Steroidkonjugate I. Hochspannungs-papierelektrophorese von 17-ketosteroidkonjugaten

VOL. 2 (I957)

CLINICA

CHIMICAACTA

STEROIDKON JUGATE I. HOCHSPANNUNGS-FAPIE~LEKTROPHORESE x7-KETOSTEROIDKON JUGATEN

407

VON

Die chromatographische Trennung von Steroidkonjugaten ist im Gegensatz zur Chromatographie der freien Steroide erst wenig bearbeitet worden. VENNINGund Mitarb.l isolierten Androsteronsulfat aus einem Hamextrakt nach Reinigung an einer Aluminiumoxyd-S~ule; WEST, REICH UND SAMUELS~konnten auf ahnliche Weise Androsteron- und ~tiochol~olonglucuronid gemeinsam aus Ham anreichem und durch nachfolgende Papierchromatographie mit wassergesattigtem Bu tanol weitgehend reinigen. SCHNEIDERund Mitarb.* isolierten Tetrahydrocortisonund Cortexonglucuronid aus einem Ham-Butanolextrakt mit Hilfe der Craig-Verteilung, EDWARDSUNDKELLIE* gelang eine Trennung von Steroidglucuroniden aus Hamextrakt durch Verteilungschromato~aphie an Kieselgel. LEWBAR~UND SCHNEIDER~~~ beschrieben vor Kurzem einige wirksame papierchromatographische Trennungsverfahren ftir Steroidkonjugate*. Die Hauptschwierigkeit bei der Chromatographie von Steroidkonjugaten aus biologischem Material liegt in der vorher notwendigen starken Anreicherung dieser Konjugate gegentiber den vorhandenen Begleitstoffen. Diese St&en infolge ihres grossen Uberschusses die C~omato~aphie oder machen sic vijuig unm~glich. Von EDWARDSUND KELLIE~ wurde eine solche Am-eicherung mit Hilfe eines modifizierten Girard-Umsatzes durchgeftihrt. ‘Dieser erfasst aber nur die Ketosteroidkonjugate und ist zudem nach Angaben der Autoren bei weitem nicht quantitativ. Auf Grund der in den Glucuroniden und Sulfaten vorhandenen leicht dissoziierbaren Sauregruppen war zu erwarten, dass eine Anreicherung und gleichzeitige Trennung durch Elektrophorese moglich ist. W&end diesbez~gliche Versuche mit der Papierelektrophorese bei niederen Spannungen (3 V/cm) nur schlechte Ergebnisse lieferten, brachte die Verwendung der Hochspannungs-Papierelektrophorese (HSPE) mit der von WERNER UNDWESTPHAL~beschriebenen Apparatur eine befriedigende Wanderung und Gruppentrennung von Steroidglucuroniden und -sulfaten. ERGEBNISSE Bei einem Versuch mit Reinsubstanzen** erhielten wir unter Verwendung von Triathanolamin-Acetatpuffer (pH 7.5) nach einer Laufzeit von 3 Stunden und einer * Kurz vor Einsendung der Arbeit wurde uns eine Publikation von 0. CRISPY, M. F. JAYLE

F. MESLIN (Acta Endocrinol.. q (rg57) 233) bekannt, in der eine Trennung van Harn-ITKetosteroidsulfaten und -glucuroniden an einer Aluminiumoxydslule beschrieben wird. Die Entwicklung erfolgte durch la-Butanol mit steigendem Wassergehalt und @titerem Zusatz van Ammoniu~ydroxyd oder Natronlauge. * * Es waren uns nur folgende Steroidkonjugate in Reinsubstanz zuganghch: Androsterons&at, Dehydroisoandrosteronsulfat. Testosteronsulfat, Oestronsulfat in Pufferldsung und kristallisiertes Oestronsulfat. UND

Literafw S. 415

H. PELZER, W. STAIR

408

VOL. 2

(1957)

Spannung von 2400 V (40 V/cm) folgende RB-Werte* : Androsteronsulfat (AS) 0.92 ; Dehydroisoandrosteronsulfat (DHAS) 0.87; Testosteronsulfat (TS) 0.88 und Oestronsulfat (OeS) 0.78 bei einer Wanderungsstrecke des Bromphenolblaus von rg cm (RB = 1.0). Die Lokalisation erfolgte durch Kontaktphotographie (TS) und durch Anfarbung mit Zimmermann-Reagens (AS, DHAS und OeS violett, TS blau). Aus den RB-Werten kann man ersehen, dass sich AS, DHAS und TS unter diesen Bedingungen nicht trennen, wahrend die Abtrennung dieser Sulfate vom OeS quantitativ gelingt (Fig. I). Eine wenn such nicht quantitative Trennung von DHAS und AS erreichten wir Oe:

