- Email: [email protected]
Rekonstrukcja tkanki chrzęstnej biomateriałami polimerowymi – wczesne wyniki makroskopowe i histologiczne
64
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Rekonstrukcja tkanki chrzęstnej biomateriałami polimerowymi – wczesne wyniki makroskopowe i histologiczne Cartilage tissue reconstruction by the polymer biomaterials – early macroscopic and histological results Wojciech Ścierski, Aleksandra Polok, Grzegorz Namysłowski, Jerzy Nożyński1, Lucyna Turecka, Natalia Urbaniec, Elżbieta Pamuła 2
Otolaryngol Pol 2009; 63 (7 ): 64-72
SUMMARY Introduction: The surgical treatment of large cartilage defects in the region of head and neck is often impossible because of the atrophy of surrounding tissues and lack of suitable material for reconstruction. In the surgical treatment many of methods and reconstructive materials have been used. For many years the suitable synthetic material for the cartilage defects reconstruction has been searched for. The aim of the study: was to evaluate two different biomaterials with proper mechanical and biological features for the cartilage replacement. Material and methods: Two type of biomaterials in this study were used: resorbable polymer - poly(L-lactide-co-glycolide) (PLG) acting as a supportive matrix. A thin layer of sodium hyaluronate (Hyal) was also deposited on the surface as well in the pore walls of PLG scaffolds in order to provide biologically active molecules promoting differentiation and regeneration of the tissue. The studies were performed on the 50 animals – rabbits divided into 2 groups. The animals were operated in the general anaesthesia. The incision was done along the edge of the rabbit’s auricle. Perichondrium and cartilage of the auricle on the surface 4 x 3 cm were prepared. Subperichondrically 1 x 1 cm fragment of the cartilage was removed by the scissors. This fragment was then replaced by the biomaterials: PLG in first group of 25 rabbits and PLG-Hyal in second group 25 rabbits. The tissues were sutured with polyglycolide Safil® 3-0. The animals obtained Enrofloxacin® for three days after the operation. Then 1, 4 and 12 weeks after the surgery the animals were painlessly euthanized by an overdose of Morbital®. Implants and surrounding tissues were excised and observed macroscopically and using an optical microscope. Results: In all the observation periods we observed proper macroscopic healing process of biomaterials. We didn’t stated strong infl ammatory process and necrosis around the implanted biomaterials. Conclusions: The histological and macroscopic examinations indicated that both materials developed in this study have properties similar to cartilaginous tissue and seem to be good for her restoration. Although the quickest tissue regeneration was found after implantation of PLG-Hyal.
©by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów Głowy i Szyi Otrzymano/Received: 02.06.2009 Zaakceptowano do druku/Accepted: 22.06.2009 Katedra i Oddział Kliniczny Laryngologii w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. med. Grzegorz Namysłowski 1 Pracownia Histopatologii Śląskiego Centrum Chorób Serca w Zabrzu Kierownik: dr med. Jerzy Nożyński 2 Katedra Biomateriałów Akademii GórniczoHutniczej w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. inż. Stanisław Błażewicz Wkład pracy autorów/Authors contribution: Wojciech Ścierski – opracowanie koncepcji pracy, eksperyment zwierzęcy, Aleksander Polok – opracowanie koncepcji pracy, eksperyment zwierzęcy, Grzegorz Namysłowski – opracowanie koncepcji pracy, Jerzy Nożyński – badanie histopatologiczne, Lucyna Turecka – udział w redagowaniu publkacji, Natalia Urbaniec – udział w redagowaniu pracy. Konflikt interesu/Conflicts of interest: Autorzy pracy nie zgłaszają konfliktu interesów. Adres do korespondencji/ Address for correspondence: imię i nazwisko: Wojciech Ścierski adres pocztowy: Katedra i Oddział Kliniczny Laryngologii Śląskiego UM w Zabrzu ul. Skłodowskiej-Curie 10 41-800 Zabrze tel. 32 271 74 20 e-mail [email protected]
Hasła indeksowe: rekonstrukcja tkanki chrzęstnej, materiały syntetyczne, kopolimer glikolidu i L-laktydu (PLG), kwas hialuronowy Key words: Cartilage tissue reconstruction, synthetic biomaterials, poly (glycolide-co-L-lactide) PGLA, hyaluronic acid (Hyal).
Wprowadzenie Tkanka chrzęstna pojawia się u zarodka w 5 tygodniu życia i występuje u dorosłego człowieka pod postacią tkanki chrząstkowej (chondroidalnej) oraz chrząstki. Wyróżniamy różne odmiany chrząstki, takie jak: miąższowa, włóknista, sprężysta oraz najbardziej zróżnicowana chrząstka szklista. Wszystkie rodzaje chrząstki rozwijają się na podłożu mezenchymy,
a na ich budowę duży wpływ wywierają czynniki mechaniczne. Rekonstrukcja ubytków tkanki chrzęstnej w obrębie narządów głowy i szyi takich jak tchawica, krtań, ucho zewnętrzne oraz przegroda nosa stanowi nadal duży problem zarówno dla otolaryngologów jak i chirurgów plastycznych. Do dnia dzisiejszego nie znaleziono O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS ani idealnej metody leczenia chirurgicznego ubytków i perforacji chrząstki, ani odpowiedniego biomateriału, którym można by ją zastąpić. W dostępnej literaturze istnieje szereg doniesień na temat prób zastosowania resorbowalnego kopolimeru laktydu i glikolidu (PLG) należącego do grupy poliestrów alifatycznych oraz kwasu hialuronowego w rekonstrukcji tkanki chrzęstnej [1–5]. Wykorzystano doskonałe właściwości mechaniczne tych biomateriałów, łatwość ich modyfikowania oraz biokompatybilność idealnie korelującą ze strukturą chemiczną chondrocytów. Prowadzono badania nad wykorzystaniem PLG w rekonstrukcji ubytków tkanki chrzęstnej w obrębie głowy i szyi (leczenie ubytków i złamań kości czaszki, rekonstrukcje podczas operacji uszu, operacje plastyczne w zakresie twarzoczaszki), a także w procesie osteogenezy w ortopedii oraz chirurgii szczękowo-twarzowej. Eksperymenty przeprowadzano na zwierzętach (myszy, szczury, króliki, owce) a ich wyniki nie były w pełni zadowalające. Brak informacji o wykorzystaniu PLG i jego kompozycji z kwasem hialuronowym (PLGHyal) w chirurgii rekonstrukcyjnej małżowiny usznej i nosa skłoniły autorów do przeprowadzenia własnych badań w tym zakresie. Pomimo stosowania różnych metod operacyjnych i materiałów w rekonstrukcji ubytków przegrody nosa, jak dotąd nie znaleziono idealnego rozwiązania. Wykorzystywanie tkanek własnych z najbliższego otoczenia (małżowina nosowa dolna, boczna ściana nosa) związane jest z dużymi ograniczeniami i niewielkim odsetkiem powodzeń. Zastosowanie materiałów syntetycznych nie przyniosło dotychczas spodziewanych efektów. Wciąż zatem poszukuje się materiału, który byłby skuteczny w odbudowie brakującego chrzęstnego fragmentu przegrody nosa. Materiał ten poza odpowiednimi cechami biologicznymi musi spełniać określone właściwości fizykomechaniczne upodabniające go do tkanki chrzęstnej przegrody nosa. Celem podjętych badań była ocena kliniczna zmodyfikowanych biomateriałów polimerowych (PLG i PLG-Hyal) w eksperymentalnej rekonstrukcji ubytków tkanki chrzęstnej oraz ocena histologiczna tkanek otaczających implantowane biomateriały.
