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Relación entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación de los concentrados de hematíes
Rev Esp Anestesiol Reanim. 2012;59(6):315---320
Revista Española de Anestesiología y Reanimación www.elsevier.es/redar
ORIGINAL
Relación entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación de los concentrados de hematíes夽 M.A. Palomero Rodríguez a,∗ , R. García Navas b,c , Y. Laporta Báez d , D. Al Kassam Martínez e , J. de Vicente Sánchez d , L.M. Cacharro Moras b , P. Sánchez Conde a , F. Mollinedo b y C. Muriel Villoria a a
Servicio de Anestesiología y Reanimación, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, Espa˜ na Centro del Cáncer, Salamanca, Espa˜ na c APOINTECH, Salamanca, Espa˜ na d Servicio de Anestesiología y Reanimación, Hospital Universitario La Paz, Madrid, Espa˜ na e Servicio de Análisis Clínicos, Hospital General Yagüe, Complejo Asistencial Universitario de Burgos, Burgos, Espa˜ na b
Recibido el 22 de agosto de 2011; aceptado el 23 de abril de 2012 Disponible en Internet el 15 de junio de 2012
PALABRAS CLAVE Arginasa; Transfusión; Concentrados de hematíes; Conservación; Hemólisis; Inmunosupresión
夽 ∗
Resumen Objetivos: Dada la creciente evidencia a favor de una relación entre el tiempo de conservación de los concentrados de hematíes y las complicaciones postransfusionales, nos planteamos analizar la relación existente entre los niveles de enzima arginasa, parámetros bioquímicos y de hemólisis, con el tiempo de conservación de concentrados de hematíes transfundidos. Material y métodos: Dise˜ namos un estudio prospectivo que incluyó 24 unidades de concentrado de hematíes, que habían sido transfundidos consecutivamente a pacientes de nuestro hospital. Luego de registrar el tiempo de conservación de cada bolsa, se extrajeron 15 ml de sangre para determinar la actividad arginasa, los datos bioquímicos y de hemólisis. Se realizó un análisis univariante de todos los parámetros registrados y se incluyeron aquellos que resultaron significativos en un modelo de regresión múltiple (p < 0,05). Resultados: El tiempo promedio de conservación fue de 18,6 ± 6,1 días (rango: 6-31 días), con un hematocrito de 59,8% ± 0,05%, una hemoglobina 20,3 ± 1,8 g/dl, un pH de 6,5 ± 0,1 y una actividad arginasa de 140,1 ± 124,0 mU/ml. Se observó una relación lineal en el análisis univariante entre el tiempo de conservación y el pH (p = 0,001), el HCO3 act (p = 0,001), el índice hemolítico (p = 0,035) y la SpO2 (p = 0,01). Una vez ajustados las variables de confusión procedentes del modelo univariante, se observó una relación lineal entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación (p = 0,031).
Este trabajo ha sido presentado parcialmente en el Congreso de Anestesiología de la ESA 2011. Autor para correspondencia. Correo electrónico: [email protected] (M.A. Palomero Rodríguez).
0034-9356/$ – see front matter © 2011 Sociedad Española de Anestesiología, Reanimación y Terapéutica del Dolor. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.redar.2012.04.021
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M.A. Palomero Rodríguez et al Conclusiones: Nuestro trabajo muestra una relación lineal directamente proporcional entre el tiempo de conservación de los concentrados de hematíes y la actividad arginasa presente en los mismos. Sugerimos que estos hallazgos podrían estar relacionados con la elevada incidencia de complicaciones tras la transfusión que puede ser directamente proporcional a su tiempo de conservación. © 2011 Sociedad Española de Anestesiología, Reanimación y Terapéutica del Dolor. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
KEYWORDS Arginase; Transfusion; Packed red blood cells; Storage; Haemolysis; Inmunosupression
Relationship between arginase activity and the storage time of packed red blood cells Abstract Objectives: Given the increasing evidence regarding a relationship between packed red blood cells storage time and post-transfusion complications, we decided to determine the relationship between the arginase enzyme levels, biochemical parameters and haemolysis, with the storage time of transfused packed red blood cells. Material and methods: We designed a prospective study that included 24 units of packed cells that had been consecutively transfused to patients of our hospital. After recording the storage time of each bag, 15 ml of blood was removed to determine arginase activity, biochemical parameters and haemolysis. A univariate analysis was performed on all the recorded parameters, and included those that were significant in the multiple regression model (P<.05). Results: The mean storage time was 18.6±6.1 days (range: 6-31 days), with a haematocrit of 59.8%±0.05%, a haemoglobin of 20.3±1.8 g/dl, a pH of 6.5±0.1, and an arginase activity of 140.1±124.0 mU/ml. A linear relationship was observed in the univariate analysis between the storage time and the pH (P=.001), the actualHCO3 (P=.001), the haemolysis index (P=.035) and the SpO2 (P=.01). Once adjusted for the confounding variables of the univariate model, a linear relationship was observed between the arginase activity and the storage time (P=.031). Conclusions: Our study shows a directly proportional linear relationship between the storage time of packed red blood cells and their arginase activity. We suggest that these findings could be associated with the high incidence of complications after transfusion that may be directly proportional to their storage time. © 2011 Sociedad Española de Anestesiología, Reanimación y Terapéutica del Dolor. Published by Elsevier España, S.L. All rights reserved.
