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Structure primaire de l'histone riche en glycine et en arginine isolée de la tumeur de chloroleucémie du Rat
BIOCHIM1E, 1971, 53, 479-483.
Structure primaire de l'histone riche en glycine et en arginine isolde de la tumeur de chloroleuc6mie du Rat, p a r P i e r r e SAUTIERE (*), Dani6ie T v n o u , Yves MOSCHETTO (**) et G6rard BtSEnTn~ (***). ( U n i t d d e R e c h e r c h e s n ° 16 d e I'I.N.S.E.R.M. s u r la B i o c h i m i e Place de Verdun, 59-Lille).
des Prot~ines,
(19-4-1971/26-5-1971).
S u m m a r y . ~ The primary structure of the glycine-rich, arginine-rich histone isolated from the ehloroleukaemic tumor of the rat has been established. The amino-acid sequence deduced from the study of the tryptic peptides and of the COOH-terminal fragment resulting from cleavage wi~h cyanogen bromide, is identical to that of homologous histories isolated from calf thymus and hog thymus.
INTRODUCTION. Les a c q u i s i t i o n s r6eentes sur la s t r u c t u r e prim a i r e de r h i s t o n e riche en glycine et en a r g i n i n e (GAR-histone) isol6e du t h y m u s de Veau Eli, de l ' e m b r y o n de Pots [2] et du t h y m u s de Pore [3, 4] nous ont m o n t r 6 la r e m a r q u a b l e c o n s t a n c e de eette structure, quel que soit le tissu ou l'esp6ee. I1 nous a p a r u int6ressant de c o n n a i t r e si cette i n v a r i a b i l i t 6 de la structure p r i m a i r e se conservait dans u n e GAR-histone iso16e d ' u n tissu n6oplasique, s a c h a n t que les histones sont impliqu6es dans le contrSle de l'activit6 g6n6tique et que, lors du processus de canc6risation, la eellule canc6reuse se m u l t i p l i e hors de tout eontr61e de l'organisme hSte. Nous avons d o n e isol6 la GAR-histone de la tt~meur de ehloroleuc6mie du Rat et nous en avons d O e r m i n 6 la s t r u c t u r e p r i m a i r e en deux 6tapes. L'6tude du p e p t i d e COOH-terminal lib6r6 de la prot6ine p a r action du b r o m u r e de cyanog6ne au n i v e a u de son u n i q u e r6sidu de m6thionine, eonstituait la p r e m i 6 r e 6tape de eette d o e r m i n a t i o n e t a 6t6 expos6e dans u n e pr6c6dente c o m m u n i c a t i o n [5]. Dans u n second temps, nous avons 6tudi6 les peptides de l ' h y d r o l y s a t t r y p s i q u e de la prot6ine et, p a r c o m p a r a i s o n avec les peptides t r y p s i q u e s de l~a GAR-histone de t h y m u s de Veau [6] et de (*) Charg6 de Recherches au C.N.R.S. ('*) Maitre de Recherehes h I'I.N.S.E.R.M. (*'~) Professeur de Biochimie Pathologique h la Facult6 de M6deei.ne de Lille.
t h y m u s de Pore, nous avons 6tabli la s6quence compl6te en acides amin6s de la GAR-histone de chloroleuc6mie. MATI~RIEL ET Mt~THODES. Les t u m e u r s de chloroleuc6mie du Rat ont 6t6 fournies par l ' I n s t i t u t de Recherche sur le Cancer ( 5 9 - L i l l e , F r a n c e ) . La t u m e u r de chloroleuc6mie est u n sarcome l y m p h o b l a s t i q u e lransmis p a r i m p l a n t a t i o n sous-cutan6e d ' u n greffon dans la r6gion dorso-lombaire de l ' a n i m a l (Rat Wistar, 250 g). EHes sont p l a c f e s dans la neige c a r b o n i q u e i m m 6 d i a t e m e n t apr6s leur abl,ation et sont conserv6es h - - 20°C j u s q u ' a u m o m e n t de leur emploi. Preparation des histones.
Toutes les op6rations sont effectu6es h + 4°C. Les t u m e u r s (200 g) sont 6 m i n c f e s et homo~ g6n6is6es p e n d a n t 2 m i n u t e s dans 2 litres d ' u n e solution de saccharose 0,25 M _ CaC12 0,003 M, h l'aide d ' u n appareil de type Packard. L,homog6nat est filtr6 sur 4 6paisseurs de gaze et centrilug6 h 1100 g p e n d a n t 30 minutes. Le s6diment est lav6 deux lois avec u n litre de solution de saocharose 0,25 M - CaC12 0,003 M, p a r homog6n6isation et c e n t r i f u g a t i o n h 1100 g p e n d a n t 30 minutes. Les n o y a u x ainsi obtenus sont purifi6s par homog6n6isation dans 250 ml d ' u n e solution de saccharose 2,2 M e t c e n t r i f u g a t i o n h 36 000 g pend a n t 90 m i n u t e s . Le s6diment constitu6 p a r les n o y a u x purs est lav6 trois fois avec 500 m l de NaC1 0,14 M , citrate
