Studien über die naphthoresorcin-reaktion von tollens

ANALYTICA

CHI?.IICr\

ACTA

227

Fast die Hiilftc: :llIcr bckunntcn IWys:~cchariclc entlliilt UronsiiIlrc-15inlIeiten*. Diese sind abcr :~uch Bcstancltcilc natiirlicher nicclcrrnalckularcr Vcrbintlungcn, so nxmchcr pflnnzlicher Glykoside ~1x1 Saponine, uncl vor nllem dcr Izusscrordcntlich wichtigcn Gruppc dcr ..f;lukuronsiiurcpaarlinge”, wclche in den II;Brperfltissi~kcitctl clcr Siiugetiere, bcsonders im Hat-n, ~~uf~efunden werden, I3isvor ungcf~itlreinemjal~r~ellnt warman allgemcin &rAnsicht .tlass frcieljronsiiuren in der Natur nicht vorkiimen, nicht zulctzt dcswcgcn. wcil cs nn cincr cinfnchcn Nachwcismij~lichkeit dcrsclbcn ncbcn den gebundcnen Uronsiiurcn mnngctlte. So bcrichtcn z.U. Awz USII OSJIAN in ihrer Monographit *21& tibcr die Biochemie dctr (;lukuronsiiurc : “Glucuronic acid is not known to occur free in nature” . Ncuerc Arboiten australischcr Forschcr~ hnben jcdoch gezcigt, d:~s 1x5 ciner ganzcn Rcihc von 13cutcltiercn frcic Glukurons5urc als norm&r Harnhcstxndtcil auftritt. In cinigcn Ffillen wurdc such tin Ausstoss van frcier Glukuronsiiurc nnch Gabcn von Chemiknlien bcobnchtet. Verabfolgt man z. n. Verona1 an Ratten orlcr iMecr&llwcinthen. so tritt im Harn diescr Tiere neben der unveriindcrten Substatiis noch frciu Glukur~)ns~ure auf, bei den Rattcn ausscrdcm in vcrmehrtcm UmfangAskorhins~itire4. Nach Eingabc \*on Anilin, o-Anisiclin, /+Anisitlin, fi-Phenetidin oclcr Phcnacetin konntcn aus dcm Horn van Knninchcn ncbcll vcrschicdcncn I’aurlingen olmc vorhcrige Iiyclrolysc z.“l’. bctriichtliche Mengen freicr Uronsiiurc als schwcrliislichcr $JToluidin-Ammoniumglukuronat-Komplcx isolicrt wertlcn, wobci allerdings die Miiglichkeit offcnblcibt, dass es sich urn tin iiusscrst labilcs Glukuronid gchandelt hat”. Unkonjugicrtc Glukurons%.u-e erschcint im mcnscl~licl~cn oder tie&&en Ham, wenn sic pcroral oder parcntcral in gr6ssercn Mengen vernbrcicht wird. Solchc Vcrsuchc dicncn einmal xur Aufhellung dcs Schicksals der Uronsiiure im Organismus+’ I, zum anderen stellcn sie ein Hilfsmittcl in der Diffcrentialdiagnosc von Lcberkrankhcitcn cIar~~l”*‘” (sog, ,,Lebcrfunktionsprobc”). Uerichte amerikanischer Autorenl4e’G, wonach sich Gaben von Glukuron per OS tiber lgngere Zcitr5ume hinweg bci rhcumatischen Erkrankungen gtinstig ausgewirkt h$tten, konnten von andercr Seitc nicht best%tigt werden 9~11.1~. Dagegen sprechen vicle FKlle von Hypcr-bilirubiniimic uncl Erythroblastose der Ncugeborenen auf eine Behandlung mit Glukuron gtinstig an17. Atinf. Clrirtr, Acta. 29 (xgG3) 227-239

w.

228

WAGSEH

Das Auftreten von freicr Galakturons5urc ist im Pfianzenreich zu erwarten, wo sie den wesentlichstcn 13austcin clcr Pcktinstoffe in Riihen, Stengcln, Friichtcn, IISW. bildct. Sie scheint sic11 jedach untcr nattirlichen Redingungen nirgends in gr6sscren sodass ihr Vorkommen lange Zeit umstritten warlo. Mengen anzuhliufenlX, All ciiesc teils nattirlichcn, tcils unter bestlmmtcn Versuchsbcdingungen erzielten V~)rkornrn~~ von freien Urons5iurcn ncben s&hen im gebundenen Zustand und neben an&x-en Zuckcrn lasscn ein Vcrfahrcn wiinschenswertcrschcinen,dasdie Erkennungund Rcstimmung dcr frcicn Siiurcn in den genannten I%llcn gcstattct.

