Studien über die Sektorenbildung bei Penicillium1)

(Aus dem Institut fiir Allgemeine Botanik der Universitat Jena)

Studien tiber die Sektorenbildung bei Penicillium 1) Von

Rudolf Muller Mit 20 Abbildungen im Text (Eingegangen am 12. Februar 1953)

1. Einleitung

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In Abhangigke it von den U mweltfakto ren zeigen die Schimmelpilze eine groJ3e Variationsb reite (DRAWERT und MULLER [1953 a]). Bei den Formen, denen wie Penicillium notatum WESTLING eine sexuelle Fortpflanzung fehlt, ist es auJ3erst schwer, etwas iiber den genetischen Wert der auftretende n Varianten auszusagen, d. h. zu entscheiden , ob es sich urn Mutationen oder nur urn Modifikationen handelt. Dies zu wissen, ist aber fiir "Kulturpfla nzen" wie Penicillium notatum nicht nur von rein wissenschaf tlichem Wert, sondern auch fiir die Praxis von groJ3er B~­ deutung. Bei den. Betrachtun gen iiber die Variabilitat eines Pilzstamme s sollte nicht unberiicksi chtigt bleiben, daJ3 unsere Aussagen iiber morphologische und physiologische Anderungen auf Erkenntniss en beruhen, die wir unter Laboratoriu msbedingun gen gewonnen haben, sich also auf das Verhalten des Pilzes unter kiinstlichen Verhaltniss en begriinden. Wir wissen, trotz vieler geschickter Versuche, diese Mikroorganismen in ihrem natiirlic~len Biotop zu studieren (vgl. WAKSMAN [1927]; KUBIENA [1932]), nur wenig iiber die LebensauJ3erungen, die sie dort zeigen. Ais sicher anzunehme n ist jedoch, daJ3 im schroffen Wechsel der Lebensweise von den natiirlichen Bedingunge n zur kiinstlichen Kultur Ursa chen auf--. flilliger Instabilitat morphologischer und physiologischer Merkmale zu suchen sind. Die rasche Folge von Kulturpassa gen, die dem natiirlichen Entwicklun gsrhythmus nicht entspricht, und die Kulturbedin gungen mit unnatiirlich veranderten Nahrstoffga ben sind wohl mit als Va~ia­ bilitatsursa chen anzunehme n. 1) Dissertation der Mathematisch-naturwissenschaftlichen Fakultat der Fried. rich-Schiller- Universitat Jena. Herrn ·Prof. Dr. O. RENNER zu seinem 70. Geburtstag in Verehrung gewidmet. 14 Flora, Bd. 140

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Bei der im folgenden zu behandelnden Erscheinung der Sektorenbildung, die unserer Arbeit als Problem zugrunde liegt, handelt es sich um eine der moglichen Ausdrucksformen der Variabilitat, wie sie sich bei kiinstlicher Zucht von Schimmelpilzen in Oberflachenkulturen auf festen Substraten zeigen. Bisher fehlt es jedoch an experimentellen Arbeiten, die sich mit den Ursachen der Sektorenbildung eingehender . befassen. Die folgenden Untersuchungen - vorwiegend zytologischer Art - stellen einen Versuch dar, zur Klarung des Abb. 1. 7 Tage alte Kulturen von Problems der Sektorenvarianten beiPenicillium notatum Stamm 17C-19 auf modifiz. Czapek- Agar. Ab- zutragen. impfung: Massenvermehrung des Grundkolonietyps. Linke und rechte Kolonie mit typischen rauhen Sektoren. Mitte: Kolonie ohne Sektorenabspaltung.

II. Definition des Sektors

Die Sektorenbildung ist dadurch charakterisiert, daB sich in den homogen versporten Pilzdecken von Oberflachenkulturen Kreisausschnitte mit mehr oder weniger scharfen Radialgrenzen herausdifferenzieren, welche in·der von ihnen eingenommenen Flache eine veranderte Ober-· flachenstruktur erkennen lassen (Abb. 1, 2 und 3). Der extra-

Abb. 2. 15 Tage alte Kulturen auf Malzagar + Pepton. 2. Passage aus lyophil getrockneten Konidien. Rechte Kolonie mit Sektorenabspaltung.

Abb. 3. 9 Tage alte Kultur auf Malzagar + Pepton. Kolonie mit vier mar. kant en rauhen Sektoren.

sektoriale Bereich mit der urspriinglichen Merkmalsbildung wird Grundkolonie genannt. Analog dazu wird zwischen Grundmyzel und Sektorenm yzel unterschieden. .

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Die sich schon bei makroskopischer Betrachtung ergebenden Abweichungen des Sektors resultieren aus Wuchsform- oder Farbunterschieden der Kolonieoberflache, welche Mufig miteinander gekoppelt sind. Bei normal sporulierenden Pilzkulturen erscheinen in der Regel die Sektoren in der Oberflache rauh, wobei sie zur glatten Oberflache der Grundkolonie einen Gegensatz bilden. Wuchsformunterschiede pragen sich besonders bei KuIturen mit verminderter Sporenbildung deutlich im Profil aus, etwa derart, daB die Grundkolonie aus hohem, lockerem und der Sektor aus flachem, dichtem Myzel besteht. Fast stets bieten die Sektoren das Bild einer fremden Komponente innerhalb der sonst durch mehr oder weniger gleichformigen Wuchs ausgezeichneten Kolonie.

III. Obersichtder Geschichte des Problems Die einzigen bekanntgewordenen Falle der Sektorenbildung bei den fruchtkorperbildenden Penicillien beschreiben DODGE (1933) von P. brefeldianum nov. spec. und SABET (1936) von P. egyptiacum. DODGE erwahnt nur beilaufig, daB Farbsektoren auf verschiedenen Agarsubstraten ungleich haufig gebilliet werden. SABET dagegen untersucht das Verhalten des sektorenbildenden P. egyptiacum in Kulturfolgen. Bei diesem Pilz beruht das Erscheinungsbild auf einer ungleichen Verteilung der Perithzien. Abimpfungen vom Sektor und von der Grundkolonie lieferten gleicherweise Kolonien mit erneuter Sektorenabspaltung. SCHIEMANN (1912) beschreibt das Auftreten von Sektoren an durch starke Reize (Gifte und hohe Temperaturen) ausgelosten Variant en. Derartige Variant en von Aspergillus niger sind nach jahrzehntelanger vegetativer Vermehrung konstant geblieben, so daB an ihrer streng en Erblichkeit nicht zu zweifeln ist (vgl. STUBBE [1938]). AIle erzielten Abanderungen betrafen zunachst die ganze Kolonie; sie waren also keine Sektorenvarianten. Sektorenbildung trat aber in den Folgekulturen dieser erzielten Varianten sowohl bei Massenvermehrung als auch bei Einzellkulturen in einem Stamme auf, und zwar ausschl~eBlich in Form von sterilem Luftmyzel. Die Luftmyzelbildung als eI'nahrungsphysiologisch bedingte Modifikation ist aber eine weit verbreitete, nicht sektoriell auftretende Erscheinung. Solche "sterile Sektoren" bilden in den Folgekulturen gewohnlich keinen eigenen Kolonietyp. Ihre Abimpfungen schlagen haufig sofort oder nach wenigen Passagen zum Ausgangstyp zurtick. Sie lieBen sich auch im oben zitierten FaIle nicht rein erhalten. BURGER (zitiert nach CHODAT [1926]) beobachtete Sektoren in Helminthosporium-Kulturen. CHODAT (1926) hat bei Aspergillusochraceus als erster das Verhalten von Sektor und Grundkolonie tiber viele Folgekulturen hinweg untersucht lind festgestellt, daB sich die beiden Wuchsformen bei Einsporvermehrung tiber viele Passagen rein erhalten lassen. Emeute Aufspaltung erfolgte jedoch stets bei Massenvermehrung, woraus er schloB, "Ie secteur est la resultante d'une mutation de hyphes". ULLSCHECK (1929) berichtete tiber Sektorenbildung bei milchwirtschaftlich wichtigen Penicillien und halt dieses Phanomen ftireine Art "Rassenspaltung". Die aufgetretenen Sektoren wurden jedoch nicht einer Einsporanalyse unterzogen. Nach BROWN (1926) und Tu (1930) wird die Sektorenbildung bei Fusarium durch hohen Zuckergehalt des Nahrmediums gefordert. Die gleichen Bedingungim begiinstigen

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nach MITRA (1931) Hnd DICKINSON (1932) das Auftreten von Sektoren bei Helminthosporum. CHRISTENSEN (1929) beobachtete beim gleichen Pilz zunehmende Sektorenhiiufigkeit bei hiiheren Kulturtemperaturen. Eingehender wurde von DIMOCK (1936/37) die Sektorenbildung bei Fusarium studiert. Der dort verwendete, auf normalem Substrat sektorenlos waehsende Stamm bildete Sektoren unter dem EinfluB hoher Zinksalzdosen. Die FoJgerungen DIMOCKS, daB die Wirkung des .Zinkions in einer spezifisehen Abanderung der "self-perpetuation" liegt, d. h. auf eine Anderung der genischen Konstitution des Kernes oder der extranuklearen Bestandteile des Zytoplasmas der Elternzelle zuriiekzufiihren ist, muB bestritten werden. In den Ansatzen der DIMocKschen Versuehe, die von einer Einsporkultur ausgingen, blieb namlich in der Zinksulfatreihe von sieben Sektoren nur ein einziger sporenloser Sektor konstant. Von Mutationen muB aber eine allgemeine Konstanz der Merkmalsbildung erwartet werden. An sich sind Mutationen unter dem EinfluB von Metallsalzen miiglieh. DaB jedoch die sektorenausliisende Wirkung spezifiseh dem Zinkion zuzuschreiben ist, muB fraglieh erscheinen. Es stellten sieh als Folge des Zinkeinflusses auch nicht sektoriell auftretende Variant en ein. (Vgl. hierzu GROSSER, KUNDTNER-SCHWARZKOPF und BERNHAUER [1950].) SAHAI VASUDEVA (1930) konnte bei der Kultur von Fusarium fructigenum auf Agarnahrbiiden in geringer Sehichthiihe sektorenahnliehes Wachs tum beobachten. Dieses sehlug bei Kultur auf normaler Substratschichthiihe sofort zum Ausgangstyp zuriick, so daB er diese Abweichungen als "falsehe Sektoren" bezeiehnete. Die "scharf abgesetzten Sektoren ", die sieh in den Folgekulturen als konstant erweisen, werden aueh von RAPER und T HOM (1949) als "eehte Mutationen" aufgefaBt. Man stellt Ihnen "sehwache Sektoren" gegeniiber, welche also Ergebnis fortsehreitender Veranderung bei fortgesetzter Laborkultur angesehen und als Stufe. eines "progressiven Variationsprozesses" im Sinne reversibler Modifikationen beurteilt werden. Das Bestreben, alie auftretenden Variationen - die sich unter Umstanden als modifikative Varianten iiber eine gewisse Anzahl von Pas sagen hinweg erhalten lassen - als Mutationen zu deuten, zwang CHODAT (1926) zu der Ansicht, daB auch zonen- und inselfiirmig in Erscheinung tretende Abweichungen der Wuehsform Sektoren seien. Durch ihr verspatetes Erseheinen hatten sie keinen Platz und keine Nahrstoffe mehr, sieh auszubreiten und einen Sektor zu formieren. Abgesehen von einer geringen Anzahl von Schimmelpilzen, bei denen das Zonenwachstum offenbar genetiseh festgelegt zu sein seheint und dann meist mit der Koremienbildung zusammen auftritt (z. B. Penicillium expansum und obligate Koremienbildner), ist die Zonenbildung bei anderen Arten jederzeit durch Wechsel der AuBeneinfliisse wie Temperatur und Licht zu andern. Die von STEVENS und HALL (1909) vertretene Ansieht, daB die Zonenbildung bei Septoria u. a. ein Effekt besonders iippigen Myzelwachstums in Abhangigkeit von der zur Aussaat verwendeten Menge des Impfmaterials sei, steht vereinzelt da. Naeh GALLEMAERTS (1911) und SABET (1936) kann vielmehr ihre ausschlieBliehe Abhangigkeit von auBeren Faktoren als gesichert gelten. Besondere Beachtung verdienen die Sektorenuntersuehungen ZICKLERS (1934), der an einem Askomyzeten mit bekannter Hauptfruehtform (Bombardia lunata) als einziger die Sektorenbildung in exakten genetischen Versuehen im Kreuzungsexperiment und in der Askosporenanalyse verfolgen konnte. Dabei wurde der erbliche Charakter der sektorielien Farbmutationen im Kreuzungsversuch gepriift. Riieksehlage zur Ausgangsform wurden als Riickmutationen gedeutet. Seine Farbmutationen

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entstanden spontan bei Kreuzungen, aber in gleicher Art auch direkt aus den Ausgangsformen. Die als Sektoren auftretenden Mutationen unterschieden sich durch einen roten Farbton von der griinen Normalform und variierten in weiteren Farbsektoren verschiedener Rot- bis Rotbraunstufen. AIle Farbung bedingenden Faktoren sollen frei mendelnde Gene und unter sich multiple Allele sein. Es ist leider nicht bekannt, durch wie viele Generationen hindurch sich diese sektoriellen "Farbmutanten" als erblich konstant erwiesen. Wie die Beobachtungen LIESKES (1921) iiber Sektorenmutationen bei Aktinomyzeten beweisen, ist dieses Phanomen nicht allein auf die Pilze beschrankt. Es sei hier auch auf das Lehrbuch von RIPPEL-BALDES (1949, S. 63) verwiesen, wo die Abbildung eines Aktinomyzetensektors wiedergegeben ist. STANIERS (1944) Befunde, daB bei Actinomyces coelicolor die Entstehung von Sektoren an die Vielsporaussaat gebunden ist, werden von ERIKSON (1948) widerlegt. Sie halt wie SCHAAL (1944) die Sektorenbildung fiir ein Rassenmerkmal, da sie an Einsporisolaten bei Schwestersporen ein und derselben Phragmosporenkette erbliche Unterschiede in bezug auf die Tendenz der Sektorenbildung feststellte. Es erscheint uns der Hinweis wichtig, daB die auf Grund ihrer Organisationsstufe zwischen den Bakterien und Pilzen stehenden Aktinomyzeten mit den Pilzen zwar das Wachstum in Hyphenform, nicht aber den Modus der Sporenbildung gemeinsam haben. Dies deutet schon auf eine weiter unten zu besprechende Erscheinung hin, bei der sich herausstellte, daB die Sektorenbildung nicht an eine bestimmte Entwicklungsstufe der Konidiogenese oder andere Sporenbildung gebunden sein kann. In jiingster Zeit erwahnt SAGROMSKY (1952, Abb. 10) in ihren Untersuchungen iiber den EinfluB des Lichtes auf dis rhythmische Konidienbildung (ringfiirmige Zonierung) von Penicillium-Kolonien das Auftreten einer "Spontanmutation" als Sektorenvariante. Die Sektorenvariante unterscheidet sich von der Grundkolonie durch eine gering ere Lichtempfindlichkeit. Die verbreitete Annahme, die Sektorenabspaltung sei mutativer Natur, kann zunachst - trotz einer gewissen Einstimmigkeit unter den Autoren - nur rein hypothetische Bedeutung haben. Es hat trotzdem nicht an Versuchen gefehlt, auch mit den imperfekten Aspergillaceen nach genetischen Grundsatzen zu arbeiten. Hier sei noch kurz auf die urn den Fragenkomplex "Heterokaryose-Dualphanomen" kreisenden wichtigsten Experimentalbeitrage von HANSEN (1938), BAKER (1944), PONTECORVO und GEMMEL (1944), LINDEGREN und ANDREWS (1945), SANSOME (1947), WILHELM (1947), PONTECORVO (1949), ROBBINsund Mc VEIGH (1949), LAlBACH (1950) und PONTE CORVO und ROPER (1952) verwiesen, auf die weiter unten einzugehen sein wird. Eriirterungen in dieser Richtung im Zusammenhang mit der Sektorenbildung als Spezialfall der Variabilitat fehlen dabei ganzlich. Vor allem aber bietet die moderne Literatur beziiglich der Sektorenbildung keinerlei zytologische Hinweise, was seine Ursache in den nicht unerheblichen Schwierigkeiten haben diidte, denen man bei zytologischen und insbesondere karyologischen Arbeiten an diesen Pilzen begegnet. Vereinzelte Befunde, welche an wenigen Objekten iiber Anzahl, Stmktur und Verteilung der Zellkerne bei den Aspergillaceen gemacht wurden, erlauben, wie es auf Grund eigener Untersuchungen festgestellt werden muBte, keine Verallgemeinerung. In der vorliegenden Arbeit wurden deshalb die Kernverhaltnisse an einem Pilz mit s.tarker Neigung zur Sektorenbildung besonders studiert.

