Régulations métaboliques de la biosynthèse de la méthionine et de la thréonine chez Saccharomyces cerevisiae

BIOCHIMICAET BIOPHYSICAACTA BBA

I

65088 Rt~GULATIONS Mt~TABOLIQUES DE LA BIOSYNTH]~SE DE LA M]~THIONINE ET DE LA THR1~ONINE CHEZ SACCHAROMYCES CEREVISIAE

I I I . ]~TUDE

CIN~TIQUED E LA R]~PRESSION ET DE LA D]~R]~PRESSION DES T R O I S P R E M I E R S ENZYMES D E LA CHA~NE H. DE ROBICHON-SZULMAJSTER E'r D. CORRIVAUX Laboratoire d'Enzymologie du C.N.R.S., Gif-sur- Yvette (France) (Re~u le 2o avril, 1964) SUMMARY

Metabolic regulations of methionine and threonine biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae I I I . Kinetic studies on repression and derepression of the first three enzymes of the pathway The kinetics of synthesis of the first enzymes of the part of pathway common to threonine and methionine synthesis in Saccharomyces cerevisiae have been studied, under conditions of repression followed b y derepression. The results show that repression is established immediately and that enzyme synthesis continues at a constant rate, whereas derepression is established slowly and progressively. These results are in agreement with the hypothesis of a rapid transformation of exogenous repressor (end-product amino acid) into "endogenous repressor". The slow elimination of the latter is probably due to temporary maintenance of exogenous repressor in the amino acid pool of the cells. INTRODUCTION I1 6tait apparu au cours des travaux pr6c6dents concernant l'6tude des r6gulations m6taboliques des trois premiers enzymes de la chaine de biosynth~se de la m6thionine et de la thr6onine chez Saccharomyces cerevisiae, que les deux produits finaux de cette chalne ont des effets trbs diff6rents tant sur la synthbse des enzymes que sur leur activit61-*. En ce qui concerne la synth~se de ces enzymes, nous avons pu montrer que la thr6onine agit sp6cifiquement sur l'aspartokinase (ATP: L-aspartate 4-phosphotransf6rase, EC 2.7.2.4), ne touchant pas ou tr~s peu les deux autres enzymes ~,3. Au contraire, la m6thionine, tout en agissant plus particulibrement sur la formation de l'homos6rine deshydrog6nase (L-homos6rine: NAD oxidor6ductase, EC 1.1.1.3) produit des effets secondaires: r6primant faiblement la synth~se de l'aspartokinase, d6r6primant celle de la semi-ald6hyde aspartique deshydrog6nase (L-aspartate fl-semiald6hyde: N A D P oxidor6ductase (phosphorylante), EC 1.2.1.11) (refs. 3, 4). Ces r6sultats nous avaient amen6s ~ conclure ~ l'existence de gbnes de r6gulation diff6rents pour chacun des trois enzymes 6tudi6s, enzymes dont les g~nes de structure ont 6t6 identifi6s et font pattie de groupes de liaison ind6pendants ~. L'existence d'un

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mutant d6r6prim6 seulement pour la synth6se de l'aspartokinase et non pour celle des autres enzymes montre qu'il en est bien ainsi 6. I1 nous a alors sembl4 int6ressant d'ftudier la cin6tique de ces r@ressions. En effet, si la transformation du r6presseur exog6ne (acide amin6 terminal) en "r6presseur endoghne" (qui doit ~tre plac6 sous le contr61e du g~ne r6presseur) est un ph6nom6ne rapide, on doit s'attendre ~ ce que le taux de rfpression (taux de synth6se de l'enzyme en pr6sence de l'acide amin6 terminal compar6 au taux de synth6se sans addition de r6presseur exog6ne) soit directement dftermin6 par la concentration du r6presseur exog6ne et s'ftablisse par cons6quent, imm6diatement. Au contraire, si cette transformation est lente, le taux de rfpression doit augmenter pendant une certaine p6riode avant d'atteindre sa valeur maximale. En d'autres termes, le taux diff6rentiel de synth6se de l'enzyme, e'est-~-dire l'accroissement de la masse d'enzyme en fonction de l'accroissement de la masse de la population cellulaire (AE/AM), doit ~tre lin6aire dans le premier cas, non lin6aire dans le second. D'autre part, la p6riode de dfr6pression, c'est-~-dire le retour au taux normal de synth6se de l'enzyme (en absence de r4presseur) doit correspondre a l'61imination du rfpresseur endog6ne. De m6me que dans le cas de la r@ression, si l'61imination du r6presseur endog6ne est rapide la synth6se doit reprendre presque imm6diatement en proportion constante de l'accroissement de la masse cellulaire. Elle doit, dans le cas contraire, pr6senter une phase de latence ou suivre une loi exponentielle. Dans le but de choisir entre ces alternatives nous avons effectu6 une s6rie d'expfriences en chemostat. I1 doit 6tre clair que le chemostat est utilis6 ici, non pas comme un appareil permettant de maintenir une populatioh cellulaire ~ un taux de croissance constant mais comme un dispositif permettant d'obto ur en culture continue, tout en maintenant constante la concentration du rfpresse~,, exog6ne, une masse cellulaire assez importante dans un volume relativement r6duit. PARTIE EXPI~RIMENTALE

