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Suivi individuel des embryons en FIV
Gynécologie Obstétrique & Fertilité 34 (2006) 801–807 http://france.elsevier.com/direct/GYOBFE/
Onzièmes Journées nationales de la FFER (Paris, 11–13 octobre 2006)
Suivi individuel des embryons en FIV Sequential assessment of individually cultured embryos in IVF F. Guérif*, J. Poindron, R. Bidault, O. Gasnier, V. Cadoret, M.-H. Saussereau, D. Royère Laboratoire de médecine et biologie de la reproduction, CHU de Bretonneau, 2, boulevard Tonnelé, 37044 Tours cedex, France Reçu le 15 juin 2006 ; accepté le 26 juin 2006 Disponible sur internet le 08 septembre 2006
Résumé Objectif. – Actuellement, il est primordial que les centres d’AMP disposent d’outils applicables en routine pour sélectionner l’embryon avec le potentiel implantatoire le plus élevé afin de réduire le taux de grossesses multiples. Dans cette étude, une analyse prospective a été menée pour déterminer si des marqueurs de développement non invasifs à j1, combinés aux évaluations morphologiques conventionnelles de j2 permettent de prédire le développement in vitro de blastocystes. Patient(e)s et méthodes. – Cette étude a été fondée sur le suivi individuel de 4190 embryons issus de patients du programme de FIV/ICSI du CHU de Tours entre janvier 2002 et décembre 2004. De j1 à j5/j6, une culture en microgouttes sous huile a permis d’enregistrer la progression séquentielle in vitro de ces embryons et la cinétique des blastocystes obtenus. Résultats. – Les résultats mettent en évidence une relation positive significative entre un profil 0 des zygotes, un premier clivage précoce, un embryon avec quatre blastomères et moins de 20 % de fragmentation à j2 et le taux de blastocystes à j5 (p < 0,05). Selon notre pratique, l’addition du profil des zygotes n’apporte pas de bénéfice supplémentaire pour affiner la sélection embryonnaire par rapport à la morphologie embryonnaire à j2 et au premier clivage à j1. Discussion et conclusion. – L’évaluation des zygotes et l’appréciation du premier clivage à j1, la morphologie embryonnaire à j2 sont prédictives isolément du développement jusqu’au stade blastocyste à j5 ou j6. Ces caractéristiques peuvent être combinées pour établir un modèle séquentiel prédictif d’évolution longitudinale in vitro applicable en routine. © 2006 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract Objective. – It is a challenge for IVF centers to propose a method to select the most viable embryo to transfer, thereby minimizing the risk of multiple births. In this study, a prospective investigation was made to determine if non-invasive developmental markers on day 1 combined to conventional evaluation on day 2 can predict in vitro blastocyst development. Patients and methods. – A total of 4190 individually cultured embryos from patients undergoing IVF/ICSI treatment at the Tours University Hospital Center from January 2002 to December 2004 were included. Individual embryos were cultured in sequential media in microdrops under mineral oil from j1 to j5/j6 allowing to record their sequential growth until the blastocyst stage. Results. – The results showed a significant positive relationship between pattern 0 zygote, early cleavage, 4 cells embryos with < 20% fragmentation on day 2 and the rate of blastocyst development on day 5 (P < 0.05). In our hands, zygote pattern does not bring additional benefit to better select embryo. Discussion and conclusion. – Zygote and early cleavage assessments on day 1, morphological appearance on day 2 are some other parameters related individually to blastocyst development on days 5 and 6. These parameters can be used collectively to establish a predictive in vitro sequential embryo assessment model for routine use in IVF clinics. © 2006 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Zygote ; Premier clivage ; Blastomère ; Fragmentation ; Blastocyste ; Milieu séquentiel ; Culture individuelle ; Embryon humain ; Fécondation in vitro Keywords: Zygote; Early cleavage; Blastomere; Fragmentation; Blastocyst; Sequential media; Individually cultured human embryos; In vitro fertilization
* Auteur
correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (F. Guérif).
1297-9589/$ - see front matter © 2006 Elsevier SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.gyobfe.2006.06.015
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1. Introduction Un des reproches majeurs faits à la fécondation in vitro est que celle-ci génère un taux élevé de grossesses multiples pouvant mettre en péril la santé de la mère et des enfants à naître. Une volonté consensuelle se développe dans le monde pour réduire la fréquence de ces grossesses multiples dans certaines populations à risque. Par ailleurs, avec l’amélioration des conditions générales de culture in vitro (milieu, environnement) des embryons, de nombreux couples obtiennent plusieurs embryons de bonne qualité et de caractéristiques morphologiques identiques. Dans toutes ces situations, il se pose alors la question au laboratoire, de l’appréciation du potentiel implantatoire des embryons obtenus. Ainsi, aujourd’hui le biologiste doit plus que jamais mettre en œuvre des critères pertinents prédictifs de l’implantation ; critères issus de moyens d’investigation non invasifs et applicables en pratique quotidienne. Plusieurs méthodes ont été proposées pour évaluer la viabilité embryonnaire. La pratique la plus ancienne et la plus habituelle consiste à sélectionner à un stade précoce les embryons à transférer en fonction de leur morphologie à j2 ou j3. Cette morphologie embryonnaire est déterminée par le nombre, la taille et la forme des blastomères, la proportion de fragments anucléés, la présence de blastomères multinucléés. De nombreuses classifications morphologiques ont été proposées dans la littérature avec des systèmes de scores prédictifs de l’implantation embryonnaire. Il a été démontré qu’après deux jours de culture, le stade 4–5 cellules est le stade optimal [1]. À ce stade de clivage, des embryons ne présentant pas ou peu de fragmentation et sans blastomère multinucléé, ont un taux plus élevé d’implantation que des embryons à un autre stade de clivage et/ou présentant plus de fragmentation. Les embryons précoces sont observés en général 44 à 46 heures postinsémination/injection mais parfois la fourchette d’observation est plus large (39 à 48 heures) selon les équipes. À partir de la fin des années 1990, deux nouvelles approches non invasives de sélection embryonnaire ont fait l’objet de multiples publications pour compléter voire concurrencer cette première approche historique : l’aspect des pronuclei (PN) et l’existence d’un clivage embryonnaire précoce à j1. Une évaluation précoce dès j1 des zygotes avec le potentiel implantatoire le plus élevé a été développée dans les pays (Allemagne, Suisse, Autriche) soumis à une loi extrêmement stricte de protection de l’embryon et pour lesquels une sélection à un stade de clivage précoce est interdite. En effet, le stade de zygote n’est pas encore considéré comme un embryon car les deux génomes sont encore séparés physiquement. Ainsi, à ce stade, il doit être décidé quels zygotes sont destinés au transfert ou à la congélation. Il y a plusieurs transformations morphologiques au cours du développement des PN des zygotes humains dont certaines impliquent des phénomènes pouvant aisément être évalués par une observation microscopique simple et non invasive. Parmi ces transformations, une phase précoce de nucléogenèse qui consiste en l’assemblage, croissance et fusion mutuelle de précurseurs nucléolaires (NPB), constitue une représentation morphologique et chronologique
bien connue pour les zygotes humains [2]. En se fondant sur des observations empiriques et des données déjà publiées, Scott et Smith ont été les premiers à établir un score à j1 intégrant la position des PN, la position des nucléoles, l’aspect du cytoplasme et la progression vers le premier clivage [3]. Cette observation a permis d’établir un score minimal (7) et maximal (15), 16 à 18 heures postinsémination ainsi qu’un score maximal (25), 24 à 26 heures postinsémination ; scores corrélés au taux d’implantation des embryons transférés. Ensuite ce score initial a été modifié par les auteurs (classification Z1 à Z4) pour des raisons de simplicité et rapidité afin de permettre un usage quotidien pour un grand nombre de techniciens de laboratoire [4]. Une autre codification des zygotes à j1 a été proposée dans la même période par une autre équipe [5]. Les paramètres morphologiques évalués incluent le nombre des NPB, leur distribution (polarisée ou non polarisée) dans chaque PN, la taille relative des deux PN et leur position l’un par rapport à l’autre. Six profils morphologiques des PN (profil 0 à 5) sont distingués en fonction du nombre et de la distribution des NPB. Ils concernent uniquement les PN de taille identique et apposés l’un à l’autre. Seul le profil 0 correspond à des zygotes qui se sont tous implantés. La polarisation des NPB n’est pas observée au tout début du développement des PN mais apparaît progressivement avec le temps par coalescence des NPB donnant naissance à des NPB plus volumineux. Ainsi, la synchronie inter-PN est selon les auteurs plus importante que la polarité. Depuis la publication de ces deux stadifications de zygotes, des variantes de ces scores ont été proposées dans la littérature [6]. L’observation du premier clivage semble également un paramètre important à considérer dans la sélection des embryons avec le meilleur potentiel d’implantation. Ces observations ont été réalisées selon des temps variables d’observation postinsémination/ICSI de 25 heures [7,8], 27 heures [9], 29 heures [10]. Ce taux de premier clivage est certainement influencé par plusieurs paramètres (sélection des couples, technique d’AMP utilisée, milieux de culture, temps d’observation…). Ainsi, dans la littérature il est rapporté des taux de premier clivage allant de 19 % des cycles de FIV classique pour une observation 25 heures postinsémination [7] à 61 % des cycles de FIV classique pour une observation 29 heures postinsémination [10]. Toutes les études réalisées à ce jour observent une amélioration significative du taux d’implantation lors de transferts d’embryons présentant un premier clivage dès j1. La croissance in vitro des embryons humains peut être réalisée jusqu’au stade blastocyste (j5/j6). Après plus de 20 ans d’AMP, le meilleur jour pour le transfert des embryons dans l’utérus est encore sujet à controverse. En effet, si certaines études rapportent des taux d’implantation plus élevés après transfert de blastocystes par rapport au transfert d’embryons précoces [11], d’autres études n’ont pas observé de différence [12]. Toutefois bien que la pratique générale soit encore de transférer à un stade précoce (j2/j3), le concept du transfert différé au stade de blastocyste a gagné en popularité avec le développement des milieux séquentiels [11]. La culture embryonnaire jusqu’au stade blastocyste a également été proposée comme un outil de sélection des embryons les plus com-