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IV. Besondere Problemstellung aus der VariabilWit und Sektorenbildung bei Penicillium notatum Stamm 170-19 1) Wir hatten bei unseren Untersuchungen den Stamm 170-19 iiber 1Y2 Jahre in Kultur. Dabei zeigte es sich, daB dieser Pilz ebenso wie viele andere Pilze, die man in kiinstlicher Kultur hat, eine betrachtliche natiirFche Variationsbreite besitzt. Die Kulturbedingungen wurden, soweit wie es moglich war, konstant gehalten. Trotzdem zeigten sich von ~bimpfung zu Abimpfung Abweichungen physiologischer . und morphologischer Art, die aber so geringfiigig waren, daB sie als "Kleinvarianten" den Habitus des Pilzstammes kaum merklich . veranderten. Urn so auffalliger ist dagegen Abb. 4. 9 Tage alte Kultur das spontane Entstehen von Abanderungen auf Malzagar+ Pepton. Farbmit starkem, gefestigtem Variantencharakter, sektoren mit diffusen Radiargrenzen. Rier treten keine wie es die Sektoren sind. Uber das AusmaB Profilunterschiede in der der fluktuierenden Variation unter gleichen Oberflache der Kolonie auf. Bedingungen liegt von solchen Pilzen umfangreiches Material vor: Es wurde von einem anderen, unserem U ntersuchungso bjekt sehr nahestehenden Stamm von Penicillium notatum gewonnen (DRA WERT und MULLER [1953]). Das Wachstum dieses Pilzes erwies sich dabei als in so hohem MaJ3e substratspezifisch, daB es geboten erscheint, die allgemeine Charakteristik eines mykologischen Objekts fiir jeden verwendeten Nahrboden zu korri. gieren. Es wird aber hier in dieAbb. 5. 25 Tage alte Kulturen mit starker sem Rahmen dar auf verzichtet, Sektorenbildung auf Malzagar + Pepton. Abimpfung von 6 Monate alter Grundurn das Hauptaugenmerk auf koloniekultur. die Sektorenbildung zu richten. Die vom Stamm 170-19 gebildeten Sektoren treten als Wuchs1) Der Stamm wurde freundlicherweise 'Vom Institut fiir Mikrobiologie, Jena, zur Verfiigung gestellt.

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form- oder Farbsektor'!:lll in Erscheinung (vgl. Abb. 1 und 4). Da Abweichungen in der Farbung der Kolonieoberflache viel haufiger nicht in Form eines Sektors auftreten, sondern die ganze Kultur oder ausnahmsweise nur inselformig begrenzte Stellen derselben erfassen, und da sich infolge zu raschen Abklingens und Rtickschlagens solche "schwache" Sektoren einer exakten Analyse entziehen, wurden in unseren Studien nur die markanteren Wuchsformsektoren genauer verfolgt. Unsere hier aufgeftihrten Aussagen beziehen sich also ausschlieBlich auf dies en Sektorentyp. Die deutlichsten Sektoren bildet der benutzte Stamm auf CzapekMedien; sie lassen sich aber in Oberflachenkultur auf beliebigen anderen Substraten ebenso nachweisen. Sektoren erscheinen in einer Kolonie in der Einzahl oder Mehrzahl und reichen im typischen FaIle bis zur Mitte . derselben oder vom Rande aus weniger tief zum Zentrum (Abb. 5 und 6). Es wird in den beobachteten Sektoren immer der gleiche Wuchsformtyp ge6. 25 Tage alte Kulturen auf modifiz. Czapek-Agar. bildet. Vom verspor- Abb. 2. Passage aus lyophil getrockneten Konidien. Kolonien ten Myzel der Grundmit peripheren Sektoren. kolonie unterscheiden sich die Sektoren bei makroskopischer Betrachtung durch ihre Oberflachenbeschaffenheit. Diese erscheint rauh, grob granuliert im Gegensatz zur glatten, homogenen Oberflache im extrasektorialen Bereich. Die Unterschiede in der Oberflachenstruktur sind mit geringen Unterschieden in der Farbung gekoppelt. U nd zwar sind beim Stamm 170-19 die Sektoren im N ormalfalle dunkler gefarbt als die Grundkolonie (s. Abb.' 7). Bei Abimpfungen vom rauhen Sektor lassen sich die Sektorenmerkmale tiber eine beliebige Anzahl von Folgekulturen rein erhalten - was von einer Einsporkultur ausgehend bis zur 38. Passage verfolgt wurde - und reproduzieren ausschlieBlich die Sektorenwuchsform. Bei Abimpfungen von der Grundkolonie dagegen erfolgt aus noch unbekannten Ursachen heraus in den Folgekulturen immer wieder Abspaltung von Sektoren. Innerhalb einer Abimpfungsserie spalten jedoch nicht aIle Folgekulturen der Grundkolonie auf, und nicht auf allen Substraten ist die Abspaltung gleich haufig.

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Einsporkulturen yom Sektor sind in den Folgekulturen ebenfalls konstant. Sie sind es sowohl in den Einsporlinien, als auch in den aus ihnen durch Massenvermehrung gezogenen Kulturen. Einsporlinien yom Grundmyzel erweisen sich zwar als weitgehend konstant; in wenigen Fallen konnte jedoch auch auf sehr alten Einsporkulturen Sektorenbildung beobachtet werden. Sektorenbildung erfolgt ferner -wenn auch in geringerem Ma.l3e als bei fortgesetzter Masseniiberimpfung - bei Massenvermehrung der Grundkolonie nach eingeschalteterEinsporpassage. Der Sektorentyp zeichnet sich ferner durch rascheres Wachstum aus. Er erreicht sein Sporulationsmaximum 1-2 Tage friiher als der Grundkolonietyp. Mischkulturen aus Sporen von Grundkolonie und Sektor liefern daher ausschlie.l3lich Kolonien, deren Wuchsform und Oberflache den Sektorenkulturen entspre-. chen. Trotz der tingleichen Sektorenhaufigkeit auf den verschiedenen Substraten konnte kein Medium gefunden werden, das die Sektorenbildung Abb.7. 7 Tage alte Kulturen auf Malzagar + Pepton. ganzlich unterdriickt. Links: Glatte Grundkolonie ohne Sektorenabspaltung. Fiir das Verstandnis Reehts: Rauhe Sektorenkolonie. desPhanomens der Sektoren bildung ergibt sich demnach aus diesem Verhalten, da.13 sich sowohl ernahrungsphysiologische als auch genetische Studien die Problematik zu teilen haben werden. Einer Entscheidung fiir oder gegen "nutritative" oder "genetische" Effekte fehlen allerdings noch wesentliche Untersuchungsergebnisse. Kernuntersuchungen an Sektoren, die bisher noch nicht durchgefiihrt wurden, erschienen uns deshalb besonders geeignet, neue Gesichtspunkte fiir die Beurteilung des noch wenig verstandlichen Variationsmechanismus beizutragen.

V. Methodik Die unter sterilen Bedingungen gezogenen Kolonien wurden bei 24 0 C im Dunkeln gehalten und auf mogliehst gleiehmii.6ig zusammengesetzten Ni1hrboden kultiviert. Als Kulturgefi1Be benutzten wir Petrisehalen (5 und 9 em Durehmesser), 100 ema fassende ErlenmeyerkOlbehen sowie 500 ema Rundkolben aus Jenaer Glas. Zur An-

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zucht submerser Schiittelkulturen diente ein Rundschwingtisch System KNOLL. Erforderliche Einsporisolate wurden nach dem Mikromanipulationsverfahren mit dem Zeiss'schen Gleitmikromanipulator gewonnen. Folgende Niihrbiiden kamen zur Anwendung: 1. Czapek-Agar: NaNO. 2,0 g KH 2 PO, 1,0 g MgSO,· 7 H 2 0 0,5 g KCl 0,5 g FeSO,· 7 H 20 0,01 g Saccharose 30,0 g Aqua dest. ad 1000 em· 2. Modifizierter Czapek-Agar: NH,NO. 1,9 g anstatt NaNO. aIle anderen Bestandteile wie unter 1. 3. Henneberg-III-Agar: Pepton 5,0 g KH 2PO, 5,0 g MgS0 4 • 7 H 20 2,0 g Na 2CO. 5,0 g Saccharose 150,0 g Aqua dest. ad 1000 em· 4. Malzagar mit Pepton: Malzextrakt 40,0 g Pepton 5,0 g Aqua dest. ad 1000 em· 5. Malzagar: Malzextr. 40,0 g Aqua de st. ad 1000 ccmB 6. Raulin-Dierckx-Agar: Lsg. A MgCO. 0,4 g Weinsa.ure 0,71 g Aqua dest. ad 100 em' Lsg. B NH,NO. 2,66 g 0,4 g (NH')2HPO , 0,4 g K.CO, (NH,).SO, 0,16 g ZnSO,· 7 H.O 0,04 g FeSO,· 7 H 20 0,04 g Saccharose 46,6 g Aqua dest. ad 900 em" Zur fertigen Liisung B werden 66 em· der Liisung A hinzugefiigt und mit Aqua dest. auf 1000 em" ergiinzt. 7. Sabouraud-Agar:

8. Pulst-Niihrliisung:

Pepton 10,0 g 40,0 g Glukose Aqua dest. ad 1000 em" Peptorr 5,0 g KNO. 0,13 g KH 2 PO, 1,035 g MgSO, . 7 H 2 0 0,16 g 40,0 g Saccharose Aquadest. ad 1000 em"

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Pepton Witte fiir bakteriologische Zwecke. Kauflicher Riibenzucker. Falls im Text nicht anders erwahnt, wurde fiir die Nahrbiiden 1-7 ein Agar aus europaischen Algen (Danagar) verwandt. Zusatz jeweils 4%. Die Nahrbiiden - auBer 7 - wurden 20 Minuten bei 120 0 C im Sterilisation: Autoklaven sterilisiert. Bei Nahrboden 7 erfolgte Momentautoklavierung. Zur Untersuchung der Frage, ob die Sektorenbildung auf eine quantitative Veranderung des Kernsatzes gegeniiber dem Grundmyzel zuriickzufiihren ist oder ob das bei der Reterokaryose wirksame Prinzip der Kernentmischung die Sektorenbildung verursacht, wurden Kernuntersuchungen der verschiedenen Myzelelemente und Konidien durchgefiihrt. Fiir die Darstellung der Zellkerne bei den Penicilli en kommt wegen der Kleinheit des Objekts und den gering en Kerndimensionen nur eine spezifische Kernfarbungsmethode in Frage, die allein eine moglichst fehlerfreie Deutung des im gefarbten Praparat sich bietenden Bildes gestattet. TISCHLER (1921/22 und 1934) gibt nach GUEGUEN (1899) eine GroBe von 0,5-2,0 bei Kernen des vegetativen Myzels von P. glaucum an, und nach KOERNICKE (1903) soil die KerngroBe 1,5-2,0 betragen. Wie sich in Vorversuchen gezeigt hatte, reich en die mit basischen Farbstoffen zu erzielenden diffusen Chromatinfarbungen (z. B. nach der Eisenhamatoxylinmethode), die au~ Farblackbildung beruhen, bei dieser KerngriiBe nicht aus. Auch die flir bakteriologische Zwecke empfohlenen Kernfarbungen nach ROBINOW (1942) und die Perchlorsaurefarbung nach CASSEL (1950) boten keine Vorteile, zumal hier aine optimale Wirkung nur in Verb in dung mit bestimmten Fixierungsmitteln erreicht wird. Aber gerade die im letzteren FaIle geforderte quecksilberhaltige Schaudinn-Fixierung galt es zu vermeiden, weil die haufig auftretenden Niederschlagsartefakte bei quecksilberhaltigen Fixierungsmitteln den Nachweis zelleigener Bestandteile nur erschweren. Dagegen erwiesen sich fiir nachfolgende Feulgenfarbung Eisessigdampfe, Flemming I, Chloroform, OsO, und ein modifiziertes Garnoy-Gemisch als geeignet.

Pepton: Saccharose: Agar:

Zusammensetzung und Anwendung der Fixierungstnittel Eisessigdam pffixierung Ein mit Klemmen an einem Stativ befestigtes Reagenzglas wurde mit 3-5 cma Eisessig geflillt und bis zum Siedepunkt erhitzt. Urn Austrocknul1g oder bloBe Ritzefixierung des Objektes zu vermeiden, wurde ein Glastrichter aufgesetzt und das.auf einem Objekttrager befindliche Objekt (Myzelproben in einem Tropfen sterilisierten Wassers) mit nach unten gekehrter Schichtseite aufgelegt. Die Temperatur wurde knapp unterhalb des Siedepunktes gehalten. Optimale Fixierungszeit: Myzelzellen 2,5 Minuten Konidien 3,;; Minuten Die Fixierung wirkt quellend. Nach der Fixierung wird das Objekt 1-3 Stunden in 96%igen Alkohol gebracht und anschlieBend 3-6 Stun den gewassert. Flemming I 1 %ige Chromsaure 18 Teile 2%ige Osmiumsaure 2,5 Eisessig 1,2 " Aqua dest. 21" Einwirkungsdauer: 2-3 Stunden, fiir Konidienmaterial bis zu 5 Stunden, mit anschlieBendu 24stiindiger Wasserung. Die Fixierung wirkt quellend.

Stndien iiber die Sektorenbildung bei Penicillium

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Chloroform Die Objekte werden in Chloroform eingetaucht. Einwirkungsdauer: 30-60 Sekunden. Nach dem Verdampfen des Chloroforms wird 10-30 Minuten gewassert. Die Fixierung schont bei kurzer Einwirkungsdauer die zytoplasmatische Feinstruktur. Carnoy, modifiziert Die Fixierung nach CARNOY erweist sich als giinstig, falls der Eisessiganteil gering gehalten wird. 100 Teile Alkohol 70% Eisessig 3 Einwirkungsdauer: 30 Minuten. AnschlieBend 12 Stunden wassern. Die Fixierung wirkt quellend. Osmiu msa ure dam pffixierung OsO, 2%ig. Einwirkungsdauer: 2-3 Minuten. Diese Fixierung arbeitet ohne Bildung von Artefakten. Sie eignet sich aber nicht gut fiir Pilzmaterial aus Oberflachenkulturen, weil OsO, in der dampffiirmigen Phase die chitinhaltigen Hyphen und Konidien nur unvollstandig fixiert. Bessere Ergebnisse werden mit Myzel aus submersen Kulturen erzielt. Das Myzel wird dabei in einem Tropfen Nahrliisung hangend fixiert. Nach der Fixierung wird mindestens 24 Stunden gewassert.