Mdthodes Nous avons utilis6 la m~me souche que pour les 6tudes pr6c6dentes: 4o94-B (haploide, grande, ad s, uq, a). On effectue une premiere pr6culture en milieu riche (extrait de levure Difco), puis une seconde pr6culture en milieu synth6tique contenant ad6nine et uracile (milieu G2I) (voir r6f. I). Cette seconde pr6culture pr61ev6e en fin de phase exponentielle, centrifug6e et lav6e, sert d'inoculum pour le chemostat. Le chemostat est plac6 dans une chambre ~ 28 °. On emploie le m6me milieu synth6tique (G2I) que pour la pr6culture, contenant, de plus, pour les exp6riences de r@ression, DL-thr6onine 2-IO -~ M, ou DL-m6thionine 2. IO-~ M. Les solutions de ces acides amin6s sont st6rilis6es par filtration et ajout6es st6rilement au milieu de base. On place un litre de milieu dans le chemostat et sept litres dans le r~cipient r~servoir. La vitesse de l'6coulement est r6gl6e ~ l'aide d'une pince ~t environ 250 ml par h. L'a6robiose est assur6e par un barbotage d'air suffisamment violent pour 6viter la s6dimentation des cellules (Fair servant au barbotage est pr6chauff6 de mani~re 6viter le refroidissement de la culture et passe pr6alablement au travers d'un humidificateur). Les fractions s'6coulant du chemostat sont recueillies dans la glace. Apr~s la r@ression, la d6r6pression est obtenue en centrifugeant les cellules Biochim. Biophys. Acta, 92 (i964) 1-9

ClNI~TIQUES DE RI~PRESSIONET DE DI~R1~PRESSIONCHEZ S. cerevisiae

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r6prim6es contenues dans le chemostat et en les utilisant comme inoculum pour un second chemostat ne contenant pas de r6presseur. A chaque pr61~vement on mesure, d'une part, le degr6 d'absorption (650 m/z) du contenu du chemostat lui-m~me en pr61evant quelques ml ~t l'orifice de sortie, et, d ' a u t r e part, le volume et le degr6 d'absorption de la fraction 6coul6e. Les fractions recueillies sont centrifug6es, ]av~es deux fois et broy6es dans l'appareil de Nossal, dans les conditions habituelles (voir r6f. I). Les activit6s enzymatiques des extraits sont mesur6es selon les mdthodes pr6c6demment d6crites 1,2. L'6volution de la masse de la culture est calcul~e, pour chaque temps, en tenant compte des cellules pr6sentes dans le chemostat et dans la fraction pr61ev6e. On peut ainsi tracer la courbe de croissance, comme s'il s'agissait d'une culture normale. On consid~re l'activit6 sp6cifique trouv6e (pour un enzyme donn6 dans un pr615vement donn6) comme ~tant l'activit6 sp6cifique m o y e n n e correspondant en fait ~ la moiti6 de la p6riode de temps qui a s6par6 ce pr61~vement du pr61~vement pr6c6dent. On a d m e t d ' a u t r e part que l'activit6 sp6cifique du contenu du chemostat lui-mSme est identique ~t celle du dernier pr61~vement. On peut alors retracer l'6volution de la synth~se totale d ' e n z y m e en r a p p o r t a n t cette activit6 sp6cifique A la masse cellulaire qui s'est form6e entre deux pr61~vements. A partir des courbes ainsi obtenues on peut tracer les pentes z]E/AM qui correspondent au t a u x de synth~se de chaque enzyme au cours de la croissance, en pr6sence ou en absence de r6presseur. La diff6rence entre ces deux pentes permet de calculer le t a u x de r6pression vrai, ind6pendamment de la r6pression apparente qui peut 8tre obtenue directement*.