dass die Mineral. Den Ausfihrungen in ‘Tcil I dieser Stutlien 2” ist zu cntnchmcn, s%ure bei der’Tor_x,rsssscltcn SnplItllorcsorcin-(~l~)-~~eakti~~n cinc erwtinschte Doppclrollcspielt (rund 2) zu tlcrsichunvortciIl~aftcr~~rvciscnoci~einedritte~~unktion (3) gcstefit, niimlich : (rj I<;~tafyse der hydrolytischen Spaltung von Oligo- und Polyuronosiden ; (2) Konderrsation t’on Uronz;Burc und SR zum Fnrbstctff; (3) l~ec~~rt)o~ylierun~ der frcigesctzten Uronsiiure-Einileitcn bei hiihercr ‘l’ernpcratur. Unscre Untersuchungen gingen nun von folgxx,ler uberlcgung aus: In dcr bislang ausschlicsslich verwcndetcn m&r oder wenigcr starken SaizsHurc bzw. Schwcfels&ire sincl clie drci gonannten Eunktiunen untrcnnbar vcrbundcn ; sic kijnntcn jedoch bci an&run Siiurcn als nicht notwcndig voneinandcr abhitngige Eigcnschaften durchaus in ut~terscl~iedlicl~em Masse vcrtreten scin. ~iesevermutun~liesssic~k in mannigfnclrcn Versuchcn zuni.ichst nieht bcstiitigen; cndlich hat sich abcr gexcigt, dass die Mineralsliurc hinsichtlich Funktion (2) in gcradezu idctller \Vcisc durch cont. Plros~~lo~s~lire ersetist werden knnn, wcnn zugieich cler~~‘asscr6c~~~Llt c~csKcaktionsmcdiums church wassermischbare organische Zusiitzo passcnd cingestcllt wird, Die Kondensation gcl~t dann so giatt vonstatten, dass sclbst bei ver~~~tttiisn~~ssi~ tiefer Temperatur (70~) kurxe Ii~nktionszeitcn mliglich sind. Untcr dicsen milden Hedingungcn ist COAbspaltung nicht xu bcfiirchten.; eine bci allcn bishcrigen Vcrfahren gegebenc Fchlerqucllc (vgl.2u) wird somit ausgeschnltct. Da die hydrolytische Aktivitst dcr Yhosphorsiiure nur cinen Hruchtcil von dcrjenigcn ciner Zvlinerals%urc betr!igt, gclingt es uunmehr, mit Hilfc dcr NR-Rcaktion freie Uronsiiurc nebcn bestimmtcn Wronosidcn quantitntiv zu erfissen. ?Yald dcs orga?tisclmt

Ztrsakcs

Xachdem bei dor l~e~l~~~~~~~ allcr bishcr tlusgearbcituten quantitativen Verfahren kcinc maximalc Farbstoffbildung nngcstrcbt wirti und Xebenreaktionen vcrschiedcner Art cinc t~~tr~cl~t~ic~~e Xolle spiclcn, ist xur Erziclung brauchbarer Wcrtc die Zugabc cincr gcnnu bemcsscnen NR-Mcnge uncrl:,‘lsslich, %ur Dosierung kommt praktisch nur einc XR-Liisung in I~ctracht, woftir allj LiJsungsmittcl bislang mcist Wasser, vercinzelt nuch Alkohol odcr Accton Ver~vellciun~ fand. Die drrmit verbundenen Nachtuilc und I~el~fcrcluellen wurden bcreits gcschildertz”. Wir hnben als Lijsungsmittel ftir das NR reinsten Eiscssig gcwiihlt, der gegeniiber den andorcn Solventien tin relativ stabiles Reagens liafert. Zwar muchcn sich bier ebenfalls Alteru,l6sv’)rgiingc bemerkbar; sic vcrlaufcn jecloch sehr vie1 langsamcr als in der wiiljsrigcn Lijsung, und die gebildetcn Farbstoffe sind such qunlitativ verschic-

STUI>XEN

iiREH

DIE

h’i\PHTHORESORCIN-I~~AKT~O~

VOX

TOLLENS.

IX

229

den20. Die Vcrwendung von Eisessig hat ferner zur Folgc, dass der Wasseranteil des Reaktionsgemisches in wciten Grcnzen beliebig cingestelit, vor allem stark herabgedriickt werden kann, wasdie Kondcnsation unter dem Einfluss der Siiure ausserordentlich erleichtert. Das VerhHltnis von I: Teil Wasser auf 7 Teile Reaktionsgemisch (zz 14.3% Wasscrgehalt) hat sich gut bewahrt. Erst auf diese \Veise wurdc es m6glich, se&t unter Einsatz der mittelstarken PhosphorsKure eine Reaktionstemperatur von 70~ und eine Reaktionszeit von 75 Min (Glukurons~ure) bzw. 30 Min (Gaiakturons5ure) einzuhalten. Bin weiterer wcsentlicher Vorteil liegt darin, dass in der iiberwiegcnd aus Eisessig hcstehenden Phase die gebildeten Farbstoffe sowie die Produktc der Nebenreaktioncn samtlich in Losung hleihen, w;ihrcncl sie hei allen bisherigen, stets im wiissrigcn System arbcitcnden Verfahren ganz oder doch zum grosstcn Teii Damit cntfalfen volt vorneherein alle Anal~~senfel~ler, die abgcschieden wercien. durch , Jdsorption dcs NR-Pigmentes an typische VerunGRAUER tm~a N~UB~ZG~~ sowie durch Verharzung cles Farbstoffes erklBren’o, Auch die glatte rcinigungen” Extraktion mit Toluol ist auf cias Vorliegcn von gellisfer Reaktionsprodukten zuriickzuftihren.

Dcr Mindcstgehalt des Reaktionsgemisches an NR wird durchdrci ~*crschicdenartigc UmstHnde bestimmt, niimlich : (I) durch die gegcnseitige :\bhkngigkcit van (a) Reaktionsteinper~~tur, (b) Daucr C-es Erhitxens und (c) NR-Konxcntration in dem Sinnc, class ftir die Erziclung eincs vorgegehuncn Ausflirhungsgrndcs dicsc Variablen nicht belicbig wiihlbar sind. (2) tVeiter ist zu heriicksichtigen, dass, wie s&on ausgtefiihrt, das NR infolge vcrschiedencr Nebcnrcaktionen dcrgewtinschten Umsct~~ln~entzo~en werdcn kann. (3) Ausserdcm macht sich beiReihenannlysen noch dcr vcrhiiltnismiissig hohe I’reis dcs reincn PrZiparates geltend. Die Wahl dcr NR-Konzcntration richtet sich nun nnch clcn jcwciligcn Erfordcrnissen. Nachdcm es uns zur Verringcrung dcr hydrolytischen Frcisctzung van gebundenen Uronsiiuren auf miiglichst niedrige Tcmpcratur und kurzc I%-hitzungszeit ankam, hnben wir die NR-Mcngc als nbhiingigc Variable hchandclt. 4 ml eincr 0.2~/~igen Losungerwicscn sich unter den gcwiihlten Reaktionsbeclirrgungen als ausreichcnd, Das bedeutct gegenitbcr dcr quantitntiv crfnssbaren Hiichstmcngc von IOO ,ogUrons!iure cincn ungcf!ihr zo-fachen Rcagcnstiberschuss, dcr selbst bettiichtliche Verlustc durch Nebcnreaktionen ausgleichen dt’rrfte. Auch der KR-Vcrbrauch hHlt sick in m&s&en Grenzen.