Es blieb noch zu untersuchen, ob die Feulgen-Farbung sich fiir den Nachweis der Substruktur von Pilzkernen eignet. Die auf FEULGEN und ROSSENBECK (1924) zuriickgehende N ukle alfarbung ist. in ihrer chemischen Seite zwar noch nicht viillig geklart, sie darf aber unter den bis jetzt bekannten Methoden immer noch als die spezifischste Kernfarbung angesehen werden. Alle auch in neuerer Zeit erhobenen Einwande gegen die Spezifitat der FEULGENSchen Nuklealreaktion lie Ben sich widerlegen. So wendet z. B. CARR (1945) ein, daB die Selektivitat der Feulgen-Farbung auf der Zerstiirung des Zytoplasmas in der vorangehenden Hydrolyse beruhe. Ferner kiinnten die als gute Absorbenten bekannten Chromosomen in der Lage sein, die Farbe des SCHIFFschen Reagenz zu regenerieren, so daB keine chemische Reaktion, sondern bloBe Adsorptionserscheinung anzunehmen sei. Gegen die Richtigkeit der zweiten Annahme sprechen aber die Ergebnisse von MAZIA und JAEGER (1939), welche Feulgen-negative Chromosomen erzielten, wenn sie aus diesen mittels Nucleasen die Thymonucleinsaure entfernt hatten. Was die Zerstiirung des Zytoplasmas bei der Hydrolyse anbetrifft, so konnte DODSON (1946) den experimentellen Beweis erbringen, daB diese zwar_ in lebenden, nicht aber in fixierten Geweben in Frage kommt. Fixierte Gewebeplasmen, die er in parallel en Versuchen bei 60 0 C 20 Minuten einer n/HCI-Hydrolyse unterwarf bzw. bei 60 0 C 20 Minuten mit aqua dest. behandelte, zeigten im ersten FaIle nur einen unbedeutenden Gewichtsverlust gegeniiber der Kontrolle. Die sich aus dem Gehalt an d-Ribose und Uracil in der Ribonucleinsaure, bzw. d-Ribodesose und dem methylierten Pyrimidin, Thymin, in der Thymonucleinsaure ergebenden chemischen Unterschiede lassen nach STOWELL (1945) kaum Zweifel an der Spezifitat der FEULGENSchen Nuklealfarbung zu. Davon unbeeinfluBt bHJibt die Frage offen, ob die bei der Nuklealreaktion auftretende Purpurfarbung auf einer Additionsverbindung (WIELAND und SCHENING [1921]) oder auf der Wiederbildung der Chinoidbindung beruht (BAKER [1942]).

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Nach unseren Erfahrungen laBt sich die FEULGENSche Kernfarbung auch fUr mykologische Objekte mit Erfolg und ohne wesentliche Abweichung von der Standardmethode in Anlehnung an JANKE (1946) nach folgendem Arbeitsgang verwenden: 1. Fixierung. 2. Wassern, je nach Fixierungsmittel, nicht unter 6 Stunden (au.Ber bei Chloroform), mindestens 24 Stun den nach Flemming I. 3. "Milde" n/HCl-Hydrolyse durch 5 Minuten bei 60 0 C. 4. Einbringen des Objekts in die farblose bis blaB gelbliche fuchsinschweflige Saure (basische Leukostufe) fUr 6-24 Stunden bei Zimmertemperatur. 5. Auswaschen mit HaSO.-haltigem Wasser. 6. Wassern durch mindestens 2'-3 Stunden in flieBendem Wasser.

VI. Kernuntersuchungen an Konidien Bei der Auswertung der mit"der FEuLGENschen Nuklealreaktion erzielten Kernf1irbungspraparate zeigte sich, daB die Konidien des Sektors iiberwiegend einkernig sind. Es lieBen sich aber auch Konidien mit zwei und mehr, bis maximal fiinf Kernen nach·weisen. Die prozentuale Haufigkeit der zweikernigen Sporen belauft sich auf etwa 6 bis 7%; Konidien mit drei und mehr Kernen finden sich in einem Prozentsatz von ungefahr 3, so daB mindestens 90% der im Bereich des Sektors gebildeten Sporen einkernig sind. Der Verdacht, daB es sich bei den Mehrkernigen etwa urn erste Keimungsstadien handelte, erwies sich als nicht zutreffend. Keimende Konidien zeigen in der Regel eine eindeutige Volumenzunahme, wobei die Anschwellung ein Vielfaches der normalen GroBe ausmachen kann. Bei den Mehrkernigen ergaben sich keinerlei Beziehungen zwischen Kernzahl und KonidiengroBe. Die einkernigen Konidien haben eine DurchschnittsgroBe von 3,8!t. Fiir die mehrkernigen Konidien lieB sich - allerdings an Hand einer bedeutend geringeren Anzahl - etwa der gleiche Durchschnittswert ermitteln. Einkernige sowie mehrkernige Konidien sind beim Stamm 170-19 in ihrer Form und GroBe sehr variabel; die Transgression der Variation ist in beiden Fallen gleich groB. Ais zuverlassiges Kriterium fiir die Konidienkeimung kann im gefarbten Praparat die ihr vorausgehende Quellung und langevor der Keimschlauchbildung sichtbar werden de "unverkennbare Differenzierung der Membran in Exine und Intine geIten. Je nach Eigenschaft des Fixierungsmittels zeichnet sich die Membran bei einleitender Keimung durch Dickenzunahme mit deutlich werdender Doppelschichtung aus (vgl. Abb.8). Weil die mit der Keimung einhergehende rasche Kern-

Studien tiber die Sektorenbildung bei Penicillium

221

teilungsfolge moglicherweise zeitlich individuell verschieden ist, schieden Konidien mit gequollener Membran fiir die Auszahlung aus. In bezug auf die Verteilung der mehrkernigen Sporen muB hervorgehoben werden, daB sie nur gelegentlich in Ketten einkerniger Konidien verstreut vorkommen. Die zweikernigen Sporen finden sich vorzugsweise gehauft in ganzen Ketten nur zweikerniger Konidien (s. Abb. 9). Sterigmen, die in strenger Folge nur zweikernige Konidien abschniiren, besitzen selbst auch zwei Kerne, so daB der doppelte Kernsatz dieser Konidien verstandlich ist, wenn man annimmt, daB be ide Sterigmenkerne je einen aus der Mitose resultierenden Teilungskern in die sich abschniirende &onidie einwandern lassen.

o Abb. 8. UngequoUene und gequollene Konidien vom Grundmyzel. Fixierung: Eisessigdampfe. Bei 1200facher VergriiBerung (120 x 10) mit ABBEschem Zeichenapparat gezeichnet.

Abb.9. Links: Einkernige Sterigma mit zwei zweikernigen Konidien in der Sporenkette. Rechts: Zweikernige Sterigma mit nur zweikernigen Konidien in der Sporenkette. Fixierung: Modifiz. Carnoy- Gemisch. Feulgen-Farbung bei 1800facher VergriiBerung (120 x 15) mit ABBESchem Zeichenapparat gezeichnet.

Sporen mit drei, vier und fiinf Kernen wurden in den zweikernigen Ketten haufiger als in den einkernigen Konidienketten gee funden. Die Ursachen des Auftretens mehrkerniger Sporen iiI den einkernigen Ketten sind noch nicht bekanntgeworden. Die Konidien des Grundmyzels sind in so iiberwiegendem MaBe einkernig, daB fiir den Stamm 170-19 die Einkernigkeit als Regel angesehen werden muB. Es wurden hier weniger als 5% Zweikernige und keine Vielkernige gefunden. • Einkernige Konidien fanden bei verschiedenen Penicillien z. B. DANGEARD (1907), BIOURGE (1923), WAKAYAMA (1930) und ELISEI (1940). Dagegen sind die Konidien der Aspergillus-Arten nach HENRARD (1934) in der Regel mehrkernig. Eine Bestatigung der BAKERS chen Auffassung (1944), daB ein- oder mehrkernige Konidien artspezifisch fiir die einzelnen Penicillien seien, kann aus den an unserem Objekt ermittelten Befunden nicht abgeleitet werden.

222

RUDOLF MULLER

VII. Kernuntersuchungen an Myzelzellen 1m Gegensatz zu den Konidien bestehen in den Zellen des Myzels hinsichtlich der Kernzahl keine Unterschiede zwischen Grund- und Sektorenmyzel. Wenn man von den erst en Myzelzellen absieht, welche sich nach dem Auswachsen des Keimschlauches abgrenzen und in diesem Entwicklungszustand meist noch vielkernig sind, so gelten die Hyphenzellen von Penicillium nach den neueren Untersuchungen von ELISEI (1940) und BAKER (1944) als konstant einkernig. Die Myzelzellen von Penicillium crustaceum sind nach DANGEARD (1907) mehrkernig. Wenigstens fUr die Zellen des Konidientragers wurde ,

Abb.10. Meniskenformige zentrale Verdickung der Querwande. Fixierung: Eisessigdampfe. Vergro.6erung wie Abb. 8.

iibereinstimmend die Einkernigkeit ermittelt. Danach herrscht allgemein die Ansicht, daB ein Gefalle in der Kernzahl von den vielkernigen Zellen der Primarhyphen zu den einkernigen Sterigmen besteht. Beim Stamm 170-19 erwiesen sich die Zellen des Konidientragers als zwei- oder mehrkernig. Nur in den Sterigmen wird im Normalfalle die strenge Einkernigkeit erreicht. Auch die iibrigen Myzele;ellen sind vorwiegend zweikernig. Zellen mit einem abweichenden Kernsatz von vier, sechs und gelegentlich mehr Kernen kommen an beliebigen Stellen im Myzel vor. Vierkernige Zellen finden sich z. B. basal in den Primarhyphen ebenso wie in den verzweigten distalen Hyphen in der Nahe der Konidientrager. Auffallig ist jedoch, daB in den Myzelzellen nur gerade Kernzahlen nachzuweisen sind. Einzelne Zellen mit schein bar ungeradem Kernsatz lieBen erkennen, daB dort gerade einer der Kerne im Teilungszustand war, so daB die nach abgeschlossener Teilung wieder hergestellte gerade Kernzahl wahrscheinlich nicht auf einer ZufiHligkeit beruht. Weder in gefarbten noch an lebenden Objekten fanden sich hellfeldmikroskopisch oder im Dunkelfeld nachweisbare Perforationen in den Querwanden. Die von BAKER (1944) zeichnerisch wiedergegebenen "septal pores", deren Vorhandensein fUr das Verstandnis der Kernwanderungen von Zelle zu Zelle bei der Heterokaryose so unentbehrlich ist, lieBen sich nicht auffinden. 1m Phasenkontrastpraparat sind sogar an Stelle der zu erwartenden Membranperforationen in den Septen haufig zentrale meniskenformige Verdickungen zu erkennen (Abb. 10).

--"

....

Studien tiber die Sektorenbildung bei Penicillium

223

VIII. GroBe, Form und Feinstrukturen der Zellkerne bei Penicillium notatum Stamm 170-19 Die Kerne erscheinen in Feulgen-Praparaten nach GroBe und Form varia bel. Ruhekerne, wie sie sich am sichersten in den Sporen finden lassen, sind rundlich bis oval. Sie sind hier etwa 0,7-1,5 (J. groB und meist groBer, als die Kerne der Myzelzellen. Dort finden sich neben dem am haufigsten zu beobachtenden Ruhekerntyp auch langovale bis· gestreckt-langliche Ruhekerne von nahezu gleichen Dimensionen. Daneben kommen auffallig kleine Kerne von 0,3 bis 0,5 (J. GroBe vor.

<€)- • • .~___::::_~-_ . .:c Abb. 11.

Vielkernige Zellen der Primarhyphen. Fixierung: Flemming I. FeulgenFarbung. Vergro.6erung wie Abb. 8.

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~~----I-.---------~------------~

Abb. 12. Vielkernige terminale Zellen der Substrathyphen. Fixierung: Flemming I, Feuigen-Farbung. Vergro.6erung wie Abb; 8.

Abb. 13. Typische Lage der Keme bei Zweikernigkeit der Zelle und gro.6el' Zentr~l­ vakuole. Fixierung: Chloroform. Feulgen-Farbung. Vergro.6erung wie Abb. 9.

Abb. 14. Typische. Lage der Kerne in vielkernigen Zellen mit mehreren Vakuolen. Fixierung: Chloroform. Feulgen-Farbung. Vergro.6erung wie Abq.9.

In den regelmaBig vielkernigen Zellen der Primarhyphen liegen die Kerne bei fast gleichem Abstand voneinander im mittleren Bereich des Plasmas (Abb. 11). Eine ahnliche Lage im Plasma haben die Kerne in den terminalen Zellen der jijngsten Hyphen, deren charakteristische Verteilung in Abb. 12 wiedergegeben ist. In allen iibrigen, fast ausnahmslos stark vakuolisierten Myzelzellen liegen die Kerne im diinnen Plasmawandbelag. Es lassen sich hier die kleinsten Kerne nachweisen. In den Zellen mit normalem Kernsatz liegen die Kerne - wenn eine einzige groBe Zellsaftvakuole die ganze Zelle erfiillt - in der Nahe der Querwande (vgl. Abb. 13). Sind in mehrkernigen Zellen mehrere kleine Vaku-

ill:

224

RUDOLF MULLER

olen vorhanden, liegen die Kerne bevorzugt paarweise in den zwischen den Vakuolen verbleibenden Plasmabriicken (Abb. 14). Die Ruhekerne lassen bei optimaler Farbung erkennen, daB die Feulgen-positive Substanz nicht den ganzen Kern homogen einnimmt. Es zeigt sich vielmehr eine Konzentration an beiden Polen. Vermutlich handelt es sich dabei urn einen von hiiheren Pflanzen her bekannten Kerntyp, der im Innern Karyolymphe fiihrt. Die beiden durch eine polare Konzentration Feuigen-positiver Substanz in Erscheinung tretenden "Kernhalften" als Chromosomen zu deuten, erscheint uns unzulassig, weil - wie aus Abb. 15 ersichtlich --: aile Ubergange zwischen "massiven" und hohlraumfiihrenden Kernen bis zu einer schein bar vollstandigen Trennung der beiden Kernhalften anzutreffen sind, wobei aber stets die urspriingliche Kernwand erhalten und gerade noch erkenntlich bleibt .

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Abb.15. Ruhekerntypen. Fixierung: Eisessigdampfe. Feulgen-Farbung. Ohne Beriicksichtigung der Dimensionen schematisiert.