Croissance La Fig. i montre les courbes de croissance obtenues au cours des diff6rentes exp6riences de r6pression. Ces courbes ont 6t6 port6es en coordonn6es normales. On voit donc que la croissance dans ces conditions n'est pas exponentielle. Elle est presque linSaire au cours de la r6pression par la mdthionine, et au cours de la r6pression par la thr6onine, elle est lin6aire au d6but puis tend vers un plateau. En fait, dans ce dernier cas la croissance s'arr~te en fin d'exp6rience et le chemostat commence ~ se "vider". Les cellules pr61ev~es en fin de r6pression et remises dans un chemostat sans r6presseur repartent imm6diatement en croissance logarithmique comme le montre la Fig. 2. Le temps m o y e n de g6n6ration est o p t i m u m (2 h) apr~s r6pression par la m6thionine, mais tr~s diminu6 apr~s r6pression par la thr6onine.

Effet de la thrdonine On voit sur la Fig. 3 que la thr6onine r6prime tr~s fortement (75% et 82%) la synth&se de l'aspartokinase. De plus, le t a u x de r6pression est constant, c'est-~-dire * Lorsque le nombre de gdn~rations est faible, il est dvident que le taux de r6pression apparent obtenu par comparaison des activit6s spdcifiques est tr~s en retrait par rapport au taux de rdpression vrai. Par exemple, si l'activitd sp~cifique est xoo et si la r6pression vraie est xoo%, on aurait apr~s un doublement une activitd sp6cifique de 5o, soit une rdpression apparente de 5O°/o.

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~C~h~*TStanl~eioni

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Fig. I. Courbes de croissance en c h e m o s t a t d a n s les c o n d i t i o n s de r~pression p a r la t h r ~ o n i n e ou p a r la m ~ t h i o n i n e (i • io -2 M e n L). Les courbes o n t 6t~ calcul~es c o m m e expliqu~ d a n s le t e x t e et port~es en coordonn~es n o r m a l e s (la croissance n ' ~ t a n t p a s exponentielle).

que la r@ression s'installe d~s le d6but de la mise en contact avec le r6presseur exog~ne et se maintient &un taux constant pendant au moins 4 g6n6rations cellulaires. L'effet de la thr6onine sur l'aspartokinase est tr~s sp6cifique. En effet, les r6sultats port6s sur la Fig. 4 montrent que la synth~se de l'homoserine deshydrog6nase n'est presque pas modifi~e par culture en pr6sence de cet acide amin& D'autre part, la synth~se de la semi-ald6hyde aspartique deshydrog6nase a 6t6 16g~rement r6prim6e

10C

/-- /fi;eov 40h

I0

20

heures

Fig. 2. Courbes de croissance o b t e n u e s en milieu m i n i m u m apr~s r~pression d a n s les c o n d i t i o n s de la Fig. i. Courbe I: apr~s r~pression p a r la thr~onine. Courbe I I : apr~s r~pression p a r la m~thionine, t~chelle s e m i - l o g a r i t h m i q u e . Les chiffres p o r t , s le long des p e n t e s i n d i q u e n t le n o m b r e de g~n6rations effectu~es p a r la culture. Les fl~ches i n d i q u e n t le m o m e n t a p p r o x i m a t i f d u r e t o u r a u t a u x n o r m a l de synth~,se de l ' e n z y m e p r i n c i p a l e m e n t r~prim~ (voir Figs. 7 et 8). TMG, t e m p s m o y e n de g~n~ration.