Der Gehalt der Probcliisung an UronsEiure sol1 ftir die quantitative Bcstimmung zwischen 20 und IOO ,ug pro ml licgen. Konzentriertere Losungen sind entsprechend zu verdfinnen, verdtinntere unter geeigneten ~‘orsichtsmassnahmen anzureichcrn.

Die NR-Reaktion geh-yrcht im aflgemcinen der VAN ‘T HoFFschen Regef: Solange nicht das Gebiet maximalet ~arbstof~ildung erreicht und iiberschtissiges NR zugegen ist, steigt unter sonst gleichen Bedingungen die Extinktion fur je xoO Temperaturerhohung auf ctwa das Doppelte. Daraus erhellt, dass der r%.rmlichen und zeitlichen Anal.

Chi?tr. ,dcfa, 29 (1963)

227-230

230

W.

WAGNER

Konstanthnltung ctcr Tempcratur w5hrend dcs Erhitzcns ganz besondere Sorgfalt gewiclmct wertlcn muss, wenn r&n Vcrgleicllbitrc Wcrte crhaltcn will. I:iir die quantitativc 13cstimmung ist ein gutcr Thermostat unbedingte Vocausseteung ; cr kann mit in crtr~iglichcn Wasser gcfiillt wcrdcn, tlzr his ctwa 80” die Vcrc1~m~fun~svcrlust~ Grenzen blcibcn.

Schwer verstiinrllich erscheint cs, clr~ hci fast nllen bisltlng angegebencn Bcstimrnungsvcrfahrcn auf clic lCollstantir~Lltun6 dcr Mussc cles IZenkticlns~cmisclrcu w%hrend &s Erliitxens nicht pxdltct Wurclc. Sclb~t die Sorgfiikigje StUdk! van FISHMAN UND GItI:rrNz” rri~kcl~t liicr kcinc Ausnahmc. N;xlr unscrcn Erf:tltrungcn ergctxzn sich in offencn GcfBssr:n ur~ters~lli~~li~he, z,T. l~ctriichtlichc Verdnmpfungsvcrlustc (xumal bcim Arbcitcn im sicclcnclen Wasserbacl), woclurch clie 15rgcbnissc stark verfiilscht werdcn lcijnnen. Nachrlcm cler Dnmpfclruck clcr unset-cs IZcaktirtnsg-cmisclIcs bei 70” nur gcring id, liisst sic11 clurch Vet-s&hiss J~e;t~cn!q$ist~r mit eincm Gummistopfcn die Vurclaml->fung clcr nicdriger sietlcndcn .%ntcilo viillig vcrliindcrn.

Ol~wold N~srrICKG UND Sn~i~~osr~sr sctwtr rgzx zum Ausscl~littclen des Urons~urer~rl~st~)ff~s statt Kther clns wcitaus selcktiver wirkcncle Rcnzol umpfolilcn liab~n, wurdc in clcr l~olpzzcit nc~cl~ viclfdl nach dcr urspr’iinglichcn Angnbe von 'POLLENS pxxrbcitcrt. In clcr ~lu~~i~titntivetl Mctll~~ik hiIt sich die l3cnzolcxtr;tktion iiberhaupt nicht cingcldirgcrt. Dcr Grund ist wolil clarin xu suchen, class mit 13cnzol aus clcm wiissri~-nlincr~tlsnuretl Gcmiscll oifcnbar kein qunntitativcr Auszug cles Farbstoffes xu didten ist, sci es clurcl~ H~mrnun~ clcs ~ll~s~n~bcr~~n~cs, sci es clurch cinen ungiinstigen VcrtciluIljiscluoticntcn. Ober vergcblichc Vcrsuche in ciiescr Hin&.zht bcriclt‘ten I I~ULLOWA~~; nur MIWEU et ui.“” cmpf~hlen~~rn~cumpdwlwt die Vcrwcnclung van l3enzol uncl fin&n jithcrganzunbrauchbar, wenn rcine Urons$urcnbzw. dcrcn Snlzc vorlicgcn. Allcrdings sir-d in clcr Mittcilung dieser Autorcn wcclcr 13clcganr~lysen no& I;chlcrgrcnzen angcgebcn, ja nicht cinmnl der Arbeitsgang wircl bcschricbcn, soclnss einc verglcichencle I3eurtcilung unmOglich ist . l;rsm~~N ct d.“@~~“2 sowie ncucrclings tine Jieihc jnpanischcr AutorcnP?~Q*+*‘J haben clns Ausscli~tt~l~~ mit Alltol~ol _1- ‘Toluol Vor~~I~nrnn~en; allcin, clurch den %uszitz von Alltohol wircl tlic Sclcktivitiit clcs cipntlichcn Estrnktionsmittcls unglinstig bccinflusst, wit FASHENA UNII STIIT am 13eispiclclcr l’cntosctlf~rbstoffcnulzeigcn konntcn20. %ur I~~tr~kti~~~~ des gel6stcn Urol~~~re~~rb~toff~s aus c1cm1Ccnktions~cmisc1~l~aben wir rciltes /‘oirrol hcr;tngczogcn. Es bidet anstellc tler bislang tiblichcn Solvcntien (Ather, Alkohol + iithcr, Amylnlkohoi. Benzyln1kohal, ~utyincct~~t,Cl~loroform) folgenclc wcscntlichc Vortcile: (n) Lcichtc, vollst;incligc uncl wcitgchcnd sclcktivc Aufnahmc cles UronsKurcfarbstd fcs, Allc Vcrbcsserungen des clualitntiven Nnchwciscs, tlic mit cler Wnhl eincs aromxtischcn I;t)lllanwns~;crst(,ffes ffkr die Extntktion vcrbunclct~ sincl, wcrclen nun uneingcscldinkt nuch clcr clunntitativcn Analyse dicnstbar gcmacht. (/j) Schr gcringc Vercl~:nl~fun~~verluste infolge cles rclativ hohen Siedcpunktcs von Toluol, bcsonclcrs im Vcrgleich zu clem bisher zumeist gebrauchtcn &her. (c) Ausgczcichncte Trcnnung cler bcidcn Phasen, wcnn mm, wie vorgc?schlagen,