Materiał i metodyka 1. Biomateriały do rekonstrukcji tkanki chrzęstnej Do badań wykorzystane zostały dwa rodzaje biomateriałów: resorbowalny kopolimer L-laktydu z glikolidem (PLG) zawierający 85% mol L-laktydu i 15% mol glikolidu (PAN Zabrze) oraz kopolimer L-laktydu z glikolidem modyfikowany kwasem hialuronowym (PLG-Hyal). Materiały te przetworzono do postaci przestrzennych gąbek z wykorzystaniem substancji porotwórczej – chlorku sodu o frakcji ziarnowej 250–320 μm (POCh, Gliwice) (ryc. 1). Próbki przygotowywano w następujący sposób: do roztworu PLG w chlorku metylenu O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
dodawano odpowiednią ilość chlorku sodu, tak, aby udział objętościowy porogenu wynosił 85%. Następnie mieszaninę homogenizowano, odlewano do szalki Petriego, suszono i umieszczano w wodzie destylowanej w celu wypłukania soli. Próbki PLG-Hyal otrzymano poprzez ciekłą impregnację pod ciśnieniem gąbek PLG roztworem kwasu hialuronowego. Następnie próbki wysuszono w suszarce próżniowej. Oba materiały zostały wyjałowione za pomocą plazmy nadtlenku wodoru (Sterrad 120, ASP, Johnson&Johnson). Biomateriały przygotowywano pod postacią pasków o wymiarach 0,5 x 1,0 cm i grubości 2 mm. 2. Eksperyment zwierzęcy Eksperyment zwierzęcy z użyciem biomateriałów został przeprowadzony na 50 królikach rasy Białe Nowozelandzkie, pochodzących z hodowli konwencjonalnej, ze stada własnego Centralnej Zwierzętarni Doświadczalnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Ze względu na dobry dostęp operacyjny materiały implantacyjne wszczepione zostały w chrząstkę małżowiny usznej, która wykazuje bardzo duże podobieństwo do elementów chrzęstnych przegrody nosa. Zwierzęta operowano w znieczuleniu ogólnym. Z cięcia wzdłuż brzegu małżowiny usznej królika wypreparowywano płat skórno-ochrzęstnowy i odsłaniano chrząstkę na powierzchni 4 x 3 cm. Podochrzęstnowo usuwano fragment chrząstki małżowiny o wymiarach 1 x 1 cm, który następnie uzupełniano przy pomocy biomateriału. 50 zwierząt doświadczalnych podzielono na dwie grupy. W grupie pierwszej 25 zwierząt ubytek chrzęstny małżowiny uzupełniono za pomocą PLG. W grupie drugiej 25 zwierząt ten sam ubytek uzupełniono przy pomocy PLG zmodyfikowanego kwasem hialuronowym. Po rekonstrukcji ubytku chrzęstnego przykładano na niego płaty skórno-ochrzęstnowe, a ranę szyto dwoma lub trzema szwami resorbowalnymi z poliglikolidu (3-0). Zwierzęta zostały poddane eutanazji po 1, 4 i 12 tygodniach obserwacji, za pomocą preparatu Morbital® w dawce 200 mg/kg masy ciała dosercowo, poprzedzonego w premedykacji podaniem Domitoru® z Ketaminą. Do badań pobierano całą małżowinę uszną wraz z implantowanym biomateriałem. Badając proces gojenia dokonano oceny makroskopowej i histologicznej. Preparaty pochodzące z miejsc implantacji utrwalano w 4% zbuforowanej formalinie, poddawano je rutynowej obróbce histologicznej, barwiono rutynowo Hematoksyliną i Eozyną. Oceniono zarówno biomateriały jak i otaczającą tkankę chrzęstną małżowiny usznej. Badania histologiczne zostały przeprowadzone w Akademii Górniczo-Hutniczej w Krakowie oraz w Pracowni Histopatologicznej Śląskiego Centrum Chorób Serca w Zabrzu. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Etycznej do spraw Doświadczeń na Zwierzętach ŚUM w Katowicach (nr zgody 17/2007 z dnia 21 lutego 2007 roku).
65
66
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
1
2
Ryc. 1. Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu elektronowego skaningowego gąbek PLG i PLG-Hyal.
3. Analiza statystyczna Analiza statystyczna zmian mikroskopowych obejmowała ocenę półilościową, rangową obfitości nacieku zapalnego, obecności komórek resorpcyjnych wielojądrowych, włóknienia oraz waskularyzacji. Nasilenie zmian ustalano w skali umownej, gdzie: 0 – oznaczało brak danej zmiany, 1 – zmianę nieznaczną, 2 – występowanie częstsze, 3 – występowanie umiarkowanie nasilone, 4 – zmianę bardzo wyraźną, 5 – zmianę dominującą w obrazie. Oceniono statystykę opisową każdej z grup czasowych porównywanych ze sobą. Właściwą wartością przeciętną jest mediana. Porównania wzajemne przeprowadzono z użyciem testu nieparametrycznego Manna-Whitneya. Przeprowadzono też analizę korelacji testem Spearmana, w której oceniono współzależność obserwowanych zmian z czasem obserwacji, upływającym od implantacji każdego z polimerów. Oceniono siłę korelacji na podstawie wartości i znaku współczynnika r Spearmana oraz znamienność tej zależności. Za wynik znamienny przyjęto prawdopodobieństwo p mniejsze lub równe 0,05. Obliczenia statystyczne przeprowadzono z wykorzystaniem pakietu Statistica 99.
Wyniki i ich omówienie U żadnego z królików nie wystąpiły powikłania związane z operacją i znieczuleniem. Proces gojenia rany był podobny u wszystkich zwierząt. We wszystkich przypadkach przez pierwsze 10 dni obserwowano umiarkowany obrzęk w okolicach cięcia małżowiny usznej bez objawów nasilonego stanu zapalnego. Zauważano jedynie niewielkie symetryczne zgrubienie brzegów rany, a przy obmacywaniu nie wyczuwano
chełbotania mogącego świadczyć o obecności krwiaka lub wydzielinie przyrannej. Rana skórna goiła się przez rychłozrost do 14 dni od zabiegu operacyjnego. Nieznaczne zgrubienia tkanek w pobliżu cięcia skórnego obserwowano do około dwóch miesięcy od zabiegu operacyjnego. 1. Badania histologiczne implantu 1. Pierwszy tydzień po implantacji Okres pierwszego tygodnia po implantacji polimeru PLG wykazywał obfity naciek zapalny, w którym dominowały liczne makrofagi i rozproszone limfocyty. Naczynia krwionośne były nieliczne, z reguły słabo widoczne wśród obfitego nacieku. Naciek idąc obwodowo tracił swoją obfitość na korzyść wydłużonych fibroblastów oraz słabo widocznych włókien kolagenowych, tworzących jego torebkę. Chrząstka w okolicy implantu nie wykazywała zmian wstecznych oraz zapalnych, zachowując prawidłową barwliwość istoty pozakomórkowej i typowy układ chondrocytów (Ryc. 2). Implantacja drugiego z badanych materiałów PLG-Hyal, wykazywała żywszy odczyn zapalny, z liczniejszymi limfocytami, domieszką makrofagów oraz licznymi poszerzonymi naczyniami kapilarnymi, sugerując ostry stan zapalny. Torebka łącznotkankowa obfitowała w fibroblasty z nieznaczną domieszką nacieku zapalnego. Zauważano także pojedyncze komórki wielojądrowe. Chrząstka, pomimo istnienia ostrego odczynu zapalnego nie wykazywała zmian (Ryc. 3). 2. Czwarty tydzień po implantacji Czwarty tydzień poimplantacyjny PLG wykazywał spadek obfitość i rozrzedzenie nacieku zapalnego, w którym dominującym elementem obrazu były cechy zapalenia resorpcyjnego, z obecnością licznych komórek olbrzymich wielojądrzastych przylegających do resztek O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
1
2
3
Ryc. 2. Implant PLG – 1 tydzień obserwacji: naciek zapalny złożony głównie z makrofagów i limfocytów obejmuje fragmenty polimeru PLG (1). Torebka wokół nacieku z włókien kolagenowych i fibroblastów (2) (pow. 400x). Chrząstka wokół PLG nie wykazuje zmian (3) (pow. 200x). Barwienie HE.
1
2
3
Ryc. 3. Implant PLG-Hyal – 1 tydzień obserwacji: Naciek zapalny składający się z limfocytów i histiocytów, widoczne młode naczynia krwionośne (1) (pow. 400x). Torebka otaczająca ziarninę zapalną z licznymi fi broblastami (2) (pow. 150x). Chrząstka bez zmian patologicznych (3) (pow. 250). Barwienie HE.