I

T5

DHAi

Bynphenolblau

kS

5 TS 1

Fig. I. Hochspannungselektrophorese von Oestronsulfat (OeS), Testosteronsulfat (TS), Dehydroisoandrosteronsulfat (DHAS) und Androsteronsulfat (AS) m Vergleich mit Bromphenolblau. Puffer: 0.17 N Triithanolaminacetat pH 7.5, 2400 V (40 V/cm), 24 mA, 3 Stunden. Das untere Bild zeigt eine UV-Kontaktphotographie desselben Pherogrammes. B ist ein Stabilisierungszusatz in der Original-OeS-Losung von Schering.

bei pH 7.5 (1800 V, 30 V/cm) und einer Versuchsdauer von 8.5 Stunden. Der Farbstoff hatte in dieser Zeit eine Strecke von 26 cm zurtickgelegt. Die Fraktionierung eines Harnextraktes durch HSPE ergab ebenfalls mehrere Zimmermann-positive Zonen, von denen eine die Glucuronide von r7-Ketosteroiden enthielt. Zur Gewinnung des Harnextraktes wurden 4 Versuchspersonen an zwei aufein* Bei allen Elektrophoresen liessen wir neben den Konjugaten eine Probe Bromphenolblau mitlaufen. Seine Wanderungsgeschwindigkeit ist bei gleichbleibender Spannung zeitlich konstant. Die intensive Farbe dieses Indikators bei alkalischem pH ermdglicht eine standige Kontrolle des Versuches. (Vergl. such die kiirzlich erschienene Arbeit iiber die Hochspannungselektrophorese von PFLEIDERER UND WIELAND~.) Litevatur s. 415

VOL. 2 (1957)

STEROIDKONJUGATE

I

409

anderfolgenden Tagen mit je IOO mg Testosteronpropionat i.m. injiziert. Vom Zeitpunkt der Injektion ab wurde 4 Tage lang der Ham gesammelt und nach Zugabe von Ammoniumsulfat mit Ather - Athanol (3 : I) extrahiert O. Mit dem Eindampfriickstand fiihrten wir eine modifizierte Girard-Trennung durch 4 und unterwarfen die ketonische Fraktion nach einer Verteilung zwischen Butanol und Wasser der

Fig. 2. Hochspannungselektrophorese

eines durch Girard-T-Reagens angereicherten Harnextraktes. Puffer: Triathanolaminacetat 0.17 N, pH 7.5, 2300 V (38 V/cm), 25 mA 31/r Stunden. (a) UV-Kontaktphotographie; (b) Anfarbung mit Zimmermann-Reagens auf r7-Ketosteroidc. Nahere Erlauterung im Text; (c) Graphische Darstellung der Verteilung der Gesamtglucuronsaure im Pherogramm.

HSPE. Die Elektrophoresebedingungen waren die gleichen wie bei der Versuchen mit Reinsubstanzen (3 Std.). Fig. za zeigt eine Kontaktphotographie des fertigen Elektropherogramms ; Fig. zb bringt die Lage der durch Anfarbung mit ZimmermannReagens sichtbar gemachten Zonen. Zu diesem Zweck haben wir nur den Teilstreifen A angefarbt und nachher im Vergleich mit der Kontaktphotographie die Fortsetzung der Zonen auf Streifen B eingezeichnet. Zur Ermittlung der Lage der Glucuronide zerschnitten wir den Streifen B in I cm breite Segmente und bestimmten hierin mit einer modifizierten NaphthoresorcinMethode die Gesamtglucuronsaure. Die dabei erhaltene Konzentrationsverteilungist in Fig. 2c wiedergegeben. Von den Zonen I, II, III, IV und VI, die alle mit Zimmermann-Reagens eine typische (violette) Farbe fur IT-Ketosteroide ergeben hatten, enthielt ‘demnach nur Zone II Glucuronsaure. Zone III stimmte in ihrem RB-Wert (0.90) mit der Zone von AS, DHAS und TS in dem Versuch mit Reinsubstanzen tiberein. Zone V farbte sich mit Zimmermann-Reagens intensiv gelb. Litcratur s. 4r5

H. PELZER, W. STAIR

4x0

VOL. 2 0957)