Introducción Desde que en 1973 se comunicara por primera vez el aumento de la supervivencia del injerto en pacientes sometidos a trasplante renal que recibieron transfusión de sangre, el efecto inmunomodulador de la transfusión de concentrados de hematíes (CH) ha sido reconocido ampliamente1 . Sin embargo, la transfusión de CH durante el período perioperatorio se asocia a una mayor incidencia de infecciones y de recurrencia tumoral2---11 . Aunque el mecanismo específico de este efecto es desconocido, la mayoría de investigaciones se centran en el análisis de mediadores inflamatorios, incluyendo citocinas, histamina o lípidos proinflamatorios, que aumentan de forma directamente proporcional al tiempo de almacenamiento de la bolsa11---16 . Baumgartner et al.16 observaron en un estudio de laboratorio que la transfusión de CH provoca la inducción de células T reguladoras, implicadas en la inmunosupresión que acontece en pacientes trasplantados, oncológicos y politraumatizados. Esta inducción no se relacionó con la leucorreducción o el tiempo de almacenamiento de la bolsa16 . La arginina es un aminoácido fundamental para el correcto funcionamiento del sistema inmunológico durante la agresión quirúrgica y la infección17 . La enzima arginasa
(L-arginina-urea-hidroxilasa, EC 3.5.3.1) metaboliza la arginina a ornitina y urea, siendo la primera precursora de poliaminas, esenciales para la proliferación y reparación celular17---20 . Prins et al.21 observaron la liberación de arginasa a partir de hematíes almacenados y sugirieron que podría estar relacionado con la inmunosupresión que acontece tras la transfusión de CH. Dada la creciente evidencia a favor de una relación entre el tiempo de conservación de los CH y las complicaciones postransfusionales5,6,11 , nos planteamos analizar la relación existente entre la cantidad de enzima arginasa, distintos parámetros bioquímicos y de hemólisis, con el tiempo de conservación de unidades de CH transfundidas provenientes de un banco de sangre de un hospital de tercer nivel.
Material y métodos Se realizó un estudio prospectivo en el que se analizaron los datos derivados de 24 CH que habían sido transfundidos consecutivamente en los quirófanos de nuestro hospital. El estudio fue aprobado por el comité de ética del hospital. Todas las muestras fueron recogidas y procesadas por los mismos miembros del equipo investigador. Previo a la transfusión y tras anotar el tiempo de conservación de la
Relación entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación de los concentrados de hematíes
Determinación del índice hemolítico La determinación del índice hemolítico se basó en el cálculo de las mediciones de la absorbancia de la hemoglobina libre en plasma en muestras diluidas a diversos pares de longitudes de onda dicromáticas a fin de obtener una representación semicuantitativa de los niveles de hemólisis presentes en el plasma. Este método es el más ampliamente utilizado para la detección de interferencias analíticas debidas a la hemólisis. Se diluyó una alícuota de suero con NaCl 0,9% y se midió la absorbancia de la hemólisis con un autoanalizador Cobas® c501 (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Alemania) a 570 nm (longitud de onda primaria) y 600 nm (longitud de onda secundaria).
Determinación de la actividad arginasa La actividad arginasa fue determinada por la conversión de arginina a ornitina mediante la modificación descrita por Corraliza et al.22 con ligeras modificaciones. La arginasa fue activada mediante la adición de 10 l de 10 mM MnCl2 a 50 L de plasma e incubada a 56 ◦ C durante 10 min. La hidrólisis de arginina fue llevada a cabo mediante la incubación de 50 l de 0,5 M L-arginina (pH: 9,7) a 37 ◦ C durante 15120 min. Para detener la reacción se agregó 400 l de H2 SO4 (96%)/H3 PO4 (85%)/H2 O (1/3/7). La determinación de urea fue cuantificada por absorbancia a 540 nm tras la adición de 20 l {alpha}-isonitrosopropiofenona (disuelta en 100% de etanol al 6%) seguido del calentamiento a 95 ◦ C durante 30 min. Una unidad de actividad arginasa fue definida como la cantidad de enzima necesaria para catalizar la formación de 1 mol de urea por ml.
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Índice hemolítico
bolsa, de cada CH se extrajeron 15 ml de sangre destinados a la determinación de actividad arginasa, datos bioquímicos (pH, pCO2 , pO2 , HCO3 , hemoglobina, hematocrito, urea, exceso de bases y sodio, SpO2 , glucosa) y de hemólisis. Los datos bioquímicos fueron determinados en un analizador de gases tipo RapidLab® 1200 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc, Tarrytown, EE. UU.). Para determinar la actividad arginasa y el índice hemolítico, se centrifugaron 10 ml de sangre a 1.200 rpm durante 12 min a temperatura ambiente. El suero obtenido fue congelado a −20 ◦ C. Todas las muestras fueron transportadas y descongeladas simultáneamente previamente a su análisis con el fin de evitar variaciones asociadas al procesado de las muestras en tiempos diferentes. El análisis de laboratorio fue ciego con respecto al tiempo de almacenamiento de las unidades de CH analizadas.