Es ist anzunehmen, daB die von SCHURHOFF (1907) flir Penicillium crustaceum FRIES angegebenen zwei Chromosomen solche Kernhalften darstellen. Die dort verwendeten Farbstoffe (Safranin-Gentianaviolett bzw. Eisenhamatoxylin) lassen unseres Erachtens die von ihm gezogenen Schliisse als sehr unsicher erscheinen. Auch WAKAYAMA (1930) ermittelt. bei 14 untersuchten Aspergillus-Arten einen haploiden Chromosomensatz von n = 2 und beschreibt die Chromosomen als rundliche, plumpe Kiirper . .Mit Ausnahme der hier intranuklearen Spindelbildung veriauft die .Mitose nach WAKA Y AMA nach dem flir die Kernteilung bei hiiheren Organismen giiltigen Schema. Nach ELISEI (1940) finden bei einem dem Penicillium lanosum nahestehenden Pilz in allen Zellen karyokinetische Teilungen statt unter Bildung von ebenfalls zwei Chromosomen. Kernteilungsstadien mit chromosomenartiger Auflockerung und Aggregierung des Chromatins konnten wir in Feulgen-Praparaten nach Flemming lund Eisessigdampffixierung erhalten. Da besonders Eisessig sehr stark quellend wirkt, wurde durch Verwendung dieser Fixierung erwartet, am ehesten in den strukturellen Feinbau der in Teilung befindlichen Kerne eindringen zu kiinnen. Die dabei sichtbar werdenden Gebilde kiinnen jedoch nicht ohne weiteres als Chromosomen gedeutet werden. Es entsteht ein zartfadiges Knauel, das etwa den doppelten Raum des Ruhekernes einnimmt und welches an spate Prophasenbilder

!££

225

Studien liber die Sektorenbildung bei Penicillium

der Kerne hOherer Pflanzen erinnert (Abb. 16). Das sich bietende Bild ist immer das gleiche: eine regellose Anhaufung fadiger Elemente, ohne daB sich auch nur AnkUinge an eine Spindelbildung oder Anordnung in einer Aquatorialplatte erkennen lassen. In den terminalen Zellen noch wachsender Substrathyphen und in den Sterigmen konnte dieser Kerntyp in optimal fixierten und gefarbten Praparaten immer wieder angetroffen werden. Sollte es' sich dabei urn Chromosomen handeln, so waren diese auBerst zart, sehr dunn und lang und auf keinen Fall nur in der Zweizahl vorhanden. Durch das Fehlen aller fUr eine normale Mitose entscheidenden Teilungsschritte lassen es diese Befunde jedoch noch nicht zu, den bei Penicillum anzutreffenden Kernteilungsmodus einer normalen Mitose gleichzusetzen. Zusammenfassend laBt sich uber die Kernuntersuchungen sagen, daB die Erwartungen, die Sektoren zeichneten sich durch einen vom

Abb. 16. Chromosomenartige Strukturen der Kerne. Fixierung: Eisessigdampfe. FeuIgen-Farbung. VergriiBerung wie Abb.9.

Grundmyzel grundsatzlich abweichenden Kernsatz in allen oder bestimmten Zellen des Myzels aus, nicht erfullt wurden. Wie sich herausstellte, ist die Kernzahl der ungekeimten Konidien weder beim Sektor noch beim Grundmyzel des verwendeten Stammes konstant. Wenn wir auch nicht wissen, wie die mehrkernigen Sporen in den einkernigen Konidienketten zustande kommen, so ist doch anzunehmen, daB die Kerne der ein- und mehrkernigen Sporen und letztere unter sich genomgleich sind, weil sie aus einkernigen Sterigmen stammen. Anders ist es bei den Kernen der Konidien aus zweikernigen Sterigmen. Hier kann das Kernpaar einer Zelle genetisch ungleich sein. Nicht nur in Sporengemischen bei Massenvermehrung, sondern auch unter Verwendung von Einzelsporen als Ausgang fur Pilzuntersuchungen muE damit gerechnet werden, daB das an den Anfang gestellte Isolat in seinem Kernsatz und damit seiner genetischen Potenzen nach vom N ormalfall betrachtlich abweichen kann. Unsere Bemuhungen, die Zellkerne am lebenden Objekt nach zuweisen, gelangen zwar mit Hilfe des Fluoreszenzmikroskopes unter Verwendung von Acridinorange bei Myzelzellen, wo sich die Befunde mit denen der Feulgen-Praparate deckten; sie blieben jedoch erfolglos bei den Konidien, was nach den von JOHANNES (1950) an PhycomycesSporen erzielten negativen Ergebnissen durch einen in der Sporenwand vorhandenen fluoreszenzlOschenden Stoff bedingt sein solI. Flora, Bd. 140

15

226

RUDOLF MULLER

Da der Grad der Konstanz des rauhen Sektors bei fortgesetzter sexueller Vermehrung auf eine strenge Erblichkeit schlieBen laBt, und weil andererseits die Haufigkeit des spontanen Auftretens immer des gleichen Sektorentyps in den Grundkolonien berechtigte Zweifel an der genmutativen Natur seiner Entstehung aufkommen laBt, wurde das Verhalten von Sektor und Grundkolonie in einer Reihe von Versuchen analysiert. Dabei wurden die zur Differenzierung zwischen Sektorenund Grundkoloniewachstum herangezogenen Werte - sofern nicht anders angegeben -- stets von dem gleichen, auf eine Einsporkultur zuriickgehenden Sektor ermittelt, der im 10-14- Tage-Intervall iiberimpft wurde.

IX. Morphologische und physiologische Differenzierung zwischen Sektor und Grundkolonie Die Unterschiede in der Oberflachenstruktur der Sektoren und der Grundkolonie sind, wie durch Auszahlen ermittelt wurde, auf Langenunterschiede der Konidienketten zuriickzufiihren. Einsporlinien des Sektors und der Grundkolonie wurden auf sieben verschiedene feste Substrate abgeimpft. Stets erscheint die Oberflache der Sektorenkolonie mehr oder weniger rauh, die der Grundmyzelkolonie glatt. Obwohl bei Kultur auf den verschiedenen NahrbOden der Habitus der Sektoren- und Grundkolonien substratspezifisch unterschiedlich ist, so ist doch der Unterschied zwischen Sektorentyp und Grundkolonietyp immer so groB, daB er unverkennbar bleibt. In beiden Wuchsformen bilden die von den Sterigmen eines Konidientragers abgeschniirten Konidienketten schwach divergente Biindel. Die Langen der Ketten ergeben die in Tabelle 1 aufgefiihrten charakteristischen Unterschiede. Es sind Auszahlungen aus vorsichtigbereiteten Zu pfpraparaten von gleichaltrigen Kulturen. Tabelle 1 Sporenanzahl der Konidienketten im Sektor I in der Grundkolonie Czapek-Agar 8. Tag

53 67 42 38 51

17 28 25 23 14

Malz-Agar 8. Tag

51 32 41 44

20 17 19 21

Sabouraud-Agar 8. Tag

24 19 21 19

I

16 8 12 10

Studien iiber die Sektorenbildung bei Penicillium

227

Danach erweisen sich die Konidienketten des Sektors durchschnittlich doppelt so lang wie die der gleichaltrigen Grundkolonie. Auch bei Mikrokulturen auf Hohlschliffobjekttragern mit sparlicherer Sporulation betrug das Langenverhaltnis etwa 2: 1. Ob hierbei auBer der groBeren Kernteilungsfrequenz in den Sterigmen des Sektors auch Unterschiede in der chemischen Struktur der Membran eine Rolle spielen, konnte nicht gepriift werden. Verbindungsstiicke - aus Wandsubstanz oder Protoplasma - zwischen den einzelnen Konidien, die sog. Konnektive, sind jedenfalls in beiden Fallen vorhanden und lassen keine Formunterschiede erkennen. Die im Habitus rauh erscheinende Oberflache des Sektors ist nicht durch groBere Bruchfestigkeit der Konidienketten bedingt, sondern resultiert aus der groBeren Zahl der gebildeten Sporen. Die rauhere Oberflache ist ein quantitativer Effekt der oben beschriebenen besonderen Sporulation, wodurch auch der zu beobachtende schwache Farbunterschied, der den Sektor dunkler ·ersche.inen laBt, zustande kommt. Anch in bezug auf die morphologischen Merkmale wie z. B. Zellenlange und -durchmesser ergeben sich zwischen Sektor und Grundkolonie groBere Abweichungen. Zur Demonstrierung der betrachtlichen Unterschiede in den Dimensionen von Sterigmen und Metulae zwischen Sektorenabkommlingen und den Abkommlingen der Grundkolonie, welche trotz der an sich groBen Variationsbreite z,um Ausdruck kommim, seien wegen des hierzu verfiigbaren umfangreicherim statistischen Materials in Tabelle 2 die in anderen Untersuchungen mit einem anderen Penicilliumnotatum-Stamm ermittelten Werte angefiihrt (DRAWERT und MULLER [1953b]). Diese stellen Mittelwerte iIi !l. aus je 50 Messungen von gleichaltrigen Kulturen auf dem gleichen Nahrboden dar. Tabelle 2 Dimensionen der Sterigmen und Metulae bei Grundkolonie (Stamm RJ 5500) und verschiedenen Sektorenvarianten in (L Sterigmen Lange Durchmesser

I

RJ 5500 Var. "Mam-Gutt"4. Typ Var. "Krater"-Typ Var. "w-Kol"-Typ

10.8 ± 0.1 9.7 8.5 8.5

± 0.2 ± 0.1 ± 0.2

± 0.03 2.3 ± 0.04 2.5 ± 0.03 2.4 ± 0.04 2.5

Lange

Metulae Durchmesser

13.0 ± 0.2

I I

11.9 ± 0.2 11.3 ± 0.2 11.3 ± 0.5

± 0.05 2.6 ± 0.04 2.8 ± 0.06 2.4 ± 0.1

3.2

W ollte man solche morphologischen Merkmale wie Sterigmen- oder Metulaelange als artspezifisch betrachten, wie es in den systematischen Bestimmungsschliisseln geschieht, so konnte man diese Sektorenabkommlinge eines Pe~icillium-notatum-Stammes als eine besondere 15*

228

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Varietat der Art, wenn nicht gar als eine andere Art beschreiben. Wie in anderen Untersuchungen belegt wurde (DRAWERT und MULLER [1953aJ), sind jedoch Bau und Verzweigung des Konidientragers so wenig konstant und so su bstra tspezifisch, daB sie fiir die Variantendiagnose und vor allem als Artmerkmal nur unter Beriicksichtigung des Substrats in Frage kommen. Dieser Gesichtspunkt wird leider auch in den neueren Monographien vermiBt (vgl. RAPER und THOM [1949]; NIETHAMMER [1949]). Der stark abweichende Charakter des Sektors driickt sich besonders in seinen physioiogischen Eigenschaften aus. Bei Oberflachenkultur auf fliissigen Medien stellt der Sektor die Kulturfliissigkeit rascher auf eine hOhere CH ein, als die Grundkolonie. In Tabelle 3 wird die Veranderung der CH in einer Versuchsserie mit je 30 Kulturen von Sektor und Grundkolonie wiedergegeben, wobei das Impfmaterial von 10 verschiedenen Grundkoloniekulturen auf Czapek-Agar und den auf diesen abgespalteten Sektoren stammte. Von jeder Kultur wurden drei Abimpfungen gemacht, so daB die aufgefiihrten PH- Werte die Mittelwerte von jeweils drei Parallelen darstellen. Wir benutzten hierzu 100 cm 3 fassende Erlenmeyerkolbchen als KulturgefaBe und beschickten sie mit je 25 cm 3 Pulst-Nahrlasung, die nach Drucksterilisation eine CH von pH 5.7 aufwies. Tabelle 3 Veranderung der CH bei Oberflachenkultur auf Pulst-Nahrlosung Grundkoloniekulturen

Sektorenkulturen 4. Tag pH 4.2 pH 3.8 pH 3.9 pH 4.1 pH4.4 pH 4.1 PH 3.8 pH 4.0 pH 4.1 pH 3.9

I

7. Tag pH 3.4 pH 3.4 pH 3.4 PH 3.6 PH 3.9 pH 3.5 pH 3.3 pH 3.6 pH3.4 pH 3.4

I

12. Tag

4. Tag

pH 3.8 pH 4.1 pH4.0 pH 4.4 pH 4.7 pH4.2 pH 3.8 pH 4.7 pH 4.1 pH 3.9

pH 4.9 PH 4.7 pH 5.0 PH 4.8 PH 4.8 p1I 4.6 PH 4.8 pH 4.9 PH 5.1 pH 5.2

I

7. Tag pH3.4 pH 3.2 pH 3.4 pH 3.2 pH 3.3 pH 3.3 pH 3.4 pH 3.2 pH 3.5 pH 3.4

I

12. Tag pH 2.9 pH 3.2 pH 3.3 pH 3.2 pH 3.4 pH 2.9 pH 2.9 pH 2.8 pH3.2 pH 2.9

Mittelwert pH 4.03±0.06IpH 3.49±0.051 pH 4.17 ±O.lllpH 4.88±0.06 pH 3.33±0.03 pH 3.07±0.07 Die cH-Messungen wurden mit Lyphanpapier durchgefiihrt, weil es die zur jeweiligen Messung erforderliche mengenm1iBig geringe Entnahme von kKulturlosung (0.05 cm ) zulaBt, ohne nennenswerte VOlumenverringerung mehrere Messungen an ein und derselben Kultur zu machen. Die Genauigkeit der Lyphanpapiermethode mit etwa 0.2 pH-Einheiten Fehlerbreite kann als fUr unsere Zwecke ausreichend angesehen werden.

Wie aus diesen Werten ersichtlich ist, bewirken die Sektorenkulturen schon nach 4 Tagen eine stark ere Ansauerung der Nahrlosung

Studien iiber die Sektorenbildung bei Penicillium

229

als die Grundkoloniekulturen. N ach 7 Tagen zeigten die Sektorenkulturen und die Grundkoloniekulturen ungefahr den gleichen Sauregrad. In der weiteren Entwicklung yom 7. bis zum 12. Tag war aber bei den Sektorenkolonien wieder ein Anstieg des pH-Wertes zu beobachten, wahrend der pH-Wert des Substrates der Grundkoloniekulturen weiter absank. Auf Pulst-NahrHisung vollzieht sich das Abfallen der CH stetig. Sie bleibt bei den Grundkoloniekulturen bei einem urn pH 3.0 schwankenden Wert stehen. Die Sektorenkolonien dagegen stellen die CH nach anfiinglichem Absinken in den Bereich urn pH 3.5 wieder auf einen Wert urn. etwa pH 4.2 ein, der dann mehr oder weniger konstant bleibt. Das raschere Wachstum der Sektorenkulturen kommt auf allen Substraten zum Ausdruck und laBt sich unter anderem leicht am Beginn der Sporulation messen. Diese setzt bei den Sektorenkolonien durchschnittlich 24-36 Stunden friiher ein als bei der Grundkolonie. Die Maxima der Konidienbildung liegen 2-4 Tage auseinander. In submersen Schiittelkulturen auf modifiz. Czapek-NahrHisung sind die Unter- Abb.l7. 6 Tage alte Schiittelkulturen in schiede im Sporulationsbeginn so C.zapek - Niihrliisung. Linker Kolben: Rechter Kolben: groB, daB der Grundkolonietyp an- Grundkoloniekultur. Sektorenkultur. fanglich fiir nicht befahigt gehalte n wurde, unter diesen Kulturbedingungen iiberhaupt Konidien zu bildell. Abb. 17 zeigt gleichaltrige geschiittelte Submerskulturen in modifiz. Czapek. Die noch farblose Grundkolonie~ bildet nach 6 Tagen nur vereinzelte Sporen, wahrend die Sektorenkultur' im gleichen Zeitraum bereits in so hohem MaBe versport ist, daB die gesamte Kulturfliissigkeit griin erscheint. Nach etwa 8-10 Tagen setzt auch in den Kulturen der Grundkolonie submerse Konidienbildung ein. Sie bleibt in allen Fallen quantitativ weit hinter der submersen Sporulation der Sektorenkulturen zuriick. Auch fiir feste Oberflachenkulturen lieJ3en sich Medien finden (z. B. Henneberg III), bei denen die Sporulation yom Grundmyzel so sparlich ist, daB die Decken fast weiB bleiten, die Sektorenkolonien jedoch intensiv· versporen.