P. S a u t i ~ r e , D. T y r o u , Y. M o s c h e t t o et G. B i s e r t e .
480
Na 0,01 M, p H 7,1, une fois a v e c 50,0 ml de tamp o n Tris 0,1 M, pH 7,6 et deux fois avec 500 ml d'~thanol fi 80 p. cent, toutes ces o p 6 r a t i o n s de lavage s'effeetuant p a r h o m o g 6 n 6 i s a t i o n et c e n t r i fugation h 110,0 g p e n d a n t 15 minutes.
La c o m p o s i t i o n en acides amin6s de la GARhistone de c h l o r o l e u c 6 m i e est pr6sent6e dans le tableau I.
L e d e r n i e r s6diment obtenu est constitu6 p a r les d 6 s o x y r i b o n u c l 6 o p r o t 6 i n e s dont on e x t r a i t les histones r i c h e s en a r g i n i n e ( F r a c t i o n s Fo,. 1 et F2,_2) , selon la m6thode de JOHNS h pH 7,0 [7].
L'identit6 de cette c o m p o s i t i o n avec celle de la GAR-histone de t h y m u s de veau [6] et l,a r e m a r quable s i m i l i t u d e des d i a g r a m m e s d'61ution des p e p t i d e s t r y p s i q u e s (figure 1 et [6]) sont d6jh en
RI~SULTATS
ET
DISCUSSION.
TABLEAU I.
Composilion en acides aminds de l'histone r i c h e en glycine el en arginine (GAR-histone) isoI~e de Ia l u m e u r de chIoroleuc~mie du Rat el dn l h y m u s de Veau. (R6sultats en hombre de r~sidus par mole). GAR-histone de chloroleuc6mie
Acides amin6s
Acide aspartlque ..................... Thr6onine ........................... S6rine .............................. Acide glutamique .................... Proline Glycine ............................. Alanine ............................. 112 cystine ......................... Valine .............................. M6thionine .......................... Isoleucine ............................ Leucine .............................. Tyrosine ............................ Phdnylalanine ....................... Lysine ............................... M~thyllystne ........................ Histidine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Arginine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5 7 2 6 1
17 7 0 9
1 6 8 4
2 10 .
.
.
.
.
Tryptophanne (') . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nb total de r6sidus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............................ A.A. Bastques/A.A. Aeides . . . . . . . . . . . . .
Lys/Arg
GAR-histone de veau
de t h y m u s
Is] 5 7 2 6 1
17 7 0 9 1
6 8
4 2 10
1
1
2
2 14 0
14
0 102 0,78 2,45
102 0,78 2,45
(*) D~termin6 par la m6thode colorim6trique de SPIEset (~HAMBERS [9]. L ' h i s t o n e r i c h e en g l y c i n e et en ~ r g i n i n e (GARhistone) est isol6e de la f r a c t i o n F2a_l p a r c h r o m a t o g r a p h i c de gel~filtration sur une c o l o n n e de S e p h a d e x G-100 (195 × 2,5 cm) 6quilibr6e et 6lu6e avee de l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e 0,01 N r81. La purer6 de nos p r 6 p a r a t i o n s d ' h i s t o n e est contr616e p a r 61ectrophorbse en gel de p o l y a c r y l a m i d e fi p H 4,5 [51.
D~termination de la sJquence des acides amines. Les m6thodes utiiis6es p o u r la d 6 t e r m i n a t i o n de la s t r u c t u r e p r i m a i r e de la GAR-histone de c h l o r o leuc6mie ont 6t6 d6crites p r 6 c 6 d e m m e n t [6].
BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 4.
f a v e u r d ' u n e 6troite analogie de s t r u c t u r e e n t r e les deux histones. La carte p e p t i d i q u e de l ' h y d r o l y s a t t r y p s i q u e de GAR-histone de c h l o r o l e u c 6 m i e et le disg r a m m e du f r a c t i o n n e m e n t de cet h y d r o l y s a t sur une c o l o n n e de C h r o m o b e a d s P avec un systbme g r a d i e n t de t a m p o n s p y r i d i n e - a c i d e f o r m i q u e et p y r i d i n e - a c i d e ac6tique sont en effet, r e s p e c t i v e m e n t s u p e r p o s a b l e s h ceux que nous avons obtenus dans les m 6 m e s c o n d i t i o n s au c o u r s de l'~tude des h y d r o l y s a t s t r y p s i q u e s de GAR-histone de t h y m u s de P o r e et de Veau. Cette analogie s'est pr6cis6e au cours de l'6tude des p e p t i d e s t r y p s i q u e s et du f r a g m e n t COOH-ter-
GAR-histone minal ohtenu par coupure de la protCine bromure de cyanoghne [5].