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200 150 100 50 0 5
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Días de conservación
Figura 1 Relación entre el índice hemolítico y los días de conservación (p = 0,035).
ajustar los valores de confusión. Se consideraron significativos valores de p < 0,05. Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS® versión 17.0 para windows (SPSS Inc, Chicago, IL, EE. UU.).
Resultados El tiempo promedio de conservación de los 24 CH analizados, índice hemolítico, actividad arginasa y pH se recogen en la tabla 1. El hematocrito promedio fue de 59,86 ± 0,05%, la hemoglobina 20,35 ± 1,80 mg/dl, urea 24,21 ± 19 mmol/l, exceso de bases de −34,4 ± 3,30 mmol/l, HCO3 7,6 ± 1,32 mmol/l y sodio 120,75 ± 7,47 mmol/l. De las unidades de CH incluidas en este estudio, 40% tenían entre 10 y 20 días de conservación, mientras que otro 40% tenían entre 20 y 30 días. Se observó una relación lineal en el análisis univariante entre el índice hemolítico y el tiempo de conservación (p = 0,035, fig. 1), entre el pH y el tiempo de conservación (p = 0,001, fig. 2), con una disminución del pH de 0,019 por cada día de conservación, entre el HCO3 act y el tiempo de conservación (p = 0,001), con una disminución del HCO3 act de 0,162 por cada día de conservación, y entre la SpO2 y el tiempo de conservación (p = 0,01), con una aumento de la SpO2 de 1,7% por cada día de conservación. El análisis univariante determinó una relación lineal no significativa entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación de los CH analizados en el estudio (0 = 0,061).
6,75 6,7 6,65
La potencia estimada del estudio para el tama˜ no muestral descrito (n = 24) fue del 81,7%, considerado suficiente para un estudio en ciencias de la salud23 . Los datos cuantitativos fueron expresados como media ± desviación estándar. Se realizó un análisis univariante de todos los parámetros registrados (pH, pCO2 , pO2 , HCO3 , hemoglobina, hematocrito, urea, exceso de bases y sodio, SpO2 , Cl, glucosa y Hb libre) y se incluyeron aquellos que resultaron significativos en un modelo de regresión múltiple con el objeto de
pH
6,6
Análisis estadístico
6,55 6,5 6,45 6,4 6,35 0
5
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Días de conservación
Figura 2 Relación entre los días de conservación y el pH (p = 0,049).
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M.A. Palomero Rodríguez et al
Tabla 1 Características de las bolsas en estudio, días de almacenamiento, índice hemolítico, actividad de arginasa y pH. Datos como valores absolutos o media ± DE y rango cuando procede
Actividad arginasa (mU/mL)
Bolsa 1 Bolsa 2 Bolsa 3 Bolsa 4 Bolsa 5 Bolsa 6 Bolsa 7 Bolsa 8 Bolsa 9 Bolsa 10 Bolsa 11 Bolsa 12 Bolsa 13 Bolsa 14 Bolsa 15 Bolsa 16 Bolsa 17 Bolsa 18 Bolsa 19 Bolsa 20 Bolsa 21 Bolsa 22 Bolsa 23 Bolsa 24 Media ± DE (rango)
Días de almacenamiento
Índice hemolítico
Actividad arginasa (mU/ml)
pH
11 18 6 9 24 24 16 13 13 11 22 17 8 16 16 28 19 23 22 29 31 20 18 22 18,66 ± 6,17 (6-31)
43 48 32 40 50 63 31 69 63 47 40 48 59 65 58 128 87 234 133 106 118 59 65 112 ----
64,4 99,8 70,3 34,6 104,9 105,1 46,0 38,9 57,6 60,3 54,0 46,3 81,3 47,6 46,3 117,5 270,9 303,0 244,8 420,2 486,0 165,6 166,2 229,5 140 ± 124
6,5 6,4 6,7 6,5 6,5 6,4 6,5 6,6 6,6 6,7 6,4 6,5 6,6 6,5 6,5 6,4 6,4 6,5 6,4 6,4 6,4 6,5 6,4 6,5 6,5 ± 0,1
6,75 500 400 300 200 100 0 0
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Días de conservación
Figura 3 Relación entre la arginasa y los días de conservación (p = 0,031).
Una vez ajustados las variables de confusión procedentes del modelo univariante que resultaron significativas o casi significativas, se observó una relación lineal entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación (p = 0,031), con un aumento de 2,743 mU/ml de actividad arginasa por cada día de conservación (fig. 3).
Discusión Uno de los principales hallazgos de este estudio es la observación de una relación lineal entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación de los CH analizados en el estudio con un período de conservación comprendido entre 6 y 31 días.