230

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Was den Sektorentyp unter vollig gleichen Bedingungen zu der gegeniiber dem Grundmyzel bedeutend gesteigerten Konidienproduktion befahigt, ist noch nicht geklart. Da der Sektor diese Eigenschaft bei rein vegetativer Vermehrung von Abimpfung zu Abimpfung beibehalt, muB man annehmen, daB sich die ihm eigenen Stoffwechselvorgange in yom Grundmyzel verschiedenen Bahnen bewegen, und daB sie erblichen Charakters sind. Wie SCHNICKE (1924) durch Phosphorgehaltsbestimmungen bei Aspergillus niger nachweisen konnte, bestehen betrachtliche U nterschiede im Phosphorgehalt zwischen MyzelzeHen und Konidien. Der Phosphorgehalt der Konidien ist groBer als der des Myzels. Da sich der hier untersuchte rauhe Sektor vor aHem durch seine gesteigerte Sporenproduktion von der Grundkolonie unterscheidet, konnte man schlieBen, daB dieser Sporulationseffekt unter anderem auf Unterschieden im Phosphorstoffwechsel beruht. Es muBte deshalb untersucht werden, ob sich auf phosphorreichen Substraten eine Sporulationssteigerung der Grundkolonie erreichen laBt, die eventuell die Unterschiede zwischen diesen und den Sektoren verwischt. Fiir diese Versuche benutzten wir die Henneberg-III-Salze, die in 10 verschiedenen Konzentrationsstufen von normaler bis zur 10fachen Konzentration mit 4 %igem Agar versteift wurden. Sektor und Grundkolonie wurden in je 10 parallelen Ansatzen gezogen. Hierbei zeigen die Kulturen auf doppelter, drei- und vierfacher H-III-Salzkonzentration friihesten Sporulationsbeginn und groBte Versporungsintensitat. Die Sporulationsverzogerung der Grundkolonie gegeniiber den Sektorenkolonien bewegt sich im normalen 12-24-Stunden- Bereich; sie verringert sich jedoch mit steigend'er H - III -Salzkonzentration und ist bei den drei hOchsten Stufen ganz aufgehoben. Hier erfolgt eine betrachtliche absolute Sporulationsverzogerung. Bei allen Konzentrationsstufen treten in den Kulturen der Grundkolonie Sektoren auf. Die durch starkere Konidienproduktion bedingte rauhe OberfUiche im Bereich des Sektors manifestiert sich in "allen H-III-Salzkonzentrationsstufen spatestens in 3 Wochen alten Kulturen auf den an H-III-Salzen hoher konzentrierten Nahrboden. Die Zeit des Sektorenauftretens verkiirzt sich proportional zur Erniedrigung der H-III-Salzkonzentration. Die Unterschiede in Rauhigkeit und Farbton lassen sich nicht verwischen, sondern bleiben immer merkbar erhalten; gleichgiiltig, ob das Substrat dem Grundkolonietyp extrem starke Konidienbildung ermog~ licht oder der Vorsprung im Sporulationsbeginn des Sektors aufgeho ben ist. GroBere U nterschiede stoffwechselphysiologischer Art bestehen ferner in der Speicherung fettahnlicher Stoffe in den Hyphen von Sektor und Grundkolonie.

Studien iiber die Sektorenbildung bei Penicillium

231

Zu ihrem Nachweis wurden Dampfe von 2%iger Osmiumsaure fUr Myzel aus festen Oberflachenkulturen und das spezifischere Sudan III fUr die leichter benetzbaren Myzelproben aus Submerskulturen angewendet.

01- und fettartige Stoffe sind in den ZeBen junger Hyphen bereits vor der Bildung von ZeBsaftvakuolen als Kiigelchen oder Tropfchen im Plasma nachzuweisen. Zellen gleicher Entwicklungsstadien, die beim Grundmyzel noch keine fettartigen Korper aufzuweisen haben, sind beim Sektor bereits stark mit sudanfarbbaren Fettgranula angereichert. In alteren Zellen des Grundmyzels werden spater auch fettartige Stoffe deponiert. Sie treten unter Verwendung gleicher Substrate nicht nur verspatet auf, sondern die Fettbildung bleibt auch mengenmaBig stark gegeniiber den ZeBen des Sektors zuriick. Hier sind die alteren ZeBen haufig so reichlich mit abgelagerten Fetten angefiillt, daB diese nach Sudanbehandlung schon makroskopisch orangerot gefarbt erscheinen. Da den auffaBigen U nterschieden in der Wachstumsgeschwindigkeit der Grundkolonienund der Sektoren quantitativ unterschiedlich verlaufende Oxydations- und Reduktionsvorgange zugrunde liegen konnen, wurde versucht, diese durch Behandlung mit einem Triphenyltetrazoliumsalz zu erkennen. Das kiirzlich von BIELIG, KAUSCHE und HAARDICK (1949) zum Nachweis von Reduktionsorten in Bakterienzellen angewendete Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) wurde bisher noch nicht fiir physiologische Untersuchungen an mykologischen Objekten benutzt. Tetrazoliumsalze dienten MUDD, WINTERSCHEID, DE LA MATER und HENDERSON (1951) zur Stiitze ihrer Thecirie, daB die Granula der Mykobakterien Mitochondrien sind. W ALLHAUSER (1951) testete mit TTC den Vitalitatsgrad von Bakterien. Tetrazoliumsalze als Reduktionsindikatoren sind relativ ungiftig und nach KUHN und JERCHEL (1941) gegen Sauerstoff bestandig. Die Oxydationsstufe des TTC ist farblos und bildet nach Reduktion rotes Formazan.

Wir untersuchten die phytochemische Reduzierung des TTC an submers gewachsenem jungen Myzel aus Schiittelkulturen. Es wurden Sporen von Grundkolonie und Sektor in 500 cm 3 Rundkolben mit 200 cm 3 Czapek;Dox-Nahrlosung eingeimpft und nach 15stiindigem Schiitteln mit TTC behandelt. Nach dieser Zeit ist die Mehrzahl der Sporen der Grundkolonie noch nicht ausgekeimt. Die in geringer Anzahl vorhandenen Keimschlauchstadien haben maximal etwa 4 fache Konidienlange. In gleichaltrigen Sektorenkulturen ist die Anzahl der noch ungekeimten Konidien gering, und es finden sich neben Keimschlauchstadien schon viele lang ausgewachsene Primarhyphen. Beim Sektor wie bei der Grund-

232

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kolonie Hil3t sich bereits eine Aggregation der KeimschHiuche zu Kiigelchen erkennen. Zur Morphogenese der Pilzkolonie sei auf BURKHOLDER und SINNOTT (1945) verwiesen. Nach diesen Autoren ist das kugelfiirmige Koloniewachstllm in submerser Schiittelkultur weder durch rein mechanische Krafte noch durch ein Oberflachenphanomen bedingt. Die Ursachen werden vielmehr in einer thigmotropischen Stimulation oder in der Ausschaltung der "orientierenden Faktoren" (wie z. B. des Reizes der Schwerkraft) gesucht, welche infolge des Schiittelns nicht mehr unilateral wirken kiinnen.

Bei einem TTC-Zusatz von 0,1 em 3 einer 10%igen Liisung auf 2 cm 3 Myzelsuspension lassen sich nach friihestens 40 Minuten an den Keimschlauchen des Sektors wenige rote Piinktchen feststellen. N ach 60 Minuten zeigen die bereits stark vakuolisierten Primarhyphen des Sektors punktfiirmig auftretendes Formazan gleichmaJ3ig in den Zellen verteilt. Zellen der Grundkolonie lassen eine Reduktion friihestens nach 75 Minuten erkennen. Nach weiteren 10~20 Stunden bleiben weder beim Sektor noch beim Grundmyzel irg,endwelche sichtbaren Unterschiede der Veranderung. 1st das Keimschlauchstadium durchschritten, erscheinen die Hyphen durch die roten Piinktchen und Kiigelchen, . die zum Teil BRowNsche Molekularbewegung zeigen, gleichmaJ3ig rot granuliert. Weder in alteren Hyphenzellen noch in den Keimschlauchen und Primarhyphen lassen sich bei diesen Versuchen Orte bevorzugten Reduktionsgeschehens in der Zelle feststellen. Die Beziehungen zwischen Reduktionsorten und Bezirk der Feulgen-Reaktion, wie sie z. B. BIELIG, KAUSCHE und HAARDICK (1949) bei Bakterien ermittelten, beste.hen in der Pilzzelle vermutlich nicht. Ubrigens werden sie auch fiir Bakterien nach neueren Untllrsuchungen von PREUNER und v. PRITTWITZ UND GAFFRON (1952) bestritten. Die Versuche mit TTC bestatigen lediglich, daB die friihesten oxydoreduktiven Stoffwechselvorgange beim Sektor rascher ablaufen als im Myzel der Grundkolonie. Dieses Urteil gilt fiir Vorgange unter gleichen auBeren Bedingungen. Es sagt femer nur etwas iiber quantitative Unterschiede aus, bietet aber keine Anhaltspunkte fiir ein Urteil iiber qualitative Differenzen. Von besonderem Interesse erschien uns in bezug auf die sich ergebenden physiologischen Unterschiede die Frage, ob sich der starke Variant encharakter des Sektors auch im Penicillinbildungsvermiigen ausdriickt. Obwohl Testergebnisse von einer groBen Anzahl nichtsektorieller Varianten veriiffentlicht wurden, sind unseres Wissens - mit Ausnahme eines Hinweises von REESE, SANDERSON, WOODWARD und EISENBERG (1949), wonach eine Sektorenvariante von Penicillium chrysogenum eine dem

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Ausgangsstamm gleiche Penicillinausbeute lieferte - bisher keine Testversuche mit Sektoren bekanntgeworden. Wir priiften deshalb je zwei Sektoren- und Grundmyzelabkommlinge des Stammes 170-19 und vergleichsweise eine aus lyophil getrockneten Sporen gezogene Kultur im Penicillinleistungstest. Ais Impfmaterial dienten die Sporen von 4 Wochen J.E alten Malzagar-Schragrohrchen- 350 t-- v Kulturen. Sie wurden mit 5 cm 3 ~4" ~::n Phosphatpuffer abgeschwemmt 300 ,'~p " und je 0,5 cm 3 der Sporensuspension in die mit 200 cm 3 Tank- 250 / ~r nahrli:isung gefiillten 500 cm 3 .. ~. 200 .. .. Rundkolben eingeimpft. Die Kul/ . ." / .. "'" turen wurden nach den iiblichen 150 ..... technischen Methoden bei 24° C ", III ~V.' in je drei parallel en Ansatzen 100 auf einem Schiitteltisch gehalten und yom 3. bis 9. Tag im Dif4 7 6 8 9Tege fusionsplattentest gegen den BaAbb. 18. Penicillinbildungsvermogen in J. E. cillus-subtilis- Teststamm SG 119 vom Stamm 170-19 und einigen Varianten. auf ihre Penicillinleistung ge- Kurve I = Grundkolonietyp (glatt), Einsporlinie aus lyophil getrockneten Sporen nach testet. In Abb. 18 sind die Mittel_ acht Einsporpassagen ohne Sektorenabspaltung. werte aus je drei parallelen Kolben in Penicillineinheiten (IE) Kurve II = In Kurzketten sporulierendes Grundmyzel einer graugriinen Farbvarigraphisch wiedergegeben. ante. Wie die Leistungskurven Kurve III = In Langketten sporulierende rauhe Sektorenvariante der in II aufzeigen, bleiben die Werte der beigefiihrten Farbvarianten. den Sektorenkolonien stark hin- Kurve IV = Sektorentyp (rauh). Einsporlinie eines Sektors nach acht Passagen. ter denen der Grundkolonie zuKurve V = Kultur aus 18 Monate alten, in riick (Kurve III u. IVin Abb. 18). steriler Erde aufbewahrten, lyophil getrockneten Sporen des normalen Stammes Stamme mit starker Ten170-19 in der 1. Passage. denz zur Sektorenabspaltung miissen - wenn sich diese Eigenschaft als genetisch fundiert und nicht als vorwiegend modifikativ bedingt erweist - Trager der beiden komplementaren Kolonietypen Grundmyzel Sektor mit ihren unterschiedlichen Anlagen sein. In diesem FaIle kann auch durch rasche Passagenfolge oder andere entsprechende Kulturbedingungen nur verhindert werden, daB sich die Sektoren manifestieren, aber die Eigenschaften des Stammes bleiben in ihrer Gesamtheit, einschlieBlich der yom Sektor beigesteuerten leistungsmindernden, erhalten. Analog dazu werden bei der lyophilen Trock-

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nung des Impfmaterials stets die Eigenschaften beider Stammkomponenten "konserviert". DaB die Ausbeuten unter Verwendung von lyophil getrockneten "Erdsporen" ziemlich konstant sind, kann.die Richtigkeit dieser Auffassung nur bestatigen. U nd daB die Leistung des Stammes nach lyophiler Trocknung am hochsten liegt, schlieBt nicht aus, daB sie nicht noch zu steigern ware, wenn die Trennung der komplementaren Kolonietypen gelange. Zu den bisher aufgefUhrten Versuchen, die eine morphologische und physiologische Differenzierung zwischen Sektor und Grundkolonie eindeutig zulassen, sei be merkt, daB der Grad der Abweichung der beiden Kolonietypen so unerwartet hoch ist, wie er in man chen Fallen zwischen den in den systematischen Werken als Arten aufgefiihrten Typen nicht groBer sein kann. Bisher wurde festgestellt, daB wir einen Grundkolonietyp und einen Sektorentyp zu unterscheiden haben. Aus dem Grundkolonietyp erscheint immer wieder der Sektorentyp. Der Sektorentyp allein aber bleibt fUr sich konstant. Waren die beiden auftretenden Kolonietypen zwei "Rassen" eines Stammes, so miiBte eine Trennung der beiden Typen wenigstens in Einsporlinien jederzeit gelingen. Das ist jedoch nicht der Fall. Urn zu ermitteln, inwieweit auBere Faktoren in den Mechanismus der Sektorenabspaltung einzugreifen vermogen, sollte zunachst versucht werden, ob sich unter bestimmten Kulturbedingungen eine Proportionalitat zur Sektorenhliufigkeit ergibt, aus der sich vielleicht die Ursachen fUr das Auftreten der rauhen Sektoren bei Penicillium notatum erkennen lassen.

X. Haufigkeit des Sektorenauftretens beim Stamm 170-19 auf verschiedenen Nahrboden Bei den Penicillien hat DODilE (1933) die Sektorenbildung im Zusammenhang mit Substraten betrachtet und festgestellt, daB bei Penicillium brefeldianum spec. nov. Sektoren auf einigen Agarnahrbiiden deutlich in Erscheinung treten, auf anderen dagegen nicht gebildet werden. Nach REESE, SANDERSON, WOODWARD und EISENBERG (1949) ist auf hochsalzigem Moyer-Agar die Sektorenvariation besonders gering.