de chloroleuctfmie avec le
Chaque peptide a Ctt! cornpark avec les peptides homologues provenant des GAR-histones de thymus de Port et de Veau : position dans le diagramme d’klution, localisation sur la carte peptidique, composition en acides amint%, acides amin&s NH,- et COOH-terminaux. Nous avons dkduit de cette Etude comparative la structure de chacun des 18 peptides de l’hydrolysat trypsique de la GAR-histone de chloroleucCmie.
du Rat.
trypsique 11 s’agit
481
de la GAR-histone de thymus de Port. des peptides T-l, T-5 et T-7 (trableau II).
Outre le peptide T-5 : Gly-Gly-Ala-Lys (AC)-Arg (fraction 7B), le peptide TSa : Gly-Gly-Ala-Lys (fraction 6-l) est prtkent dans l’hydrolysat trypsique de la GAR-histone de chloroleu&mie. Dans un certain nombre de mokules de GA’R-histone, le rCsidu de lysine en position 16 n’est pas acCtylC, ce qui permet alors l’action de la trypsine sur lla liaison Lys-Arg et la liberation du peptide T 5a*
Diagramme d’6lution des peptides trypsiques de la GAR-histone de chloroleuckmie du Rat fractionnCs snr une colonne de Chromobeads P, avec un systhme-gradient de tampons yridineacide formique et pyridineacide acktique [3 P . Les peptides sont dksignes par la lettre T. Chaque peptide est numkott? suivant sa position dmans la sequence de la protkine. Les fractions dont dkrivent les peptides, sont indiquees par des traits pleins et sont numkrot6es suivant leur ordre d’klution de la colonne.
Nous pouvons dire en effet que deux peptides ont une structure identique, lorsque ces peptides ont le m&me temps de rktention sur la colonne d’khangeur d’ions, le m&me comportement en chromatographie ou l:a mOme composition
acide acide
Clectrophorkse
sur
papier,
en acides aminks, le m&me amink en position NfHI,-terminale et le m&me aminCI B I’extrk’mitC COOH-terminale.
Parmi
les
peptides
de ChloroleucCmie, ink-&t particulier structure compl(tte pour
en
les
BIOCHIMIE,
peptides
de la GAR-histone il en est trois qui prksentent un et dont nous avons Ctabli la ?I l’aide des techniques d&rites trypsiques
homologues
1871, 53, no 4.
de
l’hydrolysat
Le taux
d’acktylation
roleuckmie
tion 16 infkrieur par DE thymus nous ne
au
niveau
de la GAR-histone du
rCsidu
de
de chlo-
lysine
en
posi-
est de l’ordre de 40 p. cent. Bien qu’il soit au taux d’acktylation (50 p. cent) trouvC LAXGE et al. [lj pour la GAR-histone de de Veau, au nivsau de ce m&me rksidu, pouvons
est significative
pas
affirmer
et qu’elle
que
est
like
cette
diffkrence
51 la nature
tumo-
rale du tissu. La structure roleuc&mie
est identique
primaire est
pr&sentCe
de la GAR-histone dans
g la structure
le
tableau
primlaire
de chloII. Elle des deux
P. Sautibre, D. T y r o u , Y. M o s c h e t t o el G. Biserte.
482
TABLEAU I I .
S~quence complete en acides amines de la GAR-histone de chlorolenc~mie dn Rat. I<-. T I---~1~--'1' 2-~1~, --T 3 ~'1 --T 4-Ae~tyl - Ser - Gly - Arg - Gly - Lys - Gly - Gly -Lys - Gly - Leu 1 10 Gly
Lys - Gly - Gly - Ala - Lys(Ae) - Arg - His - Arg - Lys(Me) 20
-
---T 7-----~1~ Val - L e u - Arg -
T 8-Asp
-Asn
-
lie
-
Gin
-
Gly
-
Ile
-
Thr
-
3O
~l l< T 9 .... >] ] L y s - P r o -- A l a - lie - A r g - A r g - L e u - A l a - A r g - A r g 4O I<
T
Gly -
10--
Gly - Val -
-
Lys
~1 <
- Arg -
lle -
n-
--T Ser -
Gly - Leu
-
lle 5O
~-i < --T 12-->" l ~ - - Tyr - Glu - Clu - Thr - Arg - Gly - Val - Leu - Lys - Val
-
60
T 13 ~1~ Phe - Leu - Glu - Asn - Val - lle - Arg - Asp - Ala - Val 70 .... T 14 )[(-T 15-> t (-Thr - Tyr - Thr - Gtu - His - Ala - Lys - Arg - Lys - Thr 8O - T 16 Ala - Met- Asp-
Val - Thr-
Val-
........ Ala- Leu
Val- Tyr-
-
90
---~1 [
Gly - Gly(OH) 102
GAR-histones et thymus La
des
peptide
que
des
acides
peptides
avec
r6sidu
et par
de
de
des
cellules
isol6es
de Novikoff
roleuc6mie,
indiquer
semble
sp6cificit6. pour
La
persisbance
la GAR-histone,
espbces,
a
nous
une d'une
au travers
certainement
une
particulibre
qui
BIOCHIMIE,
1 9 7 1 , 53, n ° 4.