La transfusión de CH induce alteraciones de tipo inmunológico, a veces opuestas, como la reacción injerto contra huésped, la aloinmunización, el desarrollo de enfermedades autoinmunes, una predisposición aumentada a infecciones nosocomiales y postoperatorias, microquimerismo, aumento de la supervivencia de órganos trasplantados y aumento de la recurrencia tumoral2---11,24,25 . Estos efectos son de importancia durante el período perioperatorio, caracterizado por procesos de tipo inflamatorio e inmunológico que sumados a la destrucción de masa tumoral y de vascularización durante la cirugía, inducen el paso de células tumorales a la circulación sanguínea 24,25 . Aunque los mecanismos exactos relacionados con esta inmunomodulación asociada a la trasfusión son desconocidos, se ha demostrado que la transfusión de sangre alogénica provoca una disminución del cociente linfocito T helper/T supresor, una disminución de la función de las células NK, una presentación de antígenos defectuosa y una disminución en la producción de citocinas incluyendo la IL-2 y el IFN- ␥26,27 . Según la FDA, el período máximo permitido para la conservación de los CH es de 42 días28 . Los hematíes almacenados durante más de 15 días sufren una depleción de la concentración intracelular de 2,3-DPG (reduciendo su capacidad de donar oxígeno29 ), de los niveles intracelulares de ATP (provocando un cambio en la forma del hematíe de discoide a esferocítico, una pérdida de la membrana lipídica y una disminución de la deformidad tisular30 ) y de antioxidantes endógenos, lo que aumenta el estrés oxidativo de las proteínas del citoesqueleto y de los fosfolípidos de membrana, favoreciendo la lisis del hematíe30,31 .
Relación entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación de los concentrados de hematíes Asimismo, se ha observado un aumento de 3 a 25 veces de la concentración de histamina, proteína eosinofílica catiónica, proteína X eosinofílica, mieloperoxidasa y activador tisular del plasminógeno en el sobrenadante de bolsas de CH entre el primer y el día 35 de almacenamiento14 , así como de mediadores inflamatorios, como citocinas, mediadores solubles derivados de leucocitos, moléculas HLA, directamente proporcionales al tiempo de almacenaje13,16 . A pesar de estas alteraciones, numerosos autores se˜ nalan a la contaminación por leucocitos como la responsable de las disfunciones inmunológicas que acontecen tras la transfusión de CH32 . A este respecto, la leucorreducción previa al almacenamiento mejora la morfología del hematíe y disminuye la hemólisis, microvesiculización y liberación de potasio33 . Sin embargo, sus efectos sobre la atenuación de la inmunosupresión y el aumento de infecciones asociados a la transfusión no son concluyentes16,33,34 . La enzima arginasa es inducida en células mieloides del sistema inmunológico por citocinas tipo Th-2 antiinflamatorias, participando en las reacciones inflamatorias mediante una disminución en la síntesis de óxido nítrico, la inducción de fibrosis y la regeneración tisular. En humanos, la enzima arginasa se expresa de forma constitutiva en los neutrófilos y es liberada durante los procesos inflamatorios. La depleción de arginina provocada por la liberación de arginasa se ha relacionado con una supresión de la respuesta inmune mediada por células T, siendo considerado uno de los principales mecanismos de inmunosupresión asociado a los procesos inflamatorios35 . Estudios realizados tanto in vitro como in vivo muestran como la ausencia de L-arginina provoca la disminución en la expresión del receptor CD3 del linfocito T (principal elemento de transducción del receptor del linfocito T) y una disminución en la producción de citocinas proinflamatorias18,20 . Según esto, grandes cantidades de enzima arginasa presentes en los CH podrían ser responsables del estado de inmunosupresión, que acontece tras la transfusión de CH. A este respecto Atzil et al.9 observaron en animales de laboratorio y líneas celulares tumorales, que los hematíes en comparación con los leucocitos o mediadores inflamatorios, son los principales responsables de la recurrencia de enfermedad tumoral relacionada con la transfusión, y que este efecto es directamente proporcional a la duración del almacenamiento. Asimismo, Bernard et al.36 , en un estudio experimental realizado sobre un modelo de transfusión en medio de cultivo, observaron la presencia en bolsas de hematíes de niveles elevados de la enzima arginasa junto a una disminución de los valores de arginina. Estos datos estarían en consonancia con los datos obtenidos en nuestro estudio, pudiendo ser los altos niveles de enzima arginasa derivados de la lisis de los hematíes presentes en los CH los responsables de la inmunosupresión y del aumento de infecciones asociados a la transfusión. De ser esta hipótesis cierta, las bolsas de CH con largo tiempo de conservación deberían ser consideradas como un factor de riesgo adicional para la progresión tumoral en enfermos oncológicos, e incluso, llegado el momento y tras los estudios oportunos, debería valorarse la utilización en este tipo de enfermos de bolsas de sangre con un tiempo de conservación razonable. Aunque los hallazgos obtenidos en este estudio sugieren que uno de los principales mecanismos responsables de la inmunomodulación secundaria a la transfusión de CH puede ser la presencia de elevadas
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cantidades de enzima arginasa, una de las limitaciones de nuestro trabajo es que no evalúa parámetros analíticos ni las consecuencias de la transfusión en los pacientes que recibieron estas bolsas. Pensamos que sería interesante la realización de nuevos estudios analizando el efecto de la transfusión de CH sobre los niveles de arginasa, parámetros bioquímicos e incluso inmunológicos (receptor CD3) en pacientes o voluntarios sanos para confirmar estos resultados. En conclusión, nuestro trabajo muestra una relación lineal entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación de los CH analizados en el estudio, con un período de conservación comprendido entre 6 y 31 días. Estos hallazgos podrían estar relacionados con la elevada incidencia de complicaciones tras la transfusión de CH, directamente proporcional a su tiempo de conservación.
