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Relations entre les Métabolismes Glucidique et Uridylique dans l'Embryon de Betterave en Germination: Existence de Différences précoces entre un Cultivar Fourrager et un Cultivar Sucrier
Universite de Clermont-Ferrand, Laboratoire de Phytomorphogenese, Clermont-Ferrand, France
Relations entre les Metabolismes Glucidique et Uridylique dans I'Embryon de Betterave en Germination: Existence de Differences precoces entre un Cultivar Fourrager et un Cultivar Sucrier Relations between Carbohydrate and Uridylic Metabolism in Germinating Beet Embryo: Existence of Early Differences between a Forage Beet and a Sugar Beet Variety M. GENDRAUD et
J. LAFLEURIEL
Avec 3 figures Rc<;u Ie 27 juillet 1979 . Accepte Ie 29 aout 1979
Summary Energy-rich uridylic nucleotide turnover is always faster in embryos from sugar beet than from forage beet, though, in these two varieties it is increased by sucrose and reduced by raffinose. The two types of embryos have identical nucleoside-diphosphate kinase, UDPGpyrophosphorylase and UDPGal-epimerase activities, but embryos from sugar beet show greater sucrose-synthetase and UDPGal-pyrophosphorylase activities than those from forage beet. These results on sucrose metabolism are discussed in relation to the ability of embryos to maintain a high turnover of the sucrose-a-galactoside pool. This property is more developed in the sugar beet variety and implies a galactose recycling in which UDPGalpyrophosphorylase may be involved. Key words: metabolism, sucrose, uridylic nucleotides, germination, Beta vulgaris.
Introduction Les embryons de Betteraves sucrieres presentent, apres 12 heures d'imbitions, une teneur en saccharose plus importante que celle des embryons de Betteraves fourrageres (GENDRAUD et LAFLEURIEL, 1977). Un aspect du metabolisme du diholoside apparait etroitement lie celui de ses a-galactosides (raffinose, stachyose etc.) puisque, lors de sa penetration dans les embryons, Ie 14C-saccharose exogene subit, pendant quelques dizaines de secondes une eclipse partielle au profit des a-galactosides. Le processus se manifeste plus rapidement, il est plus intense et plus durable dans les embryons de type sucrier; une activite a-galactosidase plus grande dans Ie cultivar
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fourrager rend compte de la reapparition plus rapide du saccharose dans les embryons de ce type (GENRAUD et CLOUX, 1979). Independamment de sa signification physiologique, un tel processus doit utiliser de l'energie et peut impliquer un recyclage du galactose. Afin de mieux connahre les modalites de l'entretien d'un «pool» d'a-galactosides du saccharose turn-over rapide, nous avons entrepris une etude dynamique du metabolisme des nucleotides uridyliques riches en energie en relation avec les biosyntheses glucidiques. Les resultats exposes dans cette Note con cement les caracteristiques de l'incorporation de precurseurs radioactifs dans les nucIeotides des embryons de deux cultivars, l'un sucrier, l'autre fourrager, ainsi que la mesure de quelques activites enzymatiques impliquees dans l'aspect energetique du processus etudie.
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Materiel et methodes a) Le materiel vegetal Les cultivars etudies (Betterave fourragere: Monoval; Betterave sucriere: Ceres, lot B. 131-32) sont monogermes genetiques. Les graines, extraites de leurs glome rules, sont sterilisees par l'hypochlorite de Ca et misses a germer en bohes de Petri sur papier Whatman nO 1 imbibe, sauf indication contra ire, d'eau distillee, elle aussi sterile. Apres 12 heures de germination a I'obscurite, a la temperature de 23 ± 1 °C, les embryons sont isoles et places dans des conditions axeniques, soit au contact d'un precurseur radioactif, soit dans un tampon d'extraction en vue de la mesure d'activites enzymatiques. b) Les precurseurs radioactifs, les enzymes (5- 3H) Uri dine (25 Ci . mmole- i ) et (8- 14 C( adenosine (58 mCi . mmole- I ) sont Fournier par Radiochemical Centre, Amersham, Grande-Bretagne. (2- 3H) adenine (1 Ci· mmole-I ), (6-14 C) acide orotique (52 mCi . mmole- I ) et (2_14C) Uri dine (55 mCi . mmole- I ) proviennent du C. E. A., Gif sur Yvette, France. UDPG-pyrophosphorylase (Boehringer, Mannheim), UDPGal-epimerase et UDPG-dehydrogenase, type III (SIGMA Chern. Co.) sont des preparations commerciales. c) Les methodes Les embryons sont morphologiquement tres homogenes et aucune difference de deveiopce stade, entre les echantillons des deux cultivars. De plus, nous pement n'est decelable avons verifie que leur teneur en proteines est identique. Tous les resultats seront donc exprimes rapportes aun embryon. - Mesure de I'incorporation de precurseurs radioactifs dans les nucleotides riches en energie. Chaque embryon est place dans 5 ,ul d'une solution radioactive sterile renfermant, soit 1 850 000 dpm de 3H, soit 462500 dpm de l4C, soit la somme des deux. Les temps d'incubation varient de 1 a 30 minutes sur Ie melange de 3H-uridine et de l4C-adenosine. lis sont de 15 minutes sur Ie melange de 3H-adenine et de l4C-acide orotique. Les embryons destines a l'estimation du turn-over des nucleotides uridyliques sont places pendant 5 minutes sur 5 ttl d'une solution de 3H-uridine (6,6 pmoles/!tl), puis maintenus pendant 10 minutes sur 5 fd d'une solution de l4C-uridine (756 pmoles/,ul) avant de sejourner 7,5 minutes sur 5 #1 d'une solution d'uridine non radioactive (40 nmoles/#1). Les nucleotides sont extraits selon la methode de KEPPLER et a!. (1970). Une partie ali quote du surnageant acido-soluble neutralise (10 pi) est deposee sur une couche mince de cellulose en presence de melanges traceurs d'uridine, UMP, UDP, UTP d'une part, d'adenosine, AMP, ADP, ATP d'autre part. La migration est maintenue pendant 3 heures dans Ie solvant
