR quantitative en temps réel de l'albumine.
5.2.2. ADN proviral dans le tissu lymphoïde
5.2.1. ADN proviral sanguin
6. Conclusion
L'ADN proviral quantifie le nombre de cellules infectées circulantes, et permet d'évaluer le stock de virus (réservoir) établi dés le début de l'infection [2]. Pour certains auteurs, le taux d'ADN proviral serait prédictif du risque de progression de la maladie, et il serait intéressant de le prendre en compte dans la décision d'instaurer le traitement antirétroviral [a]. Sous traitement, la diminution de I'ADN proviral dans le sang périphérique est plus lente que celle de la charge virale plasmatique 11, 51. Enfin
La détection de I'ADN proviral dans les ganglions sous traitement antirétroviral efficace (charge virale plasmatique indétectable) a permis de montrer une réplication virale résiduelle dans le tissu lymphoïde [6].
L
a charge virale plasmatiqueest un excellent marqueur pour apprécier I'évolutivité de I'infection à HIV. Elle peut aider à poser le diagnostic de primo-infection et de transmission maternofœtale. L'intérêt de la quantification du génome HIV dans les autres compartiments de l'organisme : LCR, sécrétions génitales, cellules mononucléées circulantes, tissu lymphoïde, est actuellement évalué dans différents protocoles de recherche.
Simon E, Quantificationof proviral load of h u m immunodeficcencyMus(ype2suwAandBu@ re9]-time PCR,J. Clin. M i i o l . 39(12) (2001) 42648. B.* Tamalet C-3 DescampsD.t Ruffault A.t A.* Bargues G.* Mouroux M., Pellegrin I., lvanoff S., Guisthau O., 1 Wez V., SeigneurinJ.M, RouziouxC., HN RNA and HIV DNA in peripheralblood mononuclearcells are consistent markers for estimahg virai loadin peiüents undergoing long-term potent treatment, AlDS Res. Hum. Retmviruses 16 (2000) 1939-47. 121 TW., ~~~~l D., B~~~~MM., shee~.,corey L.,FauciAS., Edy establishmentof a pool of infecte4 resting CD4(+) T ceils during primary HIV-1 infection, Proc. Nat[. Acad. Sei. USA 95 (1998) 8869-8873. [3] DamondF., Descamps D., FarfaraI., TellesJ.N., Fbyeo S., Campa P., Lepretre A, Mathemn S., Brun-VanetF.,
[4] OeffreissyJ.F., Prise en charge thdrapeutique des personn, infectées par le HIV. R~commandations du groupe d,experts. Rapport 2002, Flammarion MBdecint)iSc'mnC88, pParis,2002. 151 Desire N, I3ehee A., Schneider V., Jacon~etC.. Goujon C., GirardPM., RozenbaumW., NiwlasJ.C, Quantificationof human immunodeficiencyvirus type 1 proviral load by a TaqMan real-time PCR assay, J. Clin. Microbiol. 39(4) (2001) 1303-10. [61 Gunthard H.F., Havlir D.V., Fiscus S., Zhang Z.Q., Eron J., Mellors J., Gulick R., Frost S.D., Brown A.J., Schleif W., Valentine F., Jonas L, Meibohm A., lgnacio C.C., lsaacs R., Gamagami R., Emini E., Haase A., Richman D.D., Wong J.K., Residuai
human immunodeficWncy virus (HIV) Type 1 RNA and DNA in lymph nodes and HIV RNA in genitai secretions and in cerebrospinal fluid afier suppression of viremia for 2 years, J. Infect. Dis. 183 (2001) 1318-27.
[71 lzopet J., Tamalet C, Pasquier C., Sandres K., MarchouB.. Massip P., Pue1J., Quantikation of HN1 proviraiDNA by astadardid wlorimetric PCRmay, J. ~ e dwrd. . 54 (1998) 54-59. ROuzioux Huberi vJ. Burgard and the Seroco Study Group, Eariy HIV-1 DNA leval p r e d i i disease progression and death independentiy of HN-RNA and CD4 ceIl wunt Co"ference on -OSAires, J"ly 2001' Q-l
[QI khfiqueConsensw,de PActim C o o r d d 11 de I'ANRS.
Revue Française des Laboratoires, mars 2003, No351