Wir konnten in Vorversuchen ermitteln, daB die AuBenfaktoren Licht und Temperatur ohne EinfluB auf die Sektorenbildung sind. Auch SchichthOhenunterschiede des Substrats sowie Unterschiede in physikalischen Eigenschaften, wie sie etwa durch starke Austrocknung des Agars gegeniiber frisch bereiteten NahrbOden bedingt sind, bleiben' ohne EinfluB. Bei Kultur auf Schragrohrchen ist die Sektorenbildung in Kolonien aus Punktimpfungen prinzipiell moglich, wenn sie dort auch bei Ausstrich- oder Suspensionsimpfungen in vermindertem MaBe auftritt. Veranderte O2- und CO 2-Spannung, wie sie in Kulturrohrchen gegeniiber

Studien tiber die Sektorenbildung bei Penicillium

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den Plattenkulturen gegeben sind, durften danach fur das Zustandekommen von Sektoren ebenfalls bedeutungslos sein. Zur Untersuchung der Abhangigkeit der Sektorenbildung von der Zusammensetzung des Substrats wurden von den gebrauchlichen Agarmedien Czapek, Henneberg III, modifiz. Czapek, Raulin-Dierckx, Sabouraud und Malzagar (mit und ohne Pepton) herangezogen. Als Impfmaterial dienten 14-20 Tage alte Sporen von Grundkolonien des Stammes 170-19 auf Malzagar-Schragrohrchen. Die Beimpfung der NahrbOden erfolgte durch Massenaussaat. In Tabelle 5 ist die durchschnittliche Haufigkeit des Sektorenauftretens auf diesen Substraten wiedergegeben. Tabelle

I)

Sektorenhaufigkeit auf verschiedenen Agarsubstraten (Die aufgerundeten Prozentsatze wurden aus jeweils 200-250 K)llturen ermittelt.) Czapek-Agar ................ 80~ Henneberg-III-Agar ......... 70~ modifizierter Czapek-Agar .... 50~ Raulin-Dierckx-Agar . . . . . . . . . 30~ Sabouraud-Agar . . . . . . . . . . . .. 20~ Malzagar mit Pepton ........ 10~ Malzagar ohne Pepton ....... 3~

Hierbei verandern Nahrbodenwechsel in den Vorkulturen die Haufigkeitsverhiiltnisse nicht, so daB z. B. auch nach einer groBeren Reihe von Passagen auf Czapek-Agar bei Uberimpfung auf einen anderen Nahrboden die Sektorenhaufigkeit sich dort auf den fUr den neuen Nahrboden typischen Prozentsatz einstellt. Eine Beurteilung dieser Ergebnisse verleitet zu dem SchluB, daB ausschlieBlich ernahrungsphysiologische Faktoren auf die Sektorenabspaltung bestimmend wirken, weil weder eine so hohe spontane noch eine so hohe induzierte Mutationsrate vorstellbar ist. Die Tatsache, daB, wie noch auszufUhren sein wird, verschiedene Stamme unterschiedliche "natiirliche" Tendenz zur Sektorenbildung haben, laBt aber auch auf einen erblich fundierten EinfluB schlieBen. Der Vollstandigkeit halber muB zur Bewertung der Dinge jedoch darauf hingewiesen werden, daB die Sektorenhiiufigkeit innerhalb der einzelnen Nahrbodenchargen schwankte und auch in der Zeit aus ganzlich unbekannten Grunden unkontrollierbaren Schwankungen ausgesetzt war. In anderen Versuchen wurden die oben benutzten Nahrboden modifiziert. Es wurden sowohl von den standardisierten Rezepten abweichende Zucker und Stickstoffsalze verwendet, Pepton verschieden dosiert zu den sonst ohne Pepton anzusetzenden Substraten zugegeben, als auch die Metallsalzgabe erhoht, verringert oder ganz weggelassen. Die Ergebnisse waren durchweg negativ, so daB wir uns Ansatze in groBen Serien

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ersparen konnten. Eine Beeinflussung der Sektorenbildung durch die zur Ernahrung unentbehrlichen und in den NahrbOden praktisch im Uberflul3 vorhandenen Stoffe ist danach nicht zu erwarten. AIle in der Literatur bisher mitgeteilten Beobachtungen iiber die Sektorenbildung beziehen sich ausschliel3lich auf Oberflachenkulturen fester Substrate. Es erschien uns angebracht, das Verhalten von Sektorenabkommlingen auch auf NahrlOsungen zu untersuchen und zu priifen, ob hier bei Kulturen der Grundkolonie die Sektorenabspaltung vollig unterbleibt. Hierzu wurden 100 cm 3 fassende Erlenmeyerkolbchen mit 25 cm 3 modifiz. Czapek-NahrlOsung beschickt und mit Sporenmaterial von verschieden altern Grundmyzel, aus Einsporlinien und mit lyophil getrockneten Sporen, sowie zur Kontrolle mit Konidien des rauhen Sektors beimpft. Dabei zeigte sich, dal3 die in Oberflachenkultur auf fliissigen Medien kultivierten Sektorenkolonien sich in bezug auf Struktur und Farbe der Kolonieoberflache kaum von den entsprechenden Grundmyzelkolonien unterscheiden. Der Unterschied in der Konidienkettenlange ist hier nur noch minimal und lal3t auf annahernd gleich starke Konidienproduktion schliel3en. Auch der bei Kultur auf AgarnahrbOden auffallig verfriihte Sporulationsbeginn des Sektorentyps ist hier praktisch aufgehoben. Der Sektorentyp reproduziert sich jedoch sofort wieder in seiner charakteristischen rauhen Form bei Uberimpfung auf feste Substrate nach beliebiger Anzahl von Passagen iiber fliissige Medien .. Bei den Abimpfungen des Grundkolonietyps wurde unter 120 Oberflachenkulturen auf fliissigen Medien nur ein einziges Mal die Bildung eines rauhen Sektors beobachtet. Dieser trat am 13. Tage auf und entsprach in seinem Verhalten bei Kultur auf Agarsubstrateu vollig den anderen Sektoren. Die Ursachen fiir' das Ausbleiben der Formierung von Wuchsformsektoren werden in dem von Kultur auf festen Substraten abweichenden Koloniewachstum gesucht. Ganz allgemein unterbleibt auf Nahrlosungen die Ausbildung homogener, radial wachsender Pilzdecken. Die Kolonien wachsen faltig, wellig oder gekriimmt, so dal3 kein allseitig gleicher Kontakt mit dem Substrat gegeben ist. Vor allem bestehen fiir Verteilung, Abwanderung oder Haufung der abgegebenen Stoffwechselprodukte andere Verhaltnisse. Mit dem veranderten Koloniewachstum aul3ern sich auch - wie sich leicht kontrollieren lal3t - die Val'iabilitatserscheinungen in anderer Weise. Geringe Farbmodifikationen, die dort vorzugsweise die gesamte Kolonie erfassen,· bleiben hier auf eng begrenzte Stellen der Decke beschrankt. Der oben beschriebene, vereinzelt dastehende Fall der Sektoren- . bildung auf fliissigen Medien durchbricht die Regel, dal3 die Bildung

Studien iiber die Sektorenbildung bei Penicillium

237

von Sektoren nur bei Kultur auf Agarsubstraten auftritt. Es sollte nun untersucht werden, ob die Sektorenbildung durch irgendwelche aus dem Agar stammenden Stoffegefordert wird. Durch verschieden konzentrierte Agarzusatze zu Nahrlosungen miiBten sich diese Stoffe bis zum Unterschreiten ihres Wirkungsoptimums "verdiinnen" lassen, falls die Summierung verschiedener korrelativ wirksamer Stoffe fiir die Sektorenbildung maBgeblich ist. In entsprechenden Versuchen mit je 24 parallelen Grundkoloniekulturen mit modifiz. Czapek-Nahrlosung und Agarzusatzen von 1/ 32%' 1/ 16%' 1/8% usf. bis zu 4% wurden jedoch diese Erwartungen nicht erfiillt. Wahrend bei Kulturen mit den geringsten Agarzusatzen iiberhaupt keine Sektoren auftraten, fanden sie sich auf allen anderen, sofern die Agarkonzentration ausreichte, eine gelartige Oberflachenhaut zu bilden. Das Rohprodukt Agar enthii.lt hii.ufig Vitamine der B1 -Gruppe, z. B. Aneurin (SCHOPFER und BLUMER [1938]), die durch Ausfaulen des Agars und tagelanges Wassern mit flieBendem Wasser und aq~a dest. bis zu einem gewissen Grade entfernt werden konnen. Die Sektorenbildung wurde in Versuchen unter Verwendung von ausgefaultem Agar kaum merklich unterdriickt, noch durch Zugabe von reinem Aneurin in verschiedenen Konzentrationen gefordert. Nach FRIES (1938) zeigt Aneurin keinen EinfluB auf das Wachstum von Aspergillus niger, wahrend ROBBINS und KAVANAGH (1942) bei Penicillium notatum geringe Wachs~umsforderung durch Zusatz von Thiamin erzielten. Es wurden ferner Versuche mit modifiz. Czapek und vier verfiigbaren Agarsorten angesetzt, wobei groBe Unterschiede in bezug auf die Sektorenhii.ufigkeit zu beobachten waren. Vermutlich spielen dabei irgendwelche Spurenelemente als Wirkstoffkomponenten noch unbekannte Rollen. DaB ihr Gehalt bei den verschiedenen Agarsorten betrachtlich schwankt, konnte z. B. fiir Mangan nachgewiesen werden (TAUBENECK [1952]). Aus Mangel an entsprechend reinen Reagentien upd Praparaten und wegen des Fehlens wirkstofffreier Zucker lieBen sich weitere erfolgversprechende Untersuchungen in dieser Richtung noch nicht durchfiihren. Bei Parallelversuchen auf Kieselsauregallerte- und GelatinenahrbOden zeigte es sich, daB Sektor und Grundkolonie auch hier ihre typenspezifische Wuchsform beibehalten und das Abspalten von Sektoren grundsatzlich moglich ist. Auf alten Pilzkulturen kann man hii.ufig Flocken weiBen Myzels beobachten, das sich bei mikroskopischer Kontrolle als au Berst schwach versporend oder gelegentlich als vollig frei von Sterigmen und Konidien er-

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weist. Solche Bildungen werden als ErschOpfungserscheinungen oder "Entartungen" gedeutet. HEINTZELER (1939) und DELITZSCH (1943/44) konnten nachweisen, daB das Entstehen sterilen Luftmyzels von der CH abhangt, und daB Luftmyzel haufig als Folge der Saureschadigung bei partieller Saureanhaufung auftritt. Wir konnten aus dem Stamm 170-19 verschiedentlich steriles Luftmyzel, das nicht sektoriell in Erscheinung trat, isolieren und rein erhalten. Abimpfungen solcher spontaner Varianten gleichen vollig den mit UV, Stickstofflost oder anderen mutagen en Stoffen gelegentlich zu erzielenden sog. "WeiBmutanten". Eine uns zur Verfiigung stehende induzierte sporenlose Variante. wurde langere Zeit in Kultur gehalten, wobei es sich zeigte, daB sich auch hier trotz des Fehlens der Sporulation eine Sektorenabspaltung vollziehen kann. Sie trat wiederholt als typische Wuchsformvariante auf. 1m scharf abgegrenzten sektorenartigen Bereich wird nur kompaktes, niedriges Myzel gebildet, wahrend der extrasektoriale Bereich ein hohes Profit mit einer UberhOhung von 1: 2 zeigt und aus lockerem, wattigem Myzel besteht. Nach ihrem Verhalten in den Folgekulturen verkorpert die A B niedrige Wuchsform den Sektorentyp, die hohe den GrundkolonieAbb. 19. Schematische Darstellung der Abimpfungsstellen zu dem Versuch mit sporen·. typo Vereinzelt konnte beim Sekfreien Myzeliibertragungen. tor die Bildung eines schwach rotlichen Endopigments festgestellt werden. Es trat sehr unregelmaBig auf. In anderen,.nicht sektorenabspaltenden "Weil3mutanten"- Kulturen zeigte die Farbstoffbildung jedoch in geringem Mal3e Abhangigkeit von Aul3en bedingungen. In den Folgekulturen unserer sporenlosen Varjante blieben Sektorenabimpfungen rein, und Abimpfungen des extrasektorialen Bereichs spalten erneut Sektoren ab, ganz analog den Verhaltnissen von Sektor und Grundkolonie beim Ausgangsstamm 170-19. Diese Beobachtung regte dazu an; nachzupriifen; ob iiberhaupt den Konidien eine besondere Rolle beim Mechanismus der Sektorenabspaltung zukommt. Zu diesem Zweckewurden yom Sektor und Grundmyzel des Ausgangsstammes 170-19 sporenfreie Myzeliibertragungen vorgenommen und iiber 12 Passagen verfolgt. Jungen, makroskopisch noch weil3 erscheinenden Kulturen auf modifiz. Czapek- und Malzagar wurde das zur Fortzucht benotigte absolut sporenfreie Myzel in folgender Weise

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von den in Abb. 19 markierten Stellen der Kolonie entnommen. Mit Hilfe einer sterilen Platinid-Impfnadel losten wir die am Rande der Kolonien submers wachsenden Hyphenenden (A in Abb. 19) ab und iibertrugen sie unter sterilen Bedingungen auf Agarplatten. Da diese Substrathyphen im Bereich der Spitze relativ langzellig sind, gelingt die Ubertragung von Hyphenspitzen, die aus nur 2-3 intakten Zellen bestehen. Bei mikroskopischer Kontrolle lie.6 sich feststellen, da.6 solche Implantate haufig nur einzellig waren. Nach den Ergebnissen der Kernfarbungen diirfte es sich hier vorwiegend urn vielkernige Zellen handeln. Zweikernige Zellen wurden von der Kolonieunterseite aus einer mittleren Zone der Kultur in einiger Entfernung vom Ort der Punktimpfung entnommen (B in Abb. 19) und zur Anzucht auf Nahrboden iibertragen. Kulturen von Implantaten des Sektors lieferten ausnahmslos Sektorenkolonien, solche des Grundmyzels Grundkolonien mit Sektorenabspaltung wie bei Abb. 20. 16 Tage alte Kultur auf modifiz. CzapekAgar. Abimpfung: Sporenfreie Myzeliibertragung Sporeniiberimpfungen,sowohl aUs einer submersen Kultur des Grundkolonietyps. bei zweikernigen als auch bei Heterogene Oberflache. mit starker Sektorenabspaltung. vielkernigen Implantaten. Ahnliche Versuche wurden ferner mit sporenfreiem Myzel aus submersen Schiittelkulturen durchgefiihrt. Hierzu wurden von 4 Tage alten, in Tanknahrlosung gezogenen Kulturen Myzelkiigelchen auf feste NahrbOden iibertragen, die bei Uberimpfung von Myzel aus Sektorenkulturen . erwartungsgema.6 ausschlie.6lich den Sektorentyp reproduzierten, bei Uberimpfungen vom Grundmyzel dagegen Kolonien des Grundmyzeltyps mit haufig sehr heterogener Oberflache lieferten (vgl. Abb. 20). Bei . Ubertragung auf Czapek-Agar,modifiz. Czapek-Agar und Malzagar (mit und ohne Pepton) war die Sektorenhaufigkeit gleich gro.6 und betrug etwa 90%, wobei in fast allen dieser Kolonien mehr als ein Sektor gebildet wurde. Hierbei war besonders auffallig, da.6 au.6er dem blaugriinen Grundmyzel mit seinem korrespondierenden, wenig dunkleren, rauhen