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n-butanol, acetone/acide acetique/ammoniaque 5 Ofo/eau (4,5: 1,5 : 1 : 1 : 2. RANDERATH, 1963). Des essais preliminaires ont montre que migre sur la plaque, au niveau des nucleosides di- et tri-phosphates une faible quantite de composes radioactifs non sensibles a I'hydrolyse en presence d'apyrase. Des proportions croissantes de cette radioactivite disparaissent lorsque I'extrait nucleotidique est traite par Ie melange UDPG-pyrophosphorylase-apyrase, puis par Ie melange UDPGal-epimerase-UDPG-pyrophosphorylase-apyrase, en presence d'un exces de pyrophosphate. En raison des faibles radioactivites reievees, une etude plus approfondie de ces composes n'a pas ete entreprise, cependant cette observation nous a incite a ne considerer que la radioactivite globale des nucleotides riches en energie incluant les nucleos ides di- et tri-phosphates, les nucleotides-sucres et peut-etre d'autres derives nucleotidiques possedant un phosphate en (J. La partie concernee de la plaque est grattee, et la cellulose impregnee des nucleotides etudies est recueillie. La radioactivite est determinee au compteur a scintillation liquide Intertechnique S. L. 40. Le traitement des nucleotides concernes par un melange d'apyrase et de phosphatase alcaline n'a pas permis la detection de quantites notables de guanosine ou de cytidine radioactives. Les resultats sont exprimes par Ie rapport de la radioactivite incorporee dans les nucleotides riches en energie a la radioactivite presente dans Ie milieu d'incubation, pour un embryon. - Mesure des teneur en UTP, UDPG et UDPGa!. Les dosages de I'UDPG et de l'UDPGal sont realises par bioluminescence scion la technique precedemment dec rite (GENDRAUD, 1977; GENDRAUD et LAFREURIEL, 1978). Le dosage enzymatique de I'UTP est base sur I'incubation de I'extrait nuclcotidique en presence d'UDPG-pyrophosphorylase et d'un exces de glucose-l-P: UTP
+
glucose-l-P
--+
UDPG
+
PP j
Lorsque tout I'UTP est consomme, la diminution des nucleosides triphosphatcs non adenyliques (NTP) est egale it la quantite d'UTP initialement presente. La reaction est effectuee dans un volume final de 100 ,u!. A50 ill de tampon glycineKOH 0,3 M, pH 8,7, MgCI2 0,04 M, EDTA 0,004 M, glucose-l-P' (sei disodique) 10-4 M, sont ajoutes 10 pi d'une solution d'UDPG pyrophosporylase (250 ng/,lll) et 40 ,ul d'extrait dilue de maniere a contenir une quantite d' ATP comprise entre 10 et 50 pmoles. L'ensemble est maintenu pendant 30 minutes a 30°C puis porte 1 minute a 100°C. La mesure de l'UTP disparu au cours de la reaction est realisee sur 10 Iii de ce milieu au moyen de la methode de dosage des NTP deja utilisee (GENDRAUD, 1977). Afin de verifier, d'une part, que l'integrite des molecules de nucleotides est conservee, ct, d'autre part, que celle-ci permet une mesure quantitative de l'UTP, les temoins suivants sont toujours prepares: milieu reactionnel additionne de 100 pmoles d'UTP, milieu reactionel depourvu d'UDPG-pyrophosphorylase. - Mesures des activites enzymatiques. La preparation de l'extrait destine a la mesure des activites enzymatiques est realisee par broyage a 2 °C des embryons dans un tampon tris Hel 0,1 M, pH 7,5, glutathion reduit 2.10-'1 M (un embryon pour 50 ,ul de tampon) suivi d'une centrifugation a 2000 g pendant 10 minutes. Le surnageant constitue l'extrait enzymatique utilisee pour la mesure des activites puisqu'un «dessalage» sur Sephadex G-25 ne s'est pas avere indispensable. Toutes les etudes cinetiques sont effectuees a 23 ± 0,5 °C en presence des temoins depourvus de substrat ou d'extrait. L'activite nucleoside di-phosphate kinase est determinee par la mesure, par bioluminescence de la vitesse d'apparition de l' ATP au cours des reactions suivantes: UTP ou GTP
+ ADP --+ UDP + ATP + ADP --+ GDP + ATP
Le volume total du milieu reactionnel est de 2 m!. Il renferme 40 ,umoles de tampon tris-H 2S0 4 pH 7,5, 2,5 nmoles d'ADP et 2,5 nmoles d'UTP ou de GTP. La reaction est declenchee par I'addition de 1 .ul d'extrait enzymatique. L'augmentation de la concentration Z. PJlanzenphysiol. Bd. 96. S. 435-444. 1980.
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en ATP du milieu est suivie par bioluminescence sur des parties aliquotes d'un volume de 200 ,ul prcHevees toutes les 5 minutes a partir de l'addition de l'extrait. Les resultats sont exprimes en nmoles de y-phosphate transferees par minute et par embryon. Les activites UDPG-pyrophosphorylase, UDPGal-cpimerase et saccharose-synthetase sont determinees par la mesure de la vitesse initiale d'apparition de l'UDPG a 340 nm en presence de NAD+ et d'UDPG-deshydrogenase. Le produit de la reaction catalysee par l'UDPGal-pyrophosphorylase, l'UDPGal, est trans forme en UDPG gr~ce a une UDPGal epimerase du commerce. La vitesse initiale de la reaction est alors mesuree comme precedemment. Le protocole experimental est inspire de AXELOS et PEAUD-LENOEL (1978). La composition de chaque milieu reactionnel est presentee dans Ie tableau 1. Le choix d'un pH de 8,7 a ete fixe apres plusieurs essais preieminaires effectues a d'autres pH. Les resultats sont exprimes en nmoles de substrats trans formes par minute et par embryon. Table 1: Spectrophotometric measurements of enzymatic activities; composition of the assay mixtures. Nature de l'activite enzymatique etudiee
Compos ants particuliers (,umoles dans 600 ,ul)
UDPG-pyrophosphorylase
UTP: 0,2 ,umole Glucose-l-P: 0,2 pmole
UDPGal-epimerase
UDPGal: 0,2 ,umole
Saccharose synthetase
UDP: 0,2 ,umole saccharose: 0,2 ,umole
UDPGal-pyrophosphorylase
UTP: 0,2 ,umole Galactose-l-P: 0,2 ,umole UD PGal-epimerase 5 . 10-3 unites enzymatiques
Compos ants communs (,umoles dans 600 Ill)
Tris-HCl pH 8,7: 40 ,umoles NAD+: 0,4 ,umole UDPG-deshydrogenase: 5 . 10-3 unites enzymatiques Triton X-l00: 1 pi Extrait enzymatique: 20 ,ul
UDPG: uridine diphosphoglucose UDPGal: uridine diphosphogalactose d) Reproductibilite des meSitres Chaque experimentation est repetee au moins quatre fois de maniere independante, les ecarts les plus grands ne depassent pas 8 % par rapport a une valeur moyenne.