Urn zu klaren, ob Zone II 17”Ketosteroidglucuronide und Zone III r7-KS-Sulfate enthielt, schnitten wir von zwei Elektropherogrammen desselben Extraktes die beiden Zonen aus, eluierten mit Wasser und Methanol, dampften im Vakuum zur Trockene und hydrolysierten den Eindampfrtickstand nach Losung in Acetatpuffer (pH 5.0) nacheinander mit j3-Glucuronidase und BaCl,lO. Nach den einzelnen Hydrolysestufen wurde mit Chloroform extrahiert und von den eingedampften oganischen Phasen ein Teil fiir die Bestimmung der 17-KS entnommen (Tab. I). Die Bestimmung der “freien 17-KS” erfolgte durch Chloroformextraktion der Pufferlosung vor Zugabe des Fermentes. TABELLE I GEHALT

DER

ELEKTROPHORESE-ZONEN UND

11 UND

GEBUNDENEN

III DE5

HARNEXTRAKTES

Glucuronsdwe-

geebundene 17-KS Zone II Zone III

22.5 Y 15.0 Y

AN

FREIEN

IT-KETOSTEROIDEN

412.5 Y 0.0 y _-.

-I

Durch BaCl, frei-

gesetzte17-KS IO.0 y 10.0 y

Die fast negativen r7-KS-Werte nach BaCl,-Hydrolyse veranlasste uns, dieses Verfahren mit Reinsubstanzen n%her zu iiberpriifen. Wir fanden, dass unter den von uns eingehaltenen Bedingungen DHAS quantitativ gespalten wird, wahrend AS bei der Einwirkung von BaCl, kein atherlosliches r7-Ketosteroid liefert (vergl. such Literaturang. ll). Den Rest der durch ~-Glucuronidase freigesetzten 17-Ketosteroide in Zone II priiften wir mit der Papierchromatographie in Propylenglykol/Benzin auf seine qualitative Zusammensetzung. Wir fanden ungefghr gleiche Mengen Androsteron und Atiocholanolon. Eine im Vergleich zu deren Konzentration sehr kleine Menge zweier starker polarer Verbindungen (kleinere RF-Werte) farbte sich durch das Zimmermann-Reagens blau bis brsunlich. Uber ihre chemischen Strukturen konnen wir noch keine Angaben machen. In dem Extrakt eines Normalhames ist die Zone II weniger intensiv. Urn such hier fur nachfolgende Hydrolyseversuche oder fur die Papierchromatographie grossere Mengen der so vorgereinigten Steroidkonjugate zu erhalten, haben wir nach den Verfahren fiir die Angaben von WIELAND UND PFLEIDERER** ein praparatives Hochspannungselektrophorese von Steroidkonjugaten ausgearbeitet. WHhrend die 17-Ketosteroidsulfate (Versuche mit Reinsubstanzen) von St&kc: zu sehr adsorbiert werden, brachte die Verwendung von Zelluiosepulver als Tragersubstanz sehr zufriedenstellende Ergebnisse. Wir konnten bei einer Auftragebreite von IO cm noch 3.5 mg AS ohne Uberladungseffekte elektrophoresieren. Bei Verwendung von Filterpapier dagegen traten bereits zwischen 200 und 300~ Konzentrationsstorungen auf. DISKUSSION

Der Versuch, den anzuwenden,

die Vorteile der Papierelektrophorese auf die Trennung von Steroiwurde schon vor langerer Zeit von SCHR~DER und Mitarb.la be-

* Herrn Prof. Dr. WIELANDnnd Herrn Dr. PFLEIDERER (Frankfurt) sei nochmals gedankt fiir die pcrsbnliche Einf~hrung in die Technik der pr¶tiven Hochspannungselektrophorese. Lilerralur S. 415

VOL. 2 6957)