Financiación Este trabajo ha sido financiado por la Ayuda para la investigación en biomedicina, biotecnología y ciencias de la Salud de la Junta de Castilla y León y el Instituto de Salud Carlos III a˜ no 2010.
Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
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PALABRAS CLAVE Arginasa; Transfusión; Concentrados de hematíes; Conservación; Hemólisis; Inmunosupresión
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Resumen Objetivos: Dada la creciente evidencia a favor de una relación entre el tiempo de conservación de los concentrados de hematíes y las complicaciones postransfusionales, nos planteamos analizar la relación existente entre los niveles de enzima arginasa, parámetros bioquímicos y de hemólisis, con el tiempo de conservación de concentrados de hematíes transfundidos. Material y métodos: Dise˜ namos un estudio prospectivo que incluyó 24 unidades de concentrado de hematíes, que habían sido transfundidos consecutivamente a pacientes de nuestro hospital. Luego de registrar el tiempo de conservación de cada bolsa, se extrajeron 15 ml de sangre para determinar la actividad arginasa, los datos bioquímicos y de hemólisis. Se realizó un análisis univariante de todos los parámetros registrados y se incluyeron aquellos que resultaron significativos en un modelo de regresión múltiple (p < 0,05). Resultados: El tiempo promedio de conservación fue de 18,6 ± 6,1 días (rango: 6-31 días), con un hematocrito de 59,8% ± 0,05%, una hemoglobina 20,3 ± 1,8 g/dl, un pH de 6,5 ± 0,1 y una actividad arginasa de 140,1 ± 124,0 mU/ml. Se observó una relación lineal en el análisis univariante entre el tiempo de conservación y el pH (p = 0,001), el HCO3 act (p = 0,001), el índice hemolítico (p = 0,035) y la SpO2 (p = 0,01). Una vez ajustados las variables de confusión procedentes del modelo univariante, se observó una relación lineal entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación (p = 0,031).
Este trabajo ha sido presentado parcialmente en el Congreso de Anestesiología de la ESA 2011. Autor para correspondencia. Correo electrónico: [email protected] (M.A. Palomero Rodríguez).
0034-9356/$ – see front matter © 2011 Sociedad Española de Anestesiología, Reanimación y Terapéutica del Dolor. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.redar.2012.04.021
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M.A. Palomero Rodríguez et al Conclusiones: Nuestro trabajo muestra una relación lineal directamente proporcional entre el tiempo de conservación de los concentrados de hematíes y la actividad arginasa presente en los mismos. Sugerimos que estos hallazgos podrían estar relacionados con la elevada incidencia de complicaciones tras la transfusión que puede ser directamente proporcional a su tiempo de conservación. © 2011 Sociedad Española de Anestesiología, Reanimación y Terapéutica del Dolor. Publicado por Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
KEYWORDS Arginase; Transfusion; Packed red blood cells; Storage; Haemolysis; Inmunosupression
Relationship between arginase activity and the storage time of packed red blood cells Abstract Objectives: Given the increasing evidence regarding a relationship between packed red blood cells storage time and post-transfusion complications, we decided to determine the relationship between the arginase enzyme levels, biochemical parameters and haemolysis, with the storage time of transfused packed red blood cells. Material and methods: We designed a prospective study that included 24 units of packed cells that had been consecutively transfused to patients of our hospital. After recording the storage time of each bag, 15 ml of blood was removed to determine arginase activity, biochemical parameters and haemolysis. A univariate analysis was performed on all the recorded parameters, and included those that were significant in the multiple regression model (P<.05). Results: The mean storage time was 18.6±6.1 days (range: 6-31 days), with a haematocrit of 59.8%±0.05%, a haemoglobin of 20.3±1.8 g/dl, a pH of 6.5±0.1, and an arginase activity of 140.1±124.0 mU/ml. A linear relationship was observed in the univariate analysis between the storage time and the pH (P=.001), the actualHCO3 (P=.001), the haemolysis index (P=.035) and the SpO2 (P=.01). Once adjusted for the confounding variables of the univariate model, a linear relationship was observed between the arginase activity and the storage time (P=.031). Conclusions: Our study shows a directly proportional linear relationship between the storage time of packed red blood cells and their arginase activity. We suggest that these findings could be associated with the high incidence of complications after transfusion that may be directly proportional to their storage time. © 2011 Sociedad Española de Anestesiología, Reanimación y Terapéutica del Dolor. Published by Elsevier España, S.L. All rights reserved.