Ell]
6ehappe
de
en
act-
de tissus
comparaison dont
espbces bines, comme mettrait
l'6tude
(exemple
de
penser
est indispensable
d'autres
prot6ines
pour
de
cytochromes,
ou pep-
nombreuses des
h6moglo-
que h son
l'int6grit6 activit6 c'est
que
de
sa
structure
biologique son
activit6
et que, biolo-
nor-
totale
de
tmique
de l'6volution signification
des
si elle n'a pas 6volu6, gique est fondamentale.
Remerciements.
et de la chlo-
structure
avec
a 6t6 faite
des fibrinopeptides), l'histone apparait une prot6ine <( p e u 6 v o l u t i v e ~ : c e q u i p e r -
hmnaines
absence
encore.
la
84.
leuc6miques
[10], de l'h6patome
de
au niveau
la s6quence
Par tides
l'octad6ca-
coupure
cyanog6ne
des GAR-histones
[1, 2, 3 ] ,
de
en position
identit6
de Veau
.Studi6es.
a 6t6 d6duite
obtenu
de m6thionine
des amin6s
(thymus avons
amin6s
le bromure
remarquable
maux
nous
trypsiques
COOH-terminal
prot6ine
La
normaux
Porc)
s6quence
l'6tude
du
de tissus de
des toute
Ce t r a v a i l a ~t~ r ~ a l i s ~ gr£tce h u n e s u b v e n t i o n a c e o r d 6 e e n 1 9 7 0 e t 1971 p a r l a L i g u e N a t i o n a l e contre le C a n c e r q u e nous tenons h remercier tout particuli~rement. Nous remereions ses eollaborateurs
v i v e m e n t l e D o e t e u r L. A D E m S e t de l'Institut de Reeherehes s u r le
GAR-histone
de chloroleuc~mie
C a n c e r de Lille ( D i r e e t e u r : P r o f e s s e u r J. DHIESSENS) q u i n o u s o n t a i m a b l e m e n t f o u r n i les t u m e u r s de e h l o rolvuc~mie. N o u s r e m e r c i o n s M a d a m e A n n y DUHAUT, M a d e m o i selle Odile MOBEAV et M o n s i e u r C l a u d e VANDEP~I~RF, pour leur exceHente collaboration technique.
R~suM~.
L a s 6 q u e n c e c o m p l 6 t e d e s 102 r 6 s i d u s d ' a c i d e s a m i n6s de l ' h i s t o n e r i c h e e n g l y e i n e et e n a r g i n i n e isol~e de la t u m e u r de c h l o r o l e u c 6 m i e d u R a t a 6t~ d 6 d u i t e de l ' ~ t u d e d e s p e p t i d e s t r y p s i q u e s et d u f r a g m e n t C O O H - t e r m i n a l o b t e n u p a r c o u p u r e d e la p r o t 6 i n e a v e c le b r o m u r e de c y a n o g 6 n e . La s t r u c t u r e p r i m a i r e de l a G A R - h i s t o n e de c h l o r o l e u c 6 m i e est i d e n t i q u e ~t celle d e s h i s t o n e s h o m o l o g u e s isol~es d u t h y m u s de V e a u et d u t h y m u s de P o r c .
ZUSAMMENFASSUNG. Die v o l l s t i i n d i g e S e q u e n z d e r 102 A m i n o s ~ i u r e r e s t e - - u n d A r g i n i n - - rei,chen H i s t o n s , w e l c h e s a u s d e r e h l o r l e u k ~ i m i s e h e n T u m o r d e r R a t t e isol i e r t w u r d e , i s t d u r c h die U n t e r s u c h u n g d e r T r y p s i n p ~ p t i d e u n d d e s COOH-En~d-Bruchstiicks, w e l c h e s d u r c h des Glyein
BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 4.
du Rat.