STEROIDKO~JUGATE I

4x1

schrieben. Diese Autoren setzten einige Steroide, soweit sie Hydroxylgruppen enthielten, mit Bemsteinstiureanhydrid zu den entsprechenden Bemsteins&ure-Halbestem um und brachten damit das Steroidmolekiil in Verbindung mit einer im alkalischen Milieu dissoziierbaren Gruppe. Die verschiedenen W~demn~geschwindigkeiten solcher BemsteinsZure-Halbester in der Papierelektrophorese (IO V/cm) ergab eine MGglichkeit, verschiedene Steroide voneinander zu trennen und zu charakterisieren. Auf Cihnliche Weise gelang es MCKINLEY Is, Testosteron, Progesteron und Oestron nach Umsatz mit Girard-Reagens T durch Papierelektrophorese bei niederen Spannungen zu trennen. Die Anwendung des Verfahrens von SCKR~DER~~ auf die Analyse von Oxysteroiden aus Ham brachte zwar eine erhebliche Arbeitszeitverk~rzung, war aber in Bezug auf Genauigkeit und AuflBsungsvermijgen den bislang bekannten chromatographischen Methoden fi.ir freie Steroide kaum iiberlegen. Dies ist in erster Linie auf den zweifachen chemischen Eingriff zuriickzufiihren, der bei den Hamsteroiden vor einer Elektrophorese durchgeftihrt werden musste, ngmlich die Hydrolyse der Steroidkonjugate und spgiter der Umsatz der freien Steroide mit Bemsteins~ureanhydrid. Da aber such die unver~nderten Konjugate, soweit es sich urn Glucuronide und Sulfate handelt, dissoziierbare Gruppen enthalten, lag der Gedanke nahe, unter Umgehung der beiden chemischen Umsetzungen die unversnderten Konjugate durch Elektrophorese zu trennen. Das von uns beschriebene Verfahren der Hochspannungs-Papierelektrophorese von Steroidkonjugaten bringt eine Reihe von neuen M~glichkeiten fiir die Analyse von Hamsteroiden, da diese zum g&sten Teil als Konjugate ausgeschieden werden. So werden die Vorteile der Papierelektrophorese zur Trennung von Steroiden ausgenutzt, ohne dass irgend eine chemische Vergnderung der mit dem Harn ausgeschiedenen Verbindungen nijtig ist. Femer ermijglicht die Hochspannungselektrophorese eine quantitative Anreicherung der Steroidkonjugate aus biologischen EXtrakten zur nachfolgenden chromatographischen Analyse. Andere Methoden, wie z.B. die Ausf%llung der Glucuronide mit basischem Bleiacetat’* oder die Reinigung der Ketosteroidkonjugate durch Umsatz mit Girard-Reagens T*, lb sind zwar geeignet, bestimmte Konjugatgruppen anzureichern, sie erfassen aber niemals das gesamte “Spektrum” der ausgeschiedenen Steroidkonjugate. Die Hochspannungselektrophorese wird ferner die Frage beantworten lassen, ob ausser den Monoglucuroniden und Monosulfaten, die bisher als einzige Steroidkonjugate bekannt sind, noch andere wasserlijsliche Steroidkonjugate im K&per gebildet und ausgeschieden werden. Die Zonen I und VI in Fig. 2b enthalten keine GlucuronsZure und unterscheiden sich von Zone III, die den Sulfaten entspricht, so stark in ihren Wanderungsgeschwindigkeiten, dass man hier das Vorliegen anderer Steroidkonjugate bzw. -derivate vermuten kann. Die Bildung solcher unbekannter Konjugationsformen ist von anderen Autoren schon wiederholt diskutiert wordenle, I’+ l*. Wir haben in der vorliegenden Arbeit als Anwendungsbeispiel der HSPE auf eine biochemische Fragestellung den Extrakt eines Harnes von Patienten gewHhlt, die mit griisseren Mengen Testosteron behandelt worden waren. Aus den Arbeiten von SAMUELS und Mitarb.* und von EDWARDS UND KELLIE* war bekannt, dass Testosteron im K&per vomehmlich zu Androsteron und litiocholanolon abgebaut und als deren Glucuronide ausgeschieden wird. Die damit zu erwartende relativ hohe Konzentration dieser beiden Konjugate im Extrakt konnten wir noch erhijhen durch eine Umsetzung mit Girard-Reagens T 4. Dadurch erhielten wir fi.ir die elektrophoreLitmatur S. 415

412

R. PELZER, w. STAIB

VOL. 2 (x957)