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pétents au développement in vitro [11]. Quand les embryons sont cultivés in vitro, environ 50 % d’entre eux sont arrêtés au cours de la première semaine de développement pour des raisons incomplètement élucidées (anomalies chromosomiques, conditions de culture suboptimales, maturation ovocytaire inadéquate…). Hardy a estimé qu’environ 25 % des embryons ont un fort potentiel de développement quelles que soient les circonstances, que 25 % des embryons peuvent se développer normalement dans des conditions environnementales favorables mais qu’ils s’arrêteront dans des conditions suboptimales. Enfin, environ 50 % des embryons s’arrêteront systématiquement quelles que soient les conditions de culture [13]. Le centre d’Assistance médicale à la procréation (AMP) de Tours a l’expérience de la culture embryonnaire prolongée avec milieux séquentiels depuis 1997. Depuis cette date la proportion des cohortes totales ou partielles d’embryons mise en culture prolongée n’a cessé de croître et un suivi individuel des embryons est mis en place depuis 2002. Ce travail présente les données préliminaires de ce suivi individuel et séquentiel de j1 à j5/j6 afin de déterminer les relations entre morphologie à j1 (aspect des zygotes et premier clivage), morphologie à j2 et développement de blastocystes à j5/j6. 2. Patient(e)s et méthodes Entre janvier 2002 et décembre 2005, 4190 embryons issus du programme FIV/ICSI du centre d’AMP de Tours ont été analysés dans le cadre d’une étude prospective. Un suivi individuel a été réalisé depuis le stade zygote (j1) jusqu’au stade blastocyste (j5/j6) pour tous les embryons. Cette culture individuelle réalisée en microgouttes sous huile minérale concernait des embryons issus soit de l’intégralité de la cohorte embryonnaire en vue d’un transfert différé au stade blastocyste soit des embryons surnuméraires (non transférés et non congelés à j2) placés en culture prolongée. L’élément de référence dans ce suivi de culture embryonnaire in vitro était le développement ou non jusqu’au stade blastocyste en distinguant le jour d’obtention du blastocyste (j5 ou j6). En plus des caractéristiques morphologiques habituelles collectées à j2 (nombre de blastomères et taux de fragmentation), deux caractéristiques morphologiques ont été enregistrées à j1 pour chaque embryon : ● aspect des zygotes ; ● présence du premier clivage. Toutes les observations ont été réalisées sur une platine chauffante d’un microscope inversé au grossissement X200 ou X400. Dans la pratique du centre, le devenir de l’embryon à j2 (transfert immédiat, congélation précoce, culture prolongée ou élimination) est décidé en s’appuyant successivement sur les critères suivants : ● caractéristiques morphologiques à j2 ; ● clivage précoce à j1 ; ● aspect des zygotes à j1.
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La stimulation ovarienne, le recueil des ovocytes, la FIV classique ou l’ICSI, la culture embryonnaire prolongée sur milieux séquentiels ont été décrits précédemment [14]. La fécondation (j0) a été réalisée avec les milieux IVF-50™ ou G-Fert™ (Vitrolife, Göteborg, Suède). Le lendemain (j1), les zygotes ont été placés dans des microgouttes d’IVF-50™ ou de G1-2™ (Vitrolife, Göteborg, Suède) sous huile minérale. De j3 à j5/j6, la culture embryonnaire prolongée a été réalisée en microgouttes de CCM30™ ou G2-2™ (Vitrolife, Göteborg, Suède) sous huile minérale. Toutes les cultures ont été réalisées à 37 °C sous 5 % d’O2 et 6 % de CO2. 2.1. Évaluation des zygotes Les zygotes ont été observés 18 à 20 heures postinsémination/ICSI (j1). Cette observation comprenait la détermination de la présence des PN (nombre et taille respective) et des globules polaires, la détermination du nombre des NPB et leur distribution (polarisée ou non polarisée) dans chaque PN selon la classification de Tesarik [5]. Les critères de Tesarik ont été simplifiés dans l’étude présentée en incluant les profils initialement décrits comme anormaux (profils 1 à 5) dans un groupe unique de zygotes (profil non-0) par opposition au profil 0 (normal). Brièvement, les zygotes avec les caractéristiques suivantes avaient le profil 0 : ● les PN étaient accolés et de taille identique ; ● la différence dans le nombre des NPB entre les deux PN n’excédait pas trois ; ● la distribution des NPB (polarisée ou non) était la même dans les deux PN ; ● il y avait au moins trois NPB dans chaque PN. Les zygotes avec un seul PN ont été maintenus en culture tandis que les zygotes avec deux PN de taille très différente ont été exclus de toute culture embryonnaire prolongée. 2.2. Évaluation des clivages précoces Une seconde observation à j1 a été réalisée 25 à 27 heures postinsémination/ICSI pour chaque zygote afin d’enregistrer la présence ou non du premier clivage dit clivage précoce. 2.3. Évaluation des embryons Une troisième observation a été réalisée 44 à 46 heures postinsémination/ICSI (j2). Cette observation comprenait la détermination du nombre de blastomères et leur régularité en taille ainsi que le taux de fragmentation (inférieur à 20 % du volume de l’embryon, entre 20 et 50 % du volume de l’embryon, supérieur à 50 % du volume de l’embryon). Les embryons présentant des signes de multinucléation dans un ou plusieurs de leurs blastomères ont été exclus de toute culture prolongée. Dans notre centre, les embryons de qualité maximale (« top qualité ») à j2 sont définis par la présence de quatre blastomères réguliers avec moins de 20 % de fragments.
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2.4. Évaluation des blastocystes L’issue de la culture embryonnaire prolongée a été enregistrée pour chaque embryon ainsi que le jour d’obtention du blastocyste (j5 ou j6) pour définir sa cinétique de développement. La classification de Gardner a été utilisée pour qualifier l’expansion de la cavité blastocélique (B1 à B6), la masse cellulaire interne et le trophectoderme des blastocystes obtenus [15]. 2.5. Analyse statistique Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage et ont été analysés avec le logiciel Statview 4.1 (Abacus Concepts, Berkeley, CA, États-Unis) en utilisant des tables de contingences. Une différence était statistiquement significative lorsque p < 0,05. 3. Résultats Ce travail présente le suivi individuel de 4190 embryons cultivés in vitro en fonction de la prise en compte d’une ou de plusieurs caractéristiques morphologiques observées à j1 (aspect des zygotes et premier clivage) et j2 (nombre de blastomères et taux de fragmentation). L’analyse des zygotes 18 à 20 heures postinsémination/ICSI met en évidence un taux plus élevé de blastocystes lorsque les deux pronuclei présentent le profil 0 par rapport au profil non-0 et à la présence d’un seul PN (56, 41, 21 %, respectivement, p < 0,05). La cinétique d’obtention des blastocystes est significativement plus rapide avec des PN de profil 0 (Tableau 1). Par ailleurs, une fréquence accrue de zygotes avec le profil 0 est observée en ICSI par rapport à la FIV classique (19 vs 13 %, p < 0,05). Enfin, les zygotes avec le profil 0 sont significativement associés à des embryons de qualité maximale dans 48 % des cas contre seulement 24 % des cas pour les zygotes de profil non-0 (p < 0,05). L’analyse des embryons 25 à 27 heures postinsémination/ ICSI met en évidence un taux plus élevé de blastocystes lorsque les embryons présentent un premier clivage dès j1 (61 vs 34 %, p < 0,05). Si le premier clivage est observé précocement dès j1, la proportion de blastocystes obtenus dès j5 est aussi significativement plus importante (Tableau 2). Les embryons issus d’ICSI présentent une fréquence plus élevée de premier clivage à j1 par rapport aux embryons issus de FIV classique (35 vs 25 %, p < 0,05). Enfin, le clivage précoce à j1 est associé à une fréquence accrue d’embryons de qualité maximale dans 48 % des cas contre seulement 18 % des cas en cas d’absence de clivage précoce (p < 0,05). Tableau 1 Taux et cinétique de blastocystes en fonction de l’aspect des zygotes à j1 Type de PN
1 PN
Nombre (%) Taux de blastocystes (%) Pourcentage à j5
148 (3,5) 21bc 29ef
2 PN profil non-0 3325 (79,5) 41ac 53df
Tableau 2 Taux et cinétique de blastocystes en fonction de la présence du premier clivage à j1 Premier clivage j1 Nombre Taux de blastocystes (%) Pourcentage à j5
Non 2874 34a 43b
Oui 1316 61a 70b
Les valeurs affectées de la même lettre présentent une différence statistiquement significative (p < 0,05).