STUDIEN

ih3ER

DIE

NAPHT~OR~SOR~IN-R~~~KTION

VON

TOLLHNS.

11

231

durch Rotation in schrager Lage extrahiert. Es ertibrigt sich die Vcrwendungeines Scheidetrichters. (d) Vermeidung der Filtration des Extraktes, da sichalle unliislichen Partikel, sofern solche tiberhaupt gebildct werden, in der Grcnzschicht zwischen den beiden fltissigen Phasen ansammcln uncl hcim Abhcbcn des Toluols mit einer Pipette nicht storen. (e) Fortfall der Trocknung mit cinem Trockenmittel; denn die Toluolphase ist bercits vollkommen klar.

Volumen

ties ‘I’ol~~ols

Die -roluolmenge wurdc so bemessen, dass ein ausreichendes Volumcn zur Beschikkung der Mikroktivctten dcs Spektralpltotometers cinschliesslich eincs geringen Uberschusses zur Verfiigung steht, welcher die bequeme Abnnhmc dcr Toluolphase mitt& Pipette und Gummiball ermoglicht. Das Toluol nimmt wahrcnd dcs Extraktionsvorgangcs untcr gleichen Wsseren Bedingungcn eine stcts gleichbleibendc Mcnge Essigsaurc auf; so wird bei %ugabc von 2.00 ml ‘I’oluol tine Toluol-Ibsigsaure-l,laase von 2.60 ml gcbildct. Dcr zuniichst in einem Vctlumen von 7.00 ml vertciltc Farbstoff ist also schlicsslich in 2,Go ml cnthalten. und es crgibt sich dcmnach c?ur giinstigc Anreicherungsfaktor von 2.7. Nuchdcm die lionstanz cles Volumens der Toluol-~ssigsKurc-I’hnsedurclldieganl,c Vcrsuchsreiltc gewtihrleistet ist, crtibrigt sich such noch die Vcrwendung \*on Mcsskolben, sodass dcr gcsamte Arbeitsgang ?>is zur l~xtinkti~nsmessuxig in ci71e772 Gcf&s, und zwar einem Reagensglas durchgeftihrt werdcn kann.

Extra/ztiortsweise %ur Uberflihrung des Farbstoffes von dcr wassrigcn in die organischetr Phase wurcle bishcr durchweg so verfnhrcn, dass das vcrschlossenc Gefsiss kurze Zcit kriiftig gescltiittelt wurde. Die Folgen sind htiufig tine scltlechte Entnliscllungclcr Phascnsowie feinste Suspensionen wassrigcr Tropfchcn in der organischcn Schicht, die nach der Abtrcnnung erst mit cincm ‘I’rockenmittel gekliirt werdcn muss. Untcr unscren Versuchsbcdingungen gentigtes ftir tine quantitative Extraktion dcs Farbstoffcs, wenn die Rcngensgltiscr in schriiger Lagc (Vergriisscrungder l’hascngrcn;r,flachc) viormal jc 45 Sek van Hand urn die Liingsachsc gcclrcht wcrdcn, Die ‘I’oluolphase blcibt drtbci kXar und setzt sich sofort vollkommcn scharf ab.

It’eagentie~~: Cont. o-Phosphors~urc (U = 1.70) pa., Naphthorcsorcin pa. (Hoffmann, La Roche), Eisessig (99-100~~) pa., Toluol pa. In graduierte, mit Gummistopfen zu vcrschliesscnde Reagensgliiscr vort gleiclren Abmcssungcn (Anm. I) pipctticrt man je 1.00 ml dcr Probcl6sung, cnthaltend zoIOO pg freic Uronstiure. Dann gibt man aus einer Utirette jc 2.00 ml cont. Phosphorsaure in langsamer, stets gleichmiissiger Tropfcnfolge hinzu und vcrmischt sofort, Schliesslich wird (Pipette) mit je 4.00 ml ciner o.z”/,igen Naphthoresorcinlosung in Eiscssig (Annt . 2) Uberschichtet. Erst nach Reendigung dicscs Arbeitsganges darf in unmittelbarer Abfoige der Inhalt jedes Glases sorgfaltig gemischt werden (Anm. 3). Nun werden die verschlossencn Glaser 75 Min lang im Thermostaten (Anm. 4) auf 7o” erwarmt. Nach clem Erkaltcn gibt man mit Pipette jc zoo ml Toluol zu, verschlicsst