tischen Versuche einen Extrakt, der im Vergleich zu normalen H~extrakten vie1 I7-KS-Glucuronide enthielt. Hit diesem modifizierten Extrakt konnten dann Elektropherogramme erhalten werden, die bei der Anfarbung mit ZIMMERMANN-Reagens eine sehr intensiv gef5rbte Zone II (das sind die Glucuronide von Androsteron und iitiocholanolon) ergab. Dies ermijglichte uns, ohne den Einsatz von Reinsubstanzen die W~de~ngsges~hwindigkeit dieser beiden r7-KS-Konjugate zu bestimmen und gleichzeitig zu zeigen, dass Begleitstoffe aus dem Harn die Hochsp~nungselektrophorese von Steroidkonjugaten praktisch nicht beeinflussen. Versuche mit gewijhnlichen Butanolextrakten aus Normalharnen lieferten Ihnlithe Pherogramme wie das in Fig. z wiedergegebene. Infolge der geringeren Konzentration an x7-Ketosteroiden waren die Zimmermann-positiven Zonen schwHcher und erforderten jeweils die Aufarbeitung einer grosseren Zahl Elektrophero~amme zu ihrer weiteren Ch~akterisie~ng, Faber Einzelheiten werden wir an anderer Stelle berichten. EXPERIMENTELLE ANGABEN Substanzen und analytische Bestimmungsmethoden Androsteronsulfat (AS). Dehydroisoandrosteronsulfat (DHAS) und Oestronsulfat @es) in PuBEerliisung von der Schering A.G., Berlin. OestronsuIfat in krist. Form von der CIBA A.G.. WehrjBaden *. Testosteronsulfat ITS). dargestellt analog der DHAS-Svnthese von TALBOT*~. Bromphenolblau (Merck). B-Glucuronidase. Wir verwendeten einen Kalbsleberextrakt. der fur uns von den BaverWe&en in Elberfeld hergestellt wurde. Er enthielt 70,000 Fishmann-Einheiten/g Trocke&ubstanz* *. Puffer fiir die Elektrophorese: 50 ml Tri~thanolamin (Schuchard) wurden mit Wasser auf zooo ml verdtinnt und unter Riihren mit Eisessig auf pH 7.5 gebracht. Verbrauch ~a. 14 ml. Anfarbung der Papiere mit Zimmermann-Reagens auf r7-Ketosteroide: I Vol. einer Ldsung von 7 g KOH in 50 ml go%-igem Athanol und I Vol. einer 2%-igen Bthanolischen m-Dinitrobenzolldsung (Merck) wurden vereinigt, kurz gemischt und der Papierstreifen durchgezogen. Nach Vortrocknen mit Filterpapier wurde mit einem Heissluftfijhn solange erhitzt, bis die violetten r7-KS-Flecken deutlich hervortraten. Das Ganze konnte zur Verdeutlichung der Flecken noch einmal wiederholt werden. Das Reagens war nicht liinger als i/r Stunde haltbar. Besti~ung der I 7-Ketosteroide im ~~ngedampften Chloroformextrakt *o: Die eingedampften Extrakte wurden in 2 ml aldehydfreiem Athanol gel&t, mit z ml 2%-iger ~thanolischer M Dinitrobenzollosung versetzt und nach Zugabe von 2 ml 3N wassriger KOH go Min. lang bei 25” C im Dunkeln stehen gelassen. Danach wurde der Farbkomplex mit 5 ml Ather extrahiert, die Atherschicht durch ein Faltenfilter filtriert und in Kiivetten von 20 mm Schichtdicke bei 500 m,e colorimetriert. Die Farbkorrekturen erfolaten nach den Angaben von ZIMMERMAN~~. Bestimmung der Gesamtglucuron&ure im Filterpapier: Die ausgeschnittenen Papierstreifchen wurden mit einer Schere zerkleinert und in Reagensglasern */r-1 Std. mit z ml Wasser versetzt. Nach der Zugabe von z ml Naph~or~orcinreagens und 4 ml 30 vol.%-iger H,SO, beliessen wir die Glaser i/s Std. in einem kochenden Wasserbad, kiihlten sie dann mit Leitungswasser wieder ab und set&en nacheinander 8 ml Toluol und z ml dthanol zu. Unter Verschliessen wurde nun 15 sec. krlftig geschiittelt und nach der Trennung der beiden Schichten die Toluolphase durch ein Faltenfiliekhen filtriert. Die Colorimetrie erfolgte bei 570 m/A mit Kiivetten von IO mm Schichtdicke in einem Zeiss-Spektrophotometer. Darstelluna des Nanhthoresorcin-Reaaenses: In dest. Wasser wurden 0.5% Nanhthoresorcin (Merck) suspen&ert mid-2 Min. im kochendem Wasserbad erhitzt. Nach dem’Abk&hlen und Filtrieren liessen wir die schwach gelb gefarbte L&sung in einer offenen Flasche iiber Nacht bei o* stehen. Die dadurch erreichte Chi~onbildung ge>e in der Regel fur eine Glucuronslurebestimmung zwischen I und IOOy (vergl.2i). Hydrolyse mit ,%Glucuronidase und Bariumchlorid : Der zu hydrolysierende Rtickstand * Wir danken der CIBA-A.G. fiir die freundliche Uberlassung von kristall. Oestronsulfat. * * Auch an dieser Stelle wollen wir Herrn Prof. Dr. AUHAGEN bei den Bayer-Werken in Wuppertal unseren aufrichtigen Dank fiir die grosszugige Uberlassung von 36.7 Mill. Einheiten ~-Glucuronidase aussprechen. Literatur s. 415

VOL.2 (1957)