L’analyse des embryons 44 à 46 heures postinsémination/ ICSI met en évidence que le taux le plus élevé de blastocystes (58 %) est observé pour les embryons possédant quatre blastomères. Ensuite, ce taux décroît pour les embryons de plus de cinq blastomères et les embryons de trois blastomères ou moins (37 et 30 %, respectivement ; p < 0,05). La cinétique d’obtention des blastocystes décroît selon la même hiérarchie (Tableau 3). Par ailleurs, les embryons avec le taux de fragmentation le plus faible (< 20 %) à j2 présentent le taux le plus élevé de blastocystes par comparaison aux embryons avec 20 à 50 % ou plus de 50 % de fragments (48, 41, 28 %, respectivement ; p < 0,05). La cinétique d’obtention des blastocystes est d’autant plus rapide que les embryons sont moins fragmentés mais la différence n’est pas significative entre tous les groupes (Tableau 4). Lorsque deux critères morphologiques (nombre de cellules et taux de fragmentation à j2) sont combinés, il s’avère que pour un nombre donné de blastomères à j2, le taux de blastocystes est plus élevé lorsque le taux de fragmentation est inférieur à 50 %. Par ailleurs, une hiérarchie s’établit dans le taux de blastocystes entre deux valeurs extrêmes : 65 % pour les embryons avec quatre blastomères et moins de 20 % de fragmentation contre moins de 25 % pour les embryons avec plus de 50 % de fragmentation et un nombre de blastomère différent de quatre (Tableau 5). En ce qui concerne la cinétique d’obtention des blastocystes, une différence significative n’est observée que pour les embryons à quatre blastomères en fonction du taux de fragments. Lorsque à ces deux critères, l’observation du premier clivage à j1 est associée, il est observé que pour une morphologie Tableau 3 Taux et cinétique de blastocystes en fonction du nombre de blastomères à j2 Nombre de blastomères Nombre Taux de blastocystes (%) Pourcentage à j5
2à3 blastomères 1751 30ac
4 blastomères
5 à 8 blastomères
1649 58ab
790 37bc
35df
68de
51ef
Les valeurs affectées de la même lettre présentent une différence statistiquement significative (p < 0,05).
2 PN profil 0
Tableau 4 Taux et cinétique de blastocystes en fonction de la présence de fragments anucléés à j2
717 (17,0) 56ab 64de
Taux de fragmentation (%) Nombre Taux de blastocystes (%) Pourcentage à j5
Les valeurs affectées de la même lettre présentent une différence statistiquement significative (p < 0,05).
< 20 2007 48ab 58d
20 à 50 1592 41ac 54
> 50 591 28bc 47d
Les valeurs affectées de la même lettre présentent une différence statistiquement significative (p < 0,05).
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Tableau 5 Influence du taux de fragmentation à j2 (pour un nombre identique de blastomères) sur le taux et la cinétique de blastocystes Nombre de blastomères Taux de fragmentation (%) Nombre Taux de blastocystes (%) Pourcentage à j5
2 à 3 cellules < 20 799 33a 33
2 à 3 cellules > 50 327 24a 35
4 cellules < 20 879 65b 70d
4 cellules > 50 154 38b 58d
5 à 8 cellules < 20 329 43c 52
5 à 8 cellules > 50 110 22c 63
Les valeurs affectées de la même lettre présentent une différence statistiquement significative pour un nombre identique de blastomères (p < 0,05).
donnée à j2 (même nombre de blastomères et taux de fragmentation identique), un premier clivage à j1 est toujours associé à un taux de blastocyste plus élevé. Par ailleurs, le meilleur taux de blastocystes (74 %) est observé pour les embryons avec quatre blastomères, moins de 20 % de fragments et présentant un premier clivage précoce. À l’inverse les taux de blastocystes les plus faibles (21–23 %) s’observent pour les embryons présentant un nombre différent de quatre blastomères, un taux de fragmentation de plus de 50 % et une absence de clivage précoce La proportion la plus élevée de blastocystes à j5 est observée pour les embryons à quatre blastomères, moins de 20 % de fragments et présentant un premier clivage précoce (Tableau 6). Enfin, une quatrième caractéristique (aspect des zygotes à j1) a été associée dans la prédiction de l’obtention des blastocystes. À ce stade de démembrement des groupes, seuls les effectifs de plus de 50 embryons ont été considérés. Quel que soit le groupe des embryons analysé, trois blastomères ou moins, quatre blastomères ou cinq blastomères et plus, l’addition du profil des pronucléi (profil 0 ou non-0) n’apporte pas globalement, entre nos mains, de pouvoir discriminant additionnel à ce niveau, aussi bien en ce qui concerne le taux que la cinétique d’obtention des blastocystes. 4. Discussion Individuellement, les caractéristiques morphologiques d’un embryon accessibles en routine entre j1 et j2 sont associées avec le développement embryonnaire prolongé in vitro. Selon notre expérience, l’analyse de leur combinaison met en évidence à la fois l’importance des caractéristiques morphologiques à j2 et le premier clivage à j1. En revanche, l’aspect des zygotes à j1 ne semble pas apporter une aide additionnelle lors de la combinaison de ces caractéristiques. Le taux de blastocyste a été pris comme référence de la croissance embryonnaire in vitro. Bien sûr, il est à considérer que l’évaluation séquentielle répétée des embryons depuis le stade zygote jusqu’au stade blastocyste peut générer potentiellement des dommages liés à des modifications de l’environne-
ment embryonnaire occasionnées par les observations successives. Par conséquent, les temps d’observation ont été limités au maximum pour être le moins délétère possible. Deux critères ont été choisis à j1 (aspect des zygotes puis apparition du premier clivage) pour compléter ceux de j2 (nombre de blastomères et taux de fragmentation). Il s’agit de paramètres anciens et conventionnels pour les centres d’AMP en ce qui concerne les évaluations à j2, tandis que les évaluations réalisées à j1 sont d’usage restreint encore à certains centres et d’application beaucoup plus récente. La première caractéristique analysée à j1 est l’aspect des zygotes. Dans notre centre cette observation est réalisée entre 18 et 20 heures postinsémination/ICSI. Il ressort de l’analyse de la littérature que cette évaluation est effectuée dans des intervalles de temps assez larges (12–20 heures postinsémination/ICSI) mais le plus souvent entre 16 et 18 heures. Nous avons observé que 21 % des zygotes avec un seul PN visible étaient capables d’atteindre le stade blastocyste mais seulement à j6 pour la majorité d’entre eux (71 %). Un faible taux de blastocystes (18 %) a aussi été observé dans des situations similaires [16]. En ce qui concerne les zygotes à deux PN, nous avons utilisé une classification simplifiée des profils anormaux par rapport au score initialement proposé par Tesarik en les regroupant sous le terme de profil non-0 [5]. Selon cette classification, nous avons observé un taux significativement plus élevé de zygotes de profil 0 en ICSI par rapport à la FIV classique à la différence de deux autres équipes [6,17]. Par ailleurs, le lien entre les différents profils de zygotes à j1 et la qualité embryonnaire à j2/j3 diffère également selon les études. Plusieurs études n’ont pas observé de différence significative en termes de morphologie embryonnaire entre les profils 0 et non 0 [18,19]. En revanche, dans notre suivi individuel, le profil 0 est associé à une fréquence plus élevée d’embryons de bonne qualité en accord avec d’autres études [5,17,20]. Par ailleurs, il a été décrit que le profil 0 était associé au taux le plus faible d’arrêt de développement embryonnaire à j3 par rapport au profil non-0 [5,17]. Nos données, établies sur une durée plus longue de culture in vitro (j5/j6), confirment ces résultats. En
Tableau 6 Influence du premier clivage à j1 (pour un même nombre de blastomères et un même taux de fragmentation) sur le taux et la cinétique des blastocystes Nombre de blastomères Taux de fragmentation (%) Premier cliv à j1 Nombre Taux de blastocystes (%) Pourcentage à j5
2à3 cellules < 20 Non 707 31a 31
2à3 cellules < 20 Oui 91 44a 45
2à3 cellules > 50 Non 278 23 29e
2à3 cellules > 50 Oui 49 31 60e
4 cellules < 20 Non 393 53b 55f
4 cellules < 20 Oui 487 74b 79f
4 cellules > 50 Non 102 33c 44g
4 cellules > 50 Oui 52 48c 76g
5à8 cellules < 20 Non 168 26d 44
5à8 cellules < 20 Oui 161 61d 56
5à8 cellules > 50 Non 78 21 56
5à8 cellules > 50 Oui 32 25 75
Les valeurs affectées de la même lettre présentent une différence statistiquement significative pour un nombre de blastomères et un taux de fragmentation identiques (p < 0,05).