Resultats
a) Etude comparee du metabolisme des nucleotides uridyliques et adenyliques riches en energie d'embryons de Betteraves fourrageres et sucrieres
La cinetique d'incorporation de la 3H-uridine et de la 14e-adenosine dans les nucleotides riches en energie des embryons des deux cultivars est representee part la figure 1. Presque assimilable a une droite pour les nucleotides adenyliques, elle est dans ce cas la m~me pour les deux types d'embryons. Pour les nucleotides uridyliques, la linearite n'apparah qu'au-dela de 5 minutes, et la pente, plus import ante chez Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 96. S. 435-444. 1980.
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10
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20
15
25
30
temps (minutes)
Fig. 1: Kinetic evolution of the fraction of incubation mixture radioactivity incorporated in energy rich nucleotids of forage and sugar beet embryos. F: forage beet; S: sugar beet; ur: 3H-uridine; ad: HC-adenosine; a: 3H-adenine; 0: 14C-orotic acid. Embryos are incubated in a mixture of 3H-uridine (1 850 000 dpm in 5fll) and 14C-adenosine (462500 dpm in 5 ,ttl). In one case (arrows) embryos were incubated in a mixture of 3H-adenine (1 850 000 dpm in 5 ,ul) and 14C-orotic acid (462500 dpm in 5,u1).
les embryons de type sucrier indique que, dans ce cultivar, les syntheses uridyliques sont plus intenses que dans Ie cultivar fourrager. De plus, dans la suite de l'experimentation, les resultats obtenus pour des temps de marquages uniques, inferieurs 30 minutes, seront assimilables des mesures de vitesse d'incorporation. La radioactivite des nucleotides riches en energie d'embryons places pendant 15 minutes au contact d'une solution renfermant un melange de :lH-adenine et de 14 C-acide orotique confirme Ie resultant precedent (fig. 1). Elle indique de plus, que la forte intensite des syntheses uridyliques chez l'embryon de type sucrier ne provient pas de la nature du precurseur et que, vraisemblablement, elle n'est liee, ni au mode de penetration de ce compose, ni la reaction primaire d'incorporation dans les nucleotides. Enfin la mesure des teneurs en UTP, UDPG et UDPGal des embryons indique que, dans nos conditions experimentales, les «pools» de composes uridyliques ne sont pas modifies par l'incorporation des precurseurs qui restent done de simples traceurs (Tableau 2). Les resultats de marquages successifs des nucleotides d'un meme embryon par la 3H-uridine, puis la 14-C-uridine, montrent que, la suite d'un double chassage par dilution isotopique, Ie rapport aH/ 14 C des composes uridyliques riches en energie des
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Table 2: UTP, UDPG and UDPGal quantities in forage (F) and sugar (S) beet embryos before and after incubation on radioactive precursors solution. UTP (pmolesl embryon)
UDPG (pmoles/embryon)
UDPGal (pmoles/embryon)
Avant incubation
F: 202 S: 179
F: 245 S: 206
F: 81 S: 93
Apres 30 minutes d'incubation sur 3H-uridine + 14C-adenosine
F: 216 S: 187
S: 220
F: 267
F: 85 S: 95
UDPG: uridine diphosphoglucose UDPGal: uri dine diphosphogalactose
embryons de type sucrier est plus faible que celui des embryons de type fourrager (fig. 2 b). II est, par consequent, vraisemblable que dans Ie cultivar sucrier Ie turnover des nucleotides etudies soit plus rapide que dans Ie cultivar fourrager.
b) Modifications du metabolisme des nucUotides uridyliques riches en energie d'embryons de Betteraves fourrageres et sucrieres sous l'influence de glucides exogenes Les embryons sont extraits de graines mises, des Ie debut de l'imbibition, sur une solution de saccharose ou de raffinose 0,05 M. lIs sont ensuite places sur des solutions de precurseurs radioactifs renfermant elles m~mes du saccharose ou du raffinose 0.05 M.
~'UR(5min) F
3H•UR } 14C.AR 15min.
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14C-UR(10min)
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Fig. 2: Quotient of 3H to HC fractions of incubation mixture radioactivities incorporated in energy-rich nucleotides of forage and sugar beet embryos. F: forage beet; S: sugar beet; UR: uri dine ; AR: adenosine; sacch.: sucrose; raff.: raffinose. a) Embryos are incubated for 15 minutes in a mixture of 3H-uridine (1 850000 dpm in 5td) and HC-adenosine (462500 dpm in 5 ,ul). b) Embryos are incubated for 5 minutes in a solution of 3H-uridine (6,6 pmolesl,ul), then for 10 minutes in a solution of 14C-uridine (756 pmolesl,ul) and at last in a solution of nonradioactive uridine (40 nmolesl,ul).
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L'analyse des modalites de marquage des nucleotides riches en energie montre que si, dans tous les cas, Ie metabolisme uridylique des embryons de type fourrager est moins intense que celui des embryons de type sucrier, la nature du glucide exogene est susceptible de modifier ce metabolisme. Un apport de saccharose augmente l'incorporation de 3H-uridine et Ie turn-over des nucleotides uridyliques alors que Ie raffinose provoque Ie phenomene inverse (fig. 2 A et B). Ces resultats ne sont pas en contradiction avec l'hypothese selon laquelle une part non negligeable du metabolisme des nucleotides uridyliques serait liee aux biosyntheses d'a-galactosides du saccharose, les saccharose, substrat, accelererait une rection qui serait ralentie par Ie raffinose, produit de cette reaction. c) Mesures de quelques activites enzymatiques liees aux metabolismes uridylique et glucidique
Les cinq activites enzymatiques etudiees sont choisies parmi celles qui participent
a la synthese de nucleotides uridyliques riches en energie ou a leur utilisation par Ie
metabolisme glucidique. La figure 3 resume les reactions etudiees et les resultats obtenus. Trois des activites mesurees ont des valeurs independantes de la nature du cultivar, et sont relativement importantes: la nucleoside di-phosphate kinase, l'UDPG-pyrophosphorylase et I'UDPGal-epimerase. Les deux autres activites, la saccharose synthetase et l'UDPGal-pyrophosphorylase sont franchement plus elevees dans Ie cultivar sucrier et il est vraisemblable que cette particularite explique, au moins en partie, la plus grande activite du met abo lis me uridylique des embryons de type sucrier.