STEROIDKONJUGATE

i

413

wurde in 25 ml 0.1 N Acetatpuffer, pH 5.0, gel&t und zur Entfernung der freien Steroide 3 ma1 mit IO ml Chloroform ausgeschtittelt. Nach dem Waschen der organischen Phasen mit 5 ml Puffer set&en wir den vereinigten wlssrigen Phasen 8000 E. j%Glucuronidase (gel&t in 5 ml Puffer) zu, unterschichteten mit 25 ml Chloroform und liessen 4 Tage bei 37” stehen. Nun wurde erschopfend mit Chloroform extrahiert und der Extrakt wie bei den freien Steroiden auf den r7-KS-Gehalt analysiert. In der wassrigen Phase losten wir I g BaCl,/ro ml, erhitzten 4 Std. unter Rtickfluss im kochenden Wasserbad und extrahierten dann mit 3 ma1 r/z Vol. Tetrachlorkohlenstoff. Der eingedampfte Extrakt kam dann ebenfalls zur r7-KS-Bestimmung. Bei den Hydrolyseversuchen mit Reinsubstanzen lbsten wir AS bzw. DHAS (je 5007) in 25 ml Acetatpuffer, setzten 3 g BaCl, zu und erhitzten 4 Std. auf dem kochendem Wasserbad. Im Rtickstand des Ccl,-Extraktes erfolgte die r7-KS-Bestimmung. Beschreibung der Hochspannungs-Papierelektrophorese

(HSPE)

(a) Appavatur. Die Elektrophoresekammer wurde von Dr. VIRUS K.G., Bonn/Rhein geliefert. Die von uns gebaute elektrische Hochspannungsanlage entspricht im Prinzip der friiher beschriebenenze. Durch Verwendung zweier parallel geschalteter Transformatoren (220 V + 5000 V), von denen jeder acht Abgriffe hat (1.5; 2.0; 2.5 U.S.W. bis 5.0 KV), und eines im Primarkreis eingeschalteten Regelwiderstandes sind wir in der Lage, die Hochspannung von 1.5 bis IO KV zu variieren. Bei hoheren Stromstirken als 15 mA liegt die untere Spannungsgrenze tiefer. Die Ktihlung der Elektrophoresekammer erfolgt mit einem Kiihlaggregat, das von der Firma LindeKaltemaschinen aufgestellt wurde. (b) Durchfiihrung der Vevsuche. Das Elektrophoresepapier (Schleicher u. Schiill Nr. zo43b) wurde gut mit Puffer getrlnkt und der Pufferiiberschuss auf einer Plexiglasplatte leicht herausgewalzt. Den noch sehr feuchten Streifen legten wir auf die Ktihlkammer und entfernten die Luftblasen zwischen Papier und Kammer mit Hilfe einer Handwalze. Dann wurde durch starke Kiihlung (-12 bis --IS”) der Puffer im Streifen zum Gefrieren gebracht und das Substanzgemisch, gel&t in Puffer, aufgetragen. Bei den Versuchen mit Reinsubstanzen fror die aufgebrachte Losung fast augenblicklich ein, wlhrend beim Harnextrakt eine geringe Diffusion eintrat. Nun tauten wir bei abgeschalteter Ktihlung mit einem Fohn den ganzen Streifen wieder auf, stellten mittels der Diaphragmen die elektrische Verbindung mit den Elektrodenraumen her, deckten mit der Glasplatte ab und schalteten den Strom ein. Jetzt konnte such die Ktihlung wieder eingeschaltet werden (-8 bis -IO”). Nach Beendigung des Versuches entferneten wir die Diaphragmen und trockneten bei abgeschalteter Kiihlung den Papierstreifen, ohne ihn von der Kiihlkammer zu nehmen, mit einem Heissluftfohn so weit, bis ein Verwaschen der Zonen nicht mehr zu befiirchten war. Dann erst wurde er mit Wascheklammern zum Trocknen an der Luft aufgehangt. Bereitung des Harnextraktes In dem mit etwas Toluol konservierten und bis zur Verarbeitung bei o” aufbewahrten Harn (insgesamt 12.5 1) wurden 500 g Ammoniumsulfat pro Liter gel&t und die Losung 3 ma1 mit iis Vol. Ather-Athanol (3 : I) ausgeschtittelt. Nach dem Eindampfen des Gesamtextraktes im Vakuum trockneten wir den Riickstand im Vakuum iiber P,O, und erneuerten das Trockenmittel so oft, bis es keine neue Feuchtigkeit mehr aufnahm. Den dunkelbraunen Rtickstand losten wir in 200 ml abs. Methanol (iiber Magnesiumspanen destilliert) und setzten r.5 g frisch umkristallisiertes und gut getrocknetes Girard-Reagens T sowie 20 ml Eisessig zu. Nun kochten wir IOO Min. unter Riickfluss (mit Trockenrohr), liessen 3 Std. bei Raumtemperatur stehen und gossen dann die Losung in 1000 ml einer auf 10~ abgektihlten 0.325 N NaOH (130 ml 2.5 N NaOH mit Wasser auf 1000 ml aufgefiillt). Urn den gewiinschten pH von 6-7 zu erreichen, mussten noch einige ml 2.5 N NaOH zugesetzt werden. In der so erhaltenen neutralen Ldsung losten wir 120 g Ammoniumsulfat (p.a.) und extrahierten I ma1 mit 200 ml Ather und 3 ma1 mit 500 ml AtherAthanol (3 : I). Die vereinigten organischen Phasen waren tief rotbraun geflrbt, ebenso die wassrige Phase. Diese wurde nun mit i/* konzentrierter HCl unter Riihren auf pH 2 gebracht (Verbrauch 78 ml) und mit zusatzlich 8 g Ammoniumsulfat versetzt. Nach einer Einwirkungszeit von I Std. bei Raumtemperatur und 3 Std. bei o” wurde mit 3 ma1 500 ml Ather-Athanol (3 : I) ausgeschiittelt und der vereinigte Extrakt zur Entsauerung 5 ma1 mit IOO ml Wasser-AthanolAmmoniumsulfat (1000 : 150 : 500; Vol./Vol./Gew.) gewaschen. Der pH der letzten Portion war 4.5. Die Ather-Alkohol-Schicht engten wir nun im Vakuum bis zum dicken Sirup ein und l&ten diesen in Methanol bis zu einem Gesamtvolumen von IOO ml. Eine 17-KS-Bestimmung nach Zimmermann ergab einen Gehalt von 150 mg r7-Ketosteroide. Verteilung zwischen Wasser und Butanol: 6 ml der methanolischen Losung wurden mit 150 ml Wasser verdiinnt, mit ro%-iger NaOH auf pH g-10 gebracht und zur Entfernung der freien Steroide 3 ma1 mit 60 ml Ather ausgeschtittelt. Der wassrigen Phase setzten wir nun I g NaHCO, zu, extrahierten 3 ma1 mit 60 ml n-Butanol, wuschen das vereinigte Butanol mit 2 ma1 IO ml Wasser und dampften es im Vakuum ein. Der Trockenriickstand kam nach Losen in wenig Triathanolamin-Acetatpuffer in mehreren Proben zur HSPE. Literatur S. 415