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effet, le profil 0 est associé au taux de développement de blastocystes le plus élevé et selon une cinétique plus rapide par rapport au profil non-0 des zygotes. En utilisant une stadification différente des PN et en établissant un seuil, une autre équipe a établi qu’au-dessus de ce seuil (> 15), le taux de blastocystes était diminué et que par conséquent les zygotes présentant ce score ne devaient pas être transférés en priorité [6]. En utilisant une autre classification, le Z-score, décrite initialement par Scott en 1998 [3] puis simplifiée en 2000 [4], il a aussi été observé, d’une part, un lien entre le score des PN et la qualité embryonnaire à j3 et, d’autre part, que le score Z1 (qui entre dans le profil 0 de la classification de Tesarik) est associé au pourcentage le plus élevé de blastocystes avec la cinétique de développement la plus rapide [4,21]. Ainsi, l’aspect des zygotes est corrélé au développement embryonnaire in vitro mais plusieurs classifications plus ou moins complexes ont été publiées et une standardisation semble nécessaire pour uniformiser les données publiées. De plus, l’évaluation précise des PN nécessite parfois le recours à une pipette de contention, donc une manipulation du zygote pour distinguer clairement les deux PN ; ce qui augmente le temps de séjour hors de l’incubateur. Enfin, la morphologie des PN est un processus très dynamique qui consiste en l’assemblage, croissance et fusion des précurseurs nucléolaires [2]. Ainsi, un embryon peut présenter une morphologie nucléolaire spécifique à un moment donné et différente sur une observation ultérieure. La seconde caractéristique analysée à j1 est l’apparition ou non du premier clivage. Dans la majorité des centres d’AMP ainsi que dans le nôtre, cette observation est réalisée entre 25 à 27 heures postinsémination/ICSI. La nécessité de décaler le temps d’observation entre FIV classique et ICSI pour observer le même taux de clivage est soumise à controverse. Certaines équipes n’ont pas observé de différence entre FIV classique et ICSI [10,17]. En revanche, d’autres équipes comme la nôtre ont observé des différences, avec un taux de clivage précoce plus élevé en ICSI par rapport à la FIV classique pour un temps d’observation identique [7,9,22]. Cette différence pourrait s’expliquer par le fait que le spermatozoïde micro-injecté courtcircuite quelques étapes de la fécondation (fixation à la zone pellucide, réaction acrosomique…) ; ce qui réduit le temps de fécondation. C’est pourquoi il a été proposé de retarder le temps d’observation de deux heures en FIV classique par rapport à l’ICSI pour retrouver des taux de clivage précoce similaires [23]. Par ailleurs, nous avons observé que les embryons présentant un premier clivage dès j1 étaient associés à une fréquence accrue d’embryons de qualité maximale. Cela est en accord avec d’autres études qui ont constaté une meilleure qualité embryonnaire (définie par le nombre de blastomères, la régularité des blastomères, l’absence de multinucléation des blastomères) de la cohorte si un clivage précoce était enregistré 25 à 27 heures postinsémination/ICSI [22,24]. Les raisons en sont inconnues mais des hypothèses ont été suggérées : ● il a été proposé que les embryons avec clivage précoce étaient issus d’ovocytes présentant une meilleure synchronisation nucléaire et cytoplasmique. Les embryons avec un clivage précoce présenteraient moins de risque d’atteindre
le seuil minimal critique d’ARNm maternel [25] avant l’activation du génome embryonnaire ; ● la contribution du spermatozoïde (facteurs paternels) est aussi à envisager. Dans l’espèce humaine, les centrioles qui contrôlent les premières divisions mitotiques de l’ovocyte sont apportés par le spermatozoïde [26]. Par conséquent, la qualité du spermatozoïde peut être un facteur additionnel influençant le clivage précoce. Au-delà de la qualité morphologique à j2, nous avons observé que les embryons présentant un premier clivage à j1 aboutissaient environ deux fois plus souvent à un blastocyste et ce avec une cinétique plus rapide que les embryons ne présentant pas ce premier clivage à j1. D’autres études menées dans l’espèce humaine retrouvent que le taux de blastocystes issus d’embryons à clivage précoce à j1 par rapport à des embryons sans clivage précoce est plus élevé à j5 (39 vs 21 % respectivement) [8], (52 vs 21,8 % respectivement) [24] et à j6 (66 vs 40 % respectivement) [23]. Par ailleurs, une corrélation positive entre un clivage précoce et la formation de blastocystes a été rapportée dans d’autres espèces animales comme les murins [27] et les bovins [28]. En outre, dans ces études, les blastocystes issus d’embryons avec clivage précoce avaient plus de cellules que les blastocystes issus d’embryons plus lents. Il a été montré que cette différence était attribuable aux différences de chronologie du premier clivage plutôt qu’à des différences dans la vitesse de progression des cycles suivants [27]. Le nombre de blastomères et le taux de fragmentation à j2 sont exploités au quotidien dans les centres d’AMP depuis plus de 20 ans. Sans surprise, le taux le plus élevé de blastocystes est obtenu pour les embryons à quatre blastomères, suivi des embryons plus rapides (cinq–huit cellules) et enfin des embryons les plus lents (deux–trois cellules). La même hiérarchie est constatée à propos de la cinétique d’obtention de ces blastocystes. En ce qui concerne le taux de fragmentation, si le taux de blastocystes décroît avec l’augmentation du taux de fragments à j2, la cinétique d’obtention des blastocystes semble peu influencée par l’importance de la fragmentation. Comme le suivi individuel portait sur plus de 4000 embryons, il a été possible de combiner les caractéristiques d’observation à j1 et j2. Parmi les embryons à quatre blastomères à j2, ceux qui présentent un premier clivage à j1 et un taux de fragmentation inférieur à 20 % à j2 sont associés au taux le plus élevé de blastocystes (74 %) avec la cinétique la plus rapide (82 % de blastocystes à j5). L’apport de l’observation des zygotes à j1 ne semble pas apporter de discrimination additionnelle pour affiner encore plus la sélection des embryons, y compris dans le groupe d’embryons de qualité maximale. En revanche, une autre équipe qui associe le score des zygotes avec la morphologie à j3, sans intégrer le clivage précoce, a obtenu 92 % de blastocystes à j5 pour une sous-population des embryons de qualité maximale associant un score Z1 et un grade 1 à j3 [21]. Pour les embryons à quatre blastomères, un taux élevé de fragmentation (> 50 %) n’obère pas la possibilité d’obtenir des blastocystes mais la fréquence sera plus élevée si un premier clivage est observé à j1. En ce qui
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concerne les embryons présentant un clivage plus lent ou plus rapide à j2, des études complémentaires sont nécessaires pour essayer de déterminer le poids de chacun des paramètres analysés dans la prédiction du développement jusqu’au stade blastocyste. 5. Conclusion L’aspect des zygotes, le clivage précoce constituent des outils additionnels intéressants pour le biologiste afin d’affiner le choix des embryons avec le meilleur potentiel de développement. Notre étude séquentielle fondée sur un suivi embryonnaire individuel jusqu’à j5/j6 montre, d’une part, le bénéfice réel de la combinaison clivage précoce/morphologie j2 dans la prédiction du développement jusqu’au stade blastocyste et, d’autre part, l’absence d’apport conséquent de l’aspect des zygotes dans cette combinaison de caractéristiques. Nos résultats suggèrent que la pratique d’une culture embryonnaire prolongée associée à l’intégration des observations préalables (aspect des PN, clivage précoce) peut permettre d’affiner la sélection du ou des blastocystes à transférer. Ainsi, l’utilisation de scores morphologiques fondés sur une information longitudinale peut donner à l’embryologiste une meilleure appréciation de la vitalité des embryons choisis pour le transfert. Références [1]
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Onzièmes Journées nationales de la FFER (Paris, 11–13 octobre 2006)
Suivi individuel des embryons en FIV Sequential assessment of individually cultured embryos in IVF F. Guérif*, J. Poindron, R. Bidault, O. Gasnier, V. Cadoret, M.-H. Saussereau, D. Royère Laboratoire de médecine et biologie de la reproduction, CHU de Bretonneau, 2, boulevard Tonnelé, 37044 Tours cedex, France Reçu le 15 juin 2006 ; accepté le 26 juin 2006 Disponible sur internet le 08 septembre 2006