483
Zerlegen des Proteins mit Cyanogenbromid erhalten w u r d e , besti.m:mt w o r d e n . Die prim~ire S t r u k t u r d e s <
Structure primaire de l'histone riche en glycine et en arginine isolde de la tumeur de chloroleuc6mie du Rat, p a r P i e r r e SAUTIERE (*), Dani6ie T v n o u , Yves MOSCHETTO (**) et G6rard BtSEnTn~ (***). ( U n i t d d e R e c h e r c h e s n ° 16 d e I'I.N.S.E.R.M. s u r la B i o c h i m i e Place de Verdun, 59-Lille).
des Prot~ines,
(19-4-1971/26-5-1971).
S u m m a r y . ~ The primary structure of the glycine-rich, arginine-rich histone isolated from the ehloroleukaemic tumor of the rat has been established. The amino-acid sequence deduced from the study of the tryptic peptides and of the COOH-terminal fragment resulting from cleavage wi~h cyanogen bromide, is identical to that of homologous histories isolated from calf thymus and hog thymus.
INTRODUCTION. Les a c q u i s i t i o n s r6eentes sur la s t r u c t u r e prim a i r e de r h i s t o n e riche en glycine et en a r g i n i n e (GAR-histone) isol6e du t h y m u s de Veau Eli, de l ' e m b r y o n de Pots [2] et du t h y m u s de Pore [3, 4] nous ont m o n t r 6 la r e m a r q u a b l e c o n s t a n c e de eette structure, quel que soit le tissu ou l'esp6ee. I1 nous a p a r u int6ressant de c o n n a i t r e si cette i n v a r i a b i l i t 6 de la structure p r i m a i r e se conservait dans u n e GAR-histone iso16e d ' u n tissu n6oplasique, s a c h a n t que les histones sont impliqu6es dans le contrSle de l'activit6 g6n6tique et que, lors du processus de canc6risation, la eellule canc6reuse se m u l t i p l i e hors de tout eontr61e de l'organisme hSte. Nous avons d o n e isol6 la GAR-histone de la tt~meur de ehloroleuc6mie du Rat et nous en avons d O e r m i n 6 la s t r u c t u r e p r i m a i r e en deux 6tapes. L'6tude du p e p t i d e COOH-terminal lib6r6 de la prot6ine p a r action du b r o m u r e de cyanog6ne au n i v e a u de son u n i q u e r6sidu de m6thionine, eonstituait la p r e m i 6 r e 6tape de eette d o e r m i n a t i o n e t a 6t6 expos6e dans u n e pr6c6dente c o m m u n i c a t i o n [5]. Dans u n second temps, nous avons 6tudi6 les peptides de l ' h y d r o l y s a t t r y p s i q u e de la prot6ine et, p a r c o m p a r a i s o n avec les peptides t r y p s i q u e s de l~a GAR-histone de t h y m u s de Veau [6] et de (*) Charg6 de Recherches au C.N.R.S. ('*) Maitre de Recherehes h I'I.N.S.E.R.M. (*'~) Professeur de Biochimie Pathologique h la Facult6 de M6deei.ne de Lille.
t h y m u s de Pore, nous avons 6tabli la s6quence compl6te en acides amin6s de la GAR-histone de chloroleuc6mie. MATI~RIEL ET Mt~THODES. Les t u m e u r s de chloroleuc6mie du Rat ont 6t6 fournies par l ' I n s t i t u t de Recherche sur le Cancer ( 5 9 - L i l l e , F r a n c e ) . La t u m e u r de chloroleuc6mie est u n sarcome l y m p h o b l a s t i q u e lransmis p a r i m p l a n t a t i o n sous-cutan6e d ' u n greffon dans la r6gion dorso-lombaire de l ' a n i m a l (Rat Wistar, 250 g). EHes sont p l a c f e s dans la neige c a r b o n i q u e i m m 6 d i a t e m e n t apr6s leur abl,ation et sont conserv6es h - - 20°C j u s q u ' a u m o m e n t de leur emploi. Preparation des histones.
Toutes les op6rations sont effectu6es h + 4°C. Les t u m e u r s (200 g) sont 6 m i n c f e s et homo~ g6n6is6es p e n d a n t 2 m i n u t e s dans 2 litres d ' u n e solution de saccharose 0,25 M _ CaC12 0,003 M, h l'aide d ' u n appareil de type Packard. L,homog6nat est filtr6 sur 4 6paisseurs de gaze et centrilug6 h 1100 g p e n d a n t 30 minutes. Le s6diment est lav6 deux lois avec u n litre de solution de saocharose 0,25 M - CaC12 0,003 M, p a r homog6n6isation et c e n t r i f u g a t i o n h 1100 g p e n d a n t 30 minutes. Les n o y a u x ainsi obtenus sont purifi6s par homog6n6isation dans 250 ml d ' u n e solution de saccharose 2,2 M e t c e n t r i f u g a t i o n h 36 000 g pend a n t 90 m i n u t e s . Le s6diment constitu6 p a r les n o y a u x purs est lav6 trois fois avec 500 m l de NaC1 0,14 M , citrate