H. PELZER,W. STAIB

414

VOL. 2 (1957)

ZUSAMMENFASSUNG

Eine Gruppentrennung von Steroidglucuroniden und -sulfaten ist mit der Hochspannungs-Papierelektrophorese moglich. In einem Tri~th~ol~in-Acetatpuffer pH 7.5 zeigen die Sulfate von Androsteron, Dehydroisoandrosteron und Testosteron fast gleiche Wanderungsgeschwindigkeiten und sind Ieicht von dem langsamer wandernden Oestronsulfat sowie den Glucuroniden des Androsterons und Atiocholanolons abzutrennen. Die Hochspannungselektrophorese eines nicht hydrolysierten Harnextraktes ergab ftinf Zonen mit positiver Reaktion auf x7-Ketosteroide. Nur eine von diesen enthielt Glucuronsaure. Sie bestand in der Hauptsache aus Androsteronund Atiocholanolonglucuronid. SUMMARY

Group separation of the glucuronides and sulphates of steroids is possible with high-voltage paper electrophoresis. In a trieth~ol~ine-acetate buffer, pH 7.5, the sulphates of androsterone, dehydroisoandrosterone, and testerone, showed nearly equal velocities and can easily be separated from both the more slowly migrating oestrone sulphates or the glucuronides of androsterone and aetiocholanolone. The high-voltage electrophoresis of a non-hydrolysed urine extract showed five zones with positive reactions on r7-keto-steroids. Only one of these contained glucuronic acid. It consists mainly of androsterone and aetiocholanolone glucuronide.

R&SUM6

L’electrophorese sur papier a haute tension permet la separation par groupes des glucuronures et des sulfates de steroides. Les sulfates d’androsterone, de dihydroiso-androsterone et de testosterone se deplacent a des vitesses pratiquement Cquivalentes dans une solution-tampon d’acetate de triethanolamine ajustee au pH 7.5 et peuvent Ctre ainsi facilement s&pares du sulfate d’oestrone et des glucuronures d’androsterone et d’btiocholanolone qui se deplacent plus lentement. L’electrophorese ?r haute tension dun extrait d’urine non hydrolyse a fait apparaitre cinq bandes dans lesquelles la reaction aux x7-cetosteroides Ctait positive. Une seule de ces bandes renfermait de l’acide glucuronique. On y retrouvait principalement des glucuronures d’androsterone et d’etiocholanolone.