Introducción Desde que en 1973 se comunicara por primera vez el aumento de la supervivencia del injerto en pacientes sometidos a trasplante renal que recibieron transfusión de sangre, el efecto inmunomodulador de la transfusión de concentrados de hematíes (CH) ha sido reconocido ampliamente1 . Sin embargo, la transfusión de CH durante el período perioperatorio se asocia a una mayor incidencia de infecciones y de recurrencia tumoral2---11 . Aunque el mecanismo específico de este efecto es desconocido, la mayoría de investigaciones se centran en el análisis de mediadores inflamatorios, incluyendo citocinas, histamina o lípidos proinflamatorios, que aumentan de forma directamente proporcional al tiempo de almacenamiento de la bolsa11---16 . Baumgartner et al.16 observaron en un estudio de laboratorio que la transfusión de CH provoca la inducción de células T reguladoras, implicadas en la inmunosupresión que acontece en pacientes trasplantados, oncológicos y politraumatizados. Esta inducción no se relacionó con la leucorreducción o el tiempo de almacenamiento de la bolsa16 . La arginina es un aminoácido fundamental para el correcto funcionamiento del sistema inmunológico durante la agresión quirúrgica y la infección17 . La enzima arginasa
(L-arginina-urea-hidroxilasa, EC 3.5.3.1) metaboliza la arginina a ornitina y urea, siendo la primera precursora de poliaminas, esenciales para la proliferación y reparación celular17---20 . Prins et al.21 observaron la liberación de arginasa a partir de hematíes almacenados y sugirieron que podría estar relacionado con la inmunosupresión que acontece tras la transfusión de CH. Dada la creciente evidencia a favor de una relación entre el tiempo de conservación de los CH y las complicaciones postransfusionales5,6,11 , nos planteamos analizar la relación existente entre la cantidad de enzima arginasa, distintos parámetros bioquímicos y de hemólisis, con el tiempo de conservación de unidades de CH transfundidas provenientes de un banco de sangre de un hospital de tercer nivel.
Material y métodos Se realizó un estudio prospectivo en el que se analizaron los datos derivados de 24 CH que habían sido transfundidos consecutivamente en los quirófanos de nuestro hospital. El estudio fue aprobado por el comité de ética del hospital. Todas las muestras fueron recogidas y procesadas por los mismos miembros del equipo investigador. Previo a la transfusión y tras anotar el tiempo de conservación de la
Relación entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación de los concentrados de hematíes
Determinación del índice hemolítico La determinación del índice hemolítico se basó en el cálculo de las mediciones de la absorbancia de la hemoglobina libre en plasma en muestras diluidas a diversos pares de longitudes de onda dicromáticas a fin de obtener una representación semicuantitativa de los niveles de hemólisis presentes en el plasma. Este método es el más ampliamente utilizado para la detección de interferencias analíticas debidas a la hemólisis. Se diluyó una alícuota de suero con NaCl 0,9% y se midió la absorbancia de la hemólisis con un autoanalizador Cobas® c501 (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Alemania) a 570 nm (longitud de onda primaria) y 600 nm (longitud de onda secundaria).
Determinación de la actividad arginasa La actividad arginasa fue determinada por la conversión de arginina a ornitina mediante la modificación descrita por Corraliza et al.22 con ligeras modificaciones. La arginasa fue activada mediante la adición de 10 l de 10 mM MnCl2 a 50 L de plasma e incubada a 56 ◦ C durante 10 min. La hidrólisis de arginina fue llevada a cabo mediante la incubación de 50 l de 0,5 M L-arginina (pH: 9,7) a 37 ◦ C durante 15120 min. Para detener la reacción se agregó 400 l de H2 SO4 (96%)/H3 PO4 (85%)/H2 O (1/3/7). La determinación de urea fue cuantificada por absorbancia a 540 nm tras la adición de 20 l {alpha}-isonitrosopropiofenona (disuelta en 100% de etanol al 6%) seguido del calentamiento a 95 ◦ C durante 30 min. Una unidad de actividad arginasa fue definida como la cantidad de enzima necesaria para catalizar la formación de 1 mol de urea por ml.
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Índice hemolítico
bolsa, de cada CH se extrajeron 15 ml de sangre destinados a la determinación de actividad arginasa, datos bioquímicos (pH, pCO2 , pO2 , HCO3 , hemoglobina, hematocrito, urea, exceso de bases y sodio, SpO2 , glucosa) y de hemólisis. Los datos bioquímicos fueron determinados en un analizador de gases tipo RapidLab® 1200 (Siemens Healthcare Diagnostics Inc, Tarrytown, EE. UU.). Para determinar la actividad arginasa y el índice hemolítico, se centrifugaron 10 ml de sangre a 1.200 rpm durante 12 min a temperatura ambiente. El suero obtenido fue congelado a −20 ◦ C. Todas las muestras fueron transportadas y descongeladas simultáneamente previamente a su análisis con el fin de evitar variaciones asociadas al procesado de las muestras en tiempos diferentes. El análisis de laboratorio fue ciego con respecto al tiempo de almacenamiento de las unidades de CH analizadas.
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200 150 100 50 0 5
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Días de conservación
Figura 1 Relación entre el índice hemolítico y los días de conservación (p = 0,035).
ajustar los valores de confusión. Se consideraron significativos valores de p < 0,05. Para el análisis estadístico se utilizó el programa SPSS® versión 17.0 para windows (SPSS Inc, Chicago, IL, EE. UU.).