1
2
3
Ryc. 4. Implant PLG – 4 tydzień obserwacji. Liczne komórki resorpcyjne wielojądrzaste otaczają fragmenty polimeru. W zrębie widoczny rozproszony naciek limfocytarno-histiocytarny (1). Komórka olbrzymia zawierająca dwójłomne resztki polimeru (2) (pow. 400x). Miejsce nacięcia chrząstki z wytworzeniem blizny z młodej dojrzewającej chrząstki tworzącej strefy izogeniczne (3) (pow. 150x). Barwienie HE.
polimeru. Nadal dostrzegano domieszkę limfocytów. Wewnątrz części komórek olbrzymich dało się zauważyć dwójłomne resztki trawionego polimeru PLG. Chrząstka uszkodzona w okolicy implantacji polimeru ujawniaO t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
ła z kolei cechy regeneracji, zauważano zaburzony układ chondrocytów odpowiadający bliźnie chrzęstnej, z obecnością młodej, słabo zasadochłonnej istoty pozakomórkowej i różnicującym się układem młodych drob-
67
68
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
1
2
3
Ryc. 5. Implant PLG-Hyal - 4 tydzień obserwacji: Liczne ziarniniaki resorpcyjne zawierające komórki olbrzymie wielojądrowe. Włóknienie zrębu. (1) (pow. 200x). Chrząstka o zwiększonej zasadochłonności istoty podstawowej i włóknienie ochrzęstnej. Zwiększona ilość fi broblastów. Obok widoczne ziarniniaki resorpcyjne wokół fi lamentów PLG-Hyal (2,3) (pow. 400x).
1
2
3
Ryc. 6. Implant PLG – 12 tydzień obserwacji: Ziarniniaki resorpcyjne zawierające komórki wielojądrowe otoczone mankietem nacieku limfocytarnego i tkanką łączną (1) (pow. 200x). Apoptotyczny rozpad komórki olbrzymiej (2) (pow. 1000x). Zwłóknienie ochrzęstnej w sąsiedztwie z ziarniną resorpcyjną (3) (pow.50x).
1
2
3
Ryc. 7. Implant PLG-Hyal – 12 tydzień obserwacji: Liczne pobudzone limfocyty. Cytoplazma komórki olbrzymiej zawiera fragmenty polimeru (1) (pow. 600x). Wzmożona zasadochłonność istoty podstawowej chrząstki, resztki (cienie) chondrocytów, brak jąder komórkowych oraz warstwa chondroblastów (2) (pow. 100x). Chrząstka z zachowaną izogenicznością, istota podstawowa wykazuje normochromię, liczne chondrocyty zawierają jądra komórkowe (3) (pow. 200x).
nych chondrocytów w kolumny izogeniczne (Ryc. 4). Czterotygodniowa obserwacja implantów PLG-Hyal wykazywała podobne zmiany. W obrazie mikroskopowym dominowały liczne ziarniniaki resorpcyjne otaczające
resztki polimeru, cechy zapalenia ostrego zanikały, pojawiało się włóknienie zrębu. Chrząstka wykazywała wzrost zasadochłonności istoty podstawowej pozakomórkowej, chondrocyty nie wykazywały zmian wsteczO t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS nych. Natomiast okolica ochrzęstnej zlokalizowana blisko polimerowego implantu i ziarniniaków ulegała włóknieniu, pojawiały się w niej naczynia kapilarne i zwiększała się ilość fibroblastów (Ryc. 5). 3. Dwunasty tydzień po implantacji Dwunasty tydzień po implantacji PLG wykazywał histologiczne zmiany zbliżone do tygodnia czwartego. W obrazie nadal dostrzegano ziarniniaki resorpcyjne zawierające komórki olbrzymie wielojądrowe, ilość limfocytów ulegała zmniejszeniu, zaś w obwodzie ziarniniaków obserwowano zwiększenie się ilości tkanki łącznej. Niektóre z ziarniniaków imitowały odczyn sarkoidalny, w części pozostałych dostrzegany był apoptotyczny rozpad komórek z tworzeniem bezpostaciowych mas zawierających pył chromatynowy z rozpadłych jąder komórkowych. Chrząstka nie wykazywała istotnych zmian, natomiast ochrzęstna w okolicy implantowanego polimeru wykazywała cechy zwłóknienia (Ryc. 6). Implantacja PLG-Hyal wykazywała w dwunastym tygodniu obserwacji zbliżone cechy morfologiczne. Podobnie jak w obserwacjach wcześniejszych, nieliczne komórki olbrzymie ujawniały cytoplazmatyczne dwójłomne fragmenty, mogące odpowiadać fragmentom polimeru. W odróżnieniu od PLG, tkanka łączna wykazywała wzrost liczby fibroblastów, natomiast ilość włókien łącznotkankowych nie wykazywała istotnych zmian. Obrzeże chrząstki ogniskowo wykazywało zmiany zwyrodnieniowe w postaci narastającej bazofilii istoty podstawowej, ogniskowej martwicy chondrocytów z pozostawieniem wzmiankowanych bezjądrowych resztek, przy braku jakiejkolwiek reakcji zapalnej. W okolicy zmian martwiczych zauważalne były również cechy regeneracji chrząstki pod postacią wyraźnej warstwy chondroblastów, ułożonych pod mankietem ochrzęstnej. Pozostałe odcinki chrząstki nie wykazywały zmian zwyrodnieniowych, chondrocyty zawierały jądra komórkowe, a układ izogeniczny tych komórek był prawidłowo zachowany (Ryc. 7). 2. Analiza statystyczna wybranych elementów obrazu histologicznego implantów polimerowych PLG i PLG-Hyal Analiza statystyczna obejmowała ocenę półilościową, rangową obfitości nacieku zapalnego, obecności komórek resorpcyjnych wielojądrowych, włóknienia oraz waskularyzacji zmian. Z tego też powodu posłużono się statystyką nieparametryczną. Wyniki statystyki opisowej, porównań oraz analizy korelacji zestawiono w poniższych tabelach. Zaobserwowano istotny spadek intensywności nacieku zapalnego pomiędzy analizowanymi grupami badanych polimerów w 4 tygodniu obserwacji. Grupa modyfikowanego polimeru, PLG-Hyal wskazywała na wysoce istotną zależność spadku obfitości nacieku zapalnego wraz z czasem, aczkolwiek szybsze zmniejszanie się nacieku zapalnego stwierdzano w grupie PLG przy zastosowaniu analizy korelacji (tab. I). Zaobserwowano istotny spadek ilości O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
komórek resorpcyjnych wielojądrzastych pomiędzy analizowanymi grupami badanymi. Analiza korelacji wskazała na nieznamienność zależności obfitości tych komórek od czasu, aczkolwiek proces nieco szybszy zachodził w przypadku PLG-Hyal (tab. II). Jedynie w pierwszym tygodniu obserwacji stwierdzono istotną statystycznie zależność wskazującą na wyższe nasilenie włóknienia w grupie PLG-Hyal. Oba z implantowanych polimerów wykazują znamienną statystycznie korelację pomiędzy czasem obserwacji a włóknieniem, przy czym nieco szybszy proces włóknienia stwierdza się w grupie PLG (tab. III). Waskularyzacja blizny powstającej w okolicy implantowanego polimeru nie wykazywała istotnych statystycznie różnic. Oba z badanych polimerów wykazują znamienną i silną zależność pomiędzy powstawaniem młodych naczyń dokoła ziarniniaków resorpcyjnych a czasem obserwacji (tab. IV). 3. Ocena makroskopowa biomateriału W całym okresie obserwacji zwierząt stwierdzono makroskopowo prawidłowy proces wgajania obu biomateriałów polimerowych w tkankę chrzęstną małżowiny usznej królików. Począwszy od pierwszego tygodnia od zabiegu operacyjnego obserwowano dobre wrastanie obu materiałów w miejsce ubytku tkanki chrzęstnej oraz zmianę barwy i struktury ich powierzchni. W przypadku PLG obserwowano większą chropowatość i nierówność powierzchni materiału oraz zmianę zabarwienia z białej na szarożółtą w odróżnieniu od gładkiej i białej powierzchni PLG-Hyal, wykazującego makroskopowo o wiele większe podobieństwo do tkanki chrzęstnej. Stwierdzono całkowite wypełnienie ubytku tkanki chrzęstnej przez oba biomateriały polimerowe, brak cech stanu zapalnego i martwicy wokół rany pooperacyjnej przez cały okres obserwacji zwierząt.