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ClNI~TIQUES DE RIZPRESSION ET DE DIZRI~PRESSION CHEZ S. cerevisiae

5

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0

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1

2

3

4 AM(g prot~ines)

Fig. 3. S y n t h ~ s e d ' a s p a r t o k i n a s e en pr6sence de t h r ~ o n i n e ( I . lO -2 M e n L). P o u r explications, voir le t e x t e . L a c o m p a r a i s o n de la p e n t e t h 6 o r i q u e (en a b s e n c e de r6presseur) et des p e n t e s o b t e n u e s en pr6sence de r6presseur d o n n e d i r e c t e m e n t le t a u x de r@pression o b t e n u d a n s d e u x exp6riences diff~rentes (I et II).

dans une exp6rience (chemostat I: r6pression environ 2o%) et au contraire 16g~rement augment6e dans l'autre exp6rience (chemostat II: + environ lO%). I1 semble donc vraisemblable que ces variations ne sont pas significatives. Effet de la m~thionine L'effet de la m6thionine est plus complexe que celui de la thr~onine. La synth&se de l'homos6rine deshydrog~nase est la plus r6prim~e (49 et 65%). Comme pr6c6demment, cette r6pression s'6tablit d~s le d6but de l'exp6rience et son taux reste constant (Fig. 5). Toutefois, la synth&se de l'aspartokinase est 6galement rdprim6e quoique de

~'~ Asportote semi-oldehyde eb jb

deshydrog~nese

~ .,,~¢~'~//~/e.o0~"

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Homoserinedeshydrog~nose

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4 AM (g prot~ines)

Fig. 4. S y n t h ~ s e de ]a semi-aid@hyde a s p a r t i q u e deshydrog6n&se et de l'homos@rine d e s h y d r o g 6 n a s e en pr6sence de t h r 6 o n i n e (I • lO -2 M en L). Voir l@gende de la Fig. 3.

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6 AM (g pPot(~ines)

Fig. 5. Synth~se d'homos6rine deshydrog~nase en pr6sence de m6thionine (i .lO -2 M en L). Voir Mgende de la Fig. 3,

mani~re moins importante (28 et 37%). I1 faut remarquer que le taux de cette r@ression semble augmenter avec le temps (Fig. 6). D'autre part, la synth~se de la semiald6hyde aspartique deshydrog6nase est d6r@rim6e (augmentation d'environ 50% du taux de synth&se).

.~ ~, ZFZ~ /~oI!~ i/

.~/ Aspaotokinase

#L / J ,~

rtate

semi -aldehyde

cl~shydrog~nase

2

,4

6 Z~M(gprot6ines}

Fig. 6. Synth~se d ' a s p a r t o k i n a s e et de semi-ald6hyde a s p a r t i q u e deshydrog6nase en pr6sence de m6thionine (i • IO- I M e n L). Voir Mgende de la Fig. 3.

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7

AE

(ux10-s) 3

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1

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,

2

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3

4AM(g prot~nes)

Fig. 7. S y n t h ~ s e d ' a s p a r t o k i n a s e apr~s r6pression en pr6sence de thr~onine. Les cellules proven a n t d u c h e m o s t a t t I (Fig. 3) o n t ~t6 utilis6es c o m m e i n o c u l u m d a n s cette experience. L a fl~che i n d i q u e le h o m b r e de g6n6rations effectu6es p a r la c u l t u r e a v a n t le r e t o u r a u t a u x n o r m a l de s y n t h ~ s e de l ' e n z y m e (voir courbe de croissance c o r r e s p o n d a n t e : Fig. 2).

Ddrdpression On voit sur la Fig. 7 qu'aprfis r@ression de l'aspartokinase par la thr6onine le retour au taux normal de synth~se a n6cessit6 environ 2.5 g6n6rations. Dans le cas de l'homos6rine deshydrog6nase, apr~s r6pression par la m6thionine, ce retour s'est effectu6 apr~s I g6n6ration environ (Fig. 8).

AE (UxlO-e

/

1 ger~ration

Fig. 8. S y n t h 6 s e d ' h o m o s 6 r i n e d e s h y d r o g ~ n a s e apr6s r6pression en presence de m~thionine. Les cellules utilis6es c o m m e i n o c u l u m p r o v i e n n e n t d u c h e m o s t a t II (Fig. 5). Voir ldgende de la Fig. 7.