UD~P
saccharose F:36,0±3,0 5:54,1 ±3,7 e
ATP
a F204±15 5208±16
fructose
ADP
~
UTP
F98,0±7,3 590.9±7,0 PP
~DPG
ATP
ADP
"
Gal-1-P ~- - -'.- - - - - -,'-, - - - galactose
G1-P
b
d F20,0±t5 540,3±2,7
c • F 132 ±11 5140 ±11
•
PPi
'
• UDPGal "-,-,->raffinose--/ , ' , J.:'
saccharose
'"
UDP
"
y
saccharose
Fig. 3: Enzymatic activities values measured in forage and sugar beet embryos. F: forage beet; S: sugar beet; a: nucleoside diphosphate kinase; b: UDPG-pyrophosphorylase; c: UDPGal-epimerase; d: UDPGal-pyrophosphorylase; e: sucrose-synthetase. Activities are expressed as pmoles of substrates transformed by one embryo in one minute. Z. PJlanzenphysiol. Rd. 96. S. 435-444. 1980.
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Discussion et conclusions Apres 12 heures de germination, il est possible de detecter, au niveau de l'embryon, de nombreuses differences entre les cultivars fourrager et sucrier. Celles qui ont ete mises en evidence concernent Ie metabolisme uridylique lie de fas:on privilegiee aux syntheses glucidiques (HASSID, 1969). Certains des resultats presentes sont en accord avec les caracteriques d'un «pooh> d'a.-galactosides turn-over rapide. La presence d'une activite UDPGal-pyrphosphorylase dans un vegetal n'est pas un fait nouveau (IMHOFF et BOURDU, 1970), mais, elle est ici compatible avec la necessite d'un recyclage du galactose. De plus, sa plus grande importance dans Ie cultivar sucrier peut &tre l'origine d'un meilleur approvisionnement en UDPGal des systemes de synthese des a-galactosides du saccharose. Ceci contribuerait expliquer l'apparition plus rapide de ces composes dans les embryons de type sucrier. Cette interpretation neglige la forte activite UDPGal-epimerase enregistree dans les deux cultivars. II n'est pas possible de connahre actuellement sa participation a la fourniture d'UDPGal comme precurseur de a-galactosides du saccharose. Quelques essais preliminaires tendent a montrer qu'une partie de l'activite UDPGal-epimerase serait liee a des systemes membranaires dans lesquels les syntheses de lipides galactosyles peuvent ~tre importantes (AxELOS et PEAUD-LENOEL, 1978; BLEE et SCHANTZ, 1978). L'activite UDPGal-pyrophosphorylase semble cytosolique. La presence d'une activite saccharose-synthetase plus grande chez les embryons surcriers semble, a priori, logique. Cependant, etant donne la reversibilite de la reaction qu'elle catalyse, Ie probleme du sens de cette reaction in situ reste pose (TURNER, 1969; HAWKER, 1971; JENNER, 1974) et il n'est pas possible d'exclure, chez a Betterave, l'intervention de cette enzyme dans la fourniture d'UDPG aux systemes de biosyntheses membranaires et parietales (AVIGAD et aI., 1966; PAVLINOVA et PRASDLOVA, 1970; SIGNOR, 1978). L'acceleration du metabolisme uridylique observee la suite d'un apport exogene de saccharose peut &tre liee, au moins partiellement, au fonctionnement de la saccharose synthetase dans Ie sens favourable la synthese d'UDPG. Cependant, ainsi que nous l'avons remarque plus haut, Ie resultat precedent peut s'expliquer par la demande accrue d'UDPGal par les systemes de biosynthese des a-galactosides du saccharose face a l'arrivee massive du diholoside. Le ralentissement du metabolisme uridylique enregistre a la suite d'une incubation des embryons au contact du raffinose renforce cette seconde hypothese, sans exclure la premiere. Aucun renseignement n'est apporte concernant Ie r8le physiologique des a-galactosides du saccharose de l'embryon de Betterave. Peuvent-ils participer des translocations de cellule cellule, au moins pour les premiers termes de la serie (TURGEON et WEBB, 1975; FONDY et GEIGER, 1977) ou bien interviennent-ils a un niveau strictement intracellulaire (passage du cytoplasme la vacuole)? Les a-galactosides d'oses ou de polyols ont pu ~tre consideres comme des reserves de galactose (IMHOFF et BOURDU, 1970), mais une autre hypothese est que les a-galactosides du saccharose cons,tituent une forme protegee du diholoside moins sensible l'hydrolyse par l'invertase. Un cultivar possedant un equipement enzymatique susceptible d'entretenir
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un «pool» important d' a-galactosides marquage rapide aurait alors une capacite sucriere superieure. Le r8le regulateur de l'invertase, discute par plusieurs auteurs (ENGEL et KHOLODOVA, 1969; WYSE, 1974; GIAQUINTA, 1977; SIGNOR, 1978) se situerait en aval de ce «pool». Enfin, il n'est peut-hre pas illusoire de rechercher une signification physiologique commune la majorite des a-galactosides d'oses, d'holosides et de polyols recontres chez les vegetaux. Les a-galactosides du saccharose pourraient hre des regulateurs osmotiques de certains compartiments cellulaires, compte tenu de leur synthese rapide des les primeres minutes de l'imbibition des graines de Betterave (GENDRAUD et CLOUX, 1979). Cet effet, independamment de l'importance des betaines dans ce domaine (HANSON et NELSEN, 1978) serait assez comparable celui des a-galactosides du glycerol-phosphate decrit chez Ochromonas (KAUSS et QUADER, 1976; KAUSS, 1977; KAUSS et al., 1978).