Dyskusja Od wielu lat prowadzone są prace nad możliwością zastąpienia tkanki chrzęstnej materiałem syntetycznym. W przeprowadzonych badaniach własnych wykorzystano dwa rodzaje biomateriałów resorbowalnych: kopolimer L-laktydu z glikolidem (PLG) oraz PLG modyfikowany kwasem hialuronowym (PLG-Hyal). Materiały te zostały zmodyfikowane w zakresie mikrostruktury i chemicznej budowy powierzchni w taki sposób, aby nadać im właściwości chondrogenne, podtrzymujące adhezję chondrocytów i dobrą integrację z tkankami otaczającymi. Właściwości biologiczne i cechy mechaniczne zastosowanych w eksperymencie biomateriałów pozwalają przypuszczać, iż mogłyby one w skuteczny sposób zastąpić rusztowanie chrzęstne przegrody nosa. W okresie obserwacji 12 tygodni od zabiegu u żadnego ze zwierząt nie odnotowano cech nasilonego odczynu zapalnego. Podobnie wskazywały doniesienia, w których badano materiał akrylowy w połączeniu z kwasem poligliko-
69
70
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela I. Nasilenie nacieku zapalnego dokoła implantowanego polimeru. GRUPA
Średnia
Liczba przypadków
Mediana
Minimum
Maksimum
kwartyl dolny
kwartyl górny
Odchylenie standardowe
Naciek zapalny PLG 1 tydzień
5
5
5
5
5
5
5
0
PLG-Hyal 1 tydzień
4,6
5
5
4
5
4
5
0,55
Znamienność
p=0,133; p>0,05 NS
PLG 4 tydzień
5
5
5
5
5
5
5
0
PLG-Hyal 4 tydzień
4,4
5
4
4
5
4
5
0,55
Znamienność
p=0,049; p<0,05 S
PLG 12 tydzień
4,4
5
4
4
5
4
5
0,55
PLG-Hyal 12 tydzień
4
5
4
4
4
4
4
0
kwartyl dolny
kwartyl górny
Odchylenie standardowe
Znamienność
p=0,133; p>0,05 NS
Tabela II. Obecność komórek resorpcyjnych wielojądrzastych dokoła implantowanego polimeru. GRUPA
Średnia
Liczba Przypadków
Mediana
Minimum
Maksimum
Komórki wielojądrzaste PLG 1 tydzień
0
5
0
0
0
0
0
0
PLG-Hyal 1 tydzień
0
5
0
0
0
0
0
0
Znamienność
p=1,0; p>0,05 NS
PLG 4 tydzień
3,6
5
4
3
4
3
4
0,55
PLG-Hyal 4 tydzień
3,4
5
3
3
4
3
4
0,55
0,55
Znamienność
p=0,54; p>0,05 NS
PLG 12 tydzień
3,4
5
3
3
4
3
4
PLG-Hyal 12 tydzień
3
5
3
3
3
3
3
Znamienność
p=0,133; p>0,05 NS
lowym oraz poli-L-laktydem, stanowiącym stabilne rusztowanie dla hodowli chondrocytów. Wykazano niewielki odczyn zapalny materiału akrylowego w bezpośrednim kontakcie z otaczającą tkanką [6]. Analiza histologiczna preparatów wykazała, iż tkanki
otaczające implantowane polimery charakteryzowały typowe sekwencje bliznowacenia, włącznie z odczynem zapalnym, zaś polimer modyfikowany kwasem hialuronowym wyraźnie przyśpieszał proces resorpcji i powstawanie blizny. O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela III. Nasilenie włóknienia dokoła implantowanego polimeru. GRUPA
Średnia
Liczba przypadków
Mediana
Minimum
Maksimum
kwartyl dolny
kwartyl górny
Odchylenie standardowe
Włóknienie PLG 1 tydzień
0
5
0
0
0
0
0
-
PLG-Hyal 1 tydzień
0,6
5
1
0
1
0
1
0,55
Znamienność
p=0,04; p<0,05 S
PLG 4 tydzień
0,4
5
0
0
1
0
1
0,55
PLG-Hyal 4 tydzień
0,6
5
1
0
1
0
1
0,55
Znamienność
p=0,54; p>0,05 NS
PLG 12 tydzień
0,6
5
1
0
1
0
1
0,55
PLG-Hyal 12 tydzień
1,2
5
1
1
2
1
1
0,45
Maksimum
kwartyl dolny
kwartyl górny
Odchylenie standardowe
Znamienność
p=0,09; p>0,05 NS
Tabela IV. Tworzenie naczyń krwionośnych dokoła implantowanego polimeru. GRUPA
Średnia
Liczba przypadków
Mediana
Minimum Unaczynienie
PLG 1 tydzień
0,4
5
0
0
1
0
1
0,55
PLG-Hyal 1 tydzień
0,6
5
1
0
1
0
1
0,55
Znamienność
p=0,54; p>0,05 NS
PLG 4 tydzień
0,4
5
0
0
1
0
1
0,55
PLG-Hyal 4 tydzień
0,8
5
1
0
1
1
1
0,45
Znamienność
p=0,22; p>0,05 NS
PLG 12 tydzień
1
5
1
1
1
1
1
PLG-Hyal 12 tydzień
1,4
5
1
1
2
1
2
Znamienność
0,55
p=0,13; p>0,05 NS
Podobne wyniki uzyskali Haisch i wsp., którzy w badaniach in vivo i in vitro proponowali kombinację autologicznych chondrocytów, bioresorbowalnych polimerów (PGLA-PLLA) oraz kleju fibrynowego. Wykazali, iż klej fibrynowy w przeciwieństwie do struktury żelu O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
(np. agar) charakteryzuje się dużą biokompatybilnością i opornością na infekcje, jednak nie gwarantuje morfologicznej stabilizacji podczas procesu hodowli in vitro. Jednak w połączeniu z powierzchnią polimeru inicjuje dystrybucję homogennych komórek chrzęstnych [7].
71
72
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS W badaniach własnych zaobserwowano szybsze ustępowanie zmian zapalnych w pobliżu implantu PLG-Hyal. Może to być związane z przyspieszeniem procesu resorpcji oraz angiogenezy [8, 9]. Sam kwas hialuronowy uznany jest także za regulator procesu zapalnego. Jego forma wielkocząsteczkowa hamuje odczyny zapalne, z kolei postać drobnocząsteczkowa nasila proces zapalny [10]. Podsumowując, ocena własna obydwu materiałów polimerowych PLG i PLG-Hyal wykazała, iż w jednakowym stopniu pozwalają one na odtworzenie chrząstki, stanowiąc dobry materiał implantacyjny w rekonstrukcji ubytków tkanki chrzęstnej w obrębie twarzoczaszki.
4.
PIŚMIENNICTWO
8.
Puelacher WC, Mooney D, Langer R, Upton J, Vacanti JP, Vacanti CA. Design of nasoseptal cartilage replacements synthesized from biodegradable polymers and chondrocytes. Biomaterials 1994; 15(10): 774-778.
5.
Gugala Z, Gogolewski S. Differentiation, growth and activity of rat bone marrow stromal cells on resorbable poly (L/DL-lactide) membranes. Biomaterials 2004; 25: 22992307.
6.
Kamil SH, Kojima K, Vacanti MP et al. In vitro tissue engineering to generate a human-sized auricle and nasal tip. Laryngoscope 2003; 113: 90-94.
7.
Haisch A, Klaring S, Groger A, Gebert Ch, Sittinger M. A tissue-engineering model for the manufacture of auricular-shaped cartilage implants. Eur Arch Otorhinolaryngol 2002; 259: 316-321.
1.
2.
ro S, Ribatti D. Accelerated wound healing of oral soft tis-
A tissue-engineering model for the manufacture of auricu-
sues and angiogenic effect induced by a pool of aminoa-
lar-shaped cartilage implants. Eur Arch Otorhinolaryngol
cids combined to sodium hyaluronate (AMINOGAMregister
2002; 259: 316-321.
mark or target). J Biol Regul Homeost Agents 2008; 22(2): 109-116.
Leiggener ChS, Curtis R, Muller AA, Pfluger D, Gogolewski S, Rahn BA. Influence of copolymer composition of polyactide implants on cranial bone regeneration. Biomaterials 2006; 27: 202-207.
3.
Favia G, Mariggio MA, Maiorano F, Cassano A, Capodifer-
Haisch A, Klaring S, Groger A, Gebert Ch, Sittinger M.
9.
Ibrahim S, Ramamurthi A. Hyaluronic acid cues for functional endothelialization of vascular constructs. J Tissue Eng Regen Med 2008; 2(1): 22-32.
Ma Z, Gao Ch, Gong Y, Shen J. Chondrocyte behaviors on
10. Krasiński R, Tchórzewski H. Hialuronian jako czynnik re-
poly-L-lactic acid (PLLA) membranes containing hydroxyl,
gulujący proces zapalenia. Post Hig Med Dośw 2007; 61:
amide or carboxyl groups. Biomaterials 2003; 24: 3725-
683-689.