Résumé Objectif. – Actuellement, il est primordial que les centres d’AMP disposent d’outils applicables en routine pour sélectionner l’embryon avec le potentiel implantatoire le plus élevé afin de réduire le taux de grossesses multiples. Dans cette étude, une analyse prospective a été menée pour déterminer si des marqueurs de développement non invasifs à j1, combinés aux évaluations morphologiques conventionnelles de j2 permettent de prédire le développement in vitro de blastocystes. Patient(e)s et méthodes. – Cette étude a été fondée sur le suivi individuel de 4190 embryons issus de patients du programme de FIV/ICSI du CHU de Tours entre janvier 2002 et décembre 2004. De j1 à j5/j6, une culture en microgouttes sous huile a permis d’enregistrer la progression séquentielle in vitro de ces embryons et la cinétique des blastocystes obtenus. Résultats. – Les résultats mettent en évidence une relation positive significative entre un profil 0 des zygotes, un premier clivage précoce, un embryon avec quatre blastomères et moins de 20 % de fragmentation à j2 et le taux de blastocystes à j5 (p < 0,05). Selon notre pratique, l’addition du profil des zygotes n’apporte pas de bénéfice supplémentaire pour affiner la sélection embryonnaire par rapport à la morphologie embryonnaire à j2 et au premier clivage à j1. Discussion et conclusion. – L’évaluation des zygotes et l’appréciation du premier clivage à j1, la morphologie embryonnaire à j2 sont prédictives isolément du développement jusqu’au stade blastocyste à j5 ou j6. Ces caractéristiques peuvent être combinées pour établir un modèle séquentiel prédictif d’évolution longitudinale in vitro applicable en routine. © 2006 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Abstract Objective. – It is a challenge for IVF centers to propose a method to select the most viable embryo to transfer, thereby minimizing the risk of multiple births. In this study, a prospective investigation was made to determine if non-invasive developmental markers on day 1 combined to conventional evaluation on day 2 can predict in vitro blastocyst development. Patients and methods. – A total of 4190 individually cultured embryos from patients undergoing IVF/ICSI treatment at the Tours University Hospital Center from January 2002 to December 2004 were included. Individual embryos were cultured in sequential media in microdrops under mineral oil from j1 to j5/j6 allowing to record their sequential growth until the blastocyst stage. Results. – The results showed a significant positive relationship between pattern 0 zygote, early cleavage, 4 cells embryos with < 20% fragmentation on day 2 and the rate of blastocyst development on day 5 (P < 0.05). In our hands, zygote pattern does not bring additional benefit to better select embryo. Discussion and conclusion. – Zygote and early cleavage assessments on day 1, morphological appearance on day 2 are some other parameters related individually to blastocyst development on days 5 and 6. These parameters can be used collectively to establish a predictive in vitro sequential embryo assessment model for routine use in IVF clinics. © 2006 Elsevier SAS. Tous droits réservés. Mots clés : Zygote ; Premier clivage ; Blastomère ; Fragmentation ; Blastocyste ; Milieu séquentiel ; Culture individuelle ; Embryon humain ; Fécondation in vitro Keywords: Zygote; Early cleavage; Blastomere; Fragmentation; Blastocyst; Sequential media; Individually cultured human embryos; In vitro fertilization
* Auteur
correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (F. Guérif).
1297-9589/$ - see front matter © 2006 Elsevier SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.gyobfe.2006.06.015
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1. Introduction Un des reproches majeurs faits à la fécondation in vitro est que celle-ci génère un taux élevé de grossesses multiples pouvant mettre en péril la santé de la mère et des enfants à naître. Une volonté consensuelle se développe dans le monde pour réduire la fréquence de ces grossesses multiples dans certaines populations à risque. Par ailleurs, avec l’amélioration des conditions générales de culture in vitro (milieu, environnement) des embryons, de nombreux couples obtiennent plusieurs embryons de bonne qualité et de caractéristiques morphologiques identiques. Dans toutes ces situations, il se pose alors la question au laboratoire, de l’appréciation du potentiel implantatoire des embryons obtenus. Ainsi, aujourd’hui le biologiste doit plus que jamais mettre en œuvre des critères pertinents prédictifs de l’implantation ; critères issus de moyens d’investigation non invasifs et applicables en pratique quotidienne. Plusieurs méthodes ont été proposées pour évaluer la viabilité embryonnaire. La pratique la plus ancienne et la plus habituelle consiste à sélectionner à un stade précoce les embryons à transférer en fonction de leur morphologie à j2 ou j3. Cette morphologie embryonnaire est déterminée par le nombre, la taille et la forme des blastomères, la proportion de fragments anucléés, la présence de blastomères multinucléés. De nombreuses classifications morphologiques ont été proposées dans la littérature avec des systèmes de scores prédictifs de l’implantation embryonnaire. Il a été démontré qu’après deux jours de culture, le stade 4–5 cellules est le stade optimal [1]. À ce stade de clivage, des embryons ne présentant pas ou peu de fragmentation et sans blastomère multinucléé, ont un taux plus élevé d’implantation que des embryons à un autre stade de clivage et/ou présentant plus de fragmentation. Les embryons précoces sont observés en général 44 à 46 heures postinsémination/injection mais parfois la fourchette d’observation est plus large (39 à 48 heures) selon les équipes. À partir de la fin des années 1990, deux nouvelles approches non invasives de sélection embryonnaire ont fait l’objet de multiples publications pour compléter voire concurrencer cette première approche historique : l’aspect des pronuclei (PN) et l’existence d’un clivage embryonnaire précoce à j1. Une évaluation précoce dès j1 des zygotes avec le potentiel implantatoire le plus élevé a été développée dans les pays (Allemagne, Suisse, Autriche) soumis à une loi extrêmement stricte de protection de l’embryon et pour lesquels une sélection à un stade de clivage précoce est interdite. En effet, le stade de zygote n’est pas encore considéré comme un embryon car les deux génomes sont encore séparés physiquement. Ainsi, à ce stade, il doit être décidé quels zygotes sont destinés au transfert ou à la congélation. Il y a plusieurs transformations morphologiques au cours du développement des PN des zygotes humains dont certaines impliquent des phénomènes pouvant aisément être évalués par une observation microscopique simple et non invasive. Parmi ces transformations, une phase précoce de nucléogenèse qui consiste en l’assemblage, croissance et fusion mutuelle de précurseurs nucléolaires (NPB), constitue une représentation morphologique et chronologique
bien connue pour les zygotes humains [2]. En se fondant sur des observations empiriques et des données déjà publiées, Scott et Smith ont été les premiers à établir un score à j1 intégrant la position des PN, la position des nucléoles, l’aspect du cytoplasme et la progression vers le premier clivage [3]. Cette observation a permis d’établir un score minimal (7) et maximal (15), 16 à 18 heures postinsémination ainsi qu’un score maximal (25), 24 à 26 heures postinsémination ; scores corrélés au taux d’implantation des embryons transférés. Ensuite ce score initial a été modifié par les auteurs (classification Z1 à Z4) pour des raisons de simplicité et rapidité afin de permettre un usage quotidien pour un grand nombre de techniciens de laboratoire [4]. Une autre codification des zygotes à j1 a été proposée dans la même période par une autre équipe [5]. Les paramètres morphologiques évalués incluent le nombre des NPB, leur distribution (polarisée ou non polarisée) dans chaque PN, la taille relative des deux PN et leur position l’un par rapport à l’autre. Six profils morphologiques des PN (profil 0 à 5) sont distingués en fonction du nombre et de la distribution des NPB. Ils concernent uniquement les PN de taille identique et apposés l’un à l’autre. Seul le profil 0 correspond à des zygotes qui se sont tous implantés. La polarisation des NPB n’est pas observée au tout début du développement des PN mais apparaît progressivement avec le temps par coalescence des NPB donnant naissance à des NPB plus volumineux. Ainsi, la synchronie inter-PN est selon les auteurs plus importante que la polarité. Depuis la publication de ces deux stadifications de zygotes, des variantes de ces scores ont été proposées dans la littérature [6]. L’observation du premier clivage semble également un paramètre important à considérer dans la sélection des embryons avec le meilleur potentiel d’implantation. Ces observations ont été réalisées selon des temps variables d’observation postinsémination/ICSI de 25 heures [7,8], 27 heures [9], 29 heures [10]. Ce taux de premier clivage est certainement influencé par plusieurs paramètres (sélection des couples, technique d’AMP utilisée, milieux de culture, temps d’observation…). Ainsi, dans la littérature il est rapporté des taux de premier clivage allant de 19 % des cycles de FIV classique pour une observation 25 heures postinsémination [7] à 61 % des cycles de FIV classique pour une observation 29 heures postinsémination [10]. Toutes les études réalisées à ce jour observent une amélioration significative du taux d’implantation lors de transferts d’embryons présentant un premier clivage dès j1. La croissance in vitro des embryons humains peut être réalisée jusqu’au stade blastocyste (j5/j6). Après plus de 20 ans d’AMP, le meilleur jour pour le transfert des embryons dans l’utérus est encore sujet à controverse. En effet, si certaines études rapportent des taux d’implantation plus élevés après transfert de blastocystes par rapport au transfert d’embryons précoces [11], d’autres études n’ont pas observé de différence [12]. Toutefois bien que la pratique générale soit encore de transférer à un stade précoce (j2/j3), le concept du transfert différé au stade de blastocyste a gagné en popularité avec le développement des milieux séquentiels [11]. La culture embryonnaire jusqu’au stade blastocyste a également été proposée comme un outil de sélection des embryons les plus com-