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Sektor zwei weitere Sektorenkomponenten in der Kolonie auftraten. Diese unterschieden sich durch ihren aschgrauen Farbton, der sowohl in der glatten Form mit Konidienkurzketten und einer entsprechend intensiveren Farbnuance des Aschgrau mit Konidienlangketten vorkam. In ihrem Verhalten in den Folgekulturen entsprach die glatte Form dem Grundmyzel, die rauhe dem Sektor, so daB es sich also urn eine spontane Farbvariante des Ausgangsstammes handelt, die genau wie dieser die zwei kom plementaren Typen Grundmyzelform und Sektor in sich vereinigt. Beide Formen liegen in der 14. Passage vor, ohne daB riickschlagende Tendenzen festzustellen sind. Die Ergebnisse dieser beiden letzten Versuchsserien lassen erkennen, daB die Typeneigenschaften - wie sonst Stammes- oder Arteigenschaften - nicht nur bei Sporenvermehrung, sondern auch bei Myzeliibertragungen weitergegeben werden, und zwar in vollem U mfange bei vielzelligen wie bei wenigzelligen - wenn nicht sogar einzelligen - Implantaten. Danach sind auch graduelle quantitative Kernunterschiede ohne EinfluB auf die strenge Selbstreproduktion von Sektor bzw. Grundkolonie. ' Da bei Myzeliiberimpfungen von Submerskulturen des Grundkolonietyps auf AgarnahrbOden die Sektorenhaufigkeit von der nach Tabelle 5 (s. S. 235) zu erwartenden abweicht, d. h. viel hoher wird, erhebt sich die Frage, worin die hier beobachtete, stark begiinstigte Sektorenbildung begriindet ist. Wir vermuten, daB das Alter des Impfmaterials nicht nur - wie bekannt - das Zustandekommen vieler kleiner Variationsschritte beeinfluBt, sondern sich auch mit groBem Schritt auf die Sektorenabspaltung auswirkt. Es ist zu bedenken, daB die Bedingungen fiir das Pilzwachstum in Schiittelkultur sich grundsatzlich von denen in OberfHichenkultur auf festen Substraten unterscheiden. Vor allem unterscheiden sie sich durch die allseitige Beriihrung aller Hyphenoberflachen mit der Nahrlosung, sodann in der Sauerstoffversorgung und spater durch die enge Beriihrung mit den ins Substrat abgegebenen Stoffwechselprodukten. Mit dem gesteigerten Wachstum in den Schiittelkulturen beginnen und vollziehen sich hier auch Autolysevorgange bedeutend rascher. Demzufolge ist auch Myzel aus Submerskulturen solchem von gleichaltrigen Oberflachenkulturen physiologisch nicht gleichwertig und nicht miteinander vergleichbar. Obwohl zu Versuchen mit stark altersunterschiedlichem Impfmaterial und einer etwa hieraus resultierenden Beeinflussung der Sektorenbildung nur Sporen des Stammes 170-19 von im Hochstfalle 6 Monate alten

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Kulturen - au13er den lyophil getrockneten Sporen - zur Verfiigung standen, sollte diese Frage wenigstens mit dem vorhandenen Material untersucht werden. Dazu wurden Sporen verschieden alter Kulturen in Massenvermehrung auf modifiz. Czapek-Agar iiberimpft und unter sonst gleichen au13eren Bedingungen gehalten. Die Sektorenhiiufigkeit in den aus diesen Abimpfungen entstandenen Kolonien ist in Tabelle 6 wiedergegeben. Danach ist die Anzahl der Sektoren in den aus alten Konidien entstandenen Kulturen gro13er als in den aus jungen Sporen gezogenen Kolonien. Dariiber hinaus zeigen die beiden Versuche mit 20 Tage altern Impfmaterial, da13 die Sektorenhiiufigkeit auch durch die zwischen den einzelnen Uberimpfungen bei den Vorkulturen liegende Zeit im gleichen Sinne beeinflu13t wird. Das Auftreten von Sektoren steht offensichtlich mit irgendwelchen physiologischen Veranderungen, die beim Impfmaterial altersabhangig in Erscheinung treten, im Zusammenhang. Tabelle 6 Sektorenhaufigkeit in Abhiingigkeit vom Konidienalter

.

Alter der das Impfmaterial liefernden Grundkoloniekultur 4 Tage 4 Tage 12 Tage 20 Tage 20 Tage 1% Monate 2% Monate 6 Monate

Flora, Bd. 140

Anzahl der Kulturen mit 1 oder mehr Sektoren

Prozentsatz

22

34%

62

14

22%

65

24

37%

60

23

38%

29

48%

59

27

46%

57

34

60%

64

55

86%

Vorkulturen in Passagen auf Czapek-Agar und Art der iJberimpfung

Anzahl der Kulturen

19 Passagen Massenvermehrung im 4-6-TageIntervall Schriigagarkultur aus 1 % Jahre alten lyophil getrockneten Sporen 13 Passagen Massenvermehrung im 4-6-TageIntervall 19 Passagen Massenvermehrung im 4-6-TageIntervall 9 Passagen Massenvermehrung im 4-5-Wochen-Intervall 12 Passagen Massenvermehrung im 6-10-TageIntervall 9 Passagen Massenvermehrung im 6-10-TageIntervall 8 Passagen Massenvermehrung im 6-10-TageIntervall

65

60

I

,

I 16

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Welcher Art diese Veranderungen sind und in welcher Weise sie die Sektorenbildung begiinstigen, lliJ3t sich aus diesen Versuchen nicht ableiten. Nachdem in vorliegenden Untersuchungen nur mit Wuchsformsektoren gearbeitet wurde, die sich durch ihre rauhe Oberllache yom Grundkoloni.!typ in markanter Weise unters.cheiden, solI die Frage der Farbsektoren wenigstens kurz gestreift werden_ Der von ZICKLER (1934) fiir seine Farbsektoren eingefiihrte Begriff der "Farbmutatione n" bei Pilzen laBt erwarten, daB bei den in der Koloniefarbe abweichenden Sektoren tatsachlich Unterschiede in der Farbstoffbildung vorliegen_ Wieweit es sich bei den ZICKLERschen sektoriellen Farbmutat ionen von BombaTdia um eine yom Ausgangstyp abweichende Pigmentproduktion handelte, geht aus der oben zitierten Arbeit nicht hervor. Die bei unserem Penict'Uwm-Stamm aufgetretenen, als Farbsektoren bezeichneten sektoriellen Farbvarian ten (s. S, 214) erliillen jedenfalls diese Voraussetzungen nicht. Unsere Farbsektoren treten spontan in Kulturen auf verschiedenen Substraten auf. Sie wurden am haufigsten auf Malzagamahrbiiden - auf denen die Rate der Wuchsformsektoren am kleinsten ist (vgl. Tabelle 5, S. 235) - beobachtet, gleich haufig in Einsporlinien wie bei Massenvermehrung. Charakteristisch fiir diesen Variantentyp ist, daB er immer nur in helleran, niemals in dunkleren Farbtiinen von der Farbung der Grundkolonie abandert. Ein Umschlagen in neue, nicht griine Farbstufen erlolgte ebenfalls nicht. Farbvarian ten stellten sich bei unsetem Stamm ebenso haufig als nicht sektorielle Varianten ein. Farbsektoren und nichtsektorielle Farbvarianten zeigen verminderte Sporulation, und es kann geschlossen werden, daB zwischen ihnen und den viillig sporenlos wachsenden Varianten bzw. "sterilen" Sektoren nur graduelle Unterschiede bestehen. Das Verhalten der Farbsektoren in den Folgekulturen ist von den vorher beschriebenen Wuchsformsektoren ganzlich verschieden. Sie lassen sich in Massenvermehrung oder Einsporlinien nur iiber wenige Passagen rein erhalten, und zwar um so leichter, je geringfiigiger die Abweichung yom Ausgangsstamm war. AIle unsere daraufhin untersuchten Farbsektoren verloren sich ganzlich durch totalen Riickschlag. Erlolgte dieser nicht schon - wie pei den meisten - in der ersten Abimpfung, sO lieferteil die Farbsektor en noch in ein oder zwei Passagen homogene Sektorenkolonien. In den weiteren Folgekulturen erlolgten rasch partielle Riickschlage. Es erscheint in diesen Kulturen zunachst sektoriell der Ausgangstyp wieder, der bei weiteren Abimpfungen yom Farbsekto r zunehmend griiBeren Anteil an der Kultur gewinnt, bis die als Farbsektor aufgetretene Variante ganz erlischt. Die Farbsektoren unseres PeniciZlium-Stammes unterscheiden sich also grundlegend von den Wuchsformsektoren durch ihre Inkonstanz und den Grad der Abanderung. Welche Faktoren im einzelnen das Entstehen solcher rein modifikativeT Abanderungen in den Pilzkolonien bedingen, konnte nicht ermittelt werden.

Die in vorliegender Arbeit mitgeteilten Ergebnisse sind Erfahrungen . aus Untersuchungen an nur einem Penicillium-Stamm. Wie schon eingangs erwlihnt, zeigte der hierverw endete Stamm die Tendenz zur Sektorenabsp altung in besonders hohem MaJ3e. Andere Stlimme oder Arten lassen diese Erscheinung weniger Mufig erkennen. Vielleicht gibt es solche

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aus dieser oder anderen Gattungen, bei denen sich eine Variabilitat in dieser Form iiberhaupt nicht manifestiert. Beim Stamm 170-19 ist die strenge Wiederkehr des hier ausfiihrlicher besprochenen rauhen Sektorentyps jedenfalls nach bisher unveroffentlichten Arbeiten auch bei Stammselektionsversuchen nach Behandlung mit mutagen en Strahlen (VVLicht, Rontgenstrahlen) und Stickstofflost beobachtet worden. Vnter den nach solcher Behandlung entstandenen "Mutanten" hatten die meisten ihre dem Stamm eigene Sektorenbildung beibehalten. Sogar starke "Farbmutationen" mit schweren Storungen der Pigmentbildung, die unter LosteinfluB von griin nach gelbbraun umgeschlagen waren, zeigten die Sektorenbildung in unverminderter Haufigkeit. Auch hier waren analoge Konstanzverbaltnisse wie beim normalen Stamm anzutreffen. Der in einer gelbbraunen "Mutante" auftretende rauhe Sektor erwies sich als konstant, wahrend der dazu gehOrige komplementare glatte Grundmyzeltyp erneut Sektoren abspaltete. Sogar die Tendenz, zur griinen Ausgangsform zuriickzuschlagen, war bei dieser "Farbmutation" zwischen Sektor und Grundkolonie verschieden; und zwar zeigte bei der uns zur Verfiigung stehenden "Mutante" der Sektor iiberhaupt keine Griinriickschlage, wahrend bei der Grundkolonie mit zunehmender Anzahl von Uberimpfungen die Riickschlage zur Ausgangsform immer regelmaBig erfolgten. Das wurde iiber acht Pas sagen hinweg verfQIgt. Wie sich bei solchen induzierten Varianten eine Scbadigung, die im Augenblick der Behandlung die ganze Zelle betrifft, in den Folgekulturen nur auf einen der beiden aus ihr hervorgegangenen Kolonietypen konzentrieren kann, bleibt zunachst unverstiindlich. Wenn wir Variabilitatsuntersuchungen an einem anderen PeniciUium-notatum-Stamm (DRAWERT und MULLER [1953a, b) mit heranziehen, erscheint die Annahme gerechtfertigt, daB die Sektorenbildung durchaus den Charakter einer Art- bzw. Stammeseigenschaft besitzt. Der unserem Untersuchungsobjekt nahestehende Penicillium-notatumStamm RJ 5500 zeigte das Pbanomen der Sektorenbildung bei gleichen Kulturbedingungen unter 1500 Kulturen ein einziges Mal (DRA WERT und MULLER [1953b)). Dieser Sektor zerfiel jedoch in mehrere untereinander stark abweichende Wuchsformtypen, deren Konstanzverbaltnisse und Ergebnisse der Einsporanalyse kaum Parallelen zum Mechanismus der Sektorenbildung des Stammes 170-19 erkennen lie Ben. Von Interesse ist hier lediglich, daB sich die Sektorenbaufigkeit dort - im Gegensatz zu der beim Stamm 170-19 in substratverschiedenen hohen Prozentsatzen wiederkehrenden Bildung von Sektoren - nur in Pro mille ausdriicken laBt. 16*

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XI. Besprechung der Ergebnisse Die Sektorenvarianten werden zunachst noch ohne Beweis Mutanten genannt. 1m Gegensatz zu vielen anderen spontanen Variabilitatserscheinungen liegt aber der Sektorenabspaltung wenigstens zum Teil eine gewisse Konstanz der auftretenden Variant en zugrunde, die in manchen Fallen iiber langere Zeitraume hinweg und durch belie big viele Passagen erhalten werden kann. Einen solchen gefestigten Variantentyp mit besonders starkem Variantencharakter stellt der rauhe Wuchsformsektor dar, der spontan in Oberflachenkulturen fester Substrate bei dem hier verwendeten Penicillium-notatum-Stamm 170-19 auftritt. Die RegelmaBigkeit der Sektorenbildung in den Folgekulturen des Ausgangsstammes, der Grad der morphologischen und physiologischen Abweichungen des Sektors von der Grundkolonie und die Merkmalskonstanz in reinen Sektorenklonen verleihen dem rauhen Sektor nahezu eigenen Artcharakter. Ihr Auftreten in den Kulturen des Ausgangsstammes erscheint wie etwas Fremdes. Nachdem sich dieser Sektorentyp iiber eine groBe Anzahl von Passagen hinweg immer unverandert reproduzierte, war es angebracht, den Sektor zytologisch genauer zu untersuchen. Sein gesteigertes Wachstum, das sich vor allem in der verstarkten Sporulation auBert, lieB als Ursache eine Art Polyploidiewirkung vermuten. Wie die Ergebnisse des ersten Teiles unserer Arbeit zeigen, wurden jedoch diese Erwartungen nicht bestatigt. Es konnen Unterschiede in der Kernanzahl der Konidien von Sektor und Grundmyzel auftreten. Die Unterschiede stellten sich aber nicht als gesetzmaBig heraus. Beide, das Grundmyzel und der Sektor, haben in ihren Konidien normalerweise nur einen Kern. Abweichungen in der Kernanzahl findet man bei beiden Typen. Lediglich in der Haufigkeit der Abweichungen ist ein Unterschied festzustellen. Beim Grundmyzel waren 10% und beim Sektor weniger als 5% mehrkernige Konidien zu finden. Der Mechanismus der Sektorenspaltung bleibt demnach unbeeinfluBt von der in den Konidien vorhandenen Kernzahl. Ob sich die von GUILLIERMOND (1913) in Kernuntersuchungen an Penicillium glaucum beobachteten und dort als Senilitatserscheinung aufgetretenen Amitosen auch bei anderen Pitzen wiederholen, erscheint fraglich. Es lieBe sich in unserem FaIle ohnehin nicht bei allen Konidien mit hOherem Kernsatz die Kernvermehrung auf amitotische Teitungen zuriickfiihren, da es Sterigmen mit doppeltem Kernsatz gibt, die ganze Ketten zweikerniger Sporen abschniiren.