3730.
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Rekonstrukcja tkanki chrzęstnej biomateriałami polimerowymi – wczesne wyniki makroskopowe i histologiczne Cartilage tissue reconstruction by the polymer biomaterials – early macroscopic and histological results Wojciech Ścierski, Aleksandra Polok, Grzegorz Namysłowski, Jerzy Nożyński1, Lucyna Turecka, Natalia Urbaniec, Elżbieta Pamuła 2
Otolaryngol Pol 2009; 63 (7 ): 64-72
SUMMARY Introduction: The surgical treatment of large cartilage defects in the region of head and neck is often impossible because of the atrophy of surrounding tissues and lack of suitable material for reconstruction. In the surgical treatment many of methods and reconstructive materials have been used. For many years the suitable synthetic material for the cartilage defects reconstruction has been searched for. The aim of the study: was to evaluate two different biomaterials with proper mechanical and biological features for the cartilage replacement. Material and methods: Two type of biomaterials in this study were used: resorbable polymer - poly(L-lactide-co-glycolide) (PLG) acting as a supportive matrix. A thin layer of sodium hyaluronate (Hyal) was also deposited on the surface as well in the pore walls of PLG scaffolds in order to provide biologically active molecules promoting differentiation and regeneration of the tissue. The studies were performed on the 50 animals – rabbits divided into 2 groups. The animals were operated in the general anaesthesia. The incision was done along the edge of the rabbit’s auricle. Perichondrium and cartilage of the auricle on the surface 4 x 3 cm were prepared. Subperichondrically 1 x 1 cm fragment of the cartilage was removed by the scissors. This fragment was then replaced by the biomaterials: PLG in first group of 25 rabbits and PLG-Hyal in second group 25 rabbits. The tissues were sutured with polyglycolide Safil® 3-0. The animals obtained Enrofloxacin® for three days after the operation. Then 1, 4 and 12 weeks after the surgery the animals were painlessly euthanized by an overdose of Morbital®. Implants and surrounding tissues were excised and observed macroscopically and using an optical microscope. Results: In all the observation periods we observed proper macroscopic healing process of biomaterials. We didn’t stated strong infl ammatory process and necrosis around the implanted biomaterials. Conclusions: The histological and macroscopic examinations indicated that both materials developed in this study have properties similar to cartilaginous tissue and seem to be good for her restoration. Although the quickest tissue regeneration was found after implantation of PLG-Hyal.
©by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów Głowy i Szyi Otrzymano/Received: 02.06.2009 Zaakceptowano do druku/Accepted: 22.06.2009 Katedra i Oddział Kliniczny Laryngologii w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. med. Grzegorz Namysłowski 1 Pracownia Histopatologii Śląskiego Centrum Chorób Serca w Zabrzu Kierownik: dr med. Jerzy Nożyński 2 Katedra Biomateriałów Akademii GórniczoHutniczej w Krakowie Kierownik: Prof. dr hab. inż. Stanisław Błażewicz Wkład pracy autorów/Authors contribution: Wojciech Ścierski – opracowanie koncepcji pracy, eksperyment zwierzęcy, Aleksander Polok – opracowanie koncepcji pracy, eksperyment zwierzęcy, Grzegorz Namysłowski – opracowanie koncepcji pracy, Jerzy Nożyński – badanie histopatologiczne, Lucyna Turecka – udział w redagowaniu publkacji, Natalia Urbaniec – udział w redagowaniu pracy. Konflikt interesu/Conflicts of interest: Autorzy pracy nie zgłaszają konfliktu interesów. Adres do korespondencji/ Address for correspondence: imię i nazwisko: Wojciech Ścierski adres pocztowy: Katedra i Oddział Kliniczny Laryngologii Śląskiego UM w Zabrzu ul. Skłodowskiej-Curie 10 41-800 Zabrze tel. 32 271 74 20 e-mail [email protected]
Hasła indeksowe: rekonstrukcja tkanki chrzęstnej, materiały syntetyczne, kopolimer glikolidu i L-laktydu (PLG), kwas hialuronowy Key words: Cartilage tissue reconstruction, synthetic biomaterials, poly (glycolide-co-L-lactide) PGLA, hyaluronic acid (Hyal).
Wprowadzenie Tkanka chrzęstna pojawia się u zarodka w 5 tygodniu życia i występuje u dorosłego człowieka pod postacią tkanki chrząstkowej (chondroidalnej) oraz chrząstki. Wyróżniamy różne odmiany chrząstki, takie jak: miąższowa, włóknista, sprężysta oraz najbardziej zróżnicowana chrząstka szklista. Wszystkie rodzaje chrząstki rozwijają się na podłożu mezenchymy,
a na ich budowę duży wpływ wywierają czynniki mechaniczne. Rekonstrukcja ubytków tkanki chrzęstnej w obrębie narządów głowy i szyi takich jak tchawica, krtań, ucho zewnętrzne oraz przegroda nosa stanowi nadal duży problem zarówno dla otolaryngologów jak i chirurgów plastycznych. Do dnia dzisiejszego nie znaleziono O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS ani idealnej metody leczenia chirurgicznego ubytków i perforacji chrząstki, ani odpowiedniego biomateriału, którym można by ją zastąpić. W dostępnej literaturze istnieje szereg doniesień na temat prób zastosowania resorbowalnego kopolimeru laktydu i glikolidu (PLG) należącego do grupy poliestrów alifatycznych oraz kwasu hialuronowego w rekonstrukcji tkanki chrzęstnej [1–5]. Wykorzystano doskonałe właściwości mechaniczne tych biomateriałów, łatwość ich modyfikowania oraz biokompatybilność idealnie korelującą ze strukturą chemiczną chondrocytów. Prowadzono badania nad wykorzystaniem PLG w rekonstrukcji ubytków tkanki chrzęstnej w obrębie głowy i szyi (leczenie ubytków i złamań kości czaszki, rekonstrukcje podczas operacji uszu, operacje plastyczne w zakresie twarzoczaszki), a także w procesie osteogenezy w ortopedii oraz chirurgii szczękowo-twarzowej. Eksperymenty przeprowadzano na zwierzętach (myszy, szczury, króliki, owce) a ich wyniki nie były w pełni zadowalające. Brak informacji o wykorzystaniu PLG i jego kompozycji z kwasem hialuronowym (PLGHyal) w chirurgii rekonstrukcyjnej małżowiny usznej i nosa skłoniły autorów do przeprowadzenia własnych badań w tym zakresie. Pomimo stosowania różnych metod operacyjnych i materiałów w rekonstrukcji ubytków przegrody nosa, jak dotąd nie znaleziono idealnego rozwiązania. Wykorzystywanie tkanek własnych z najbliższego otoczenia (małżowina nosowa dolna, boczna ściana nosa) związane jest z dużymi ograniczeniami i niewielkim odsetkiem powodzeń. Zastosowanie materiałów syntetycznych nie przyniosło dotychczas spodziewanych efektów. Wciąż zatem poszukuje się materiału, który byłby skuteczny w odbudowie brakującego chrzęstnego fragmentu przegrody nosa. Materiał ten poza odpowiednimi cechami biologicznymi musi spełniać określone właściwości fizykomechaniczne upodabniające go do tkanki chrzęstnej przegrody nosa. Celem podjętych badań była ocena kliniczna zmodyfikowanych biomateriałów polimerowych (PLG i PLG-Hyal) w eksperymentalnej rekonstrukcji ubytków tkanki chrzęstnej oraz ocena histologiczna tkanek otaczających implantowane biomateriały.