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Relations entre les Metabolismes Glucidique et Uridylique dans I'Embryon de Betterave en Germination: Existence de Differences precoces entre un Cultivar Fourrager et un Cultivar Sucrier Relations between Carbohydrate and Uridylic Metabolism in Germinating Beet Embryo: Existence of Early Differences between a Forage Beet and a Sugar Beet Variety M. GENDRAUD et
J. LAFLEURIEL
Avec 3 figures Rc<;u Ie 27 juillet 1979 . Accepte Ie 29 aout 1979
Summary Energy-rich uridylic nucleotide turnover is always faster in embryos from sugar beet than from forage beet, though, in these two varieties it is increased by sucrose and reduced by raffinose. The two types of embryos have identical nucleoside-diphosphate kinase, UDPGpyrophosphorylase and UDPGal-epimerase activities, but embryos from sugar beet show greater sucrose-synthetase and UDPGal-pyrophosphorylase activities than those from forage beet. These results on sucrose metabolism are discussed in relation to the ability of embryos to maintain a high turnover of the sucrose-a-galactoside pool. This property is more developed in the sugar beet variety and implies a galactose recycling in which UDPGalpyrophosphorylase may be involved. Key words: metabolism, sucrose, uridylic nucleotides, germination, Beta vulgaris.
Introduction Les embryons de Betteraves sucrieres presentent, apres 12 heures d'imbitions, une teneur en saccharose plus importante que celle des embryons de Betteraves fourrageres (GENDRAUD et LAFLEURIEL, 1977). Un aspect du metabolisme du diholoside apparait etroitement lie celui de ses a-galactosides (raffinose, stachyose etc.) puisque, lors de sa penetration dans les embryons, Ie 14C-saccharose exogene subit, pendant quelques dizaines de secondes une eclipse partielle au profit des a-galactosides. Le processus se manifeste plus rapidement, il est plus intense et plus durable dans les embryons de type sucrier; une activite a-galactosidase plus grande dans Ie cultivar
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fourrager rend compte de la reapparition plus rapide du saccharose dans les embryons de ce type (GENRAUD et CLOUX, 1979). Independamment de sa signification physiologique, un tel processus doit utiliser de l'energie et peut impliquer un recyclage du galactose. Afin de mieux connahre les modalites de l'entretien d'un «pool» d'a-galactosides du saccharose turn-over rapide, nous avons entrepris une etude dynamique du metabolisme des nucleotides uridyliques riches en energie en relation avec les biosyntheses glucidiques. Les resultats exposes dans cette Note con cement les caracteristiques de l'incorporation de precurseurs radioactifs dans les nucIeotides des embryons de deux cultivars, l'un sucrier, l'autre fourrager, ainsi que la mesure de quelques activites enzymatiques impliquees dans l'aspect energetique du processus etudie.
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Materiel et methodes a) Le materiel vegetal Les cultivars etudies (Betterave fourragere: Monoval; Betterave sucriere: Ceres, lot B. 131-32) sont monogermes genetiques. Les graines, extraites de leurs glome rules, sont sterilisees par l'hypochlorite de Ca et misses a germer en bohes de Petri sur papier Whatman nO 1 imbibe, sauf indication contra ire, d'eau distillee, elle aussi sterile. Apres 12 heures de germination a I'obscurite, a la temperature de 23 ± 1 °C, les embryons sont isoles et places dans des conditions axeniques, soit au contact d'un precurseur radioactif, soit dans un tampon d'extraction en vue de la mesure d'activites enzymatiques. b) Les precurseurs radioactifs, les enzymes (5- 3H) Uri dine (25 Ci . mmole- i ) et (8- 14 C( adenosine (58 mCi . mmole- I ) sont Fournier par Radiochemical Centre, Amersham, Grande-Bretagne. (2- 3H) adenine (1 Ci· mmole-I ), (6-14 C) acide orotique (52 mCi . mmole- I ) et (2_14C) Uri dine (55 mCi . mmole- I ) proviennent du C. E. A., Gif sur Yvette, France. UDPG-pyrophosphorylase (Boehringer, Mannheim), UDPGal-epimerase et UDPG-dehydrogenase, type III (SIGMA Chern. Co.) sont des preparations commerciales. c) Les methodes Les embryons sont morphologiquement tres homogenes et aucune difference de deveiopce stade, entre les echantillons des deux cultivars. De plus, nous pement n'est decelable avons verifie que leur teneur en proteines est identique. Tous les resultats seront donc exprimes rapportes aun embryon. - Mesure de I'incorporation de precurseurs radioactifs dans les nucleotides riches en energie. Chaque embryon est place dans 5 ,ul d'une solution radioactive sterile renfermant, soit 1 850 000 dpm de 3H, soit 462500 dpm de l4C, soit la somme des deux. Les temps d'incubation varient de 1 a 30 minutes sur Ie melange de 3H-uridine et de l4C-adenosine. lis sont de 15 minutes sur Ie melange de 3H-adenine et de l4C-acide orotique. Les embryons destines a l'estimation du turn-over des nucleotides uridyliques sont places pendant 5 minutes sur 5 ttl d'une solution de 3H-uridine (6,6 pmoles/!tl), puis maintenus pendant 10 minutes sur 5 fd d'une solution de l4C-uridine (756 pmoles/,ul) avant de sejourner 7,5 minutes sur 5 #1 d'une solution d'uridine non radioactive (40 nmoles/#1). Les nucleotides sont extraits selon la methode de KEPPLER et a!. (1970). Une partie ali quote du surnageant acido-soluble neutralise (10 pi) est deposee sur une couche mince de cellulose en presence de melanges traceurs d'uridine, UMP, UDP, UTP d'une part, d'adenosine, AMP, ADP, ATP d'autre part. La migration est maintenue pendant 3 heures dans Ie solvant
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Relations entre les mctabolismes glucidique et uridylique