DISCUSSION

L'ensemble de ces r~sultats confirme et 6tend les r6sultats pr6c6demment obtenus au cours des exp6riences de r~pression avec des cultures discontinues I-3. On a vu en effet

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que la thr6onine r6prime sp4cifiquement la synth6se de l'aspartokinase. Cet enzyme est toutefois faiblement r6prim6 par la m4thionine. L'homos6rine deshydrog6nase n'est r6primfe que par la mfthionine. Ce dernier acide amin6 provoque 6galement une d6r4pression de la semi-ald6hyde aspartique d6shydrogfnase*. On voit donc que les produits terminaux, m6thionine et thr6onine, contr61ent d'une mani6re diff6rente et complexe le taux de biosynth6se des trois enzymes communs ~ la biosynth6se de ces deux m6tabolites Asp - - - + A s p - P O ~

> Semi-aldehyde aspartique - - - + Homos6rine - - - -+ M6thionine Y Thr6onine

Bien que les r6pressions observ6es ne soient pas totales, elles influent consid6rablement sur le taux de croissance des cultures. Nous avions pu montrer en culture discontinue que le taux de croissance normal pent 4tre r6tabli par l'addition du second produit final, ce qui montre que la limitation de la croissance est due ~ la cr6ation d'une auxotrophie partielle en pr6sence du r@resseur (carence en m6thi0nine en r6pression thr6onine et vice-versa). Cependant la croissance, dans ces conditions de culture discontinue, se maintient ~ un taux r6duit mais constant. Ceci nous avait amen6 ~ conclure que les inhibitions par r6tro-contr61e devaient 6tre faibles ou nulles. En effet, on pent calculer que la concentration de l'acide amin6 r@resseur dans le pool devrait inhiber compl6tement l'activit6 des enzymes 6tudi6s. 4 Dans les exp6riences pr6sent6es ici, le taux de d6r@ression n'6tant pas consid6rablement plus important que dans les exp6riences pr6c6demment cit6es, on aurait dfl s'attendre ~t une croissance comparable. Nous avons vu que tel n'est pas le cas. I1 est plausible de supposer que, dans le chemostat, le taux de r6presseur 6rant maintenu constant, il y a un effet de r6tro-contr61e qui s'ajoute ~ la r6pression. Cet effet ne doit 6tre que partiel, mais devient d'autant plus important physiologiquement que l'activit6 sp6cifique des cellules s'abaisse. On doit remarquer, ~t l'appui de cette hypoth6se, que l'aspartokinase est des trois enzymes 6tudi6s le plus sensible au r6tro-contr61e, celui-ci 6rant exerc6 par la thr6onine. Or, c'est darts les exp6riences de r6pression par la thr6onine que l'effet sur la croissance a 6t6 le plus dramatique. De plus, la croissance reprend exponentiellement et sans phase de latence apr6s 61imination du r6presseur exog6ne, bien que le retour au taux normal de biosynth6se se fasse plus lentement. Ceci montre bien que l'inhibition presque complete de la croissance (en fin de "chemostat thr6onine") n'6tait pas due seulement ~ la r@ression. Quoiqu'il en soit, cet effet est loin d'4tre celui attendu si les enzymes 6taient effectivement en contact avec l'acide amin6 r@resseur ~t la concentration qui est effectivement pr6sente dans le pooP. Cette observation renforce l'hypoth6se que nous avions avanc6e pr6c6demment selon laquelle la synth6se du r6presseur endog6ne partir de l'acide amin6 exog6ne serait en relation directe avec le pool interne et que, par contre, ce pool n'est pas en relation directe avec les enzymes pr6sents clans le cytoplasme 4.*. On pourrait concevoir, au contraire, que les r6gulations internes (en * Ce p h 6 n o m 6 n e p e u t s ' e x p l i q u e r en s u p p o s a n t que l a s y n t h 6 s e de la s e m i - a l d 6 h y d e a s p a r t i q u e d e s h y d r o g ~ n a s e est m a x i m a l e m e n t r4prim~e p a r la t h r g o n i n e endog6ne. L a r6pre s s i on de l a l ' h o m o s e r i n e d e s h y d r o g 6 n a s e p a r la m 6 t h i o n i n e , c a u s a n t une carence en thr6onine, p r o v o q u e r a i t en m 4 m e t e m p s la d4r6pression de la s e m i - a l d 4 h y d e a s p a r t i q u e d e s h y d r o g g n a s e a. ** Une h y p o t h 6 s e tr6s v o i s i n e a 4t6 a v a n c 6 e r 6 e e m m e n t p a r SERCARZ ET GORINI 8 p o u r exp l i q u e r la d~r6pression des e n z y m e s de la voie de b i o s y n t h 6 s e de l ' a r g i n i n e chez u n m u t a n t p a r t i c u l i e r de Escherichia coli.