Materiał i metodyka 1. Biomateriały do rekonstrukcji tkanki chrzęstnej Do badań wykorzystane zostały dwa rodzaje biomateriałów: resorbowalny kopolimer L-laktydu z glikolidem (PLG) zawierający 85% mol L-laktydu i 15% mol glikolidu (PAN Zabrze) oraz kopolimer L-laktydu z glikolidem modyfikowany kwasem hialuronowym (PLG-Hyal). Materiały te przetworzono do postaci przestrzennych gąbek z wykorzystaniem substancji porotwórczej – chlorku sodu o frakcji ziarnowej 250–320 μm (POCh, Gliwice) (ryc. 1). Próbki przygotowywano w następujący sposób: do roztworu PLG w chlorku metylenu O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
dodawano odpowiednią ilość chlorku sodu, tak, aby udział objętościowy porogenu wynosił 85%. Następnie mieszaninę homogenizowano, odlewano do szalki Petriego, suszono i umieszczano w wodzie destylowanej w celu wypłukania soli. Próbki PLG-Hyal otrzymano poprzez ciekłą impregnację pod ciśnieniem gąbek PLG roztworem kwasu hialuronowego. Następnie próbki wysuszono w suszarce próżniowej. Oba materiały zostały wyjałowione za pomocą plazmy nadtlenku wodoru (Sterrad 120, ASP, Johnson&Johnson). Biomateriały przygotowywano pod postacią pasków o wymiarach 0,5 x 1,0 cm i grubości 2 mm. 2. Eksperyment zwierzęcy Eksperyment zwierzęcy z użyciem biomateriałów został przeprowadzony na 50 królikach rasy Białe Nowozelandzkie, pochodzących z hodowli konwencjonalnej, ze stada własnego Centralnej Zwierzętarni Doświadczalnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Ze względu na dobry dostęp operacyjny materiały implantacyjne wszczepione zostały w chrząstkę małżowiny usznej, która wykazuje bardzo duże podobieństwo do elementów chrzęstnych przegrody nosa. Zwierzęta operowano w znieczuleniu ogólnym. Z cięcia wzdłuż brzegu małżowiny usznej królika wypreparowywano płat skórno-ochrzęstnowy i odsłaniano chrząstkę na powierzchni 4 x 3 cm. Podochrzęstnowo usuwano fragment chrząstki małżowiny o wymiarach 1 x 1 cm, który następnie uzupełniano przy pomocy biomateriału. 50 zwierząt doświadczalnych podzielono na dwie grupy. W grupie pierwszej 25 zwierząt ubytek chrzęstny małżowiny uzupełniono za pomocą PLG. W grupie drugiej 25 zwierząt ten sam ubytek uzupełniono przy pomocy PLG zmodyfikowanego kwasem hialuronowym. Po rekonstrukcji ubytku chrzęstnego przykładano na niego płaty skórno-ochrzęstnowe, a ranę szyto dwoma lub trzema szwami resorbowalnymi z poliglikolidu (3-0). Zwierzęta zostały poddane eutanazji po 1, 4 i 12 tygodniach obserwacji, za pomocą preparatu Morbital® w dawce 200 mg/kg masy ciała dosercowo, poprzedzonego w premedykacji podaniem Domitoru® z Ketaminą. Do badań pobierano całą małżowinę uszną wraz z implantowanym biomateriałem. Badając proces gojenia dokonano oceny makroskopowej i histologicznej. Preparaty pochodzące z miejsc implantacji utrwalano w 4% zbuforowanej formalinie, poddawano je rutynowej obróbce histologicznej, barwiono rutynowo Hematoksyliną i Eozyną. Oceniono zarówno biomateriały jak i otaczającą tkankę chrzęstną małżowiny usznej. Badania histologiczne zostały przeprowadzone w Akademii Górniczo-Hutniczej w Krakowie oraz w Pracowni Histopatologicznej Śląskiego Centrum Chorób Serca w Zabrzu. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Etycznej do spraw Doświadczeń na Zwierzętach ŚUM w Katowicach (nr zgody 17/2007 z dnia 21 lutego 2007 roku).
65
66
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
1
2
Ryc. 1. Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu elektronowego skaningowego gąbek PLG i PLG-Hyal.
3. Analiza statystyczna Analiza statystyczna zmian mikroskopowych obejmowała ocenę półilościową, rangową obfitości nacieku zapalnego, obecności komórek resorpcyjnych wielojądrowych, włóknienia oraz waskularyzacji. Nasilenie zmian ustalano w skali umownej, gdzie: 0 – oznaczało brak danej zmiany, 1 – zmianę nieznaczną, 2 – występowanie częstsze, 3 – występowanie umiarkowanie nasilone, 4 – zmianę bardzo wyraźną, 5 – zmianę dominującą w obrazie. Oceniono statystykę opisową każdej z grup czasowych porównywanych ze sobą. Właściwą wartością przeciętną jest mediana. Porównania wzajemne przeprowadzono z użyciem testu nieparametrycznego Manna-Whitneya. Przeprowadzono też analizę korelacji testem Spearmana, w której oceniono współzależność obserwowanych zmian z czasem obserwacji, upływającym od implantacji każdego z polimerów. Oceniono siłę korelacji na podstawie wartości i znaku współczynnika r Spearmana oraz znamienność tej zależności. Za wynik znamienny przyjęto prawdopodobieństwo p mniejsze lub równe 0,05. Obliczenia statystyczne przeprowadzono z wykorzystaniem pakietu Statistica 99.
Wyniki i ich omówienie U żadnego z królików nie wystąpiły powikłania związane z operacją i znieczuleniem. Proces gojenia rany był podobny u wszystkich zwierząt. We wszystkich przypadkach przez pierwsze 10 dni obserwowano umiarkowany obrzęk w okolicach cięcia małżowiny usznej bez objawów nasilonego stanu zapalnego. Zauważano jedynie niewielkie symetryczne zgrubienie brzegów rany, a przy obmacywaniu nie wyczuwano
chełbotania mogącego świadczyć o obecności krwiaka lub wydzielinie przyrannej. Rana skórna goiła się przez rychłozrost do 14 dni od zabiegu operacyjnego. Nieznaczne zgrubienia tkanek w pobliżu cięcia skórnego obserwowano do około dwóch miesięcy od zabiegu operacyjnego. 1. Badania histologiczne implantu 1. Pierwszy tydzień po implantacji Okres pierwszego tygodnia po implantacji polimeru PLG wykazywał obfity naciek zapalny, w którym dominowały liczne makrofagi i rozproszone limfocyty. Naczynia krwionośne były nieliczne, z reguły słabo widoczne wśród obfitego nacieku. Naciek idąc obwodowo tracił swoją obfitość na korzyść wydłużonych fibroblastów oraz słabo widocznych włókien kolagenowych, tworzących jego torebkę. Chrząstka w okolicy implantu nie wykazywała zmian wstecznych oraz zapalnych, zachowując prawidłową barwliwość istoty pozakomórkowej i typowy układ chondrocytów (Ryc. 2). Implantacja drugiego z badanych materiałów PLG-Hyal, wykazywała żywszy odczyn zapalny, z liczniejszymi limfocytami, domieszką makrofagów oraz licznymi poszerzonymi naczyniami kapilarnymi, sugerując ostry stan zapalny. Torebka łącznotkankowa obfitowała w fibroblasty z nieznaczną domieszką nacieku zapalnego. Zauważano także pojedyncze komórki wielojądrowe. Chrząstka, pomimo istnienia ostrego odczynu zapalnego nie wykazywała zmian (Ryc. 3). 2. Czwarty tydzień po implantacji Czwarty tydzień poimplantacyjny PLG wykazywał spadek obfitość i rozrzedzenie nacieku zapalnego, w którym dominującym elementem obrazu były cechy zapalenia resorpcyjnego, z obecnością licznych komórek olbrzymich wielojądrzastych przylegających do resztek O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
1
2
3
Ryc. 2. Implant PLG – 1 tydzień obserwacji: naciek zapalny złożony głównie z makrofagów i limfocytów obejmuje fragmenty polimeru PLG (1). Torebka wokół nacieku z włókien kolagenowych i fibroblastów (2) (pow. 400x). Chrząstka wokół PLG nie wykazuje zmian (3) (pow. 200x). Barwienie HE.
1
2
3
Ryc. 3. Implant PLG-Hyal – 1 tydzień obserwacji: Naciek zapalny składający się z limfocytów i histiocytów, widoczne młode naczynia krwionośne (1) (pow. 400x). Torebka otaczająca ziarninę zapalną z licznymi fi broblastami (2) (pow. 150x). Chrząstka bez zmian patologicznych (3) (pow. 250). Barwienie HE.