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n-butanol, acetone/acide acetique/ammoniaque 5 Ofo/eau (4,5: 1,5 : 1 : 1 : 2. RANDERATH, 1963). Des essais preliminaires ont montre que migre sur la plaque, au niveau des nucleosides di- et tri-phosphates une faible quantite de composes radioactifs non sensibles a I'hydrolyse en presence d'apyrase. Des proportions croissantes de cette radioactivite disparaissent lorsque I'extrait nucleotidique est traite par Ie melange UDPG-pyrophosphorylase-apyrase, puis par Ie melange UDPGal-epimerase-UDPG-pyrophosphorylase-apyrase, en presence d'un exces de pyrophosphate. En raison des faibles radioactivites reievees, une etude plus approfondie de ces composes n'a pas ete entreprise, cependant cette observation nous a incite a ne considerer que la radioactivite globale des nucleotides riches en energie incluant les nucleos ides di- et tri-phosphates, les nucleotides-sucres et peut-etre d'autres derives nucleotidiques possedant un phosphate en (J. La partie concernee de la plaque est grattee, et la cellulose impregnee des nucleotides etudies est recueillie. La radioactivite est determinee au compteur a scintillation liquide Intertechnique S. L. 40. Le traitement des nucleotides concernes par un melange d'apyrase et de phosphatase alcaline n'a pas permis la detection de quantites notables de guanosine ou de cytidine radioactives. Les resultats sont exprimes par Ie rapport de la radioactivite incorporee dans les nucleotides riches en energie a la radioactivite presente dans Ie milieu d'incubation, pour un embryon. - Mesure des teneur en UTP, UDPG et UDPGa!. Les dosages de I'UDPG et de l'UDPGal sont realises par bioluminescence scion la technique precedemment dec rite (GENDRAUD, 1977; GENDRAUD et LAFREURIEL, 1978). Le dosage enzymatique de I'UTP est base sur I'incubation de I'extrait nuclcotidique en presence d'UDPG-pyrophosphorylase et d'un exces de glucose-l-P: UTP
+
glucose-l-P
--+
UDPG
+
PP j
Lorsque tout I'UTP est consomme, la diminution des nucleosides triphosphatcs non adenyliques (NTP) est egale it la quantite d'UTP initialement presente. La reaction est effectuee dans un volume final de 100 ,u!. A50 ill de tampon glycineKOH 0,3 M, pH 8,7, MgCI2 0,04 M, EDTA 0,004 M, glucose-l-P' (sei disodique) 10-4 M, sont ajoutes 10 pi d'une solution d'UDPG pyrophosporylase (250 ng/,lll) et 40 ,ul d'extrait dilue de maniere a contenir une quantite d' ATP comprise entre 10 et 50 pmoles. L'ensemble est maintenu pendant 30 minutes a 30°C puis porte 1 minute a 100°C. La mesure de l'UTP disparu au cours de la reaction est realisee sur 10 Iii de ce milieu au moyen de la methode de dosage des NTP deja utilisee (GENDRAUD, 1977). Afin de verifier, d'une part, que l'integrite des molecules de nucleotides est conservee, ct, d'autre part, que celle-ci permet une mesure quantitative de l'UTP, les temoins suivants sont toujours prepares: milieu reactionnel additionne de 100 pmoles d'UTP, milieu reactionel depourvu d'UDPG-pyrophosphorylase. - Mesures des activites enzymatiques. La preparation de l'extrait destine a la mesure des activites enzymatiques est realisee par broyage a 2 °C des embryons dans un tampon tris Hel 0,1 M, pH 7,5, glutathion reduit 2.10-'1 M (un embryon pour 50 ,ul de tampon) suivi d'une centrifugation a 2000 g pendant 10 minutes. Le surnageant constitue l'extrait enzymatique utilisee pour la mesure des activites puisqu'un «dessalage» sur Sephadex G-25 ne s'est pas avere indispensable. Toutes les etudes cinetiques sont effectuees a 23 ± 0,5 °C en presence des temoins depourvus de substrat ou d'extrait. L'activite nucleoside di-phosphate kinase est determinee par la mesure, par bioluminescence de la vitesse d'apparition de l' ATP au cours des reactions suivantes: UTP ou GTP
+ ADP --+ UDP + ATP + ADP --+ GDP + ATP
Le volume total du milieu reactionnel est de 2 m!. Il renferme 40 ,umoles de tampon tris-H 2S0 4 pH 7,5, 2,5 nmoles d'ADP et 2,5 nmoles d'UTP ou de GTP. La reaction est declenchee par I'addition de 1 .ul d'extrait enzymatique. L'augmentation de la concentration Z. PJlanzenphysiol. Bd. 96. S. 435-444. 1980.
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en ATP du milieu est suivie par bioluminescence sur des parties aliquotes d'un volume de 200 ,ul prcHevees toutes les 5 minutes a partir de l'addition de l'extrait. Les resultats sont exprimes en nmoles de y-phosphate transferees par minute et par embryon. Les activites UDPG-pyrophosphorylase, UDPGal-cpimerase et saccharose-synthetase sont determinees par la mesure de la vitesse initiale d'apparition de l'UDPG a 340 nm en presence de NAD+ et d'UDPG-deshydrogenase. Le produit de la reaction catalysee par l'UDPGal-pyrophosphorylase, l'UDPGal, est trans forme en UDPG gr~ce a une UDPGal epimerase du commerce. La vitesse initiale de la reaction est alors mesuree comme precedemment. Le protocole experimental est inspire de AXELOS et PEAUD-LENOEL (1978). La composition de chaque milieu reactionnel est presentee dans Ie tableau 1. Le choix d'un pH de 8,7 a ete fixe apres plusieurs essais preieminaires effectues a d'autres pH. Les resultats sont exprimes en nmoles de substrats trans formes par minute et par embryon. Table 1: Spectrophotometric measurements of enzymatic activities; composition of the assay mixtures. Nature de l'activite enzymatique etudiee
Compos ants particuliers (,umoles dans 600 ,ul)
UDPG-pyrophosphorylase
UTP: 0,2 ,umole Glucose-l-P: 0,2 pmole
UDPGal-epimerase
UDPGal: 0,2 ,umole
Saccharose synthetase
UDP: 0,2 ,umole saccharose: 0,2 ,umole
UDPGal-pyrophosphorylase
UTP: 0,2 ,umole Galactose-l-P: 0,2 ,umole UD PGal-epimerase 5 . 10-3 unites enzymatiques
Compos ants communs (,umoles dans 600 Ill)
Tris-HCl pH 8,7: 40 ,umoles NAD+: 0,4 ,umole UDPG-deshydrogenase: 5 . 10-3 unites enzymatiques Triton X-l00: 1 pi Extrait enzymatique: 20 ,ul
UDPG: uridine diphosphoglucose UDPGal: uridine diphosphogalactose d) Reproductibilite des meSitres Chaque experimentation est repetee au moins quatre fois de maniere independante, les ecarts les plus grands ne depassent pas 8 % par rapport a une valeur moyenne.