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pétents au développement in vitro [11]. Quand les embryons sont cultivés in vitro, environ 50 % d’entre eux sont arrêtés au cours de la première semaine de développement pour des raisons incomplètement élucidées (anomalies chromosomiques, conditions de culture suboptimales, maturation ovocytaire inadéquate…). Hardy a estimé qu’environ 25 % des embryons ont un fort potentiel de développement quelles que soient les circonstances, que 25 % des embryons peuvent se développer normalement dans des conditions environnementales favorables mais qu’ils s’arrêteront dans des conditions suboptimales. Enfin, environ 50 % des embryons s’arrêteront systématiquement quelles que soient les conditions de culture [13]. Le centre d’Assistance médicale à la procréation (AMP) de Tours a l’expérience de la culture embryonnaire prolongée avec milieux séquentiels depuis 1997. Depuis cette date la proportion des cohortes totales ou partielles d’embryons mise en culture prolongée n’a cessé de croître et un suivi individuel des embryons est mis en place depuis 2002. Ce travail présente les données préliminaires de ce suivi individuel et séquentiel de j1 à j5/j6 afin de déterminer les relations entre morphologie à j1 (aspect des zygotes et premier clivage), morphologie à j2 et développement de blastocystes à j5/j6. 2. Patient(e)s et méthodes Entre janvier 2002 et décembre 2005, 4190 embryons issus du programme FIV/ICSI du centre d’AMP de Tours ont été analysés dans le cadre d’une étude prospective. Un suivi individuel a été réalisé depuis le stade zygote (j1) jusqu’au stade blastocyste (j5/j6) pour tous les embryons. Cette culture individuelle réalisée en microgouttes sous huile minérale concernait des embryons issus soit de l’intégralité de la cohorte embryonnaire en vue d’un transfert différé au stade blastocyste soit des embryons surnuméraires (non transférés et non congelés à j2) placés en culture prolongée. L’élément de référence dans ce suivi de culture embryonnaire in vitro était le développement ou non jusqu’au stade blastocyste en distinguant le jour d’obtention du blastocyste (j5 ou j6). En plus des caractéristiques morphologiques habituelles collectées à j2 (nombre de blastomères et taux de fragmentation), deux caractéristiques morphologiques ont été enregistrées à j1 pour chaque embryon : ● aspect des zygotes ; ● présence du premier clivage. Toutes les observations ont été réalisées sur une platine chauffante d’un microscope inversé au grossissement X200 ou X400. Dans la pratique du centre, le devenir de l’embryon à j2 (transfert immédiat, congélation précoce, culture prolongée ou élimination) est décidé en s’appuyant successivement sur les critères suivants : ● caractéristiques morphologiques à j2 ; ● clivage précoce à j1 ; ● aspect des zygotes à j1.
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La stimulation ovarienne, le recueil des ovocytes, la FIV classique ou l’ICSI, la culture embryonnaire prolongée sur milieux séquentiels ont été décrits précédemment [14]. La fécondation (j0) a été réalisée avec les milieux IVF-50™ ou G-Fert™ (Vitrolife, Göteborg, Suède). Le lendemain (j1), les zygotes ont été placés dans des microgouttes d’IVF-50™ ou de G1-2™ (Vitrolife, Göteborg, Suède) sous huile minérale. De j3 à j5/j6, la culture embryonnaire prolongée a été réalisée en microgouttes de CCM30™ ou G2-2™ (Vitrolife, Göteborg, Suède) sous huile minérale. Toutes les cultures ont été réalisées à 37 °C sous 5 % d’O2 et 6 % de CO2. 2.1. Évaluation des zygotes Les zygotes ont été observés 18 à 20 heures postinsémination/ICSI (j1). Cette observation comprenait la détermination de la présence des PN (nombre et taille respective) et des globules polaires, la détermination du nombre des NPB et leur distribution (polarisée ou non polarisée) dans chaque PN selon la classification de Tesarik [5]. Les critères de Tesarik ont été simplifiés dans l’étude présentée en incluant les profils initialement décrits comme anormaux (profils 1 à 5) dans un groupe unique de zygotes (profil non-0) par opposition au profil 0 (normal). Brièvement, les zygotes avec les caractéristiques suivantes avaient le profil 0 : ● les PN étaient accolés et de taille identique ; ● la différence dans le nombre des NPB entre les deux PN n’excédait pas trois ; ● la distribution des NPB (polarisée ou non) était la même dans les deux PN ; ● il y avait au moins trois NPB dans chaque PN. Les zygotes avec un seul PN ont été maintenus en culture tandis que les zygotes avec deux PN de taille très différente ont été exclus de toute culture embryonnaire prolongée. 2.2. Évaluation des clivages précoces Une seconde observation à j1 a été réalisée 25 à 27 heures postinsémination/ICSI pour chaque zygote afin d’enregistrer la présence ou non du premier clivage dit clivage précoce. 2.3. Évaluation des embryons Une troisième observation a été réalisée 44 à 46 heures postinsémination/ICSI (j2). Cette observation comprenait la détermination du nombre de blastomères et leur régularité en taille ainsi que le taux de fragmentation (inférieur à 20 % du volume de l’embryon, entre 20 et 50 % du volume de l’embryon, supérieur à 50 % du volume de l’embryon). Les embryons présentant des signes de multinucléation dans un ou plusieurs de leurs blastomères ont été exclus de toute culture prolongée. Dans notre centre, les embryons de qualité maximale (« top qualité ») à j2 sont définis par la présence de quatre blastomères réguliers avec moins de 20 % de fragments.
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2.4. Évaluation des blastocystes L’issue de la culture embryonnaire prolongée a été enregistrée pour chaque embryon ainsi que le jour d’obtention du blastocyste (j5 ou j6) pour définir sa cinétique de développement. La classification de Gardner a été utilisée pour qualifier l’expansion de la cavité blastocélique (B1 à B6), la masse cellulaire interne et le trophectoderme des blastocystes obtenus [15]. 2.5. Analyse statistique Les résultats sont exprimés sous forme de pourcentage et ont été analysés avec le logiciel Statview 4.1 (Abacus Concepts, Berkeley, CA, États-Unis) en utilisant des tables de contingences. Une différence était statistiquement significative lorsque p < 0,05. 3. Résultats Ce travail présente le suivi individuel de 4190 embryons cultivés in vitro en fonction de la prise en compte d’une ou de plusieurs caractéristiques morphologiques observées à j1 (aspect des zygotes et premier clivage) et j2 (nombre de blastomères et taux de fragmentation). L’analyse des zygotes 18 à 20 heures postinsémination/ICSI met en évidence un taux plus élevé de blastocystes lorsque les deux pronuclei présentent le profil 0 par rapport au profil non-0 et à la présence d’un seul PN (56, 41, 21 %, respectivement, p < 0,05). La cinétique d’obtention des blastocystes est significativement plus rapide avec des PN de profil 0 (Tableau 1). Par ailleurs, une fréquence accrue de zygotes avec le profil 0 est observée en ICSI par rapport à la FIV classique (19 vs 13 %, p < 0,05). Enfin, les zygotes avec le profil 0 sont significativement associés à des embryons de qualité maximale dans 48 % des cas contre seulement 24 % des cas pour les zygotes de profil non-0 (p < 0,05). L’analyse des embryons 25 à 27 heures postinsémination/ ICSI met en évidence un taux plus élevé de blastocystes lorsque les embryons présentent un premier clivage dès j1 (61 vs 34 %, p < 0,05). Si le premier clivage est observé précocement dès j1, la proportion de blastocystes obtenus dès j5 est aussi significativement plus importante (Tableau 2). Les embryons issus d’ICSI présentent une fréquence plus élevée de premier clivage à j1 par rapport aux embryons issus de FIV classique (35 vs 25 %, p < 0,05). Enfin, le clivage précoce à j1 est associé à une fréquence accrue d’embryons de qualité maximale dans 48 % des cas contre seulement 18 % des cas en cas d’absence de clivage précoce (p < 0,05). Tableau 1 Taux et cinétique de blastocystes en fonction de l’aspect des zygotes à j1 Type de PN
1 PN
Nombre (%) Taux de blastocystes (%) Pourcentage à j5
148 (3,5) 21bc 29ef
2 PN profil non-0 3325 (79,5) 41ac 53df
Tableau 2 Taux et cinétique de blastocystes en fonction de la présence du premier clivage à j1 Premier clivage j1 Nombre Taux de blastocystes (%) Pourcentage à j5
Non 2874 34a 43b
Oui 1316 61a 70b
Les valeurs affectées de la même lettre présentent une différence statistiquement significative (p < 0,05).