1
2
3
Ryc. 4. Implant PLG – 4 tydzień obserwacji. Liczne komórki resorpcyjne wielojądrzaste otaczają fragmenty polimeru. W zrębie widoczny rozproszony naciek limfocytarno-histiocytarny (1). Komórka olbrzymia zawierająca dwójłomne resztki polimeru (2) (pow. 400x). Miejsce nacięcia chrząstki z wytworzeniem blizny z młodej dojrzewającej chrząstki tworzącej strefy izogeniczne (3) (pow. 150x). Barwienie HE.
polimeru. Nadal dostrzegano domieszkę limfocytów. Wewnątrz części komórek olbrzymich dało się zauważyć dwójłomne resztki trawionego polimeru PLG. Chrząstka uszkodzona w okolicy implantacji polimeru ujawniaO t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
ła z kolei cechy regeneracji, zauważano zaburzony układ chondrocytów odpowiadający bliźnie chrzęstnej, z obecnością młodej, słabo zasadochłonnej istoty pozakomórkowej i różnicującym się układem młodych drob-
67
68
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
1
2
3
Ryc. 5. Implant PLG-Hyal - 4 tydzień obserwacji: Liczne ziarniniaki resorpcyjne zawierające komórki olbrzymie wielojądrowe. Włóknienie zrębu. (1) (pow. 200x). Chrząstka o zwiększonej zasadochłonności istoty podstawowej i włóknienie ochrzęstnej. Zwiększona ilość fi broblastów. Obok widoczne ziarniniaki resorpcyjne wokół fi lamentów PLG-Hyal (2,3) (pow. 400x).
1
2
3
Ryc. 6. Implant PLG – 12 tydzień obserwacji: Ziarniniaki resorpcyjne zawierające komórki wielojądrowe otoczone mankietem nacieku limfocytarnego i tkanką łączną (1) (pow. 200x). Apoptotyczny rozpad komórki olbrzymiej (2) (pow. 1000x). Zwłóknienie ochrzęstnej w sąsiedztwie z ziarniną resorpcyjną (3) (pow.50x).
1
2
3
Ryc. 7. Implant PLG-Hyal – 12 tydzień obserwacji: Liczne pobudzone limfocyty. Cytoplazma komórki olbrzymiej zawiera fragmenty polimeru (1) (pow. 600x). Wzmożona zasadochłonność istoty podstawowej chrząstki, resztki (cienie) chondrocytów, brak jąder komórkowych oraz warstwa chondroblastów (2) (pow. 100x). Chrząstka z zachowaną izogenicznością, istota podstawowa wykazuje normochromię, liczne chondrocyty zawierają jądra komórkowe (3) (pow. 200x).
nych chondrocytów w kolumny izogeniczne (Ryc. 4). Czterotygodniowa obserwacja implantów PLG-Hyal wykazywała podobne zmiany. W obrazie mikroskopowym dominowały liczne ziarniniaki resorpcyjne otaczające
resztki polimeru, cechy zapalenia ostrego zanikały, pojawiało się włóknienie zrębu. Chrząstka wykazywała wzrost zasadochłonności istoty podstawowej pozakomórkowej, chondrocyty nie wykazywały zmian wsteczO t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS nych. Natomiast okolica ochrzęstnej zlokalizowana blisko polimerowego implantu i ziarniniaków ulegała włóknieniu, pojawiały się w niej naczynia kapilarne i zwiększała się ilość fibroblastów (Ryc. 5). 3. Dwunasty tydzień po implantacji Dwunasty tydzień po implantacji PLG wykazywał histologiczne zmiany zbliżone do tygodnia czwartego. W obrazie nadal dostrzegano ziarniniaki resorpcyjne zawierające komórki olbrzymie wielojądrowe, ilość limfocytów ulegała zmniejszeniu, zaś w obwodzie ziarniniaków obserwowano zwiększenie się ilości tkanki łącznej. Niektóre z ziarniniaków imitowały odczyn sarkoidalny, w części pozostałych dostrzegany był apoptotyczny rozpad komórek z tworzeniem bezpostaciowych mas zawierających pył chromatynowy z rozpadłych jąder komórkowych. Chrząstka nie wykazywała istotnych zmian, natomiast ochrzęstna w okolicy implantowanego polimeru wykazywała cechy zwłóknienia (Ryc. 6). Implantacja PLG-Hyal wykazywała w dwunastym tygodniu obserwacji zbliżone cechy morfologiczne. Podobnie jak w obserwacjach wcześniejszych, nieliczne komórki olbrzymie ujawniały cytoplazmatyczne dwójłomne fragmenty, mogące odpowiadać fragmentom polimeru. W odróżnieniu od PLG, tkanka łączna wykazywała wzrost liczby fibroblastów, natomiast ilość włókien łącznotkankowych nie wykazywała istotnych zmian. Obrzeże chrząstki ogniskowo wykazywało zmiany zwyrodnieniowe w postaci narastającej bazofilii istoty podstawowej, ogniskowej martwicy chondrocytów z pozostawieniem wzmiankowanych bezjądrowych resztek, przy braku jakiejkolwiek reakcji zapalnej. W okolicy zmian martwiczych zauważalne były również cechy regeneracji chrząstki pod postacią wyraźnej warstwy chondroblastów, ułożonych pod mankietem ochrzęstnej. Pozostałe odcinki chrząstki nie wykazywały zmian zwyrodnieniowych, chondrocyty zawierały jądra komórkowe, a układ izogeniczny tych komórek był prawidłowo zachowany (Ryc. 7). 2. Analiza statystyczna wybranych elementów obrazu histologicznego implantów polimerowych PLG i PLG-Hyal Analiza statystyczna obejmowała ocenę półilościową, rangową obfitości nacieku zapalnego, obecności komórek resorpcyjnych wielojądrowych, włóknienia oraz waskularyzacji zmian. Z tego też powodu posłużono się statystyką nieparametryczną. Wyniki statystyki opisowej, porównań oraz analizy korelacji zestawiono w poniższych tabelach. Zaobserwowano istotny spadek intensywności nacieku zapalnego pomiędzy analizowanymi grupami badanych polimerów w 4 tygodniu obserwacji. Grupa modyfikowanego polimeru, PLG-Hyal wskazywała na wysoce istotną zależność spadku obfitości nacieku zapalnego wraz z czasem, aczkolwiek szybsze zmniejszanie się nacieku zapalnego stwierdzano w grupie PLG przy zastosowaniu analizy korelacji (tab. I). Zaobserwowano istotny spadek ilości O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
komórek resorpcyjnych wielojądrzastych pomiędzy analizowanymi grupami badanymi. Analiza korelacji wskazała na nieznamienność zależności obfitości tych komórek od czasu, aczkolwiek proces nieco szybszy zachodził w przypadku PLG-Hyal (tab. II). Jedynie w pierwszym tygodniu obserwacji stwierdzono istotną statystycznie zależność wskazującą na wyższe nasilenie włóknienia w grupie PLG-Hyal. Oba z implantowanych polimerów wykazują znamienną statystycznie korelację pomiędzy czasem obserwacji a włóknieniem, przy czym nieco szybszy proces włóknienia stwierdza się w grupie PLG (tab. III). Waskularyzacja blizny powstającej w okolicy implantowanego polimeru nie wykazywała istotnych statystycznie różnic. Oba z badanych polimerów wykazują znamienną i silną zależność pomiędzy powstawaniem młodych naczyń dokoła ziarniniaków resorpcyjnych a czasem obserwacji (tab. IV). 3. Ocena makroskopowa biomateriału W całym okresie obserwacji zwierząt stwierdzono makroskopowo prawidłowy proces wgajania obu biomateriałów polimerowych w tkankę chrzęstną małżowiny usznej królików. Począwszy od pierwszego tygodnia od zabiegu operacyjnego obserwowano dobre wrastanie obu materiałów w miejsce ubytku tkanki chrzęstnej oraz zmianę barwy i struktury ich powierzchni. W przypadku PLG obserwowano większą chropowatość i nierówność powierzchni materiału oraz zmianę zabarwienia z białej na szarożółtą w odróżnieniu od gładkiej i białej powierzchni PLG-Hyal, wykazującego makroskopowo o wiele większe podobieństwo do tkanki chrzęstnej. Stwierdzono całkowite wypełnienie ubytku tkanki chrzęstnej przez oba biomateriały polimerowe, brak cech stanu zapalnego i martwicy wokół rany pooperacyjnej przez cały okres obserwacji zwierząt.