Resultats
a) Etude comparee du metabolisme des nucleotides uridyliques et adenyliques riches en energie d'embryons de Betteraves fourrageres et sucrieres
La cinetique d'incorporation de la 3H-uridine et de la 14e-adenosine dans les nucleotides riches en energie des embryons des deux cultivars est representee part la figure 1. Presque assimilable a une droite pour les nucleotides adenyliques, elle est dans ce cas la m~me pour les deux types d'embryons. Pour les nucleotides uridyliques, la linearite n'apparah qu'au-dela de 5 minutes, et la pente, plus import ante chez Z. Pjlanzenphysiol. Bd. 96. S. 435-444. 1980.
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10
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20
15
25
30
temps (minutes)
Fig. 1: Kinetic evolution of the fraction of incubation mixture radioactivity incorporated in energy rich nucleotids of forage and sugar beet embryos. F: forage beet; S: sugar beet; ur: 3H-uridine; ad: HC-adenosine; a: 3H-adenine; 0: 14C-orotic acid. Embryos are incubated in a mixture of 3H-uridine (1 850 000 dpm in 5fll) and 14C-adenosine (462500 dpm in 5 ,ttl). In one case (arrows) embryos were incubated in a mixture of 3H-adenine (1 850 000 dpm in 5 ,ul) and 14C-orotic acid (462500 dpm in 5,u1).
les embryons de type sucrier indique que, dans ce cultivar, les syntheses uridyliques sont plus intenses que dans Ie cultivar fourrager. De plus, dans la suite de l'experimentation, les resultats obtenus pour des temps de marquages uniques, inferieurs 30 minutes, seront assimilables des mesures de vitesse d'incorporation. La radioactivite des nucleotides riches en energie d'embryons places pendant 15 minutes au contact d'une solution renfermant un melange de :lH-adenine et de 14 C-acide orotique confirme Ie resultant precedent (fig. 1). Elle indique de plus, que la forte intensite des syntheses uridyliques chez l'embryon de type sucrier ne provient pas de la nature du precurseur et que, vraisemblablement, elle n'est liee, ni au mode de penetration de ce compose, ni la reaction primaire d'incorporation dans les nucleotides. Enfin la mesure des teneurs en UTP, UDPG et UDPGal des embryons indique que, dans nos conditions experimentales, les «pools» de composes uridyliques ne sont pas modifies par l'incorporation des precurseurs qui restent done de simples traceurs (Tableau 2). Les resultats de marquages successifs des nucleotides d'un meme embryon par la 3H-uridine, puis la 14-C-uridine, montrent que, la suite d'un double chassage par dilution isotopique, Ie rapport aH/ 14 C des composes uridyliques riches en energie des
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a
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Table 2: UTP, UDPG and UDPGal quantities in forage (F) and sugar (S) beet embryos before and after incubation on radioactive precursors solution. UTP (pmolesl embryon)
UDPG (pmoles/embryon)
UDPGal (pmoles/embryon)
Avant incubation
F: 202 S: 179
F: 245 S: 206
F: 81 S: 93
Apres 30 minutes d'incubation sur 3H-uridine + 14C-adenosine
F: 216 S: 187
S: 220
F: 267
F: 85 S: 95
UDPG: uridine diphosphoglucose UDPGal: uri dine diphosphogalactose
embryons de type sucrier est plus faible que celui des embryons de type fourrager (fig. 2 b). II est, par consequent, vraisemblable que dans Ie cultivar sucrier Ie turnover des nucleotides etudies soit plus rapide que dans Ie cultivar fourrager.
b) Modifications du metabolisme des nucUotides uridyliques riches en energie d'embryons de Betteraves fourrageres et sucrieres sous l'influence de glucides exogenes Les embryons sont extraits de graines mises, des Ie debut de l'imbibition, sur une solution de saccharose ou de raffinose 0,05 M. lIs sont ensuite places sur des solutions de precurseurs radioactifs renfermant elles m~mes du saccharose ou du raffinose 0.05 M.
~'UR(5min) F
3H•UR } 14C.AR 15min.
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14C-UR(10min)
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Fig. 2: Quotient of 3H to HC fractions of incubation mixture radioactivities incorporated in energy-rich nucleotides of forage and sugar beet embryos. F: forage beet; S: sugar beet; UR: uri dine ; AR: adenosine; sacch.: sucrose; raff.: raffinose. a) Embryos are incubated for 15 minutes in a mixture of 3H-uridine (1 850000 dpm in 5td) and HC-adenosine (462500 dpm in 5 ,ul). b) Embryos are incubated for 5 minutes in a solution of 3H-uridine (6,6 pmolesl,ul), then for 10 minutes in a solution of 14C-uridine (756 pmolesl,ul) and at last in a solution of nonradioactive uridine (40 nmolesl,ul).
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Relations entre les metabolismes glucidique et uridylique
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L'analyse des modalites de marquage des nucleotides riches en energie montre que si, dans tous les cas, Ie metabolisme uridylique des embryons de type fourrager est moins intense que celui des embryons de type sucrier, la nature du glucide exogene est susceptible de modifier ce metabolisme. Un apport de saccharose augmente l'incorporation de 3H-uridine et Ie turn-over des nucleotides uridyliques alors que Ie raffinose provoque Ie phenomene inverse (fig. 2 A et B). Ces resultats ne sont pas en contradiction avec l'hypothese selon laquelle une part non negligeable du metabolisme des nucleotides uridyliques serait liee aux biosyntheses d'a-galactosides du saccharose, les saccharose, substrat, accelererait une rection qui serait ralentie par Ie raffinose, produit de cette reaction. c) Mesures de quelques activites enzymatiques liees aux metabolismes uridylique et glucidique
Les cinq activites enzymatiques etudiees sont choisies parmi celles qui participent
a la synthese de nucleotides uridyliques riches en energie ou a leur utilisation par Ie
metabolisme glucidique. La figure 3 resume les reactions etudiees et les resultats obtenus. Trois des activites mesurees ont des valeurs independantes de la nature du cultivar, et sont relativement importantes: la nucleoside di-phosphate kinase, l'UDPG-pyrophosphorylase et I'UDPGal-epimerase. Les deux autres activites, la saccharose synthetase et l'UDPGal-pyrophosphorylase sont franchement plus elevees dans Ie cultivar sucrier et il est vraisemblable que cette particularite explique, au moins en partie, la plus grande activite du met abo lis me uridylique des embryons de type sucrier.