232

w. WAGNER

wiederum und stellt clann die S&e ,glcichzeitig in Eiswasser. Etwa 15 Min spHtcr beginnt man mit dcr Extraktion, indcm man Glas urn Glas aus dem Waaser nimmt und 45 Sek iang in schrtiger Lagc um seine Achse dreht. Als Naiterung dient zweckmgssig ein starkwandiges Zentrifugengias van passcnder Weitc. Die ‘I’emperatursteigerung dcs Inhnlts durch die Handw~rmc ist m6glichst gcring zu halten; man stelit sofort wicdcr ins Eiswasscr zurtick. Wcnn dieser Extraktit,nstcilschritt vicrmat . bis der Inhalt auf Raumtcmpcratur ~~kommen ist und iicst ciannclusVolun~cndcrkInrcnToiuol-Essigs~urc-Phasc ah. Letzterc wird mittels Pipette undC;ummil~~~llnl~~cl~ol~cn und zur Extinktionsmessung bci 570 rnp in I cm-Mikrokiivettcn cingeftillt (Anm. 5). Zur Aufsteiiung der Eichkurvc wcrdcn drei Eichwcrto mit 22, 44 und 88 pg Glukuran/ml (3 24.25, 48.5 und 97 lug Glukurons3iure/ml) in jctier Analysenscric mitgefiihrt, desgleichen ein Lccrwert mit x.00 ml Wasaer. WBhrenci dcs gcsamtcn Arbeitsgangcs ist die Einwirkung starker Lichtclucllcn zu vermeiden !

Anm. 1. Wir haben IZcagcnsglHsor mit den Abmcssungcn r8o x 18 mm (ca. 45 ml Rauminhalt) verwentlet, die cinc 0.5 ml-‘l’eilung bcsitacn. Anm. 2. Am bestcn bcreitet man die L&ung unn~~ttelbar vor dem Gebrauch. Sol1 sic ftir cinigc Tagc auf Vorrat hcrgcstcllt werden, so empfiehit sich die Aufhcwahrung in eincr gut vcrschlosscncn braunen Fiasche bei Raumtemperatur (nicht im Ktihischrank) , Anm. 3. Es dtirfen kcinc Schiicrcn mehr xu crkenncn sein! Anm. 4. Dcr Thermostat wcist in scinem Deckcl eine der Hijchstzahi cicr Rcagcnsgl&cr pro Analysenscric cntsprcchcnclc Anzuhi von ISohrungcn auf, durch welche die Gliiser mit gcringcm Spiclraum eingefiihrt wcrdcn k&men. Lctztcre wcrden in dcr gcwtinschten Eintauchtiefc clurch cinc tibcrgczogcnc konische Gummidichtung festgehnltcn. Durch lcbhaftes Rtiltren wird ftir mschcn ‘Temperaturausgleich gcsorgt. Anm. 5. Unserc Vcrsuchsreihcn wurden teiis im 13cckman Spcktralphotometer DU, tcils im Zeiss Gcr%t PMf? II clurchgcmcssen.

Die quantitative l3cstinllnun~ tlcr Gal~~kturo~is~iure crfolgt in glcichcr W&c wit bci dcr Glukuronsiiure mit clcr cinzigcn Abweichung, class zur l~nrbstoffbilclung nur 30 rvlin auf 7o” crhitzt wird. Die Eichwcrte enthaltcn hicr ~4.25~48.5 und 97pgGalnkturonsGure/ml.

Unter clcn angegebcncn Vcrsuchsbedingungcn ist im 13creich von 20 bis IOO ~6 UronsZurc das Ll\ar~j~l~~--R~~~~scl~c Gesctz erftillt. Die Abweichungen der einzelncn Messpunktc von dcr Eichgcradcn licgcn fast ausnahmslos untcr 2%, in keinem Falie nbcr tiber 3%, Wie bci vielen I~olorim~tris~l~en ~etl~oden war cs nuch bier nicht miiglich, eine ftir mehrere Versuchsrcihen gtlltige, reproduzierbarc Eichgcrade aufzusteilen. Worauf das zurtickzufiihren ist, konntc trotz sorgf<iger 13eobnchtung ailer clie Rcaktion be..frrcd.C!rit)r.

/f&a,

29

(1963)

227-239

STUDIEN

CRER

DIE

NAPHTHORESORCIN-REAKTION

VONTOLLENS.

II

233

mi t cliesen treffenden UmstZnde nicht cindcutig gekl5rt wcrden. Obereinstimmend Erfahrungen betonen such HOLLSIANN UND WILLE~O sowie FHETWURST UNJ) AHLHELMED, dass zur Erziclung IlijchstmOglicher Genauigkeit bei jccler Annlysenseric neue Eichwertc mitgefiihrt werdcn miissen. Uromiiure mben underen I
53.6

0

53.6 53.G 53.6 n 111~CJrIll

18 36 51

-_--__.

_-

54

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9.5 57.0 Gr.o

^____ van ~-;\l~xlth\'l~l~lkur(~:l~Xi~l.

-_

Die Anwcscnheit cincr iicluivalcntcn Mengc Glukose &din@ also eincn Fchlcr van -/- 13.8%! Ausftihrlichcrc Untersuchungen tiber st6rcndc Einfltissc clcr iibrigcn Zucker stam31 (Ausschiittcln dcs Rcaktionsgcmischcs mit Alkohol men von S*rAr
W. WAGNER

234

TABELLl~ I5INI’LUSS

OLUKOSIS

VON

UND

PRUCTOSP,

AUF

22.0

-

-

-

44.0

-

-

-

DIR

Ii IlRSTIMMUNG

Di?H GLUKURONSAURE

0.07G 0.154

-

-

0.0775 0.0805 0.0735

22.4 23.3 44.4 .-

-+- 2.0 -i- 5.9 -t I.0 -

22.0

225

-

10 : I

22.0

450

450

-

-

20

22.0

-_

-

-

44.0

-

-

-

0.1485

-

-

22.0 22.0

22s ‘I .P

10 : 1 20 : I

0.076

to : I

0.080 0.1515

22.7 24.0

-+ 3.4 -i- 8.9

.1*).0

450

_-

22.0

-

-

-

o.oGgg

-

-

44.0

-

-

-

-

2:1 4 : 1 I : f

0.1425 0.070

-

45-O

22.2

0.074.5 o*t435 0.070

23.6 44.3 -

-I- 0.7 -I- 7.2 -t- 0.7 -

0*‘445 0.05.)