L’analyse des embryons 44 à 46 heures postinsémination/ ICSI met en évidence que le taux le plus élevé de blastocystes (58 %) est observé pour les embryons possédant quatre blastomères. Ensuite, ce taux décroît pour les embryons de plus de cinq blastomères et les embryons de trois blastomères ou moins (37 et 30 %, respectivement ; p < 0,05). La cinétique d’obtention des blastocystes décroît selon la même hiérarchie (Tableau 3). Par ailleurs, les embryons avec le taux de fragmentation le plus faible (< 20 %) à j2 présentent le taux le plus élevé de blastocystes par comparaison aux embryons avec 20 à 50 % ou plus de 50 % de fragments (48, 41, 28 %, respectivement ; p < 0,05). La cinétique d’obtention des blastocystes est d’autant plus rapide que les embryons sont moins fragmentés mais la différence n’est pas significative entre tous les groupes (Tableau 4). Lorsque deux critères morphologiques (nombre de cellules et taux de fragmentation à j2) sont combinés, il s’avère que pour un nombre donné de blastomères à j2, le taux de blastocystes est plus élevé lorsque le taux de fragmentation est inférieur à 50 %. Par ailleurs, une hiérarchie s’établit dans le taux de blastocystes entre deux valeurs extrêmes : 65 % pour les embryons avec quatre blastomères et moins de 20 % de fragmentation contre moins de 25 % pour les embryons avec plus de 50 % de fragmentation et un nombre de blastomère différent de quatre (Tableau 5). En ce qui concerne la cinétique d’obtention des blastocystes, une différence significative n’est observée que pour les embryons à quatre blastomères en fonction du taux de fragments. Lorsque à ces deux critères, l’observation du premier clivage à j1 est associée, il est observé que pour une morphologie Tableau 3 Taux et cinétique de blastocystes en fonction du nombre de blastomères à j2 Nombre de blastomères Nombre Taux de blastocystes (%) Pourcentage à j5
2à3 blastomères 1751 30ac
4 blastomères
5 à 8 blastomères
1649 58ab
790 37bc
35df
68de
51ef
Les valeurs affectées de la même lettre présentent une différence statistiquement significative (p < 0,05).
2 PN profil 0
Tableau 4 Taux et cinétique de blastocystes en fonction de la présence de fragments anucléés à j2
717 (17,0) 56ab 64de
Taux de fragmentation (%) Nombre Taux de blastocystes (%) Pourcentage à j5
Les valeurs affectées de la même lettre présentent une différence statistiquement significative (p < 0,05).
< 20 2007 48ab 58d
20 à 50 1592 41ac 54
> 50 591 28bc 47d
Les valeurs affectées de la même lettre présentent une différence statistiquement significative (p < 0,05).
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Tableau 5 Influence du taux de fragmentation à j2 (pour un nombre identique de blastomères) sur le taux et la cinétique de blastocystes Nombre de blastomères Taux de fragmentation (%) Nombre Taux de blastocystes (%) Pourcentage à j5
2 à 3 cellules < 20 799 33a 33
2 à 3 cellules > 50 327 24a 35
4 cellules < 20 879 65b 70d
4 cellules > 50 154 38b 58d
5 à 8 cellules < 20 329 43c 52
5 à 8 cellules > 50 110 22c 63
Les valeurs affectées de la même lettre présentent une différence statistiquement significative pour un nombre identique de blastomères (p < 0,05).
donnée à j2 (même nombre de blastomères et taux de fragmentation identique), un premier clivage à j1 est toujours associé à un taux de blastocyste plus élevé. Par ailleurs, le meilleur taux de blastocystes (74 %) est observé pour les embryons avec quatre blastomères, moins de 20 % de fragments et présentant un premier clivage précoce. À l’inverse les taux de blastocystes les plus faibles (21–23 %) s’observent pour les embryons présentant un nombre différent de quatre blastomères, un taux de fragmentation de plus de 50 % et une absence de clivage précoce La proportion la plus élevée de blastocystes à j5 est observée pour les embryons à quatre blastomères, moins de 20 % de fragments et présentant un premier clivage précoce (Tableau 6). Enfin, une quatrième caractéristique (aspect des zygotes à j1) a été associée dans la prédiction de l’obtention des blastocystes. À ce stade de démembrement des groupes, seuls les effectifs de plus de 50 embryons ont été considérés. Quel que soit le groupe des embryons analysé, trois blastomères ou moins, quatre blastomères ou cinq blastomères et plus, l’addition du profil des pronucléi (profil 0 ou non-0) n’apporte pas globalement, entre nos mains, de pouvoir discriminant additionnel à ce niveau, aussi bien en ce qui concerne le taux que la cinétique d’obtention des blastocystes. 4. Discussion Individuellement, les caractéristiques morphologiques d’un embryon accessibles en routine entre j1 et j2 sont associées avec le développement embryonnaire prolongé in vitro. Selon notre expérience, l’analyse de leur combinaison met en évidence à la fois l’importance des caractéristiques morphologiques à j2 et le premier clivage à j1. En revanche, l’aspect des zygotes à j1 ne semble pas apporter une aide additionnelle lors de la combinaison de ces caractéristiques. Le taux de blastocyste a été pris comme référence de la croissance embryonnaire in vitro. Bien sûr, il est à considérer que l’évaluation séquentielle répétée des embryons depuis le stade zygote jusqu’au stade blastocyste peut générer potentiellement des dommages liés à des modifications de l’environne-
ment embryonnaire occasionnées par les observations successives. Par conséquent, les temps d’observation ont été limités au maximum pour être le moins délétère possible. Deux critères ont été choisis à j1 (aspect des zygotes puis apparition du premier clivage) pour compléter ceux de j2 (nombre de blastomères et taux de fragmentation). Il s’agit de paramètres anciens et conventionnels pour les centres d’AMP en ce qui concerne les évaluations à j2, tandis que les évaluations réalisées à j1 sont d’usage restreint encore à certains centres et d’application beaucoup plus récente. La première caractéristique analysée à j1 est l’aspect des zygotes. Dans notre centre cette observation est réalisée entre 18 et 20 heures postinsémination/ICSI. Il ressort de l’analyse de la littérature que cette évaluation est effectuée dans des intervalles de temps assez larges (12–20 heures postinsémination/ICSI) mais le plus souvent entre 16 et 18 heures. Nous avons observé que 21 % des zygotes avec un seul PN visible étaient capables d’atteindre le stade blastocyste mais seulement à j6 pour la majorité d’entre eux (71 %). Un faible taux de blastocystes (18 %) a aussi été observé dans des situations similaires [16]. En ce qui concerne les zygotes à deux PN, nous avons utilisé une classification simplifiée des profils anormaux par rapport au score initialement proposé par Tesarik en les regroupant sous le terme de profil non-0 [5]. Selon cette classification, nous avons observé un taux significativement plus élevé de zygotes de profil 0 en ICSI par rapport à la FIV classique à la différence de deux autres équipes [6,17]. Par ailleurs, le lien entre les différents profils de zygotes à j1 et la qualité embryonnaire à j2/j3 diffère également selon les études. Plusieurs études n’ont pas observé de différence significative en termes de morphologie embryonnaire entre les profils 0 et non 0 [18,19]. En revanche, dans notre suivi individuel, le profil 0 est associé à une fréquence plus élevée d’embryons de bonne qualité en accord avec d’autres études [5,17,20]. Par ailleurs, il a été décrit que le profil 0 était associé au taux le plus faible d’arrêt de développement embryonnaire à j3 par rapport au profil non-0 [5,17]. Nos données, établies sur une durée plus longue de culture in vitro (j5/j6), confirment ces résultats. En
Tableau 6 Influence du premier clivage à j1 (pour un même nombre de blastomères et un même taux de fragmentation) sur le taux et la cinétique des blastocystes Nombre de blastomères Taux de fragmentation (%) Premier cliv à j1 Nombre Taux de blastocystes (%) Pourcentage à j5
2à3 cellules < 20 Non 707 31a 31
2à3 cellules < 20 Oui 91 44a 45
2à3 cellules > 50 Non 278 23 29e
2à3 cellules > 50 Oui 49 31 60e
4 cellules < 20 Non 393 53b 55f
4 cellules < 20 Oui 487 74b 79f
4 cellules > 50 Non 102 33c 44g
4 cellules > 50 Oui 52 48c 76g
5à8 cellules < 20 Non 168 26d 44
5à8 cellules < 20 Oui 161 61d 56
5à8 cellules > 50 Non 78 21 56
5à8 cellules > 50 Oui 32 25 75
Les valeurs affectées de la même lettre présentent une différence statistiquement significative pour un nombre de blastomères et un taux de fragmentation identiques (p < 0,05).