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absence de rfpresseur exog~ne) soient plus particulifirement dues au r6tro-contr61e puisque les enzymes qui aboutissent k la synth~se des acides amin6s responsables de du r6tro-contr61e sont probablement tous localis6s au sein du cytoplasme. En ce qui concerne la question que nous nous 6tions posfie au d~but de ce travail, il ressort clairement que la synth~se de r@resseur endog~ne (soit ~ partir de la thrfionine, soit ~ partir de la m6ttlionine) est un ptl6nom~ne rapide et qui se poursuit ~ taux constant. Contrairement A la r6pression la d6r@ression se manifeste, dans nos conditions exp6rimentales, comme un pll6nom~ne lent et progressif. On pourrait penser,/~ premiere vue, que ceci s'explique par une ~limination lente du r@resseur endog~ne. Toutefois, il semble n6cessaire de prendre en consid~ration le r61e du pool d'acides amin6s dans l'interpr~tation de ce ph6nom~ne. En effet, les propri6t6s de l'amino acide perm6ase de S. cerevisiae que nous avons ~tudi~e par ailleurs, indiquent que l'acide amin~ exog~ne (m~thionine et thr6onine) peut 6tre concentr~ par les cellules jusqu'au moins lO .2 M. Nous avons montr6 6galement que l'effet de concentration est pratiquement irr6versible en absence d'un acide amin6 exog~neT,9. Par cons6quent, m6me apr~s cessation de l'apport ext6rieur de r@resseur exog~ne, il est probable que le r@resseur endog~ne peut encore se former ~ partir du pool jusqu'k abaissement de celui-ci au-dessous d'un niveau critique. Une ~tude plus approfondie de la cin~tique et des conditions n6cessaires ~ la d6r@ression est actuellement en cours. REMERCIEMENT5

Ce travail a b6n~fici6 de l'aide de la National Science Foundation (Grant G 14856), du Fonds de D6veloppement de la Recherche Scientifique et Technique (Convention 61 FR o63) et du Commissariat ~ l'Energie Atomique. RI~SUMI~

L'6tude de la cin6tique de synth~se des trois enzymes communs ~ la biosynth~se de la thr6onine et de la m6tllionine chez Saccharomyces cerevisiae dans les conditions de r@ression puis de d6r@ression montre que la r@ression s'~tablit imm6diatement et se poursuit ~ un taux constant, tandis que la d6r@ression s'6tablit lentement et progressivement. Ces rdsultats semblent en faveur d'une transformation rapide du r@resseur exog~ne (acide amin6 terminal) en "r6presseur endog~ne" et d'une 61imination lente de ce dernier, probablement due au maintien temporaire du r@resseur exog&ne dans le pool des acides amin6s. BIBLIOGRAPHIE 1 E . R . STADTMAN, G . N . COHEN, G . L E BRAS ET H . DE ROBICHON-SZULMAJSTER, J. Biol. Chem., 2 3 6 (1961) 2 o 3 3 . 2 H . DE ROBICHON-SZULMAJSTtgR ET D . CORRIVAUX, Biochim. Biophys. Acta, 73 (1963) 248a y . I{ARASSEVITCH ET H . DE ROBICHON-SZULMAJSTER, Biochim. Biophys. Acta, 73 (1963) 4 1 4 • 4 H . DE ROBICHON-SZULMAJSTER, g . SURDIN, g . KARASSEVITCH ET D . CORRIVAUX, CoUoque International sur les mdcanismes de r@ulation C.N.R.S., Marseille, r963, s o u s p r e s s e . s R . I{. I~IORTIMER ET H . DE ROBICHON-SZULMAJSTER, m a n u s c r i t e n p r 6 p a r a t i o n . 8 H . DE ROBICHON-SZULMAJSTER ET W . SLY, Proc. X I International Congress Genetics, I (1963) 357 y . SURDIN, W . SLY, J . SIRE, A. M. BORDES ET I-I. DE ROBICHON-SZULMAJSTER, R ~ s u l t a t s n o n publi~s. 8 E . E . SERCARZ ET L . GORIIqI, J. Mol. Biol., 8 (1964) 2 5 4 . 9 y . SURDIN, W . SLY, J . SIRE, &. IV[. BORDES ET H . DE ROBICHON-SZULMAJSTER, C.R. Acad. Sci., 2 5 8 (1964) 5 0 4 6 .

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