UD~P
saccharose F:36,0±3,0 5:54,1 ±3,7 e
ATP
a F204±15 5208±16
fructose
ADP
~
UTP
F98,0±7,3 590.9±7,0 PP
~DPG
ATP
ADP
"
Gal-1-P ~- - -'.- - - - - -,'-, - - - galactose
G1-P
b
d F20,0±t5 540,3±2,7
c • F 132 ±11 5140 ±11
•
PPi
'
• UDPGal "-,-,->raffinose--/ , ' , J.:'
saccharose
'"
UDP
"
y
saccharose
Fig. 3: Enzymatic activities values measured in forage and sugar beet embryos. F: forage beet; S: sugar beet; a: nucleoside diphosphate kinase; b: UDPG-pyrophosphorylase; c: UDPGal-epimerase; d: UDPGal-pyrophosphorylase; e: sucrose-synthetase. Activities are expressed as pmoles of substrates transformed by one embryo in one minute. Z. PJlanzenphysiol. Rd. 96. S. 435-444. 1980.
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GENDRAUD et
J. LAFLEURIEL
Discussion et conclusions Apres 12 heures de germination, il est possible de detecter, au niveau de l'embryon, de nombreuses differences entre les cultivars fourrager et sucrier. Celles qui ont ete mises en evidence concernent Ie metabolisme uridylique lie de fas:on privilegiee aux syntheses glucidiques (HASSID, 1969). Certains des resultats presentes sont en accord avec les caracteriques d'un «pooh> d'a.-galactosides turn-over rapide. La presence d'une activite UDPGal-pyrphosphorylase dans un vegetal n'est pas un fait nouveau (IMHOFF et BOURDU, 1970), mais, elle est ici compatible avec la necessite d'un recyclage du galactose. De plus, sa plus grande importance dans Ie cultivar sucrier peut &tre l'origine d'un meilleur approvisionnement en UDPGal des systemes de synthese des a-galactosides du saccharose. Ceci contribuerait expliquer l'apparition plus rapide de ces composes dans les embryons de type sucrier. Cette interpretation neglige la forte activite UDPGal-epimerase enregistree dans les deux cultivars. II n'est pas possible de connahre actuellement sa participation a la fourniture d'UDPGal comme precurseur de a-galactosides du saccharose. Quelques essais preliminaires tendent a montrer qu'une partie de l'activite UDPGal-epimerase serait liee a des systemes membranaires dans lesquels les syntheses de lipides galactosyles peuvent ~tre importantes (AxELOS et PEAUD-LENOEL, 1978; BLEE et SCHANTZ, 1978). L'activite UDPGal-pyrophosphorylase semble cytosolique. La presence d'une activite saccharose-synthetase plus grande chez les embryons surcriers semble, a priori, logique. Cependant, etant donne la reversibilite de la reaction qu'elle catalyse, Ie probleme du sens de cette reaction in situ reste pose (TURNER, 1969; HAWKER, 1971; JENNER, 1974) et il n'est pas possible d'exclure, chez a Betterave, l'intervention de cette enzyme dans la fourniture d'UDPG aux systemes de biosyntheses membranaires et parietales (AVIGAD et aI., 1966; PAVLINOVA et PRASDLOVA, 1970; SIGNOR, 1978). L'acceleration du metabolisme uridylique observee la suite d'un apport exogene de saccharose peut &tre liee, au moins partiellement, au fonctionnement de la saccharose synthetase dans Ie sens favourable la synthese d'UDPG. Cependant, ainsi que nous l'avons remarque plus haut, Ie resultat precedent peut s'expliquer par la demande accrue d'UDPGal par les systemes de biosynthese des a-galactosides du saccharose face a l'arrivee massive du diholoside. Le ralentissement du metabolisme uridylique enregistre a la suite d'une incubation des embryons au contact du raffinose renforce cette seconde hypothese, sans exclure la premiere. Aucun renseignement n'est apporte concernant Ie r8le physiologique des a-galactosides du saccharose de l'embryon de Betterave. Peuvent-ils participer des translocations de cellule cellule, au moins pour les premiers termes de la serie (TURGEON et WEBB, 1975; FONDY et GEIGER, 1977) ou bien interviennent-ils a un niveau strictement intracellulaire (passage du cytoplasme la vacuole)? Les a-galactosides d'oses ou de polyols ont pu ~tre consideres comme des reserves de galactose (IMHOFF et BOURDU, 1970), mais une autre hypothese est que les a-galactosides du saccharose cons,tituent une forme protegee du diholoside moins sensible l'hydrolyse par l'invertase. Un cultivar possedant un equipement enzymatique susceptible d'entretenir
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un «pool» important d' a-galactosides marquage rapide aurait alors une capacite sucriere superieure. Le r8le regulateur de l'invertase, discute par plusieurs auteurs (ENGEL et KHOLODOVA, 1969; WYSE, 1974; GIAQUINTA, 1977; SIGNOR, 1978) se situerait en aval de ce «pool». Enfin, il n'est peut-hre pas illusoire de rechercher une signification physiologique commune la majorite des a-galactosides d'oses, d'holosides et de polyols recontres chez les vegetaux. Les a-galactosides du saccharose pourraient hre des regulateurs osmotiques de certains compartiments cellulaires, compte tenu de leur synthese rapide des les primeres minutes de l'imbibition des graines de Betterave (GENDRAUD et CLOUX, 1979). Cet effet, independamment de l'importance des betaines dans ce domaine (HANSON et NELSEN, 1978) serait assez comparable celui des a-galactosides du glycerol-phosphate decrit chez Ochromonas (KAUSS et QUADER, 1976; KAUSS, 1977; KAUSS et al., 1978).
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