-

-

0.0725

‘7.3

22.x

44-o

22.0 22.0

: I

10

-

: I

0*~555

444

-I-

-

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-

-

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54.0 cjo.0 rjo.0

3:x 2 :I

o*t4s

41.1

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-

-

-

0.070

-

-

44.0

-

-

-

0.

-

-

2’t.O

-

45.G

2 : I

0.0725

22.0

-

00.0

4

I

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23.0

4.1 .o

-

go.0

2 : I

0. I#3

45*2

44.0 22.0 +;*o

17.G

22.0 44,o 22.0

IZINYLlISS

rjo .o

__

VON

GLUKOSlE

UN12 IRUCTOSR

: I

4

:

AUIr

I ‘)‘I

DlIL UI:STIhlMlJNG

x.8 3.6 0.3

22.8

--

--

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2 .o

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GAiAKTURONS~URl~

---

24.25

-

-

24.25

22s 450

-

-

-

-

-

-

20 : I 10 : I

0.0845

-3.5 -0.G

O.IGI)

-3.4

-

-

b.083 0. I 61)

2.f.25

22.7

450 450

-

45.0

go.0

go.0

IO

: I

20

: I

X0

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24.1

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Act&a, 29 (1963)

227-239

SPUDKEN

GBER

235

VONTOLLENS.II

DIENA~HTHORESORCIN-HEAI('~'ToN

dase zur Bestimmung cler frcigesetztcn Urons5ure nicht abgetrennt zu werden braucht. iihniiche VerhZltnisse treffen wir bei der Gaiakturonsgure an. KERTESZ~~ hat die von Gaiakturonsiiure tiberMethodc von RATISH UND BULLOWA~~ auf die Bestimmung tragcn und bemcrkt: “Small proportionsof giucosc and gaiactose do not seem to intcrfcre; both arabinose and fructose in proportions exceeding the amount of galacturonic acid may completely destroy the reliability of the method”. AHTZ UND OSJIAN"C Bussern sich iiber die Fchiergrenzc van Giukuronstiurebestimmungcn im bioiogischcn Material wit foigt : “ The accuracy claimed for these methods is selclom better than -J--O/,, and it is doubtful whether cvcn this degree of accuracy is obtainedconsistently”. DEICH>~,\SN ~~~~V~~~~~~~~~i~abcn~i~ici~failsfiirii~rVcrfahren tine Fehicrgrcnzevon 5’y0 angcgeben. Lasscn wir demnach Abwcichungen bis zu j--O/” vom wahrcnWertezu, so crmijgiicht es clas bcschricbene Vcrfahren, Giukuronsiiure noch ncben dcr cloppeiten Menge Fructose oder dcr zehnfachcn Mcngc Giukosc quantitativ zu erfasscn (l’abeiie II). Hei dcr Gaiakturonsiiure ist sognr die v&facile Mcnge Fructose odcr die zwnnzigfnchc Mengc Giukosc unerhcbiich (‘l’al~eiic III).

Urn das Vcrhaitcn tier (;iukuronsiiurc (und ancicrcr Uronsiiurcn) im Organismus verfoigcn zu icijnncn, ist ein Verfahrcn fiir die Rcstimmung von frcicr nebcn gcbundener Uronsiiurc im seibcn SlllIStriltVorausscrtzung34. Niihcrc I3cschUftigung mit ciicscr Probiematik ichrt zuntichst, dass es sich hicrbei urn zwci mc~thodisch rccht ungieichwertige ‘Teiiprobicmc handcit, jc nacildcm, ob die gebundcnc Uronsiiure in Makromoicktiicn otlcr niedcrmoickuiarcn Verbindungcn cntliaitcn ist. Liegen ais 13cgicitcr i~ocl~moickuiurc Poiyuronosidc (Chondroitin-schwcfclsiiurc. Hcparin, Hyaiurons$urc, rrszrl.) vor, so liisst sic11 durch cinfachc Massnahmcn, z.,?Y. cinc Aikoholftiiiung, die Abtrcnnung von dcr monomcrcn Stiure bewirkcn. In wcitaus den meisten Fliiicn wird aber tiic freie Uronsiiurc ncben niedermoiekuiaren Uronosidcn zu bcstimmen sein. Wcnn man beclcnkt, dnssz.U. die 13indungspartner tier Giukuronstiurc in den Kiirpcrfitissigkcitcn den vcrschicrienstcn Substanzklasscn angchiircn und iibcrdics mchrcre Bindungstypcn vorkommcn. woraussich stark untcrschicdiiche Eigcnschaftcn dcr Paariingc crgebcn, so crschcint es begrcifiich, dass den 13emtihungcn in diescr Richtung bisher rccht bcscheidenc Erfoige gegentiberstchcn. Im Schriittum sind niihcrc Angabcn nur zu den foigcndcn bciden Methoden zu finden: Dicses Verfahrcn (I) Entfcrnung tier Glukuronoside durch iithcrcxtraktion. ciientc urspriingiich zur Abtrcnnung von Giukuronsiiurepaarlingen aus dem Harn von Vcrsuchsticren in priiparativem Massstab, wurde dann durch NEUISEI~G UNU SCHEWI
ctbi?W.

ACta,

29

(1963)

227-239

W.