P. S a u t i ~ r e , D. T y r o u , Y. M o s c h e t t o et G. B i s e r t e .
480
Na 0,01 M, p H 7,1, une fois a v e c 50,0 ml de tamp o n Tris 0,1 M, pH 7,6 et deux fois avec 500 ml d'~thanol fi 80 p. cent, toutes ces o p 6 r a t i o n s de lavage s'effeetuant p a r h o m o g 6 n 6 i s a t i o n et c e n t r i fugation h 110,0 g p e n d a n t 15 minutes.
La c o m p o s i t i o n en acides amin6s de la GARhistone de c h l o r o l e u c 6 m i e est pr6sent6e dans le tableau I.
L e d e r n i e r s6diment obtenu est constitu6 p a r les d 6 s o x y r i b o n u c l 6 o p r o t 6 i n e s dont on e x t r a i t les histones r i c h e s en a r g i n i n e ( F r a c t i o n s Fo,. 1 et F2,_2) , selon la m6thode de JOHNS h pH 7,0 [7].
L'identit6 de cette c o m p o s i t i o n avec celle de la GAR-histone de t h y m u s de veau [6] et l,a r e m a r quable s i m i l i t u d e des d i a g r a m m e s d'61ution des p e p t i d e s t r y p s i q u e s (figure 1 et [6]) sont d6jh en
RI~SULTATS
ET
DISCUSSION.
TABLEAU I.
Composilion en acides aminds de l'histone r i c h e en glycine el en arginine (GAR-histone) isoI~e de Ia l u m e u r de chIoroleuc~mie du Rat el dn l h y m u s de Veau. (R6sultats en hombre de r~sidus par mole). GAR-histone de chloroleuc6mie
Acides amin6s
Acide aspartlque ..................... Thr6onine ........................... S6rine .............................. Acide glutamique .................... Proline Glycine ............................. Alanine ............................. 112 cystine ......................... Valine .............................. M6thionine .......................... Isoleucine ............................ Leucine .............................. Tyrosine ............................ Phdnylalanine ....................... Lysine ............................... M~thyllystne ........................ Histidine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Arginine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5 7 2 6 1
17 7 0 9
1 6 8 4
2 10 .
.
.
.
.
Tryptophanne (') . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Nb total de r6sidus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ............................ A.A. Bastques/A.A. Aeides . . . . . . . . . . . . .
Lys/Arg
GAR-histone de veau
de t h y m u s
Is] 5 7 2 6 1
17 7 0 9 1
6 8
4 2 10
1
1
2
2 14 0
14
0 102 0,78 2,45
102 0,78 2,45
(*) D~termin6 par la m6thode colorim6trique de SPIEset (~HAMBERS [9]. L ' h i s t o n e r i c h e en g l y c i n e et en ~ r g i n i n e (GARhistone) est isol6e de la f r a c t i o n F2a_l p a r c h r o m a t o g r a p h i c de gel~filtration sur une c o l o n n e de S e p h a d e x G-100 (195 × 2,5 cm) 6quilibr6e et 6lu6e avee de l ' a c i d e c h l o r h y d r i q u e 0,01 N r81. La purer6 de nos p r 6 p a r a t i o n s d ' h i s t o n e est contr616e p a r 61ectrophorbse en gel de p o l y a c r y l a m i d e fi p H 4,5 [51.
D~termination de la sJquence des acides amines. Les m6thodes utiiis6es p o u r la d 6 t e r m i n a t i o n de la s t r u c t u r e p r i m a i r e de la GAR-histone de c h l o r o leuc6mie ont 6t6 d6crites p r 6 c 6 d e m m e n t [6].
BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 4.
f a v e u r d ' u n e 6troite analogie de s t r u c t u r e e n t r e les deux histones. La carte p e p t i d i q u e de l ' h y d r o l y s a t t r y p s i q u e de GAR-histone de c h l o r o l e u c 6 m i e et le disg r a m m e du f r a c t i o n n e m e n t de cet h y d r o l y s a t sur une c o l o n n e de C h r o m o b e a d s P avec un systbme g r a d i e n t de t a m p o n s p y r i d i n e - a c i d e f o r m i q u e et p y r i d i n e - a c i d e ac6tique sont en effet, r e s p e c t i v e m e n t s u p e r p o s a b l e s h ceux que nous avons obtenus dans les m 6 m e s c o n d i t i o n s au c o u r s de l'~tude des h y d r o l y s a t s t r y p s i q u e s de GAR-histone de t h y m u s de P o r e et de Veau. Cette analogie s'est pr6cis6e au cours de l'6tude des p e p t i d e s t r y p s i q u e s et du f r a g m e n t COOH-ter-
GAR-histone minal ohtenu par coupure de la protCine bromure de cyanoghne [5].