Dyskusja Od wielu lat prowadzone są prace nad możliwością zastąpienia tkanki chrzęstnej materiałem syntetycznym. W przeprowadzonych badaniach własnych wykorzystano dwa rodzaje biomateriałów resorbowalnych: kopolimer L-laktydu z glikolidem (PLG) oraz PLG modyfikowany kwasem hialuronowym (PLG-Hyal). Materiały te zostały zmodyfikowane w zakresie mikrostruktury i chemicznej budowy powierzchni w taki sposób, aby nadać im właściwości chondrogenne, podtrzymujące adhezję chondrocytów i dobrą integrację z tkankami otaczającymi. Właściwości biologiczne i cechy mechaniczne zastosowanych w eksperymencie biomateriałów pozwalają przypuszczać, iż mogłyby one w skuteczny sposób zastąpić rusztowanie chrzęstne przegrody nosa. W okresie obserwacji 12 tygodni od zabiegu u żadnego ze zwierząt nie odnotowano cech nasilonego odczynu zapalnego. Podobnie wskazywały doniesienia, w których badano materiał akrylowy w połączeniu z kwasem poligliko-
69
70
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela I. Nasilenie nacieku zapalnego dokoła implantowanego polimeru. GRUPA
Średnia
Liczba przypadków
Mediana
Minimum
Maksimum
kwartyl dolny
kwartyl górny
Odchylenie standardowe
Naciek zapalny PLG 1 tydzień
5
5
5
5
5
5
5
0
PLG-Hyal 1 tydzień
4,6
5
5
4
5
4
5
0,55
Znamienność
p=0,133; p>0,05 NS
PLG 4 tydzień
5
5
5
5
5
5
5
0
PLG-Hyal 4 tydzień
4,4
5
4
4
5
4
5
0,55
Znamienność
p=0,049; p<0,05 S
PLG 12 tydzień
4,4
5
4
4
5
4
5
0,55
PLG-Hyal 12 tydzień
4
5
4
4
4
4
4
0
kwartyl dolny
kwartyl górny
Odchylenie standardowe
Znamienność
p=0,133; p>0,05 NS
Tabela II. Obecność komórek resorpcyjnych wielojądrzastych dokoła implantowanego polimeru. GRUPA
Średnia
Liczba Przypadków
Mediana
Minimum
Maksimum
Komórki wielojądrzaste PLG 1 tydzień
0
5
0
0
0
0
0
0
PLG-Hyal 1 tydzień
0
5
0
0
0
0
0
0
Znamienność
p=1,0; p>0,05 NS
PLG 4 tydzień
3,6
5
4
3
4
3
4
0,55
PLG-Hyal 4 tydzień
3,4
5
3
3
4
3
4
0,55
0,55
Znamienność
p=0,54; p>0,05 NS
PLG 12 tydzień
3,4
5
3
3
4
3
4
PLG-Hyal 12 tydzień
3
5
3
3
3
3
3
Znamienność
p=0,133; p>0,05 NS
lowym oraz poli-L-laktydem, stanowiącym stabilne rusztowanie dla hodowli chondrocytów. Wykazano niewielki odczyn zapalny materiału akrylowego w bezpośrednim kontakcie z otaczającą tkanką [6]. Analiza histologiczna preparatów wykazała, iż tkanki
otaczające implantowane polimery charakteryzowały typowe sekwencje bliznowacenia, włącznie z odczynem zapalnym, zaś polimer modyfikowany kwasem hialuronowym wyraźnie przyśpieszał proces resorpcji i powstawanie blizny. O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela III. Nasilenie włóknienia dokoła implantowanego polimeru. GRUPA
Średnia
Liczba przypadków
Mediana
Minimum
Maksimum
kwartyl dolny
kwartyl górny
Odchylenie standardowe
Włóknienie PLG 1 tydzień
0
5
0
0
0
0
0
-
PLG-Hyal 1 tydzień
0,6
5
1
0
1
0
1
0,55
Znamienność
p=0,04; p<0,05 S
PLG 4 tydzień
0,4
5
0
0
1
0
1
0,55
PLG-Hyal 4 tydzień
0,6
5
1
0
1
0
1
0,55
Znamienność
p=0,54; p>0,05 NS
PLG 12 tydzień
0,6
5
1
0
1
0
1
0,55
PLG-Hyal 12 tydzień
1,2
5
1
1
2
1
1
0,45
Maksimum
kwartyl dolny
kwartyl górny
Odchylenie standardowe
Znamienność
p=0,09; p>0,05 NS
Tabela IV. Tworzenie naczyń krwionośnych dokoła implantowanego polimeru. GRUPA
Średnia
Liczba przypadków
Mediana
Minimum Unaczynienie
PLG 1 tydzień
0,4
5
0
0
1
0
1
0,55
PLG-Hyal 1 tydzień
0,6
5
1
0
1
0
1
0,55
Znamienność
p=0,54; p>0,05 NS
PLG 4 tydzień
0,4
5
0
0
1
0
1
0,55
PLG-Hyal 4 tydzień
0,8
5
1
0
1
1
1
0,45
Znamienność
p=0,22; p>0,05 NS
PLG 12 tydzień
1
5
1
1
1
1
1
PLG-Hyal 12 tydzień
1,4
5
1
1
2
1
2
Znamienność
0,55
p=0,13; p>0,05 NS
Podobne wyniki uzyskali Haisch i wsp., którzy w badaniach in vivo i in vitro proponowali kombinację autologicznych chondrocytów, bioresorbowalnych polimerów (PGLA-PLLA) oraz kleju fibrynowego. Wykazali, iż klej fibrynowy w przeciwieństwie do struktury żelu O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
(np. agar) charakteryzuje się dużą biokompatybilnością i opornością na infekcje, jednak nie gwarantuje morfologicznej stabilizacji podczas procesu hodowli in vitro. Jednak w połączeniu z powierzchnią polimeru inicjuje dystrybucję homogennych komórek chrzęstnych [7].
71
72
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS W badaniach własnych zaobserwowano szybsze ustępowanie zmian zapalnych w pobliżu implantu PLG-Hyal. Może to być związane z przyspieszeniem procesu resorpcji oraz angiogenezy [8, 9]. Sam kwas hialuronowy uznany jest także za regulator procesu zapalnego. Jego forma wielkocząsteczkowa hamuje odczyny zapalne, z kolei postać drobnocząsteczkowa nasila proces zapalny [10]. Podsumowując, ocena własna obydwu materiałów polimerowych PLG i PLG-Hyal wykazała, iż w jednakowym stopniu pozwalają one na odtworzenie chrząstki, stanowiąc dobry materiał implantacyjny w rekonstrukcji ubytków tkanki chrzęstnej w obrębie twarzoczaszki.
4.
PIŚMIENNICTWO
8.
Puelacher WC, Mooney D, Langer R, Upton J, Vacanti JP, Vacanti CA. Design of nasoseptal cartilage replacements synthesized from biodegradable polymers and chondrocytes. Biomaterials 1994; 15(10): 774-778.
5.
Gugala Z, Gogolewski S. Differentiation, growth and activity of rat bone marrow stromal cells on resorbable poly (L/DL-lactide) membranes. Biomaterials 2004; 25: 22992307.
6.
Kamil SH, Kojima K, Vacanti MP et al. In vitro tissue engineering to generate a human-sized auricle and nasal tip. Laryngoscope 2003; 113: 90-94.
7.
Haisch A, Klaring S, Groger A, Gebert Ch, Sittinger M. A tissue-engineering model for the manufacture of auricular-shaped cartilage implants. Eur Arch Otorhinolaryngol 2002; 259: 316-321.
1.
2.
ro S, Ribatti D. Accelerated wound healing of oral soft tis-
A tissue-engineering model for the manufacture of auricu-
sues and angiogenic effect induced by a pool of aminoa-
lar-shaped cartilage implants. Eur Arch Otorhinolaryngol
cids combined to sodium hyaluronate (AMINOGAMregister
2002; 259: 316-321.
mark or target). J Biol Regul Homeost Agents 2008; 22(2): 109-116.
Leiggener ChS, Curtis R, Muller AA, Pfluger D, Gogolewski S, Rahn BA. Influence of copolymer composition of polyactide implants on cranial bone regeneration. Biomaterials 2006; 27: 202-207.
3.
Favia G, Mariggio MA, Maiorano F, Cassano A, Capodifer-
Haisch A, Klaring S, Groger A, Gebert Ch, Sittinger M.
9.
Ibrahim S, Ramamurthi A. Hyaluronic acid cues for functional endothelialization of vascular constructs. J Tissue Eng Regen Med 2008; 2(1): 22-32.
Ma Z, Gao Ch, Gong Y, Shen J. Chondrocyte behaviors on
10. Krasiński R, Tchórzewski H. Hialuronian jako czynnik re-
poly-L-lactic acid (PLLA) membranes containing hydroxyl,
gulujący proces zapalenia. Post Hig Med Dośw 2007; 61:
amide or carboxyl groups. Biomaterials 2003; 24: 3725-
683-689.
3730.
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9