PE3IOME ~pyllROBOe

p~fZAtSHUe

CTepO%i~~AyiC~HUdOBU

CTepOM.~rA~~OHHdCyAb~aTOBBO3MOH(HO

6y~am10ro aAeaTpo+opeaa BLGCOKUM HanpmcermeM. TIpn TpmTanonamaaJaeTamoM 6ymepe pH 7.5, cynb@am awpomepoHa, ,aern..qxmoaw~pomepona u TeeTomepona IIMeIOT novns wewruwhre CKOpOCTll mrpagriri Ii AerKO OT&eAKEOTCS OT 6oAee

npu

no~ow

Metlheswbrx scTepoHcyAb@aToB,

a Tax~eoTrAyKyp0~~~0~a~pocTep0nansTzfoxonarioAotia.

BAeKTpO+Ope3 BbICOKIlM Hanp~e~eMHe-nWpOtul3Etp~~Oro IUiTb 3OH C EIOAOXGiTeA woof peaKgsie& Ha I7-Ke~ocTep0~. "yEyPOEiOB)no AOEEAyKypOHUda.

Literatuv S. 415

KWAOTy

M COCTORAP,

I‘naBHblM 06pa3OM,

MOqeBOl-0 SKCTparCTaBWIBZiA TOAbKO o,wia 3oHa co,ziepxcaAa M3 aHJQlOCTepOH- Ei BTEIOXOAaHO-

VOL.

2 (1957)

STEROIDKON

JUGATE

I

4x5

LITERATUR I E. H. VENNING, M, M. HOFFMAN UND J. S. L. BROWNE, J. Biol. Chem., 146 (rgqz) 369. 2 C. D. WEST, H. REXCH UND L. T. SAMUELS, J.&al. Chem., rg3 (rggx) 2x9. 3 J. J. SCHNEIDER, M. L. LEWBART, P. LEVITAN UND S. LIEBERMAN, J, Am. Chem. Sot., 77

(1955) 4184. 4 R. W. A. EDWARDS UND A. E. KELLIE, C&m. & Ind. (Londolz), (1956) 250. 5 M. L. LEWBART UND J. J. SCHNEIDER, Nature, 176 (1955) 1175. 6 J. J. SCHNEIDER UND M. L. LEWBART, J. Biol. Chem., 222 (1956) 787. 7 G. WERNER UND 0. WESTPHAL, Anger. Chem., 67 (x955) 251. 8 TH. WIELAND UND G. PFLEIDERER, A+zgem. Chem., 69 (1955) Iqg. Q N. W. H. EDWARDS, A. E. KELLIE UND A. P. WADE, hfena. Sot. Endocrind., No. z (1953) 53. 10 N. B. TALBOT, J. RYAN UND J. K. WOLFE, J. Biol. Chem., 148 (1943) 593. I I S. LIEBERMAN, B. MOND UND E. SMYLES, Recent Progress in Hormone Research, Vol. g, Acade12 13 14 15 16 17 18 rg

20 ZI 22

I&C PreSS InC., New York, 1954, p, 113. W. SCHR~DER, K. D. Voro~ UND 1. BECKXANN, 2. Bhysiol. Chem., 302 (x955) 63. W. P. MCKINLEY, .%ence. 121 (1955) 139. H. PELZER, unveroffentlichte Versuche. J. B. ONESON UND S. L. COHEN, ~ndocr~~o~ogy, gr (1952) 173. S. LIEBERMAN, P. BRAZEAU UND L. B. HARITON, J. Am. Chem. Sac., 70 (I&) 5094. C. H. EADES, JR., R. L. POLLACK UND J. S. KING, JR., Federatiolz Proc. 13 (1954) 201, zitiert nach P. B, HUDSON UND M. E. LOMBARDO, J. Cl&. Endocrinol and Metabolism, 15 (1955) 324. K. D. VOIGT UND W. SCHROEDER, Nattire, 176 (1955) 599. TH. WIELAND UND G. PFLEIDERER, Angem. Chem., 67 (1955) 257. W. ZIMMERMANN, H. U. ANTON UND D. PONTIUS, Z. $+siol. Chem., 289 (1952) 91. N. E. ARTZ UND I?. M. OSMAN, Biochemistry of Glucttronic Acid. Academic Press Inc., ?iew York, 1950, p. 7. P. TURBA, H. PELZER UND H. SCHUSTER, 2. $8ysiol. Claem., 296 (1954) 97. Eingegangen

den 4.

Juni rg57