de chloroleuctfmie avec le
Chaque peptide a Ctt! cornpark avec les peptides homologues provenant des GAR-histones de thymus de Port et de Veau : position dans le diagramme d’klution, localisation sur la carte peptidique, composition en acides amint%, acides amin&s NH,- et COOH-terminaux. Nous avons dkduit de cette Etude comparative la structure de chacun des 18 peptides de l’hydrolysat trypsique de la GAR-histone de chloroleucCmie.
du Rat.
trypsique 11 s’agit
481
de la GAR-histone de thymus de Port. des peptides T-l, T-5 et T-7 (trableau II).
Outre le peptide T-5 : Gly-Gly-Ala-Lys (AC)-Arg (fraction 7B), le peptide TSa : Gly-Gly-Ala-Lys (fraction 6-l) est prtkent dans l’hydrolysat trypsique de la GAR-histone de chloroleu&mie. Dans un certain nombre de mokules de GA’R-histone, le rCsidu de lysine en position 16 n’est pas acCtylC, ce qui permet alors l’action de la trypsine sur lla liaison Lys-Arg et la liberation du peptide T 5a*
Diagramme d’6lution des peptides trypsiques de la GAR-histone de chloroleuckmie du Rat fractionnCs snr une colonne de Chromobeads P, avec un systhme-gradient de tampons yridineacide formique et pyridineacide acktique [3 P . Les peptides sont dksignes par la lettre T. Chaque peptide est numkott? suivant sa position dmans la sequence de la protkine. Les fractions dont dkrivent les peptides, sont indiquees par des traits pleins et sont numkrot6es suivant leur ordre d’klution de la colonne.
Nous pouvons dire en effet que deux peptides ont une structure identique, lorsque ces peptides ont le m&me temps de rktention sur la colonne d’khangeur d’ions, le m&me comportement en chromatographie ou l:a mOme composition
acide acide
Clectrophorkse
sur
papier,
en acides aminks, le m&me amink en position NfHI,-terminale et le m&me aminCI B I’extrk’mitC COOH-terminale.
Parmi
les
peptides
de ChloroleucCmie, ink-&t particulier structure compl(tte pour
en
les
BIOCHIMIE,
peptides
de la GAR-histone il en est trois qui prksentent un et dont nous avons Ctabli la ?I l’aide des techniques d&rites trypsiques
homologues
1871, 53, no 4.
de
l’hydrolysat
Le taux
d’acktylation
roleuckmie
tion 16 infkrieur par DE thymus nous ne
au
niveau
de la GAR-histone du
rCsidu
de
de chlo-
lysine
en
posi-
est de l’ordre de 40 p. cent. Bien qu’il soit au taux d’acktylation (50 p. cent) trouvC LAXGE et al. [lj pour la GAR-histone de de Veau, au nivsau de ce m&me rksidu, pouvons
est significative
pas
affirmer
et qu’elle
que
est
like
cette
diffkrence
51 la nature
tumo-
rale du tissu. La structure roleuc&mie
est identique
primaire est
pr&sentCe
de la GAR-histone dans
g la structure
le
tableau
primlaire
de chloII. Elle des deux
P. Sautibre, D. T y r o u , Y. M o s c h e t t o el G. Biserte.
482
TABLEAU I I .
S~quence complete en acides amines de la GAR-histone de chlorolenc~mie dn Rat. I<-. T I---~1~--'1' 2-~1~, --T 3 ~'1 --T 4-Ae~tyl - Ser - Gly - Arg - Gly - Lys - Gly - Gly -Lys - Gly - Leu 1 10 Gly
Lys - Gly - Gly - Ala - Lys(Ae) - Arg - His - Arg - Lys(Me) 20
-
---T 7-----~1~ Val - L e u - Arg -
T 8-Asp
-Asn
-
lie
-
Gin
-
Gly
-
Ile
-
Thr
-
3O
~l l< T 9 .... >] ] L y s - P r o -- A l a - lie - A r g - A r g - L e u - A l a - A r g - A r g 4O I<
T
Gly -
10--
Gly - Val -
-
Lys
~1 <
- Arg -
lle -
n-
--T Ser -
Gly - Leu
-
lle 5O
~-i < --T 12-->" l ~ - - Tyr - Glu - Clu - Thr - Arg - Gly - Val - Leu - Lys - Val
-
60
T 13 ~1~ Phe - Leu - Glu - Asn - Val - lle - Arg - Asp - Ala - Val 70 .... T 14 )[(-T 15-> t (-Thr - Tyr - Thr - Gtu - His - Ala - Lys - Arg - Lys - Thr 8O - T 16 Ala - Met- Asp-
Val - Thr-
Val-
........ Ala- Leu
Val- Tyr-
-
90
---~1 [
Gly - Gly(OH) 102
GAR-histones et thymus La
des
peptide
que
des
acides
peptides
avec
r6sidu
et par
de
de
des
cellules
isol6es
de Novikoff
roleuc6mie,
indiquer
semble
sp6cificit6. pour
La
persisbance
la GAR-histone,
espbces,
a
nous
une d'une
au travers
certainement
une
particulibre
qui
BIOCHIMIE,
1 9 7 1 , 53, n ° 4.