Resultados El tiempo promedio de conservación de los 24 CH analizados, índice hemolítico, actividad arginasa y pH se recogen en la tabla 1. El hematocrito promedio fue de 59,86 ± 0,05%, la hemoglobina 20,35 ± 1,80 mg/dl, urea 24,21 ± 19 mmol/l, exceso de bases de −34,4 ± 3,30 mmol/l, HCO3 7,6 ± 1,32 mmol/l y sodio 120,75 ± 7,47 mmol/l. De las unidades de CH incluidas en este estudio, 40% tenían entre 10 y 20 días de conservación, mientras que otro 40% tenían entre 20 y 30 días. Se observó una relación lineal en el análisis univariante entre el índice hemolítico y el tiempo de conservación (p = 0,035, fig. 1), entre el pH y el tiempo de conservación (p = 0,001, fig. 2), con una disminución del pH de 0,019 por cada día de conservación, entre el HCO3 act y el tiempo de conservación (p = 0,001), con una disminución del HCO3 act de 0,162 por cada día de conservación, y entre la SpO2 y el tiempo de conservación (p = 0,01), con una aumento de la SpO2 de 1,7% por cada día de conservación. El análisis univariante determinó una relación lineal no significativa entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación de los CH analizados en el estudio (0 = 0,061).
6,75 6,7 6,65
La potencia estimada del estudio para el tama˜ no muestral descrito (n = 24) fue del 81,7%, considerado suficiente para un estudio en ciencias de la salud23 . Los datos cuantitativos fueron expresados como media ± desviación estándar. Se realizó un análisis univariante de todos los parámetros registrados (pH, pCO2 , pO2 , HCO3 , hemoglobina, hematocrito, urea, exceso de bases y sodio, SpO2 , Cl, glucosa y Hb libre) y se incluyeron aquellos que resultaron significativos en un modelo de regresión múltiple con el objeto de
pH
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Análisis estadístico
6,55 6,5 6,45 6,4 6,35 0
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Días de conservación
Figura 2 Relación entre los días de conservación y el pH (p = 0,049).
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Tabla 1 Características de las bolsas en estudio, días de almacenamiento, índice hemolítico, actividad de arginasa y pH. Datos como valores absolutos o media ± DE y rango cuando procede
Actividad arginasa (mU/mL)
Bolsa 1 Bolsa 2 Bolsa 3 Bolsa 4 Bolsa 5 Bolsa 6 Bolsa 7 Bolsa 8 Bolsa 9 Bolsa 10 Bolsa 11 Bolsa 12 Bolsa 13 Bolsa 14 Bolsa 15 Bolsa 16 Bolsa 17 Bolsa 18 Bolsa 19 Bolsa 20 Bolsa 21 Bolsa 22 Bolsa 23 Bolsa 24 Media ± DE (rango)
Días de almacenamiento
Índice hemolítico
Actividad arginasa (mU/ml)
pH
11 18 6 9 24 24 16 13 13 11 22 17 8 16 16 28 19 23 22 29 31 20 18 22 18,66 ± 6,17 (6-31)
43 48 32 40 50 63 31 69 63 47 40 48 59 65 58 128 87 234 133 106 118 59 65 112 ----
64,4 99,8 70,3 34,6 104,9 105,1 46,0 38,9 57,6 60,3 54,0 46,3 81,3 47,6 46,3 117,5 270,9 303,0 244,8 420,2 486,0 165,6 166,2 229,5 140 ± 124
6,5 6,4 6,7 6,5 6,5 6,4 6,5 6,6 6,6 6,7 6,4 6,5 6,6 6,5 6,5 6,4 6,4 6,5 6,4 6,4 6,4 6,5 6,4 6,5 6,5 ± 0,1
6,75 500 400 300 200 100 0 0
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Días de conservación
Figura 3 Relación entre la arginasa y los días de conservación (p = 0,031).
Una vez ajustados las variables de confusión procedentes del modelo univariante que resultaron significativas o casi significativas, se observó una relación lineal entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación (p = 0,031), con un aumento de 2,743 mU/ml de actividad arginasa por cada día de conservación (fig. 3).
Discusión Uno de los principales hallazgos de este estudio es la observación de una relación lineal entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación de los CH analizados en el estudio con un período de conservación comprendido entre 6 y 31 días.
La transfusión de CH induce alteraciones de tipo inmunológico, a veces opuestas, como la reacción injerto contra huésped, la aloinmunización, el desarrollo de enfermedades autoinmunes, una predisposición aumentada a infecciones nosocomiales y postoperatorias, microquimerismo, aumento de la supervivencia de órganos trasplantados y aumento de la recurrencia tumoral2---11,24,25 . Estos efectos son de importancia durante el período perioperatorio, caracterizado por procesos de tipo inflamatorio e inmunológico que sumados a la destrucción de masa tumoral y de vascularización durante la cirugía, inducen el paso de células tumorales a la circulación sanguínea 24,25 . Aunque los mecanismos exactos relacionados con esta inmunomodulación asociada a la trasfusión son desconocidos, se ha demostrado que la transfusión de sangre alogénica provoca una disminución del cociente linfocito T helper/T supresor, una disminución de la función de las células NK, una presentación de antígenos defectuosa y una disminución en la producción de citocinas incluyendo la IL-2 y el IFN- ␥26,27 . Según la FDA, el período máximo permitido para la conservación de los CH es de 42 días28 . Los hematíes almacenados durante más de 15 días sufren una depleción de la concentración intracelular de 2,3-DPG (reduciendo su capacidad de donar oxígeno29 ), de los niveles intracelulares de ATP (provocando un cambio en la forma del hematíe de discoide a esferocítico, una pérdida de la membrana lipídica y una disminución de la deformidad tisular30 ) y de antioxidantes endógenos, lo que aumenta el estrés oxidativo de las proteínas del citoesqueleto y de los fosfolípidos de membrana, favoreciendo la lisis del hematíe30,31 .