236

WAGNER

wicweit das such ftir Uronosidc zutrifft, wurde bishcr nicht untersucht. Die Reaktion ermijglicht zwar halbquantitative Aussagen, wenn grtissere Mcngen an Uronsiiuren vorliegcn; tin gcnaucs Verfahrcn kisst sich hicrauf aber nicht aufbauen. (3) Die An,yabe bci HINSISERC; UNI> LASG”~+,class von JARIIICE~Qeine Methode zur gctrennten l~cstimmun~ vcln frcier Uronsiiure hcschricben wurde, beruht auf einem Irrtum. Demgegenfibcr grtindct sich unscr Vrn-schlag zur Rustimmung van freier neben gcbundcncr Uronsiiurc tiuf die hydrolytische Resistcnz gewisser Uronoside. Urn den Anwenclt~ngsl~crcich cles ncucn Vcrfahrtns iibcrblickcn zu kijnncn, muss folgcndcs vorausgescl~ickt wcrdcn. Van den natiiriich vorkommcnden <)ligo-urctnosiclcn fslillt clcr ganz tibcrwicgcnde ‘I’cil untcr clic Iilnssc clcr sag. ,,~;lukuronsiiurepaarlin~c”. Ihr Name wcist bereits auf den chcmiscllcn Aufhau bin: Es hanclelt sich urn Verhindungen, die man sich aus einem Molekiil Glukuronsiiure und cinem Mctlekiil eincs organischcn Bausteincs, dcr H an cincm Hctero-Atom (0, N, S) gebundcn enthiilt, clurch Abspaftung van cinem MolckUl Wasscr entstanclctn dcnken kann. _Jc nach dum ~indun~styp zwischcn den bcidcn Komponcntcn sind vier Gruppcn xu untcrschcidon, clic sich gcgcniibcr hydrolytischcn IZinfliisscn giinzliclt vcrschicden vcrhalten. (I) P/telrofiit/tcv-7j~,. Dicscr stcllt die ~lykosicliscl~e Verkntipfung eincs Phenols mit dcm Ct-Hydrttxyl der ~~luk~~r(~n~~urc dnt-. %u dicsem Yyp gch6rt sowohl mcngcnm&ssig als nuch dcr %a111 clcr Individucn nnch dcr grZisste ‘I’cil der im Siiugetierkijrper anzutrcffcndcn Paarlingc. Die Pl~cn(~l~tllcr-~ruppierun~ ist gegcn Hydrolyse mit S%uren s&r wiclcrstantlsfiihi~, wcnnglcich van Fall zu.Fall ~:eringfii~igeUntcrsclticclcsichgcltend ma&en. (2) Alilo/loliit/zev-~‘y~. Hicr ist an dcr glykosiclischcn 13inclung am Cl cinc alkoholischc Hydroxylgruppe bctciligt. Dieser Typ umfasst mit wcnigen Ausnahmen allc fibrigcn , ,gcpa&tcn Uronsiiurcn”. Bei den nntiiriich v(~rk~)mrnen~en Vcrtretern ist xumeist ein sckunciiirer Alkohol betciligt. Die hydrolytischc Resistenz hiingt von der Natur des alkol~~~lis~l~cn ~3itlclun~spartner~ ab, ist abcr stets vie1 gcringer als beim I’henoliithcr-Typ. (3) Ester-Tyl,. Die (;lukurons~urc ist iiber CI cstcrartig tnit dcr Carboxylgruppc Eine solchc Gruppicrung sctnt hydrocincr (mcist aromatischen) S%ure vcrbundcn. !y:ischcn ~it~wir~~utl~~n nur geringen Widerstand cntgcgcn : Schon bcim Kochcn mit Wnsscr crfolgt rascher Zcrfall in die Komponcntcn : dcsgleichcn beim Stehcn der sch\Vach alknlischcn L&sung bci Raumtcmpcratur. Yaarlinge vom Ester-Typ spielen in den KBrpcrfltissigkeiten normnlcrwcisc nur eine untergeordnetc Kollc. Nach Gaben von bcstimmten Arzneimitteln, wie z.H. Snlicylsiiurc, erschcinen sie jcdoch als eine miigliche Aussclrciclungsform im Ham. (4) A*~ti?~-T~fi. ‘13ei clieser eigenartigen Untcrklasse, drtren Konstitution noch nicht restlos gcsichcrt erseheint, sol1 durch W~sseraustritt zwischcn ciner aromatischen Aminogruppc und dcm Halbacctal-Hydroxyl dcr Glukurons5ure eine nmin-art&e j3inc~un~ zustanclc gekommen sein. Man vcrmutct, class dcrartigc K&-per im Ham von Vcrsuchsticrcn enthalten sind, die mit Anilin, Rnisidin odcr Pheneticlin behandelt wurdcn. Ihrc Isolicruny: schcitert an cfem Umstancl, dass sic ausserordentlich leicht hyclrolysicrt wcrclcn. Dicse Ausfithrungcn

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XAPHTHORESORCIN-REAKTI~N

DIE

237

*rmmr.E xv PH~NOLPHTHALEIN-CLUKUHONOSID (PTG) UND 8-HYDROXYCHINOLIN-GLUKUROXOSID (WCC) AUF DIE. UI%TInI3lIJNc; DICK GLUKUHOSSilVRIE -.I_--_. ----. .., _._,_ _.--

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(1963)