Ell]
6ehappe
de
en
act-
de tissus
comparaison dont
espbces bines, comme mettrait
l'6tude
(exemple
de
penser
est indispensable
d'autres
prot6ines
pour
de
cytochromes,
ou pep-
nombreuses des
h6moglo-
que h son
l'int6grit6 activit6 c'est
que
de
sa
structure
biologique son
activit6
et que, biolo-
nor-
totale
de
tmique
de l'6volution signification
des
si elle n'a pas 6volu6, gique est fondamentale.
Remerciements.
et de la chlo-
structure
avec
a 6t6 faite
des fibrinopeptides), l'histone apparait une prot6ine <( p e u 6 v o l u t i v e ~ : c e q u i p e r -
hmnaines
absence
encore.
la
84.
leuc6miques
[10], de l'h6patome
de
au niveau
la s6quence
Par tides
l'octad6ca-
coupure
cyanog6ne
des GAR-histones
[1, 2, 3 ] ,
de
en position
identit6
de Veau
.Studi6es.
a 6t6 d6duite
obtenu
de m6thionine
des amin6s
(thymus avons
amin6s
le bromure
remarquable
maux
nous
trypsiques
COOH-terminal
prot6ine
La
normaux
Porc)
s6quence
l'6tude
du
de tissus de
des toute
Ce t r a v a i l a ~t~ r ~ a l i s ~ gr£tce h u n e s u b v e n t i o n a c e o r d 6 e e n 1 9 7 0 e t 1971 p a r l a L i g u e N a t i o n a l e contre le C a n c e r q u e nous tenons h remercier tout particuli~rement. Nous remereions ses eollaborateurs
v i v e m e n t l e D o e t e u r L. A D E m S e t de l'Institut de Reeherehes s u r le
GAR-histone
de chloroleuc~mie
C a n c e r de Lille ( D i r e e t e u r : P r o f e s s e u r J. DHIESSENS) q u i n o u s o n t a i m a b l e m e n t f o u r n i les t u m e u r s de e h l o rolvuc~mie. N o u s r e m e r c i o n s M a d a m e A n n y DUHAUT, M a d e m o i selle Odile MOBEAV et M o n s i e u r C l a u d e VANDEP~I~RF, pour leur exceHente collaboration technique.
R~suM~.
L a s 6 q u e n c e c o m p l 6 t e d e s 102 r 6 s i d u s d ' a c i d e s a m i n6s de l ' h i s t o n e r i c h e e n g l y e i n e et e n a r g i n i n e isol~e de la t u m e u r de c h l o r o l e u c 6 m i e d u R a t a 6t~ d 6 d u i t e de l ' ~ t u d e d e s p e p t i d e s t r y p s i q u e s et d u f r a g m e n t C O O H - t e r m i n a l o b t e n u p a r c o u p u r e d e la p r o t 6 i n e a v e c le b r o m u r e de c y a n o g 6 n e . La s t r u c t u r e p r i m a i r e de l a G A R - h i s t o n e de c h l o r o l e u c 6 m i e est i d e n t i q u e ~t celle d e s h i s t o n e s h o m o l o g u e s isol~es d u t h y m u s de V e a u et d u t h y m u s de P o r c .
ZUSAMMENFASSUNG. Die v o l l s t i i n d i g e S e q u e n z d e r 102 A m i n o s ~ i u r e r e s t e - - u n d A r g i n i n - - rei,chen H i s t o n s , w e l c h e s a u s d e r e h l o r l e u k ~ i m i s e h e n T u m o r d e r R a t t e isol i e r t w u r d e , i s t d u r c h die U n t e r s u c h u n g d e r T r y p s i n p ~ p t i d e u n d d e s COOH-En~d-Bruchstiicks, w e l c h e s d u r c h des Glyein
BIOCHIMIE, 1971, 53, n ° 4.
du Rat.
483
Zerlegen des Proteins mit Cyanogenbromid erhalten w u r d e , besti.m:mt w o r d e n . Die prim~ire S t r u k t u r d e s <