Relación entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación de los concentrados de hematíes Asimismo, se ha observado un aumento de 3 a 25 veces de la concentración de histamina, proteína eosinofílica catiónica, proteína X eosinofílica, mieloperoxidasa y activador tisular del plasminógeno en el sobrenadante de bolsas de CH entre el primer y el día 35 de almacenamiento14 , así como de mediadores inflamatorios, como citocinas, mediadores solubles derivados de leucocitos, moléculas HLA, directamente proporcionales al tiempo de almacenaje13,16 . A pesar de estas alteraciones, numerosos autores se˜ nalan a la contaminación por leucocitos como la responsable de las disfunciones inmunológicas que acontecen tras la transfusión de CH32 . A este respecto, la leucorreducción previa al almacenamiento mejora la morfología del hematíe y disminuye la hemólisis, microvesiculización y liberación de potasio33 . Sin embargo, sus efectos sobre la atenuación de la inmunosupresión y el aumento de infecciones asociados a la transfusión no son concluyentes16,33,34 . La enzima arginasa es inducida en células mieloides del sistema inmunológico por citocinas tipo Th-2 antiinflamatorias, participando en las reacciones inflamatorias mediante una disminución en la síntesis de óxido nítrico, la inducción de fibrosis y la regeneración tisular. En humanos, la enzima arginasa se expresa de forma constitutiva en los neutrófilos y es liberada durante los procesos inflamatorios. La depleción de arginina provocada por la liberación de arginasa se ha relacionado con una supresión de la respuesta inmune mediada por células T, siendo considerado uno de los principales mecanismos de inmunosupresión asociado a los procesos inflamatorios35 . Estudios realizados tanto in vitro como in vivo muestran como la ausencia de L-arginina provoca la disminución en la expresión del receptor CD3 del linfocito T (principal elemento de transducción del receptor del linfocito T) y una disminución en la producción de citocinas proinflamatorias18,20 . Según esto, grandes cantidades de enzima arginasa presentes en los CH podrían ser responsables del estado de inmunosupresión, que acontece tras la transfusión de CH. A este respecto Atzil et al.9 observaron en animales de laboratorio y líneas celulares tumorales, que los hematíes en comparación con los leucocitos o mediadores inflamatorios, son los principales responsables de la recurrencia de enfermedad tumoral relacionada con la transfusión, y que este efecto es directamente proporcional a la duración del almacenamiento. Asimismo, Bernard et al.36 , en un estudio experimental realizado sobre un modelo de transfusión en medio de cultivo, observaron la presencia en bolsas de hematíes de niveles elevados de la enzima arginasa junto a una disminución de los valores de arginina. Estos datos estarían en consonancia con los datos obtenidos en nuestro estudio, pudiendo ser los altos niveles de enzima arginasa derivados de la lisis de los hematíes presentes en los CH los responsables de la inmunosupresión y del aumento de infecciones asociados a la transfusión. De ser esta hipótesis cierta, las bolsas de CH con largo tiempo de conservación deberían ser consideradas como un factor de riesgo adicional para la progresión tumoral en enfermos oncológicos, e incluso, llegado el momento y tras los estudios oportunos, debería valorarse la utilización en este tipo de enfermos de bolsas de sangre con un tiempo de conservación razonable. Aunque los hallazgos obtenidos en este estudio sugieren que uno de los principales mecanismos responsables de la inmunomodulación secundaria a la transfusión de CH puede ser la presencia de elevadas
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cantidades de enzima arginasa, una de las limitaciones de nuestro trabajo es que no evalúa parámetros analíticos ni las consecuencias de la transfusión en los pacientes que recibieron estas bolsas. Pensamos que sería interesante la realización de nuevos estudios analizando el efecto de la transfusión de CH sobre los niveles de arginasa, parámetros bioquímicos e incluso inmunológicos (receptor CD3) en pacientes o voluntarios sanos para confirmar estos resultados. En conclusión, nuestro trabajo muestra una relación lineal entre la actividad arginasa y el tiempo de conservación de los CH analizados en el estudio, con un período de conservación comprendido entre 6 y 31 días. Estos hallazgos podrían estar relacionados con la elevada incidencia de complicaciones tras la transfusión de CH, directamente proporcional a su tiempo de conservación.
Financiación Este trabajo ha sido financiado por la Ayuda para la investigación en biomedicina, biotecnología y ciencias de la Salud de la Junta de Castilla y León y el Instituto de Salud Carlos III a˜ no 2010.
Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
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