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Fiir die aus Massenvermehrung entstandenen Kolonien ist die Kernzahl des Sporenmaterials unwesentlich. Sie ist es aber nicht bei Einsporlinien. Wenn wir nicht nur in den Abimpfungen von Grundmyzel-Einsporkulturen, sondern sogar in diesen Einsporkulturen selbst Sektoren er hielten, so konnte die Kernzahl unter der Voraussetzung EinfluB erzielen, daB die Heterokaryose-Theorie im Zusammenhang mit der Sektorenbildung fiir unseren Pilz Giiltigkeit hiitte. Leider hilft aber die Erkenntnis, daB es ein- und mehrkernige Sporen im gleichen Stamm gibt, kaum weiter. Die Methoden der Vitalfiirbung von Zellkernen versagen bei ungekeimten Pilzsporen; der Kernsatz der fiir die Einsporlinien benutzten Konidie liiBt sich nicht bestimmen. Unter diesem Aspekt verliert auch die Einsporkultur als sicheres Kriterium fiir die Gleichheit des durch die Kerne weitergegebenen Erbgutes an Bedeutung. Aus den Kernuntersuchungen miissen unsere Ergebnisse beziiglich der Feinstruktur und des Teilungsmodus hervorgehoben werden. Die Ergebnisse weichen von dem ab, was bisher in der Literatur bekanntgeworden ist. Die von SCHURHOFF (1907), WAKAYAMA (1930) und ELISEI (1940) bei Penicillium- und Aspergillus-Arten ermittelten Chromosomenzahlen von n = 2 konnen fiir unseren Penicillium-Stamm nicht bestatigt werden. Die FEULGENSche Nuklealreaktion ist als spezifische Kernfiirbung bei Chromosomenuntersuchungen an unserem Objekt urn so unerlaBlicher, als die Kerne dieser Pilze die kleinsten bekannten Dimensionen aufweisen. Die Chromosomenbestimmung der oben zitierten Autoren resultiert dagegen aus Eisenhiimatoxylinpriiparaten, mit denen wir in Vorversuchen stets nur eine diffuse Kernfiirbung erhielten. Besondere Schwierigkeiten ergeben sich dabei fiir die Differenzierung einzelner Bestandteile des Pilzkernes. Die Auffassung, daB die Kerne der niederen pflanzlichen Organismen nur aus einem nukleolusartigen Korper bestehen, welcher von einer nicht fiirbbaren Zone umgeben ist (FEINBERG [1901] und iihnlich WAKAYAMA [1930]), muB als eine Folgeerscheinung der Anwendung unspezifischer Kernfiirbungsmittel angesehen werden. Unsere Feulgenfiirbungen ermoglichten den Nachweis von Nukleoli nicht, weil bei der Nuklealreaktion Kernsaft und' Nukleolus ungefiirbt bleiben (GATES [1942]). Hinweise von FRANCINI (zit. nach GATES) und von SAVILLE (1939) auf eine teilweise Fiirbbarkeit des Nukleolus konnten nicht bestiitigt werden. Bei der Kernteilung des verwendeten Penicillium-notatum-Stammes wurden keine Stadien angetroffen, die Ankliinge an das von hoheren Pflanzen her bekannte Schema der Mitose zeigen. Bilder mit chromo-

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somenartigen Strukturen fan den sich nur in der einen sich immer wiederholenden Form als zartfadiges, regelloses Knauel. Da unter den Askomyzeten Vertreter mit n = 8,12 und sogar 16 Chromosomen genannt werden (vgl. TISCHLER [1921/22]), ware ein groBerer haploider Chromosomensatz durchaus nichts Unerwartetes, obwohl fiir die Aspergillaceen in den bereits zitierten Arbeiten iibereinstimmend haploid n = 2 Chromosomen angegeben werden. Vermutlich sind es aber mehr als zwei. Unsere Einwande gegen die konstatierte Zweizahl der Chromosomen richten sich besonders gegen die SCHURHoFFschen (1907) Hamatoxylinfarbungen, weil die dort zeichnerisch wiedergegebenen zwei Chromosomen ihrer Anordnung nach einem haufig wiederkehrenden Ruhekerntyp unseres Objekts entsprachen. Es hat den Anschein, als ob es sich dabei urn einen aus zwei kappenformigen "Kernhalften" zusammengesetzten Kerntyp mit groBem Kernsaftraum oder Nukleolus handelt, den wir sehr oft beobachteten. Nicht nur das Vorhandensein von gleitenden Dbergangen bis zu "massiven" Kernen, sondern auch die Tatsache, daB dieser Kerntyp in so groBer Zahl in den Zellen des MyzeIs vorkommt, wo nicht nur in Teilung befindliche Kerne zu erwarten sind, widerspricht der Annahme, daB es sich urn Chromosomen handelt. Unterschiede der Kerne von Sektor und Grundmyzel konnte n weder in bezug auf Anzahl, GroBe, Form oder F e ins t r u k t u r f est g est e 11 t w e r den. Urn die qualitativen und genetischen Unterschiede zu erfassen, wurden Sektor und Grundkolonie in ihrem Verhalten wahrend der Kultur eingehend verfolgt. Die dazu angestellten Versuche gingen von einer Einsporkultur aus, so daJ3 mit den auf S. 244 gemachten Einschrankungen alle Folgekulturen homokaryotisch sein miiJ3ten. Fiir die trotzdem erfolgende standige Aufspaltung des Stammes in Sektorentyp und Grundkolonietyp gibt es zunachst keine Erklarung. Nach unserer VorsteHung muJ3 der hier bearbeitete Pilzstamm die beiden Wuchsformtypen "Grundkolonie" und "Sektor" in sich vereinigen. Von beiden Wuchsformen laJ3t sich nur der Sektor als Typ rein erhalten. Trotzdem bleibt die Frage zu erortern, ob der Sektorenbildung mutative oder modifikative Veranderungen zugrunde liegen. Mit groJ3er Dbereinstimmung wird von den meisten an anderer Stelle bereits zitierten Autoren der Sektor als Mutation aufgefaBt, wofiir in unserem FaIle die absolute Konstanz des einmal aufgetretenen Sektors spricht. Demgegenfiber steht jedoch die Tatsache, daB der Grundkolonietyp unter bestimmten Kulturbedingungen in so extrem hohen Prozentsatzen (80 % und mehr!) immer wieder denselben Sektorentyp aus seinen Kolonien hervor-

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gehen laBt, obwohl spontane Mutation nur in einem Verhaltnis von 1: 10000 erwartet werden diirfte (ROBBINS und Mc VEIGH [1949]). Ware die Eigenschaft der Sektorenbildung, die auch nach Einsporpassagen beibehalten wird, ein im strengen Sinne erbliches Rassenmerkmal, wie von STAKMANN, KERNKAMP, KING und MARTIN (1943) u. a. angenommen wird, so miiBte die Sektorenabspaltung obligatorisch und unter gleichen Bedingungen in allen Abimpfungen der Grundkolonie stattfinden, was jedoch nicht der Fall ist. DaB aber die Tendenz zur Sektorenabspaltung bei den einzelnen Stammen sehr unterschiedlich ist, geht aus der Gegeniiberstellung des Stammes 170-19 mit dem Stamm RJ 5500 hervor. Bei diesem wurde in etwa 1500 Kulturen nur ein einziges Mal die Entstehung einer spontanen Sektorenvariante beobachtet (DRA WERT und MULLER [1953b). Diese spaltete jedoch in fUnf verschiedene Variantentypen auf, so daB die Konstanzverhaltnisse iiberhaupt nicht mit denen des rauhen Sektorentyps im Stamme 170-19 vergleichbar sind. Aber auch im Stamm 170-19 gibt es neben dem rauhen, konstanten Sektorentyp andere mit sehr schwachem Variantencharakter, die als Farbsektoren auftreten und eine modifikative Natur durch ihre Inkonstanz erkennen lassen. Zwischen den Farbsektoren und dem Wuchsformsektor bestehen also nicht nur graduelle Unterschiede. Weder die Heterokaryose-Theorie noch die Auffassung yom "DualPhanomen" konnen eine befriedigende Erklarung fiir den dem PenicilliumStamm 170-19 eigenen Variationsmechanismus geben. Nach WILHELM (1949), LAIBACH (1950) u. a. setzt sich jede Rasse aus zwei distinkten Bestandteilen zusammen, die zu einer Kultur assoziiert sind. Eine Aufspaltung oder Entmischung braucht nur in den heterokaryotischen, z. B. intermediaren Typen zu erfolgen. Dagegen ist mit ROBBINS und Mc VEIGH (1949) einzuwenden, daB die Anzahl der verschiedenen Varianten aus einer Rasse viel groBer ist, als unter den obigen Voraussetzungen moglich sein kann. Nach dieser Auffassung miiBte weiterhin bei alten Kulturen durch Einsporpassagen Kernentmischung stattfinden, wenn sie heterokaryotisch sind. Sie miiBten aufspalten und nicht konstant bleiben. Die niemals aufspaltenden Einsporlinien unseres Sektorentyps waren demnach als homokaryotisch aufzufassen. An der Stelle des primaren Auftretens eines Sektors in einer durch Massenvermehrung der Grundkolonie erhaltenen Kultur miiBte dieser infolge der iiberall im Myzel stattfindenden Anastomosenbildung heterokaryotisch sein, d. h. er miiBte bereits in der ersten Abimpfung aufspalten, was jedoch niemals beobachtet wurde.

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Fiir den Grundkolonietyp lagen nach diesen Theorien folgende Verhaltnisse vor: AIle durch Massenvermehrung erzielten Kolonien waren heterokaryotisch und spalten demgema.13 in den Folgekulturen auf, was in unserem FaIle zutrifft. In den Einsporlinien des heterokaryotischen Grundkolonietyps mii.l3te grundsatzlich eine Aufspaltung nach einem nicht bestimmbaren Prozentsatz, der theoretisch 1: 1 betragen diirfte, erfolgen. Das hei.l3t, es mii.l3ten aus bestimmten Einsporisolaten homokaryotische Grundkoloniekulturen, aus anderen homokaryotische Sektorenkulturen entstehen. Da.13 jedoch aus dem Grundkolonietyp - aus Einsporkultur oder Massenkultur - jemals eine reine Sektorenkultur hervorgegangen ware, konnte niemals beobachtet werden. Unsere Definition der Sektorenabspaltung betont schon, da.13 der Sektor immer wieder auf dem Wege der A b spa I tun g aus der Grundkolonie hervorgeht. Danach widersprechen die Verhiiltnisse der Sektorenvariabilitat des von uns untersuchten Penicillium-Stammes dem "Dualphiinomeri" und der Heterokaryose-Theorie. Unseres Erachtens wird dort die Moglichkeit, da.13 auch durch au.l3ere Faktoren eine standige Beeinflussung der Typenfestigkeit usw. gegeben sein kann, zu wenig beriicksichtigt. Jedes von der Erwartung abweichende Verhalten wird auf Mutation zuriickgefUhrt. In unserem FaIle der Sektorenbildung zeigen die entsprechenden Versuche, da.13 gerade durch die au.l3eren Bedingungen (z. B. Einflu.13 des Substrats in seiner komplexen Zusammensetzung, Vorhandensein von Spurenelementen im Optimum usw.) die Haufigkeit der Sektorenabspaltung bestimmt wird. Unbedingte Konstanz hat nur der Sektorentypo Sie lie.13 sich jedoch nicht fUr den Abspaltungsmechanismus ermitteln. Vorstellungen iiber die mutative Natur des Sektorenentstehens konnten eine Stiitze in den Ergebnissen der Versuche unter Verwendung physiologisch alter Zellen als Impfmaterial finden, wenn man die Ergebnisse von STUBBE (1936), MARQUARDT (1949) u. a., wonach Abbauprodukte korpereigener Stoffe - wie z. B. Putrescin - eine ErhOhung der spontanen Mutabilitat bedingen, auch auf die heterotrophen Mikroorganismen iibertragen kann. Die Eigenschaften des konstanten, rauhen Wuchsformsektors lassen fiir die Sektorenbildung auf einen Mutationscharakter schlie.l3en. Dabei mii.l3te jedoch eine Erklarung fUr die au.l3ergewohnlich hohe spontane Mutationsrate gesucht werden. Vielleicht darf bei der' Beurteilung des Variationsprozesses dieser Organismen den Zellkernen nicht mehr so gro.l3e Bedeutung beigemessen werden. Bestehen doch hier auch keineswegs solche Kern-Plasmarelationen, wie sie unseren Vorstellungen fUr hOhere Organismen entsprechen.

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Es liiBt sich auf Grund der in den Zellen der Pilze anzutreffenden varia bIen Kernzahl erwarten, daB nicht allein die Kerne fiir die Selbstreproduktion und den Variationsmechanismus eine Rolle spielen. Irgendwelche ihrer Wirkungsweise nach noch unbekannte und durch verschiedene AuBenfaktoren leichter beeinfluBbare "Kernaquivalente" im Plasma lassen sich auf jeden Fall vermuten. Inwieweit diese in den Variationsvorgang und damit auch in die Sektorenbildung einzugreifen imstande sind, UiBt sich zur Zeit noch nicht bestimmen.

XII. Zusammenfassung An einem Penicillium-notatum-Stamm wurde die Sektorenbildung eingehend verfolgt und eine morphologisch-physiologische Differenzierung der beiden in diesem Pilzstamm vorhandenen Kolonietypen Grundkolonie und Sektor gegeben. Der 'nach morphologischer Diagnose moglichen Unterscheidung zwischen rauhem Wuchsformsektor und Grundkolonie liegt ein Sporulationseffekt zugrunde. Das starke Abweichen im physiologischen Verhalten stellt den Sektor als besonders stark en Variantentyp heraus. Die Unterschiede driicken sich vor allem in Wachstumsgeschwindigkeit, Veranderung der CH bei Kultur auf fliissigen Medien, in der Speicherung von Fetten und in der Penicillinleistung aus. Zytologische Untersuchungen ergaben, daB sich die Kernverhiiltnisse der beiden Typen weder grundlegend in der Kernzahl noch nach Form und Feinstruktur unterscheiden. Die in der Literatur fiir Penicillium angegebene Chromosomenzahl von n = 2 konnte nicht bestiitigt werden. Auf Grund des Verhaltens von Einsporlinien laBt sich die Heterokaryose-Dualphiinomen-Theorie fiir eine Erkliirung der Sektorenbildung des untersuchten Stammes nicht heranziehen. Der Sektorenbildung miissen im ,vorliegenden Fall trotz starker Abhiingigkeit von AuBenfaktoren Erblichkeitsmerkmale zuerkannt werden. Es wurde geschlossen, daB unter den bei der Sektorenabspaltung wirksamen Faktoren vor allem Spurenelemente eine entscheidende Rolle spielen. Als Grund fiir die substratverschieden unterschiedliche Hiiufigkeit der Sektorenbildung wird angenommen, daB in der Pilzzelle auBer den kerneigenen genetischen Faktoren modifizierbare plasmatische Kernaquivalente von gleich groBer Bedeutung vorhanden sind, und daB vor allem die letzteren den Variationsmechanismus steuern.

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Die Untersuchungen wurden im Institut fiir Allgemeine Botanik der Friedrich-Schiller-Universitat J ena durchgefiihrt. Herrn Professor Dr. H. DRA WERT bin ich fiir die Anregung der Arbeit, Herrn Professor Dr. H. WARTENBERG flir die Uberlassung eines Arbeitsplatzes sowie Herrn Professor Dr. H. KNOLL fiir eine finanzielle Unterstiitzung zu groBem Dank verpflichtet.

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Anschrift des Verfassers: D,r. RUDOLF MULLER, J ena, von-Rase-Weg 3, Institut fiir Allgemeine Botanik.