227-239

W. WAGNER

238 mung

van frcicr nebcn gqdxmdcner UrcxGiure, das sich auf das Hydrolyscverhalten der Uronosicle sttitzt, prinzipielle Grenzen gcxogcn sin& Unter ISeclingungcn, wie sic bcreits clcn im vorhcrgchcnclcn Absclmitt beschriebencn Vcrsuchsreihcn zugrundefiegen, ist clie Aufspaltung cler Glukuronoside mit IJhenol~tll~r-~ruppierun~ ~0 ~~ril~~f~~i~, clrrss eine quantitative ~~stimmun~ von freicr nehen cierrtrtig gebunclcncr Uronstiure bis etwzt xur fiinffnchcn molrirun Mcnge dcr lctztcren miiglich wircl (“l’abollc IV). Padinge vom Ester-Typ uncl vom Amin-Typ wenlcn sich hingcgcn sclbst untcr den schoncndsten ICondensationsbcdinlungen wie frcic ~lul~urons~~urc verhaltcn ; dxr uuch ~~i~j~xli~~n vom Alk(t?ir,liitilcr-‘Typ kiinncn noch in bctriichtlicl~em Ausmass hytlrolysicrt w~rlen (Tnbclle V). Denn~~~~ bcdeutet diescr Umstancl keine wcsentlichc ~~insc~lr~nkun~ der Verwcndbarkeit cles gcschildcrten Vcrfdrens fiir licihonanalyson xur Erforschung dcs Glutcurons~urcstoffwecllsels b;sw. zu I,ei,crfunktionsprtifungcn bcim M~~chcn, uncl xw;Lr aus den folgendcn Grlinclcn : (I) Die untcr normalen V~r~l~iltniss~n im Ham ~lus~~s~~~i~~~~nen Clukurons%xx+ paartinge sind, wio gesagt, Ill~~~~nIn~issi~ ggn;l, iiberwicgencl V~ri3i~l~un~~n mit Phcnoliit~~er-grtlppicrutIg, Dcr Amin-‘l’yp kommt pmktisch nicht var. 13ei Ausschluss von Me~lik~~rn~nt~n uncl Drogcn tretcn Uronosidc mit Alkofloliitllor-~>in~u~l~ nur in Form tlcr qu:Lntit;ltiv stark xurticktrctonden 410Gruppc cler Steroidkonjug:ute, solche mit ~st~r-~~i~ciun~ wohl nur nls ~i~irul?ir~-~lukur~n~)sicl~ in ~rs~~~~inun~, (z) Liegun in Sondorfiillen Uronoside vom Alkohol~ther-‘I’yp in I;“riissercr Mengc vor, so liisst sich tntmchmal tine (~urnixlci~st tcilweise) Al>tr~nntl~~~ dcrsclbcn ntlch Ixvvu mit iithcP7 errcichcn. Vielfnch fiihrt such cinc I>ifferctlzbcstimrn\ing gem&s Gc~:rlnt~lukurotlHilurc

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gel~utltlcnc

zum &I, wobci die (;esamt6’luliurt,nsiiure fnhren mit Minesxlsiiurc, die gebundcnc crmittclt wird.

Unc mdthoclc, bilSdC8iir In rhction

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nach cinem clcr bisher ~~l~r~~Li~llii~l~~nVerGiukuronsriure nach I~rs~is~r/\?~u NI> GHWSN12

dc ef‘QtLISNS, Cst proposdc

~xnlr

lc microchap!

dcs ncidcs uro-

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srumEN

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NAPHTHDRESORGIN-REAKTION

239

voN~OrmsNs.Ix

niqucs librcs. Lcs causes d’crrcurs dcs m&hodcs prdcddcntcs sont dvitt’cs par I’cmploi d’acidcphosphoriquo ct d’unc solution du rbactif dans l’acidc acbtique glacial, et par extraction du colorant dans Ic tolulnc. L’acidc glucuroniquc libre pcut i%rc dos& en pr&scncc dc glucuronosidcs du type phbol-&hcr, et Ggalcmcnt; cn prfscncc d’autrcs ttydrates de carbonc. LITERATIJR f R. L. WHISTLER UND ?V. hl. CORBRTT, in W. PIGMAN (Ed.). The Carhlrydrafes, Acndcmic Prcza Xew York, 1957, S. 648. 3 N. E. ARTZ USD E. >I. OS~IAN, Uioc/tetrristry of ~hTJltVttiC /lcid. Academic bc?iB. NCW York. 1950, a = S.13. b = S.7 f, c = S.8. .‘~trslt&iatz J. 3 N. T. HINICS, Arrslrafiurr J. Sci., 18 (1QJjG) 198; N. ‘r. EiINfCs UND A. ~ottlc;P~, sci., 19 (1957) 228: Ricstruticrtt J. Exptf. Biot. Mrd. Sci., 35 (1957) 37. ,g J. J. UUHNS, C. EVANS UND N. T~ot~so~. I. Uioi. Chcttt., 227 (1Q57) 785. t J* N. SMITH UND R. ‘I’. WILLIAMS, Oiochem. J.* +g (1~49) 230, 242, 250. a W. f-f. ~:ISHMAN Cl Uf., f. cliti, ItJtWSt., 30 (J<,sr) 685. 7 &I. A, i'A.CKlfAM UND G. c. UIJTLRR, J. fjid. ClJettl., 1g.g (Ir)s2) 349. 0 j. 1:. I&X.IGLAS UND C. G. KINO, J. i3iol. Cltetta,, rg8 (tgsz) $87; 203 (1953) 889. (rqs.+) 267; Zlrtrl. rlrclr. I\‘fitr. ilfcd., 201 * f-i. SUDHoP. %. PlrysiuC. Clietrr., 290 (1952) 72; 2~6 (rQ54) 89; H. SOD&IOJ~ UND 1'.DJURANOVIE:. Kiita. lYoci~sc/rr., 3 I (x953) HOG. SO S. l-IoLLMANx, %. Plrysiol. Cltettr., 297 (rg54) 74; zgll (tg$+) 77; s. I.IOLL.\IANN UiuJ:,13. WILL& %. Physiol. Chettt * * 290 (t 9.52) 91. 11 I”. IQiimwu~~~ uxn f-i. A. AHLHELM, .47clr. Exptl. Puflrol. i%rarrtUfoi., II f (1953) 382. f2 Y. YO~COE, %ppOYU &fed, .I., XI (1957) X49. UNJ3 ‘r. ‘3 T. WRGSlhNN UND j. MAWGG, Scltwei;. Met&. Wociisckr., 81, (ic)s')) 345; j. xU~OG
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227-239