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effet, le profil 0 est associé au taux de développement de blastocystes le plus élevé et selon une cinétique plus rapide par rapport au profil non-0 des zygotes. En utilisant une stadification différente des PN et en établissant un seuil, une autre équipe a établi qu’au-dessus de ce seuil (> 15), le taux de blastocystes était diminué et que par conséquent les zygotes présentant ce score ne devaient pas être transférés en priorité [6]. En utilisant une autre classification, le Z-score, décrite initialement par Scott en 1998 [3] puis simplifiée en 2000 [4], il a aussi été observé, d’une part, un lien entre le score des PN et la qualité embryonnaire à j3 et, d’autre part, que le score Z1 (qui entre dans le profil 0 de la classification de Tesarik) est associé au pourcentage le plus élevé de blastocystes avec la cinétique de développement la plus rapide [4,21]. Ainsi, l’aspect des zygotes est corrélé au développement embryonnaire in vitro mais plusieurs classifications plus ou moins complexes ont été publiées et une standardisation semble nécessaire pour uniformiser les données publiées. De plus, l’évaluation précise des PN nécessite parfois le recours à une pipette de contention, donc une manipulation du zygote pour distinguer clairement les deux PN ; ce qui augmente le temps de séjour hors de l’incubateur. Enfin, la morphologie des PN est un processus très dynamique qui consiste en l’assemblage, croissance et fusion des précurseurs nucléolaires [2]. Ainsi, un embryon peut présenter une morphologie nucléolaire spécifique à un moment donné et différente sur une observation ultérieure. La seconde caractéristique analysée à j1 est l’apparition ou non du premier clivage. Dans la majorité des centres d’AMP ainsi que dans le nôtre, cette observation est réalisée entre 25 à 27 heures postinsémination/ICSI. La nécessité de décaler le temps d’observation entre FIV classique et ICSI pour observer le même taux de clivage est soumise à controverse. Certaines équipes n’ont pas observé de différence entre FIV classique et ICSI [10,17]. En revanche, d’autres équipes comme la nôtre ont observé des différences, avec un taux de clivage précoce plus élevé en ICSI par rapport à la FIV classique pour un temps d’observation identique [7,9,22]. Cette différence pourrait s’expliquer par le fait que le spermatozoïde micro-injecté courtcircuite quelques étapes de la fécondation (fixation à la zone pellucide, réaction acrosomique…) ; ce qui réduit le temps de fécondation. C’est pourquoi il a été proposé de retarder le temps d’observation de deux heures en FIV classique par rapport à l’ICSI pour retrouver des taux de clivage précoce similaires [23]. Par ailleurs, nous avons observé que les embryons présentant un premier clivage dès j1 étaient associés à une fréquence accrue d’embryons de qualité maximale. Cela est en accord avec d’autres études qui ont constaté une meilleure qualité embryonnaire (définie par le nombre de blastomères, la régularité des blastomères, l’absence de multinucléation des blastomères) de la cohorte si un clivage précoce était enregistré 25 à 27 heures postinsémination/ICSI [22,24]. Les raisons en sont inconnues mais des hypothèses ont été suggérées : ● il a été proposé que les embryons avec clivage précoce étaient issus d’ovocytes présentant une meilleure synchronisation nucléaire et cytoplasmique. Les embryons avec un clivage précoce présenteraient moins de risque d’atteindre
le seuil minimal critique d’ARNm maternel [25] avant l’activation du génome embryonnaire ; ● la contribution du spermatozoïde (facteurs paternels) est aussi à envisager. Dans l’espèce humaine, les centrioles qui contrôlent les premières divisions mitotiques de l’ovocyte sont apportés par le spermatozoïde [26]. Par conséquent, la qualité du spermatozoïde peut être un facteur additionnel influençant le clivage précoce. Au-delà de la qualité morphologique à j2, nous avons observé que les embryons présentant un premier clivage à j1 aboutissaient environ deux fois plus souvent à un blastocyste et ce avec une cinétique plus rapide que les embryons ne présentant pas ce premier clivage à j1. D’autres études menées dans l’espèce humaine retrouvent que le taux de blastocystes issus d’embryons à clivage précoce à j1 par rapport à des embryons sans clivage précoce est plus élevé à j5 (39 vs 21 % respectivement) [8], (52 vs 21,8 % respectivement) [24] et à j6 (66 vs 40 % respectivement) [23]. Par ailleurs, une corrélation positive entre un clivage précoce et la formation de blastocystes a été rapportée dans d’autres espèces animales comme les murins [27] et les bovins [28]. En outre, dans ces études, les blastocystes issus d’embryons avec clivage précoce avaient plus de cellules que les blastocystes issus d’embryons plus lents. Il a été montré que cette différence était attribuable aux différences de chronologie du premier clivage plutôt qu’à des différences dans la vitesse de progression des cycles suivants [27]. Le nombre de blastomères et le taux de fragmentation à j2 sont exploités au quotidien dans les centres d’AMP depuis plus de 20 ans. Sans surprise, le taux le plus élevé de blastocystes est obtenu pour les embryons à quatre blastomères, suivi des embryons plus rapides (cinq–huit cellules) et enfin des embryons les plus lents (deux–trois cellules). La même hiérarchie est constatée à propos de la cinétique d’obtention de ces blastocystes. En ce qui concerne le taux de fragmentation, si le taux de blastocystes décroît avec l’augmentation du taux de fragments à j2, la cinétique d’obtention des blastocystes semble peu influencée par l’importance de la fragmentation. Comme le suivi individuel portait sur plus de 4000 embryons, il a été possible de combiner les caractéristiques d’observation à j1 et j2. Parmi les embryons à quatre blastomères à j2, ceux qui présentent un premier clivage à j1 et un taux de fragmentation inférieur à 20 % à j2 sont associés au taux le plus élevé de blastocystes (74 %) avec la cinétique la plus rapide (82 % de blastocystes à j5). L’apport de l’observation des zygotes à j1 ne semble pas apporter de discrimination additionnelle pour affiner encore plus la sélection des embryons, y compris dans le groupe d’embryons de qualité maximale. En revanche, une autre équipe qui associe le score des zygotes avec la morphologie à j3, sans intégrer le clivage précoce, a obtenu 92 % de blastocystes à j5 pour une sous-population des embryons de qualité maximale associant un score Z1 et un grade 1 à j3 [21]. Pour les embryons à quatre blastomères, un taux élevé de fragmentation (> 50 %) n’obère pas la possibilité d’obtenir des blastocystes mais la fréquence sera plus élevée si un premier clivage est observé à j1. En ce qui
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concerne les embryons présentant un clivage plus lent ou plus rapide à j2, des études complémentaires sont nécessaires pour essayer de déterminer le poids de chacun des paramètres analysés dans la prédiction du développement jusqu’au stade blastocyste. 5. Conclusion L’aspect des zygotes, le clivage précoce constituent des outils additionnels intéressants pour le biologiste afin d’affiner le choix des embryons avec le meilleur potentiel de développement. Notre étude séquentielle fondée sur un suivi embryonnaire individuel jusqu’à j5/j6 montre, d’une part, le bénéfice réel de la combinaison clivage précoce/morphologie j2 dans la prédiction du développement jusqu’au stade blastocyste et, d’autre part, l’absence d’apport conséquent de l’aspect des zygotes dans cette combinaison de caractéristiques. Nos résultats suggèrent que la pratique d’une culture embryonnaire prolongée associée à l’intégration des observations préalables (aspect des PN, clivage précoce) peut permettre d’affiner la sélection du ou des blastocystes à transférer. Ainsi, l’utilisation de scores morphologiques fondés sur une information longitudinale peut donner à l’embryologiste une meilleure appréciation de la vitalité des embryons choisis pour le transfert. Références [1]
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